CN109234188B - 一株异养硝化好氧反硝化菌l2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株异养硝化好氧反硝化菌L2及其应用，该菌株为Xenophilus sp.L2,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.15918。该菌能进行异养硝化和/或好氧反硝化，可应用于氮污染水体的治理修复。

Description

一株异养硝化好氧反硝化菌L2及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株异养硝化好氧反硝化菌L2及其应用。
背景技术
氮素给环境造成的污染问题近年来日益突出，其危害性也日益被人们认识和重视。如氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有可能转化为致癌、致突变和致畸的亚硝胺；又如氮素流入水体造成水体富营养化，引起水质恶化以至湖泊退化。生物脱氮具有处理效果好、处理过程稳定可靠、操作管理方便等的优点而得到广泛应用。
传统的硝化细菌为自养菌，但其生长环境严格、生长速度慢，难于大量培养造成应用受到限制。异养硝化菌能够直接利用水体中有机质营养进行生长的同时降解氨氮，生长速度快并可同时去除COD和氨氮。同时一般认为反硝化是在厌氧下进行，但一些异养硝化细菌却能够进行好氧反硝化，这对氮污染物的去除具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株异养硝化好氧反硝化菌L2及其应用。
本发明采用的具体方案为：
一株异养硝化好氧反硝化菌L2，该菌株为Xenophilus sp.L2,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.15918。
本发明还提供了上述异养硝化好氧反硝化菌L2的应用，将所述的异养硝化好氧反硝化菌L2接种于氮污染水体中，进行异养硝化和/或好氧反硝化。
本发明所具有的有益效果：
本发明异养硝化好氧反硝化菌L2能同步实现异养硝化和好氧反硝化，具有很大的经济价值。
附图说明
图1为异养硝化好氧反硝化菌L2的PCR产物电泳图；
图2为菌株L2与相关种的16S rDNA序列***发育树。
菌株保藏
本发明Xenophilus sp.L2,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.15918，保藏日期：2018年6月8日。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1：异养硝化好氧反硝化菌L2的分离
取天津蓟州区河道底泥5g，加入121℃灭菌处理的100ml富集培养基(NH4Cl0.382g/L、KNO3 0.36g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、K2HPO4 0.2g/L、NaCI 0.12g/L、MnSO4·4H2O 0.01g/L、FeSO4 0.01g/L、其余为水，pH7.0～7.2)中，30℃、150rpm振荡好氧培养3d，然后30℃、静置培养3d，如此再重复一次。然后将上述富集液取5ml再次接入121℃灭菌处理的100ml富集培养基(NH4Cl 0.382g/L、KNO3 0.36g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、K2HPO4 0.2g/L、NaCI 0.12g/L、MnSO4·4H2O 0.01g/L、FeSO4 0.01g/L、其余为水，pH7.0～7.2)中，30℃、150rpm振荡好氧培养3d，然后30℃、静置培养3d，如此再重复一次。然后取上述二次富集的富集液使用固体富集培养基(琼脂15g/L、NH4Cl0.382g/L、KNO3 0.36g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、K2HPO4 0.2g/L、NaCI 0.12g/L、MnSO4·4H2O 0.01g/L、FeSO4 0.01g/L、其余为水，pH7.0～7.2)进行稀释涂布，挑取单菌落，分离得到菌株L2。
实施例2异养硝化好氧反硝化菌L2的鉴定
L2的形态特征：短杆状、不产生芽孢，在固体平板上形成青色菌落。L2的生理生化特征：革兰氏染色阴性，脲酶反应阴性。将活化的L2，CGMCC No.15918接种在液体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl)中，30℃、150rpm振荡培养24h。取1ml新鲜培养菌液4℃、8000rpm离心5min，收集菌体，采用DNA提取试剂盒提取DNA，然后采用通用引物8F/1492R进行PCR扩增，PCR产物电泳检测后，如图1泳道3电泳条带，并测定16S rDNA基因序列(如SEQ ID NO:1所示)，，经比对确定L2属于Xenophilus sp.。菌株L2与相关种的16S rDNA序列***发育树见图2。
序列表：SEQ ID NO:1：
ttcggatgctgacgagtggcgaacgggtgagtaatacatcggaacgtgcccgatcgtgggggatagctcggcgaaagccggattaataccgcatacgatctacggatgaaagcaggggaccgcaaggccttgcgcgaacggagcggccgatggcagattaggtagttggtggggtaaaggctcaccaagccgacgatctgtagctggtctgagaggacgaccagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttggacaatgggcgcaagcctgatccagcaatgccgcgtgcaggatgaaggccttcgggttgtaaactgcttttgtacggaacgaaaaggctctggttaatacctggggctcatgacggtaccgtaagaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggtgatgtaagacagttgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatctgtgactgcatcgctggagtgcggcagagggggatggaattccgcgtgtagcagtgaaatgcgtagatatgcggaggaacaccgatggcgaaggcaatcccctgggcctgcactgacgctcatgcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgtcaactggttgttgggaatttgctttctcagtaacgaagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggtttaattcgatgcaacgcgaaaaaccttacccacctttgacatgtacggaactcgccagagatggcttggtgctcgaaagagagccgtaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcattagttgctacattcagttgggcactctaatgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttataggtggggctacacacgtcatacaatggctggtacaaagggttgccaacccgcgagggggagctaatcccataaagccagtcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagcgggttctgccagaagtagttag
(2)L2，CGMCC No.15918异养硝化功能检测
将活化的L2，CGMCC No.15918接种在液体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L氯化钠)中，30℃、150rpm振荡培养24h。按5％(V/V)取新鲜菌液接种在异养硝化模拟废水(NH4Cl 0.382g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、K2HPO4 0.2g/L、NaCI 0.12g/L、MnSO4·4H2O 0.01g/L、FeSO4 0.01g/L、pH7.0～7.2)中，30℃、150rpm振荡好氧培养7d。并有未接菌的空白对照。在培养7d后，使用格里斯氏试剂和二苯胺试剂检测培养液中是否出现亚硝酸盐或者硝酸盐。如果培养液中存在亚硝酸盐或者硝酸盐，说明发生异养硝化，为异养硝化阳性；如果培养液中不存在亚硝酸盐和硝酸盐，说明未发生异养硝化，为异养硝化阴性。
格里斯氏试剂和二苯胺试剂检测结果表明L2，CGMCC No.15918异养硝化阳性，具有异养硝化功能。
根据标准HJ 535-2009水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法建立氨氮的不同浓度(mg/L)与OD值的关系见表1，以OD值为横坐标，氨氮浓度为纵坐标，绘制标准曲线得曲线公式为：y＝5.3087x+0.0005，其中R2＝0.9996。
表1 不同浓度(mg/L)氨氮与OD值
NH<sub>3</sub>-N 0 0.1 0.2 0.6 1 1.2 1.4 1.6 2
OD值 0.007 0.026 0.043 0.12 0.195 0.233 0.272 0.313 0.379
同样根据标准HJ 535-2009水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法，将空白对照组和L2实验组培养后的溶液，稀释50倍(使氨氮浓度在0.1-2mg/L)后测定稀释液的OD值(见表2)，校正后根据标准曲线公式y＝5.3087x+0.0005计算稀释液中的氨氮浓度(同见表2)，根据稀释倍数确定空白对照组和L2实验组培养后的原始溶液中的氨氮浓度(同见表2)。
表2 空白对照组和L2实验组氨氮测定
Figure BDA0001766385780000041
根据(空白对照组原液氨氮浓度-L2实验组原液氨氮浓度)/空白对照组原液氨氮浓度计算L2，CGMCC No.15918异养硝化的氨氮降解率＝(95.05-44.09)/95.05＝53.61％。
实施例4L2，CGMCC No.15918好氧反硝化功能检测
将活化的L2，CGMCC No.15918接种在液体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L氯化钠)中，30℃、150rpm振荡培养24h。按5％(V/V)取新鲜菌液接种在好氧反硝化模拟废水(KNO3 0.36g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、K2HPO4 0.2g/L、NaCI 0.12g/L、MnSO4·4H2O 0.01g/L、FeSO4 0.01g/L、pH7.0～7.2)中，30℃、150rpm振荡好氧培养7d。并有未接菌的空白对照。在培养7d后，使用格里斯氏试剂和二苯胺试剂检测培养液中是否出现亚硝酸盐以及硝酸盐是否消耗殆尽。如果培养液中存在亚硝酸盐，说明发生好氧反硝化，为好氧反硝化阳性；如果培养液中硝酸盐消耗，也说明发生好氧反硝化，也为好氧反硝化阳性。
格里斯氏试剂和二苯胺试剂检测结果表明L2，CGMCC No.15918好氧反硝化阳性，具有好氧反硝化功能。
根据标准HJ 636-2012水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法建立总氮的不同浓度(mg/L)与OD值的关系见表3，以零总氮的OD值校正后的OD值为横坐标，总氮浓度为纵坐标，绘制标准曲线得曲线公式为：y＝18.724x+0.2922，其中R2＝0.9993。
表3 不同浓度(mg/L)总氮与OD值
总氮 0 0.5 1 2.5 5 6
A<sub>220</sub> 0.0638 0.0794 0.104 0.1848 0.3112 0.3767
A<sub>275</sub> 0.0051 0.0064 0.0075 0.0056 0.0055 0.0075
A<sub>220</sub>-2A<sub>275</sub> 0.0536 0.0666 0.089 0.1736 0.3002 0.3617
同样根据标准HJ 636-2012水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，将空白对照组和L2实验组培养后的溶液，稀释10倍(使总氮浓度在0.2-7mg/L)后测定稀释液的OD值(见表4)，校正后根据标准曲线公式y＝18.724x+0.2922计算稀释液中的总氮浓度(同见表4)，根据稀释倍数确定空白对照组和L2实验组培养后的原始溶液中的总氮浓度(同见表4)。
表4 空白对照组和L2实验组总氮测定
Figure BDA0001766385780000051
根据(空白对照组原液总氮浓度-L2实验组原液总氮浓度)/空白对照组原液总氮浓度计算L2，CGMCC No.15918好氧反硝化的总氮降解率＝(51.01-20.02)/51.01＝60.74％。
序列表
<110> 李晓明
<120> 一株异养硝化好氧反硝化菌L2及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1355
<212> DNA
<213> 嗜异生质菌(Xenophilus sp.)
<400> 1
ttcggatgct gacgagtggc gaacgggtga gtaatacatc ggaacgtgcc cgatcgtggg 60
ggatagctcg gcgaaagccg gattaatacc gcatacgatc tacggatgaa agcaggggac 120
cgcaaggcct tgcgcgaacg gagcggccga tggcagatta ggtagttggt ggggtaaagg 180
ctcaccaagc cgacgatctg tagctggtct gagaggacga ccagccacac tgggactgag 240
acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaatt ttggacaatg ggcgcaagcc 300
tgatccagca atgccgcgtg caggatgaag gccttcgggt tgtaaactgc ttttgtacgg 360
aacgaaaagg ctctggttaa tacctggggc tcatgacggt accgtaagaa taagcaccgg 420
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgcg agcgttaatc ggaattactg 480
ggcgtaaagc gtgcgcaggc ggtgatgtaa gacagttgtg aaatccccgg gctcaacctg 540
ggaactgcat ctgtgactgc atcgctggag tgcggcagag ggggatggaa ttccgcgtgt 600
agcagtgaaa tgcgtagata tgcggaggaa caccgatggc gaaggcaatc ccctgggcct 660
gcactgacgc tcatgcacga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 720
acgccctaaa cgatgtcaac tggttgttgg gaatttgctt tctcagtaac gaagctaacg 780
cgtgaagttg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg 840
gacccgcaca agcggtggat gatgtggttt aattcgatgc aacgcgaaaa accttaccca 900
cctttgacat gtacggaact cgccagagat ggcttggtgc tcgaaagaga gccgtaacac 960
aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1020
gcgcaaccct tgtcattagt tgctacattc agttgggcac tctaatgaga ctgccggtga 1080
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttatagg tggggctaca 1140
cacgtcatac aatggctggt acaaagggtt gccaacccgc gagggggagc taatcccata 1200
aagccagtcg tagtccggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagtcg gaatcgctag 1260
taatcgtgga tcagaatgtc acggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc 1320
acaccatggg agcgggttct gccagaagta gttag 1355

Claims (2)

1.一株异养硝化好氧反硝化菌L2，其特征在于：该菌株为Xenophilus sp.L2,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCCNo.15918。
2.权利要求1所述异养硝化好氧反硝化菌L2的应用，其特征在于：将所述的异养硝化好氧反硝化菌L2接种于氮污染水体中，进行异养硝化和/或好氧反硝化。
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