CN101351559A - 病原体的多元定量检测 - Google Patents

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Abstract

本发明允许定量检测一个样品中的多种病原体。该方法包括用多种病原体特异性引物对来扩增样品，从而由每种病原体特异性引物对产生大小不同的扩增子。该方法还包括使用对应于每种病原体特异性引物对的多种竞争剂多核苷酸靶标。将所述竞争剂多核苷酸以已知的浓度加入反应混合物中，以定量样品中病原体的量。该方法可用于监测个体(优选免疫受损的个体)中的病原体感染。

Description

病原体的多元定量检测
与相关申请参考
本发明要求2005年11月9日提交的序列号为60/735,085的美国临时专利申请的优先权和权益，其全部内容以参考方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于同时定量测试样品中两种或更多种病毒、细菌或原生动物病原体的方法和组合物。更具体地，本发明涉及用于定量测试来自个体的样品以定量检测和/或监测病原体感染的方法和组合物。
背景技术
免疫缺陷可由多种不同的病因引起，包括由于遗传性基因异常(例如，Chediak-Higashi综合征、重度联合免疫缺损、慢性肉芽肿病、DiGeorge综合征)、接触辐射、化学疗法、重金属或杀虫剂，或者由于细菌、病毒(HIV)、寄生生物或真菌感染而获得。
在器官移植手术中，尤其是在肾、肝、心、肺和骨髓移植手术中，必须抑制移植物受者的免疫***，以使手术后移植排斥的可能性最小化。使用了多种免疫抑制疗法，并已提出用于这一目的。然而，免疫抑制疗法需要小心地进行监测，因为它们可导致受者对在其他情况下可被正常免疫***控制的细菌和病毒的感染特别敏感。已成功应用于临床实践中的免疫抑制剂包括类固醇、硫唑嘌呤和环孢菌素A。在临床实践中必须尝试对预防或治疗移植排斥与保持一定量的受者免疫***以对抗其它传染原所需的免疫抑制程度进行平衡。
发明内容
本文公开了用于鉴定和测定个体患者中两种或更多种病原体的量从而监测疾病的出现和/或疾病的发展的方法，所述患者包括无症状的患者以及免疫受损并且就目的病原性疾病而言无症状的患者。
在一方面，本文公开的方法允许鉴定两种或更多种靶标多核苷酸(例如DNA或RNA)的存在和/或量，所述靶标多核苷酸是两种或更多种病原体特异性的并且是从该两种或更多种病原体中制备或分离的，所述病原体特别地是可存在于给定生物样品中的病毒、细菌和原生动物病原体以及真菌病原体。
所述方法允许单个进行以及以多元模式进行地检测和定量核酸样品中的病原体特异性靶标核酸(例如，DNA或RNA)，这可进一步允许在单个反应中测定两种或更多种靶标核酸的水平(例如，表达水平或拷贝数)。鉴定和定量临床样品中的病原体特异性靶标具有多种临床用途，其包括密切监测免疫***受损的患者。
在一方面，本文所述方法使用内标，其通过使用多种已知浓度的外部添加竞争剂核酸而得到，所述竞争剂核酸产生已知大小的扩增产物，其大小彼此不同并与靶标核酸的大小不同。将尺寸分离(例如通过毛细管电泳)与检测(例如通过荧光检测)联用，产生所述竞争剂核酸的相应扩增产物丰度的标准曲线。所述标准曲线可用于测定原始样品中的靶标核酸浓度。
在一方面，本文所述方法涉及估计或测定核酸样品中的病原体特异性靶标核酸(例如，DNA或RNA)水平的方法，该方法包括：对于给定的病原体特异性靶标核酸，选择将在扩增所述靶标(例如，通过PCR或RT-PCR)后产生长度已知的靶标扩增子的扩增引物对。产生一组至少两种竞争剂核酸(例如，DNA或RNA分子)，其中当使用相同的扩增引物对进行扩增时，所述竞争剂产生相对于靶标核酸来说长度不同但扩增效率相似的产物。进行扩增反应，其中将待分析靶标核酸水平的样品与已知不同浓度的至少两种竞争剂核酸混合，然后分离和检测扩增产物。竞争剂核酸组提供了用于测定原始样品中靶标核酸量的内参。该方法适用于在单次操作中测量单个样品中多种病原体特异性靶标核酸，这允许得到给定样品中选定病原体靶基因序列的扩增谱。该谱允许精确定量给定样品中病原体特异性核酸的水平。
在一方面，本文所述方法涉及检测免疫受损的症状发生前患者中的选定病原体。因为免疫受损患者(尤其是接受免疫抑制剂治疗的移植物受者)中临床症状的发生推迟，所以定量检测病毒、细菌和原生动物病原体提供了一种在感染早期阶段指导抗感染治疗的方式，这通过在治疗可能最有效时调整免疫抑制治疗(旨在免疫抑制的以及具有免疫抑制副作用的治疗)的施用和抗病原体剂(例如，抗病毒剂、抗生素、抗真菌剂)的施用来实现。
另一方面，所述方法用于分析怀疑含有多种预定病原体中任意种的样品，这通过筛选样品中用于核酸扩增反应的多种病原体特异性靶标从而从每种病原体特异性靶标产生扩增子来实现。该方法包括选择一系列病原体特异性的引物对，其中每对引物对应于并靶向相应病原体的特异性核酸序列。这一系列病原体特异性引物在同时使用时产生样品中所存在特异性病原体的不同大小的扩增子。通过拆分部分扩增混合物来检测扩增子，从而测定扩增子是否存在，如果存在的话则测定其大小。可以在扩增反应全程中收集样品部分以确定扩增子何时首先出现，或者在扩增反应结束时收集样品。
另一方面，所述方法用于定量测定样品中的多种预定病原体，所述样品被怀疑包含至少一种病原体。该方法包括获得被怀疑包含至少一种预定病原体的样品。可以从环境(例如，土壤、水、动物或人的废物)或者从植物、动物、冷冻组织库或人类来源(例如，病原体携带者或宿主)获得所述样品。从样品中分离核酸用作扩增反应中的模板。选择病原体特异性引物使其对应于样品中怀疑存在的多种病原体之每一种。扩增反应中还包括对照多核苷酸，优选竞争剂多核苷酸。竞争剂多核苷酸是用于通过病原体特异性引物进行扩增的模板，然而所产生的扩增子的大小明显不同于使用相同的或任何其它病原体特异性引物与样品或对照模板时从样品核酸中扩增的产物。竞争剂多核苷酸以特定的浓度(即拷贝数)加入，以允许测定病原体特异性核酸的量(即拷贝数)。样品中病原体的量可以低于该方法的检出限或者不存在。
在一方面，所述方法包括对相同来源的一系列样品监测多种预定病原体中任意种。该方法包括以规律的间隔(例如，约每周一次，约每月一次，约每季度一次)从来源获得样品，并使用竞争剂多核苷酸扩增法定量样品中多种病原体的量。来源可以是免疫受损的个体，他们常常尽管被感染但却无症状。通过以规律的间隔定量测定多种病原体的量，在无症状个体中可以检测病原体并且可采用合适的措施，如修改导致个体免疫抑制的组合物施用或者采用某种治疗方式从而改善和/或治疗该病原体感染。
定义
当提及“制备或分离自”病原体的核酸时，本文使用的术语“制备或分离自”是指分离自病毒或其它病原体的核酸以及复制自病毒的核酸，例如使用病毒核酸作为模板通过逆转录或DNA聚合的过程来实现。所述病原体核酸可以与宿主核酸一起分离自样品。
本文使用的术语“病原体”是指生物体(包括微生物)，其通过直接感染另一生物或者通过产生在另一生物中致病的物质(例如，产生病原性毒素的细菌等)而导致另一生物(例如，动物和植物)发病。本文使用的病原体包括但不限于细菌、原生动物、真菌、线虫、类病毒和病毒或其任意组合，其中每种病原体能够独立地或与另一病原体一起导致脊椎动物发病，所述脊椎动物包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人。本文使用的术语“病原体”还包括在非免疫受损宿主中通常可能不具有病原性的微生物。病毒病原体的非限制性的特定实例包括HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。
本文使用的术语“微生物”包括原核的和真核的微生物物种，其来自古生菌(Archaea)域、细菌域和真核生物域，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生生物。术语“微生物细胞”与术语“微生物”可交换使用。
“细菌”或“真细菌”是指原核生物域。细菌包括至少以下11个不同的群：(1)革兰氏阳性(gram+)菌，其中存在两个主要的分支：(i)高G+C群(放线菌、分枝杆菌、微球菌等)(ii)低G+C群(芽孢杆菌、梭菌属、乳杆菌、葡萄球菌、链球菌、支原体)；(2)变形菌(proteobacteria)，例如紫色光合+非光合的革兰氏阴性菌(包括最“常见”的革兰氏阴性菌)；(3)蓝细菌，例如生氧型光养生物；(4)螺旋菌和相关物种；(5)浮霉状菌属；(6)类菌体，黄杆菌；(7)衣原体；(8)绿色硫黄菌；(9)绿色非硫黄菌(也叫做厌氧型光自养生物)；(10)抗辐射的微球菌及其亲缘菌；(11)栖热袍菌属和栖热腔菌属的嗜热生物。
“革兰氏阴性菌”包括球菌、非肠杆菌和肠杆菌。革兰氏阴性菌的属包括，例如奈瑟氏球菌属(Neisseria)、螺菌属(Spirillum)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、嗜血菌属(Haemophilus)、博德特氏菌属(Bordetella)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、醋杆菌属(Acetobacter)、气杆菌属(Aerobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)、螺菌属(Spirilla)、沙雷氏菌属(Serratia)、弧菌属(Vibrio)、根瘤菌属(Rhizobium)、衣原体属(Chlamydia)、立克次氏体属(Rickettsia)、密螺旋体属(Treponema)和梭杆菌属(Fusobacterium)。
“革兰氏阳性菌”包括球菌、非芽孢型杆菌和芽孢型杆菌。革兰氏阳性菌的属包括，例如放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、乳杆菌属(Lactobacillus)、利斯特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、粘球菌属(Myxococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。
本文使用的术语“检测”是指定性测定样品中是否存在微生物。术语“检测”还包括“鉴定”微生物，即根据本领域公认的以及本说明书所述的分类法来确定微生物的属、种或株系。术语“检测”还包括定量测定样品中的微生物，例如1微升(或1毫升或1升)或1微克(或1毫克或1克或1千克)样品中微生物的拷贝数。
本文使用的术语“免疫受损的患者或个体”是指由于该个体的免疫***不以最佳能力工作而具有发生感染性疾病风险的个体。在一方面，该个体是由于设计用于例如预防炎症或预防移植物排斥的治疗方案而免疫受损。
本文使用的术语“样品”是指分离自其天然环境并包含多核苷酸的生物材料。本文所述方法的样品可由纯化或分离的多核苷酸组成，或者它可以包含含有多核苷酸的生物样品，如组织样品、生物流体样品或细胞样品。生物流体包括但不限于例如血、血浆、唾液、尿、脑脊液、灌洗液和白细胞泳动(leukophoresis)样品。样品还可以是环境样品，如土壤、水或者 动物或人的***物，从而检测已发生特定病原体相关疾病暴发的区域中病原体的存在情况。样品还可以从组织库或其它来源获得，用于分析存档样品或者在移植前测试组织。可用于本文所述方法中的样品可以是包含多核苷酸的任何植物、动物、细菌或病毒材料，或者来源于它们的任何材料。
样品由于任意多种原因而“被怀疑包含多种预定病原体中的至少一种”。例如，如果生活在土壤样品收集位置附近的人或动物表现出与土壤病原体相关的病症或疾病症状，则该土壤样品可被怀疑包含病原体。或者，可怀疑免疫抑制个体或由于其它原因而对感染敏感的个体是病原体的宿主或携带者，而未表现出明显的感染征兆。即使不存在感染，也可怀疑取自所述个体的样品包含多种病原体中的至少一种。
本文使用的术语“扩增子”是指来自核酸扩增反应的扩增产物。该术语泛指已知大小的特异性预期扩增产物，其由使用给定的扩增引物组产生。
本文使用的术语“逆转录物”是指RNA链的DNA互补体，其通过RNA依赖性DNA聚合酶活性而产生。
本文使用的术语“竞争剂多核苷酸”或“核酸竞争剂”是指长度和组成已知的核酸模板，其可使用选择用于扩增靶标核酸的寡核苷酸引物对进行扩增。在某些实施方案中，所述竞争剂核酸可以是RNA分子，在这种情况下它可以叫作“竞争剂RNA”或“RNA竞争剂”。在另一些实施方案中，所述竞争剂核酸可以是DNA分子，在这种情况下它可以叫作“竞争剂DNA”或“DNA竞争剂”。 “竞争剂核酸”(无论DNA或RNA)将产生比由靶标核酸所产生的扩增子更长或更短的扩增子，例如已知的可区分长度，例如分别为靶标核酸中内部***或缺失的长度。所述内部***或缺失应该为1至20个核苷酸或碱基，优选5至20个核苷酸或碱基，或者5至10个核苷酸或碱基。靶标与竞争剂扩增子的长度差异为1至20个核苷酸长度，优选5至20或者5至10个核苷酸长度。优选地，***序列不会引入形成靶标序列中不存在的稳定二级结构的能力。预测核酸二级结构的软件在本领域是公知的。当使用选定的扩增引物对时，“竞争剂多核苷酸”将具有与靶标核酸相似的扩增效率。
用于核酸扩增时，本文使用的术语“相似的效率”是指使用相同组引物以及等量的靶标和竞争剂模板产生的检测靶标和竞争剂核酸扩增产物的循环阈值(threshold cycle，Ct)是相同的。可以计算部分循环的Ct。然而，当循环数的整数部分相同时，一种扩增子的Ct与另一扩增子的Ct“相同”，即，在本文使用的术语中，2.0、2.3和2.6的Ct是“相同”的。本文使用的“Ct”是PCR循环数，在该循环数时PCR产物的信号强度达到扩增产物信号强度背景值10倍标准差的阈值。本文中，信号强度是指来自已掺入荧光标记(通过标记引物或者掺入标记的核苷酸)的扩增产物的荧光信号，是对样品中的扩增产物进行毛细管电泳之后测量的，所述样品来自循环反应的多个循环点。扩增效率的另一个度量是在连续的循环中测量扩增产物的量(例如，通过荧光整合或标签掺入)，使用公式E＝(Pn+1-Pn)/(Pn-Pn-1)计算效率，其中P＝循环n时的扩增产物量。如果靶标与竞争剂核酸之间效率差异的绝对值小于0.2，则扩增效率是“相似的”。
在本文所述的方法中，如果靶标与竞争剂核酸的扩增效率以任一这些标准(优选以所述两种标准)而言是“相似的”，则效率是“相似的”。
“能介导扩增”的引物对应理解为特异性针对靶标、具有适当的解链温度并且不包含过多的二级结构的引物对。本文提供了设计能介导扩增的引物对的指导方针。
本文使用的“促进扩增的条件”是制造商针对扩增用酶提供的扩增条件。应当理解的是，酶可以在一定范围的条件(例如，离子浓度、温度、酶浓度)下起作用。还应当理解的是，扩增可能需要多种温度(例如，在PCR中)。促进扩增的条件不需要针对反应中所有引物和靶标而言都是一致的，并且反应可在仍可能发生扩增的次优条件下进行。
本文使用的术语“等分试样”是指取自扩增反应混合物的样品体积。等分试样的量可以变化，但通常会在给定的实验操作中恒定。等分试样小于整个反应混合物的体积。当在扩增期间取出X个等分试样时，等分试样的体积将小于或等于所述反应体积的1/X。
本文使用的术语“分配”是指分配、转移、取出、挤出或除去。
本文使用的短语“在多个阶段从反应混合物分配等分试样”是指在扩增反应期间取出等分试样至少两次，并优选至少约3、4、5、10、15、20、30或更多次。“阶段”是指在给定循环数时或之后的点，或者当扩增为非循环时它是指在反应起始时或之后的选定时间。
本文使用的“分离”样品中的核酸是指通过大小对核酸片段进行分离的过程。所述分离的方法应该能够分离大小差异为10个核苷酸或更少(或者，10个碱基对或更少，例如使用非变性条件时)的核酸片段。本文所述方法中所使用分离技术的优选分辨率包括相差5个核苷酸或更少(或者，5个碱基对或更少)的核酸分辨率，高至(并包括)仅相差一个核苷酸(或一个碱基对)的核酸分辨率。
本文使用的“可通过毛细管电泳区分的大小”的提法是指至少一个核苷酸(或碱基对)的差异，但优选至少5个核苷酸(或碱基对)或更多、高至(并包括)10个核苷酸(或碱基对)或更多的差异。当涉及多核苷酸长度使用时，本文使用的术语“明显不同于”是指该多核苷酸的长度可通过毛细管电泳与另一多核苷酸区分开的长度。
本文使用的术语“扩增产物”是指多核苷酸，它是扩增反应中产生的特定多核苷酸的拷贝。本发明的“扩增产物”可以是DNA或RNA，并可以是双链或单链。扩增产物在本文中也称为“扩增子”。
本文使用的术语“扩增”或“扩增反应”是指产生特定多核苷酸序列的拷贝或者增加特定多核苷酸序列的拷贝数或量的反应。例如，多核苷酸扩增可以是使用聚合酶和寡核苷酸引物对来产生多于初始存在量的任何特定多核苷酸序列(即完整或部分的靶标多核苷酸序列)的过程。可通过聚合酶链式反应(PCR)的体外方法进行扩增。通常参见PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification(H.A.Erlich编辑)Freeman Press，NY，NY(1992)；PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Innis等编辑)Academic Press，San Diego，CA(1990)；Mattila等，Nucleic Acids Res.19：4967(1991)；Eckert等，PCR Methods andApplications 1：17(1991)；PCR(McPherson等编辑)，IRL Press，Oxford；以及美国专利号4,683,202和4,683,195，其中每篇文献均通过参考整体并入本文。另一些扩增方法包括但不限于：(a)连接酶链式反应(LCR)(参见Wu和Wallace，Genomics 4：560(1989)和Landegren等，Science241：1077(1988))；(b)转录扩增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173(1989))；(c)自持续序列扩增(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1874(1990))；和(d)基于核酸的序列扩增(NABSA)(参见Sooknanan，R.和Malek，L.，Bio Technology 13：563-65(1995))，其中每篇文献均通过参考整体并入本文。
本文使用的“靶标多核苷酸”(例如包括靶标RNA或靶标DNA)是待分析的多核苷酸。可在使用本发明的方法进行分析前分离或扩增靶标多核苷酸。例如，所述靶标多核苷酸可以是位于寡核苷酸引物对两个成员的杂交区域之间的序列，所述引物用于扩增所述靶标多核苷酸。靶标多核苷酸可以是RNA或DNA(例如包括cDNA)。靶标多核苷酸序列通常作为较大“模板”序列的一部分存在；然而，在某些情形中，靶序列和模板是相同的。
本文使用的“病原体特异性靶标多核苷酸”是如上定义的靶标多核苷酸，其中所述靶标多核苷酸是制备或分离自目的病原体、并且仅在所分析的一组不同病原体的一个成员中存在的多核苷酸。
本文使用的“寡核苷酸引物”是指能与多核苷酸模板退火并提供3’末端以产生与所述多核苷酸互补的延伸产物的多核苷酸分子(即DNA或RNA)。起始和延伸的条件通常包括：在适当的缓冲液(“缓冲液”包括作为辅因子或者影响pH、离子强度等的替代物)中以及合适的温度下存在4种不同的脱氧核苷三磷酸(dNTP)和聚合诱导剂(如DNA聚合酶或逆转录酶活性)。本文所述的引物可以是单链或双链。所述引物优选为单链以实现最高扩增效率。可用于本文所述方法中的“引物”小于或等于100个核苷酸的长度，例如小于或等于90、80、70、60、50、40、30、20、15个，但优选长于10个核苷酸的长度。
本文使用的“标记”或“可检测标记”是指可用于提供可检测(优选可定量)信号的任何部分或分子。“标记核苷酸”(例如，dNTP)或“标记多核苷酸”是与可检测标记连接的核苷酸。术语“连接”包括共价和非共价健合，例如通过氢键、离子键或范德华键键合。这些键合可以在至少两个相同或不同的原子或离子间由于所述原子或离子的电子密度重新分配而形成。标记可提供可通过荧光、放射性、比色分析、重量分析、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性、质谱分析、结合亲和力、杂交射频、纳米晶体等进行检测的信号。本文所述方法中可使用的核苷酸可以是标记的，从而扩增产物中可掺入该标记核苷酸，并变为可检测的。根据本发明，荧光染料是优选的标记。合适的荧光染料包括荧光色素如Cy5、Cy3、罗丹明及衍生物(如得克萨斯红)、荧光素及衍生物(如5-溴甲基荧光素)、萤光黄、IAEDANS、7-Me2N-香豆素-4-乙酸酯、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯、7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、monobromobimane、三磺酸芘(pyrene trisulfonate)，如Cascade蓝和单溴甲基-ammoniobimane(实施参见DeLuca，Immunofluorescence Analysis，Antibody As a Tool，Marchalonis，等编辑，John Wiley & Sons，Ltd.，(1982)，其通过参考并入本文中)。
本文使用的术语“标记核苷酸”还旨在包括固有地发出荧光的合成或生物化学衍生的核苷酸类似物，例如美国专利号6,268,132和5,763,167所述，Hawkins等(1995，Nucleic Acids Research，23 2872-2880)、Seela等(2000，Helvetica Chimica Acta，83：910-927)、Wierzchowski等(1996，Biochimica et Biophysica Acta，1290：9-17)、Virta等(2003，Nucleosides，Nucleotides & Nucleic Acids，22：85-98)，其通过参考整体并入本文中。“固有地发出荧光”是指核苷酸类似物具有独特的光谱，并在其生理条件下选择性激发和发射的能力方面不同于通常存在的常规核苷。对于固有地发出荧光的核苷酸来说，荧光通常发生在近紫外波长至可见波长。优选地，荧光发生在250nm至700nm的波长，最优选在250nm至500nm的可见波长。
术语“可检测标记”或“标记”包括自身或者通过与另一标记相互作用能产生可检测信号的分子或部分。所述“标记”可以是信号产生***的成员，并因此可与该信号产生***的另一些成员一起产生可检测信号，例如，生物素-抗生物素蛋白信号产生***，或用于荧光共振能传递(fluorescent resonance energy transfer，FRET)的供体-受体对(Stryer等，1978，Ann.Rev.Biochem.，47：819；Selvin，1995，Methods Enzymol.，246：300)或者结合核酸(DNA或RNA分子)后产生可检测信号的核酸结合染料。
本文使用的术语“核苷酸”或“核酸”是指核苷的磷酸酯，例如单、双、三和四磷酸酯，其中最常见的酯化位点是附着于戊糖(或非戊糖的“糖部分”的等价位置)C-5位的羟基。术语“核苷酸”包括常规核苷酸和非常规核苷酸，其包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酸酯、成环原子(ring atom)改性的衍生物等，例如固有地发出荧光的核苷酸。
本文使用的术语“常规核苷酸”是指天然存在的脱氧核苷酸(dNTP)之一，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP和dITP。
本文使用的术语“非常规核苷酸”是指不是天然存在核苷酸的核苷酸。术语“天然存在的”是指无人类介入地存在于自然界中的核苷酸。相反，术语“非常规核苷酸”是指仅在人类介入下存在的核苷酸。“非常规核苷酸”可包括其中戊糖和/或一个或多个磷酸酯替换为各自类似物的核苷酸。示例性戊糖类似物为先前就核苷类似物所描述的类似物。示例性磷酸酯类似物包括但不限于烷基膦酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoroanilidate、磷酰胺(phosphoroamidate)、磷酸硼等，包括任何相关的平衡离子(如果存在的话)。非常规核苷酸可显示与另一人工核苷酸的碱基配对偏好性超过常规核苷酸(例如，如Ohtsuki等2001，Proc.Natl.Acad.Sci.，98：4922-4925所述，其因此通过参考并入本文)。可通过如Ohtsuki等(如上)所述的T7转录测定来测量碱基配对能力。另一些非限制性“人工核苷酸”实例可见于Lutz等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.，8：1149-1152；Voegel和Benner(1996)Helv.Chim.Acta 76，1863-1880；Horlacher等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.，92：6329-6333；Switzer等(1993)，Biochemistry 32：10489-10496；Tor和Dervan(1993)J.Am.Chem.Soc.115：4461-4467；Piccirilli等(1991)Biochemistry 30：10350-10356；Switzer等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：8322-8323，所有文献均通过参考并入本文。“非常规核苷酸”还可以是简并核苷酸或固有地发出荧光的核苷酸。
本文使用的术语“简并核苷酸”表示可以为dA、dG、dC和dT中任一种的核苷酸，或者可与dA、dG、dC和dT中至少两种进行碱基配对的核苷酸。与dA、dG、dC和dT中至少两种进行碱基配对的简并核苷酸的非限制性列表包括：肌苷、5-硝基吡咯(5-nitropyrole)、5-硝基吲哚、次黄嘌呤、6H，8H，4-二氢嘧啶并[4，5c][1，2]沙星-7-酮(P)、2-氨基-6-甲氧氨基嘌呤、dPTP和8-氧-dGTP。
提及引物时，本文使用的术语“相反方向”指一种引物包含与靶标多核苷酸模板的有义链互补的核苷酸序列，另一引物包含与同一靶标多核苷酸模板的反义链互补的核苷酸序列。相反方向的引物可由与其互补的匹配多核苷酸模板产生PCR扩增产物。相反方向的两种引物可叫作反向引物和正向引物。
本文使用的术语“相同方向”指引物包含与靶标多核苷酸模板的同一条链互补的核苷酸序列。相同方向的引物不会由与其互补的匹配多核苷酸模板产生PCR扩增产物。
本文使用的“多核苷酸”或“核酸”通常指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或者经修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”非限制地包括单链和双链多核苷酸。本文使用的术语“多核苷酸”包括多核苷酸的化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒及细胞(包括例如简单细胞和复杂细胞)特征性的DNA和RNA化学形式。用于本发明的多核苷酸可以是分离的或纯化的多核苷酸，或者它可以是在扩增反应中扩增的多核苷酸。
本文使用的术语“组”是指至少两成员的一个组。因此，寡核苷酸引物“组”包括至少两种寡核苷酸引物。一方面，寡核苷酸引物“组”是指足以从多种靶标病原体中的每个成员特异性扩增核酸扩增子的一组引物——通常，所述多种靶标病原体的每个成员需要一对寡核苷酸引物，(应注意，在某些方面，这些引物对还用于扩增一种或多种竞争剂或内标模板)。
本文使用的术语“对”是指两个(种)。因此，寡核苷酸引物“对”是两种寡核苷酸引物。当使用寡核苷酸引物“对”从双链模板(例如，基因组DNA或cDNA)产生延伸产物时，优选该寡核苷酸引物对与双链模板的不同链杂交，即它们具有相反的方向。
提及多核苷酸时，本文使用的“分离的”或“纯化的”是指天然存在的序列已从其正常细胞环境取出或者在非天然环境中合成(例如，人工合成)。因此，“分离的”或“纯化的”序列可以在无细胞溶液中或置于不同的细胞环境中。术语“纯化的”并不意味着所述序列是惟一存在的核苷酸，而是它基本上不含(纯度约90-95％，高至99-100％)与其天然相关的非核苷酸或非多核苷酸物质。
本文使用的术语“cDNA”是指通过RNA依赖性DNA聚合酶活性(例如，逆转录酶)的作用由RNA模板产生的互补或复制多核苷酸。
本文使用的“互补”是指多核苷酸单链(或其一部分)与反向平行的多核苷酸链(或其一部分)杂交、从而在互补链之间形成双链多核苷酸的能力，所述杂交通过反向平行多核苷酸单链中核苷酸之间连续的碱基配对(即，不被任何未配对核苷酸打断)来实现。如果第一多核苷酸中的每一个核苷酸均与第二多核苷酸的互补区内的核苷酸形成碱基配对，则称所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸链“完全互补”。如果第一多核苷酸中的一个核苷酸不与第二多核苷酸中对应的核苷酸碱基配对，则称所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸链不完全互补(即部分互补)。多核苷酸链之间的互补性程度对于多核苷酸链之间退火或杂交的效率和强度有显著影响。这在依赖于多核苷酸链之间结合的扩增反应中尤其重要。
如果引物中至少50％(优选60％，更优选70％、80％，更优选90％或更多)的核苷酸与靶标多核苷酸上的核苷酸形成碱基对，则该寡核苷酸引物与该靶标多核苷酸“互补”。
在扩增反应的情形中使用时，本文使用的术语“分析”是指对靶标多核苷酸进行定性的(即，存在与否、大小检测或同一性等)或定量的(即量)测定，这可以是基于标记所产生信号的大小(强度)或数目的可见的或自动化的评估。所述多核苷酸的“量”(例如，以μg、μmol或拷贝数衡量)可通过本领域公知的方法(例如，通过UV吸收或荧光强度，通过将凝胶上的条带强度与长度和量已知的参照进行比较)来测量，例如，如Basic Methods in Molecular Biology，(1986，Davis等，Elsevier，NY)和Current Protocols in Molecular Biology(1997，Ausubel等，John Weley&Sons，Inc.)所述。本发明中一种测量多核苷酸量的方式是测量该多核苷酸发射的荧光强度，并将其与参照多核苷酸(即已知量的多核苷酸)发射的荧光强度进行比较。
本文使用的“癌症治疗”是指目标为降低癌症的严重程度或至少部分消除癌症的任何治疗。或者，“癌症治疗”是指目标为降低或至少部分地消除癌症转移的任何治疗。再或者，癌症治疗是指目标为降低或至少部分地消除转移性结节生长(例如，在手术除去原发瘤之后)的任何治疗。换言之，癌症治疗是指目标为减缓、控制、降低对象中癌症的可能性或概率或者推迟癌症发病的任何治疗。
本文使用的术语“癌症”具有其在本领域中的含义，例如，不受控制的组织和/或细胞生长，其具有扩散至身体远端部位的潜力(即，转移)。示例性癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤、结肠癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、***癌、卵巢癌、黑色素瘤等。
本文使用的术语“移植物”是从一个个体移植到另一个体的身体部分、器官、组织、细胞或其部分。所述移植物可以是例如异种的、同种异体的、同基因遗传改造的或者遗传改造的自体移植物。
本文使用的术语“毛细管电泳”指来自扩增反应的等分试样中核酸分子的电泳分离，其中所述分离在毛细管中进行。可用的毛细管内径约10至300μm，并且长度可为约0.2cm～约3m，但优选0.5cm至20cm，更优选0.5cm至10cm。另外，“毛细管电泳”的定义特别地包括使用微观流体的微毛细管(例如可从Caliper或Agilent Technologies获得)。
本文使用的“免疫抑制药物”是指降低免疫***启动针对病原体的有效应答之能力的药剂。例如在以合适剂量施用时导致胸腺或***的T细胞失活的药物。这样的药剂非限制性实例为皮质类固醇、环孢菌素、FK-506和雷帕霉素。
本文使用的术语“无症状的”是指不显示被给定病原体或给定的病原体组合感染的特征性身体症状的个体。
本文使用的“多种”或“组”是指多于两种，例如3种或更多、4种或更多、5种或更多、6种或更多、7种或更多、8种或更多、9种或更多、10种或更多等。
附图说明
图1显示本文所述方法中包括的代表性病毒Genbank登记号的表。
图2是同时检测6种病毒病原体的电泳图的代表性实例。对应于所标出的病毒CMV(巨细胞病毒)、BK(BK病毒，人多瘤病毒)、JC(JC病毒，人多瘤病毒)、HHV6(人疱疹病毒6)、HHV7(人疱疹病毒7)和EBV(EB病毒)的扩增DNA片段(即扩增子)在36cm毛细管阵列上使用ABI 3730遗传分析仪***进行分离。
图3是检测与图2相同的6种病毒病原体的扩增曲线的代表性实例。将标明拷贝数的每种病毒引入含有荧光标记引物的反应混合物中，从而进行实时分析。在所标明的循环结束时取出一部分扩增混合物，并通过毛细管电泳进行分离。以对数标度将相对荧光单位(峰面积的对数)对循环数作图。
图4是一系列校准曲线的代表性实例，其显示检测给定拷贝数的每种病毒靶标的循环阈值(Ct)。阈值循环数定义为对应于通过Gene Mapper数据分析软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)计算为35000荧光单位的循环数。
图5是所列靶标的靶标特异性寡核苷酸表。
发明详述
由于基因组学的出现，微生物(包括病原体)现在可以基于微生物特异性基因或转录物的存在进行鉴定。转录和蛋白质水平的表达模式均已引起对致病性和潜在诊断工具的其他构想。
本文所述方法涉及用于诊断和定量多种类型病原体感染的精确、灵敏并且同时进行的方法，其中使用特异性针对每种待测病原体的寡核苷酸组作为引物，从而扩增临床样品中试图检测的每种特定病原体的病原体转录物或基因组的特定区域。所述病原体选自病毒、细菌、原生动物和真菌。或者，所述病原体选自病毒、细菌和原生动物。或者，所述病原体选自病毒和细菌。
本文所述方法涉及用于诊断和定量多种类型病毒感染的精确、灵敏并且同时进行的方法，其中使用特异性针对每种待测病毒的寡核苷酸组作为引物，从而扩增临床样品中试图检测的每种特定病毒的病毒转录物或基因组的特定区域。
本文所述的方法可用于检测来自任何个体的样品中的病原体。然而，因为免疫功能下降导致免疫受损状态，所述免疫受损状态可使宿主易患来源于病原体(包括病毒病原体)的严重的和危及生命的疾病，所以对处于或怀疑处于免疫受损状态的个体监测可能对该个体的健康有害的病原体(包括病毒病原体)是有益的。对来自患者(特别是免疫抑制患者)样品中病原体(病毒病原体)的早期检测为先行治疗提供了机会，所述治疗包括例如改变向患者施用的任何免疫抑制剂的剂量。
通常，在以下群体中进行针对导致感染性疾病的病原体的诊断性检测：显示一种或多种病原性感染的特征性症状的患者，或者与患有一种或多种病原性感染的个体有接触的人，或者由于其他原因而怀疑已发生由一种或多种病原体引起的感染性疾病的人。
对免疫受损的患者(特别是在移植物或组织的移植后接受免疫抑制治疗的患者或者接受导致免疫***严重抑制的治疗(例如癌症化疗治疗)的患者)的处置向传统的诊断模式提出了挑战。首先，与免疫活性个体相比，在免疫缺陷患者中感染性疾病特征性的临床症状的发生被推迟，并一般伴随着感染性疾病的较晚期阶段和更高的病原体效价。这种效应使抗感染治疗复杂化，并可导致患者的结局较差。其次，免疫抑制治疗常常导致先前被健康免疫***有效控制的潜伏性感染再次活跃。在这些情况下，简单地检测病原体存在是不够的，相反，定量监测病原体效价及其变化对于患者和医生将更有价值。另外，在感染发作时或其早期阶段检测疾病发展可有助于尽早施用有效的治疗，从而增加成功的机会。同样，在对移植患者进行免疫抑制治疗的具体实例中，监测感染性疾病的发展可用于调整免疫抑制药物的方案，从而帮助免疫***对抗病原体，而同时平衡移植排斥的可能性。
虽然定量监测无症状个体中的病原体通常是不实际的，然而对于接受免疫抑制治疗的患者来说却可能是非常有益的。特别地，对移植后患者监测病原体感染可改善移植后存活，并使移植排斥最小化。如果不是作为针对每种特定目的感染的单个测试，而是作为对来自患者的单个样品进行的平行测定组，或者优选地作为对免疫受损患者显示最高风险的病原体的多元测定组，那么定量监测患者中的病原体是特别实用的。所述被监测的病原体可基于许多因素进行选择，所述因素包括但不限于患者中免疫抑制的原因、个体所接触的环境因素和个体表现出的症状。这些考虑因素是本领域技术人员所熟知的。
这样的多元测定可使用分子诊断方法来开发，特别是使用对病原体特异性核酸进行PCR扩增的方法。
使用PCR来检测和/或定量测定样品中病毒的方法包括如Kimura H，等Quantitative analysis of Epstein-Barr virus load by using a real-timePCR assay.J.Clin Microbiol.37：132，1999；Martell M，等High-throughput real-time reverse transcription-PCR quantitation ofhepatitis C virus RNA J Clin Microbiol.February 1999；37(2)：327-32；Mercier B，等Simultaneous screening for HBV DNA and HCV RNAgenomes in blood donations using a novel TaqMan PCR assay.J VirolMethods.January 1999；77(1)：1-9。
PCR方法可包括外源对照，如使用在提取步骤、逆转录步骤或PCR步骤中加入的人工引入的已知浓度核酸分子。加入已知浓度的外源核酸作为定量内标的概念由Chelly等(1988)Nature 333：858-860(其通过参考并入本文中)引入。在PCR中使用外源核酸作为内标描述于以下文献中，例如WO 93/02215；WO 92/11273.；美国专利号5,213,961和5,219,727，所有文献均通过参考并入本文中。已证明类似的策略在使用等温扩增反应定量测量核酸中有效，所述等温扩增反应如NASBA(Kievits等，1991，J.Virol.Methods 35：273-86)或者SDA(Walker，1994，Nucleic Acids Res.22：2670-7)。
毛细管电泳已用于定量检测基因表达。Rajevic等(2001，Pflugers Arch.442(6 Suppl 1)：R190-2)公开了用于检测癌基因差异表达的方法，其通过使用7对引物同时检测多种癌基因表达的差异来实现。用荧光染料标记有义引物的5’端。多元荧光RT-PCR的结果通过毛细管电泳利用ABI-PRISM310遗传分析仪进行分析。Borson等(1998，Biotechniques 25：130-7)描述了用于定量低丰度mRNA转录物的策略，其基于将定量竞争性逆转录PCR(QC-RT-PCR)与毛细管电泳(CE)联用，用于快速分离和检测产物。George等(1997，J Chromatogr B Biomed Sci Appl 695：93-102)描述了将毛细管电泳***(ABI 310)用于鉴定荧光差异显示生成的EST模式。Odin等(1999，J Chromatogr B Biomed Sci Appl 734：47-53)描述了具有多色检测的自动化毛细管凝胶电泳，用于分离和定量PCR扩增的cDNA。
除了基于核酸的检测以外，还可使用病毒、细菌和/或原生动物特异性标志物实现病毒、细菌和/或原生动物的多元检测。这些标志物包括特异性针对每种待检测病毒、细菌和/或原生动物的蛋白质、碳水化合物或脂质。尽管所述方法对于检测病原体存在是有用的，但是它们对于多元测定(例如本文所教导的方法)来说不够灵敏，并且常常由于它们通常不如本发明的方法灵敏而需要更多的样品。多种方法可用于检测一种或多种生物标志物，包括使用特异性结合所述生物标志物的一种或多种抗体的方法。提及抗体或其他结合部分时，短语“特异性结合”是指靶标标志物的存在(即使是所述靶标标志物存在于蛋白质和其它生物材料的异质群中时)所决定的结合反应。因此，在指定的测定条件下，特异性结合部分优先与特定的靶标标志物结合，并且不大量结合测试样品中存在的其它组分。
多种免疫测定形式可用于选择与特定病原体发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规地将固相ELISA免疫测定用于选择与分析物发生特异性免疫反应的单克隆抗体。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York，其描述了可用于测定特定免疫反应的免疫测定形式和条件。通常，对特定靶标具有特异性的抗体将结合数量至少为背景两倍的靶标，更通常超过背景的10至100倍。
可针对任意数目的病原体特异性生物分子来产生抗体，所述生物分子包括蛋白质、碳水化合物或脂质。优选地，所述标志物分子在病原体增殖期间产生，并位于病原体颗粒表面上或被病原体感染的细胞表面上。另外，标记可从病原体或被病原体感染的细胞中分泌出来，或者可在病原体或被病原体感染的细胞裂解期间释放至溶液中。
一种CMV病毒特异性的病毒标记是pp65基质蛋白。特异性结合pp65基质蛋白的抗体可在基于抗体的方法中用于定量检测活跃复制的CMV，所述方法包括但不限于使用外周血白细胞的免疫荧光测定或酶联免疫测定(如ELISA)(Clin Diagn Virol.1996 May 5(2-3)：81-90 Grandien M.)。
可使用特异性结合主要衣壳蛋白VP1的抗体来检测人多瘤JC病毒(JVirol Methods.1996 May；59(1-2)：177-87；Chang D，Liou ZM，Ou WC，Wang KZ，Wang M，Fung CY，Tsai RT.)。
可通过使用特异性结合基质蛋白G的抗体的免疫测定来测量人单纯疱疹病毒。而且，可通过特异性结合G蛋白两种变体(gG1和gG2)之一的抗体来区分HSV的两种主要类型(HSV1和HSV2)，(J Virol Methods.1999 Dec；83(1-2)：75-82.Coyle PV，Desai A，Wyatt D，McCaughey C，O’Neill HJ.)。
可使用特异性结合脂多糖(LPS)(细菌膜外部的主要组分)的抗体来检测病原性革兰氏阴性菌(J Immunol Methods.2005Mar；298(1-2)：73-81.Thirumalapura NR，Morton RJ，Ramachandran A，Malayer JR.)。
可使用特异性结合60kDa蛋白质(统称为p60)的抗体来检测单核细胞增生利斯特氏菌(Lysteria monocytogenes)，p60由iap(侵袭相关蛋白)基因编码并由单核细胞增生利斯特氏菌大量分泌至培养基中(ClinDiagn Lab Immunol.2004 May；11(3)：446-51.Yu KY，Noh Y，Chung M，Park HJ，Lee N，Youn M，Jung BY，Youn BS.)。
可以用特异性结合脂***甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)(分枝杆菌的细胞壁外部主要的特异性糖脂组分)的抗体来测量结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(J Microbiol Methods.2001 May；45(1)：41-52.Hamasur B，Bruchfeld J，Haile M，Pawlowski A，Bjorvatn B，Kallenius G，Svenson SB.)。
可通过多种不同的测定平台来进行使用免疫测定的多元检测，所述测定平台检测用荧光染料标记的抗体或者与能产生可测量信号(有色染料、荧光或发光染料)的酶化学连接的抗体。这样的测定平台的实例包括病原体感染细胞的免疫荧光或免疫酶染色(Immunocytochemical Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology)，Lorette C.Javois(Editor)，Humana Press，1999)、酶联免疫测定(ELISA)(The ELISA Guidebook(Methods in Molecular Biology)，J.R.Crowther(Editor)，Humana Press，2000)、由Luminex Inc商品化的有色小珠(如美国专利6,524,793所述)、多元ELISA微阵列(例如由Endogen(Fisher Scientific Co的一个分支)商品化的Search Light平台)。
发生的机会性感染(细菌的、病毒的、真菌的或原生动物/寄生生物的)的确切类型取决于免疫学改变的类型和程度(其为细胞的、体液的、吞噬细胞的还是联合的缺陷)；还取决于存在于内部和外部环境中的生物。向移植受者施用皮质类固醇和其他免疫毒性药物可导致大量抑制宿主防御的所有阶段，包括皮肤和粘膜屏障的破坏。
肠道需氧型微生物(主要为细菌和念珠菌)是导致肝移植受者中发生感染的潜在原因，所述感染发生在移植后的第一和第二个月。通常的部位为腹部、血流、肺和手术伤口。
肠道营养常常是在移植后时期向虚弱的患者提供充足养分所必需的，并且这对于避免真菌性脓毒症来说可能优于肠外营养。然而，肠配方也是极好的微生物培养基并容易被污染，并可导致胃肠炎和脓毒症。经常污染肠配方的生物包括阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、链球菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙雷氏菌属物种(Serratia spp.)、柠檬酸杆菌属物种(Citrobacter spp.)和芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)。
有几种病原体可能对处于免疫受损状态的个体是危险的，其包括但不限于细菌，所述细菌包括但不限于B组链球菌、大肠杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neiserriameningitidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)或脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)、单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)、铜绿假单胞菌、脑膜炎球菌性脑膜炎(meningococcal meningitis)、肺炎球菌性肺炎(pneumococcal pneumonia)、诺卡氏菌属物种(Nocardia spp.)、军团菌属物种(Legionella spp.)、革兰氏阴性芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、土拉热弗朗西丝氏菌(francisella tularensis)、大肠杆菌、弧菌属物种(vibrio spp.)、志贺氏菌属物种(Shigella spp.)、单核细胞增生利斯特氏菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、沙门氏菌、单核细胞增生利斯特氏菌、肠侵袭性大肠杆菌和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，并包括但不限于原生动物包括微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、人环孢子虫(Cyclospora cayetanensis)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴(Enamoebahistolytica)、人刚地弓形虫(toxoplasma gondii)和微孢子虫(Microsporidia)。
有几种病毒可能对处于免疫受损状态的个体是危险的，所述病毒包括但不限于HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。
在免疫受损患者中感染有害病原体(包括病毒病原体)的威胁需要监测外周血的病毒水平以及其它病原体的水平。可使用特异性针对每种被监测病毒的个体血清学技术来检测病原体。然而，个体血清测试是昂贵并且低效的。核酸扩增方法(如PCR)可能允许在疾病发展的早期阶段进行病原体检测，而不用等待产生免疫应答(如果事实上产生任何免疫应答的话)。由于PCR相关方法的灵敏度以及PCR检测样品中病原体基因组存在情况的能力，样品中病原体的存在和数量均可在早期阶段使用PCR技术与血清学技术相比更灵敏地测定。
一方面，本发明涉及用于在单个测定中检测来自免疫受损个体的生物样品中多种病原体之任意种的存在情况的方法。所述多种病原体包括病毒、细菌、原生动物、真菌及其任意组合。所述方法包括以下4个步骤。
第一步包括对多种病原体中的每种病原体选择寡核苷酸引物对，所述引物对在一组扩增条件下介导从制备或分离自目的病原体的核酸中扩增长度已知并选定的多核苷酸扩增子。
将来自目的病原体的扩增子的长度设计成不同于任何其它扩增子的长度，所述其它扩增子来自制备或分离自患者样品中所分析多种病原体中其余每个成员的每种病原体核酸靶标。为多种病原体的每个成员选择一对引物建立了用于同时扩增一组扩增子的寡核苷酸引物组，每种扩增子对应于多种病原体中的一种病原体。
第二步包括在允许多核苷酸扩增的条件下将来自生物样品的核酸或通过如逆转录的方法制备或分离自生物样品的核酸与所述寡核苷酸引物组接触。当所述多种病原体的一个或多个成员存在于生物样品中时，通过扩增反应产生了指示每个存在成员的存在情况的已知长度扩增子。
第三步包括通过大小来分离扩增的核酸分子。第四步包括检测分离的核酸。在实践中，可以将分离和检测步骤联用，例如，通过例如毛细管电泳分离标记核酸，并通过如毛细管尾部或其附近的荧光进行检测。对所分离扩增子的检测是基于每种扩增子的已知长度。将每种扩增子的长度设计成明显不同于来自其它靶标核酸的其余扩增子的长度。因此，每种所检测扩增子的大小使得能够测定多种目的病原体中的哪种(如果有的话)存在于生物样品中。
该方法的变化包括但不限于，在扩增期间的一个或多个间隔时从扩增反应物中取样(例如从反应混合物取出等分试样)。这可以允许得到可精确测定每种病原体模板原始量的扩增谱。
该方法的另一些变化包括在扩增步骤前对从生物样品中纯化的核酸分子进行逆转录。这可以允许检测例如RNA病毒的病毒基因组，或者检测病毒转录物以及来自其它类型病原体的转录物的存在。
另外，本方法能够在单个测定中检测生物样品中至少两种病原体的存在，或者检测生物样品中至少3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、或14种、或15种或者至少多达16种的不同病原体的存在。在一个实施方案中，所述病原体的检测来自扩增多种病原体来源的靶标分子的单个扩增反应。
在另一实施方案中，待检测的病毒病原体选自：HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。另外，本方法能够同时检测制备或分离自生物样品的核酸样品中至少两种病毒特异性靶标分子的存在，或者检测制备或分离自生物样品的测试核酸中至少3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、或14种、或15种或者至少多达16种病毒特异性靶标分子，并且可包括检测选自以下的至少两种或者至少3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、或14种、或15种或者至少多达16种不同特异性病毒靶标的存在：HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。
本文所述方法的另一方面是样品可得自已施用治疗过程的个体，所述治疗过程导致个体免疫受损。这些治疗包括但不限于对移植患者和癌症患者开出的免疫抑制治疗。本文所述的方法可用于监测免疫抑制治疗或导致免疫抑制的治疗的过程。
本文所述的方法还可包括定量样品中待测定的多种病原体中每一种病原体的步骤。一方面，通过在测试核酸样品中加入至少两种核酸竞争剂分子来增强定量，所述核酸竞争剂分子会与制备或分离自病原体的病原体特异性靶标核酸使用相同的引物以相似的效率扩增。加入测试核酸样品中的每组竞争剂靶标的浓度是已知的，并可以彼此相差至少一个数量级。所述竞争剂核酸可包含RNA和/或DNA。
本文所述方法提供了用于在来自免疫受损患者的样品中检测和定量多种目的病原体的方法，所述方法包括对每种给定病原体选择对该病原体具有特异性的病原体特异性靶标多核苷酸。在此方法中，对每种给定的病原体特异性靶标多核苷酸选择一对寡核苷酸扩增引物，从而该引物对将产生对给定病原体特异性靶标多核苷酸的至少一部分具有特异性并由其产生的已知长度扩增子，其中所述扩增子的长度不同于产生自任何其它选定病原体特异性靶标多核苷酸或产生自竞争剂多核苷酸的扩增子的长度。
此方法还包括合成一种或多种竞争剂多核苷酸，从而当使用前面段落所述的寡核苷酸扩增引物对时，每种竞争剂多核苷酸将产生已知长度的扩增子，其中所述扩增子的长度不同于产生自任何病原体特异性靶标多核苷酸或任何其它竞争剂多核苷酸的扩增子的长度。
此方法还包括从患者样品中纯化多核苷酸，所述多核苷酸为RNA、DNA或二者均有。对于RNA的情况，使用逆转录酶形成cDNA。
此方法还包括向纯化和/或制备自个体样品的多核苷酸中添加预定量的所述一种或多种竞争剂多核苷酸，从而形成多核苷酸测试混合物。每一种竞争剂多核苷酸以彼此不同(例如一个对数的级别)的已知浓度添加。然后，在允许从每种病原体特异性靶标多核苷酸以及竞争剂核苷酸产生扩增子的条件下，使用第一和第二寡核苷酸扩增引物对，在单个多元测定中扩增存在于多核苷酸测试混合物中的每种靶标多核苷酸，每对引物特异性针对每种测定病原体。
该方法还包括分离前面段落中所述PCR反应中产生的扩增子，并检测这些扩增子的每一种。所产生扩增子的长度可用于鉴定扩增子来自哪些靶标多核苷酸，并因此能够鉴定从样品检测到哪些病原体。
此方法还可包括定量前面段落中所鉴定的每种病原体特异性靶标多核苷酸，其通过将产生自每种病原体特异性靶标多核苷酸的扩增子量与产生自一种或多种各自的竞争剂多核苷酸扩增子量进行比较来实现，因为在即将进行扩增前，每种竞争剂多核苷酸以预定量存在于测试多核苷酸测试混合物中。每种病原体特异性靶标多核苷酸的数量对应于个体样品中存在的各个目的病原体的量。
可利用毛细管电泳(CE)分离扩增子，并且一种或多种寡核苷酸扩增引物可以与可检测标记连接。所述可检测标记可包括但不限于：荧光标记、放射性标记、比色标记、磁性标记和酶标记。从扩增测定中检测到的每种扩增子的量可通过测量标记信号(例如通过测量荧光)来测定。
在每种病原体特异性靶标多核苷酸包括RNA的情形中，提供了在扩增前进行逆转录病原体特异性靶标多核苷酸和竞争剂RNA多核苷酸的步骤。因此，在对RNA和DNA均独立进行纯化的方法中，在独立的扩增反应中分析纯化的RNA和纯化的DNA。或者，只要至少一种靶标为RNA病毒或者试图检测病毒转录物或病原体转录物时，就可使用逆转录步骤。可通过PCR或使用转录介导的扩增(如TMA和NASBA)来产生扩增子。
实时PCR可用于本文所述的方法中。已应用“实时”定量PCR分析来测定病毒DNA水平(Niesters H等Development of a real-timequantitative assay for detection of Epstein-Barr virus.J Clin Microbiol.February 2000；38(2)：712-5)。动态PCR是用于测定初始的模板拷贝数的方法。在该方法中，PCR反应中的定量信息来自DNA量从刚刚超过背景对数生长至平台的几个循环。通常，40个循环中只有6至8个循环会落在曲线的对数线性部分。
在本文所述的方法中，所述病原体可以是病毒，包括但不限于HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。
在本文所述的方法中，所述病原体可以是细菌，包括但不限于B组链球菌、大肠杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎链球菌、流感嗜血菌、肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟氏球菌、单核细胞增生利斯特氏菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎球菌性脑膜炎、肺炎球菌性肺炎、诺卡氏菌属物种、军团菌属物种、革兰氏阴性芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、肉毒杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌、大肠杆菌、弧菌属物种、志贺氏菌属物种、单核细胞增生利斯特氏菌、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、单核细胞增生利斯特氏菌、肠侵袭性大肠杆菌和结核分枝杆菌。
一方面，在允许进行多元检测的单个测定中包括特异性针对两种或更多(例如多达15种或更多)不同病毒的引物。
病毒靶标
本文所述的方法可有效鉴定多种病毒中任一种的存在和/或量。与临床特别相关尤其是与免疫受损患者相关的病毒描述如下。
HSV-1和HSV-2
如美国专利5,558,863所述，已知超过50种疱疹病毒感染超过30个不同的物种。A.J.Nahmias和B.Roizman，New Engl.J.Med.289，pp.667-674(1973)。单纯疱疹病毒1(HSV-1)和单纯疱疹病毒-2(HSV-2)是最具临床意义的天然存在的单纯疱疹病毒(HSV)的变体。人类是该病毒的唯一贮主。HSV首先在1920年被分离出来。B.Lipschutz，Arch.Derm.Syph.(Berl)136，428-482页(1921)。在1961年区分出两种血清型。通常，HSV-1感染非生殖器部位，而HSV-2感染生殖器部位。然而，有可能在生殖器疱疹病例中分离出HSV-1。传染是直接的。感染后通常发生口腔、眼、皮肤或生殖道中的局部溃疡或损伤。传播可在新生儿和免疫抑制者中引起脑炎。该病毒可维持潜伏(推测可维持数年)，直至压力、环境因素、其它药物、食品添加剂或食品触发其复发(参见A.J.Nahmias和B.Roizman，New Engl.J.Med.13，667-674页(1973)；W.E.Rawls，E.H.Lennette(eds.)，Laboratory Diagnosis of Viral Infections，Marcel Dekker，Inc.，New York，313-328页(1985))。
EBV
EB病毒(EBV)是来自疱疹病毒组的另一种病原体。发现于20世纪60年代，它是传染性单核细胞增多症的主要病原体，并与伯基特淋巴瘤和鼻咽癌恶性病有关(参见W.Henle和G.Henle，M.A.Epstein和B.G.Achong(编辑)，The Epstein-Barr Virus，Springer-Verlag，Berlin，297页(1979))。传染性单核细胞增多症的特征为***病、发热和咽炎。如同HSV变体一样，EB病毒可建立潜伏性感染，当宿主被免疫抑制时其可被再次激活(参见E.T.Lennette，E.H.Lennette(编辑)，Laboratory Diagnosisof Viral Infection，Marcel Dekker，Inc.，New York，257-271页(1985))。同样，在重度免疫受损患者中EBV还可导致急性和迅速发展的B淋巴增生性疾病。
移植患者都具有发生EBV感染的风险，因此有发生移植后淋巴增生性疾病(post transplant lymphoproliferative disorder，PTLD)的风险。然而，发生该并发症风险最高的人群是肝移植人群。这是因为这些患者通常非常年轻(常小于5岁)，因此他们通常未接触过EBV，所以不具有对该病毒的天然免疫。
VZV
水痘带状疱疹病毒(VZV)也是疱疹病毒，并且是水痘(禽痘)和带状疱疹二者的病原体。水痘主要发生在儿童中，而更具局限性的带状疱疹发生在老年人和免疫受损者中。实际上，带状疱疹是由于潜伏VZ感染的再次激活所致。患者遭受疼痛的、泡状皮肤损伤(参见A.Gershon，E.H.Lennette(编辑)，Laboratory Diagnosis of Viral Infections，Marcel Dekker，Inc.，New York，329-340页(1985))。当前，镇痛剂提供带状疱疹的惟一治疗(参见R.Boyd，等，Basic Medical Microbiology，第二版，Little，Brownand Company，Boston，527页，(1981))。
CMV
巨细胞病毒(CMV)也是人疱疹病毒家族的成员，其感染全世界范围所有个体的50-100％，如美国专利6,936,251所述。
CMV通过唾液、尿或母乳天然传播，但也可以从其它机体分泌物中回收。另外，CMV可通过生育或***期间的生殖泌尿接触、通过输血(特别是白细胞)以及骨髓或器官移植经胎盘向胎儿传播。
在初次感染后，CMV以动态潜伏状态在宿主一生中维持在身体内，受宿主免疫***的良好控制，并可定期从不同的部位和身体分泌物中回收。尽管通常是良性的，在免疫缺陷个体中CMV感染可以是破坏性的和致命的，所述免疫缺陷个体如移植受者、AIDS患者、患有遗传决定的免疫缺陷的患者以及具有不成熟免疫***的新生儿。
HHV6
人疱疹病毒-6(HHV6)病毒也是人疱疹病毒家族的成员，并包含双链DNA。HHV6毒株已分离自患有AIDS或患有淋巴增生性疾病的患者的淋巴细胞。这些病毒还被认为是幼儿急疹的病原体，如美国专利5,545,520所述。
HHV6是首先由Salahuddin和同事在1986年描述的β疱疹病毒，其在约百分之九十的人群中以潜伏状态存在。然而在活跃感染期中，该病毒与多种临床疾病有关。如美国专利5,756,302所述，HHV-6是儿童中幼儿急疹和幼儿玫瑰疹的临床病原体，并且与初次感染HHV-6的婴儿中临床显著的骨髓抑制普遍相关。在成人中，HHV-6与多种在有风险的免疫受损或免疫抑制人群中可能致命的临床疾病的成因有关。值得注意的是，HHV-6在患有肺炎和脑炎的患者中以及在同种异体骨髓移植(allogeneicbone marrow tranplant，AlBMT)或实体器官移植后的免疫抑制患者中很突出。在AlBMT患者中，HHV-6相关骨髓抑制(HHV-6 associated bonemarrow suppression，HBMS)与骨髓的直接病毒感染相关。HHV-6持续感染骨髓可引起慢性骨髓抑制。
HHV-7
如美国专利公布20040091852所述，人疱疹病毒7(HHV-7)是发现于1990年的β-疱疹病毒。HHV-7在一般人群中广泛传播，在年轻时产生原发阶段感染，并且像其它疱疹病毒一样，以潜伏形式在受感染生物中无限期维持。HHV-7在遗传上接近巨细胞病毒(CMV)和人疱疹病毒6(HHV-6)，CMV和HHV-6(尤其是CMV)是重要的病原性病毒。HHV-7在人类疾病中的作用仍在探索中。人们认为在免疫抑制期间它的致病能力加强，并导致严重的机会性感染，像其它疱疹病毒那样。特别地，这可能是器官移植后的情况。
HHV-8
基于序列同源性，HHV-8属于γ疱疹病毒亚家族，并且与EBV和松鼠猴疱疹病毒(Herpes virus saimiri)密切相关，如美国专利公布20030013077所述。HHV-8基因组的大小为140kb，侧翼为长度约为800bp的若干重复序列(Russo等，1996)。HHV-8编码约80种蛋白质，其中10种表现出与细胞基因产物的同源性(Neipel等，1997)。类似于所有其它的疱疹病毒，HHV-8能够导致裂解性感染，然后变为潜伏性感染。在潜伏期，表达至少两种病毒转录物：编码v-细胞周期蛋白、v-flip和LANA蛋白的差异剪接mRNA，以及T0.7(长度为0.7kb的短RNA，功能迄今未知)(Zhong等，1996)。病毒转录物T0.7是潜伏期表达最多的RNA，并具有对应于60、35和47个氨基酸的3个开放读码框。
已在所有形式的卡波西肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤(primary effusionlymphoma，PEL)、卡斯尔曼病、血管肉瘤、接受移植的患者的皮肤损伤、浆细胞瘤、结节病中以及健康的对照个体中检测到了人疱疹病毒8(Chang等，1994；Boshoff和Weiss，1997)。
丙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒(HCV)是90％的所有非甲型、非乙型肝炎病例中的主要病原体(Dymock，B.W.Emerging Drugs 6：13-42(2001))。HCV感染的发生率已经成为越来越严重的公共卫生问题，全世界范围有2-15％个体受到感染。尽管HCV的初次感染通常是无症状的，但多数HCV感染发展至可持续几十年的慢性状态。在具有慢性HCV感染的人中，相信约20-50％最后将发展为慢性肝病(例如肝硬化)，并且这些病例的20-30％将导致肝衰竭或肝癌。
HCV是已良好表征的正(+)链RNA病毒，长度约为9.6kb，并且具有编码约3000个氨基酸的多蛋白的单个长开放读码框(ORF)(Lohman等，Science 285：110-113(1999)，明确地通过参考整体并入本文)，如美国专利公布20040121975所述。该ORF的侧翼为5’末端的用作内部核糖体进入位点(IRES)的非翻译区以及3’末端的基因组复制必需的高度保守序列(Lohman，如上引用)。结构蛋白在多蛋白的N端区域中，非结构蛋白(nonstructral protein，NS)在其余的2至5B中。
乙型肝炎病毒
乙型肝炎病毒(HBV)是致密的包膜DNA病毒，属于肝DNA病毒家族。该病毒是全世界范围内慢性肝病和肝细胞癌的主要起因(Hoomagle(1990)N.Eng.J.Med.323：337-339)。HBV与急性和慢性肝炎以及肝细胞癌有关，并还可能是获得性免疫缺陷综合征发展中的辅因子(Dienstag等in Harrison’s Principles of Internal Medicine，第十三版(Isselbacher等编辑)McGraw-Hill，NY，N.Y.(1993)1458-1483页)。
HBV是致密的包膜DNA病毒，属于肝DNA病毒家族。它具有环状的部分单链部分双链的3.2kb基因组，其包括4个重叠基因：(1)pre-S和S基因，其编码多种包膜或表面抗原(HBsAg)；(2)preC和C基因，其编码抗原HBcAg和HBeAg；(3)P基因，其编码病毒聚合酶；以及(4)X基因，其编码反式激活蛋白HBx。已获得许多肝DNA病毒的全长克隆以及它们的核苷酸序列(参见，例如Raney等Molecular Biology of theHepatitis B Virus(McLachlan编辑)CRC Press，Boston，Mass.，(1991)1-38页)。复制在肝细胞中发生，并包括HBV基因组的单链区转变成双链环状DNA，得到共价闭合的环状DNA(covalently closed circular DNA，CCCDNA)。该DNA通过宿主RNA聚合酶的转录产生正链极性的RNA模板(前基因组RNA)，其作为模板用于翻译病毒蛋白质，并且还包装到病毒核心中。在所述病毒核心中，RNA作为模板用于逆转录，产生DNA负链。然后，病毒聚合酶使用病毒RNA寡聚体作为引物从而产生DNA正链。病毒核心中新合成的双链DNA与病毒的包膜蛋白装配在一起，产生新的感染性病毒颗粒。
AAV
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，一种依赖腺病毒或疱疹病毒进行完整“溶胞”感染的细小病毒(Buller等，J.Virol.40：241-47(1981))。如美国专利6593123所述，AAV需要与无关的辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒)共感染来发生生产性感染。不存在辅助病毒时，AAV通过使其基因组进入宿主细胞染色体来建立潜伏状态。辅助病毒的后续感染使已整合的病毒基因组复苏，然后其能够复制从而产生感染性的病毒后代。有关AAV的综述，参见例如Berns和Bohenzky(1987)Advances in Virus Research(Academic Press，Inc.)32：243-307。
AAV基因组由线性单链DNA分子组成，其包含4681个碱基(Berns和Bohenzky，如上引用)。该基因组在每个末端包含反向末端重复(inverted terminal repeat，ITR)，其以顺式发挥DNA复制起点和病毒包装信号的功能。ITR的长度约为145bp。基因组的内部非重复部分包括两个大的开放读码框，分别称为AAV的rep和cap区域。这些区域编码提供AAV辅助蛋白功能的病毒蛋白，即参与病毒体的复制和包装的蛋白质。具体地，从AAV rep区域合成至少由4种病毒蛋白质组成的家族——Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40，根据其表观分子量命名。AAV cap区域编码至少3种蛋白质——VP1、VP2和VP3。有关AAV基因组的详细描述，参见例如Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol，and Immunol.158：97-129。
EEEV
东方马脑脊髓炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus，EEEV)是披膜病毒科甲病毒属的成员，该科由可见于全世界大部地区的蚊媒RNA病毒组成。该病毒通常通过多种蚊的摄食活动而在啮齿动物或鸟类宿主之间循环。EEE首先于1933年在弗吉尼亚和新泽西分离出来(Ten Broeck，C.等[1935]J.Exp.Med.62：677)。
WNE
西尼罗病毒(WNE)是黄病毒科黄病毒属的成员，属于日本脑炎病毒抗原性复合体，如美国专利公布20040197769所述。该血清复合体包括JEV、SLEV、Alfuy、Koutango、Kunjin、Cacipacore、Yaounde和墨累山谷脑炎病毒。WNE感染通常具有轻微的症状，然而在老年人和免疫受损的患者中感染可能是致命的。轻微WNE感染的典型症状包括发热、头痛、身体疼痛、疹和淋巴腺肿胀。脑炎的重度疾病通常发现在老年患者中(D.S.Asnis等，如上引用)。大多数情况下，对黄病毒感染的患者采用对症疗法，即治疗黄病毒感染的一般性症状，因此对于初步治疗来说，仅了解该感染是黄病毒感染可能就已足够。然而，在某些其它病例中，对特定的黄病毒(尤其是WNE)进行快速和精确的诊断是很重要的，从而可开始进行正确的治疗。
JCV
JC病毒(JCV)属于人多瘤病毒组。JCV可通过对形成髓鞘质的少突胶质细胞的裂解性感染和对星形细胞的顿挫型感染而导致亚急性脱髓鞘性脑病，如美国专利6,238,859所述。这种感染(在临床上称作“进行性多灶性脑白质营养不良(progressive multifocal leukoencephalopathy，PML)”)导致在大脑、小脑和脑干中形成脱髓鞘病灶，并通常在几个月内导致死亡。尽管JCV似乎存在于约80％的成年人群中，但是PML通常仅与免疫***的削弱相关发生。越来越多地使用免疫抑制性药物以及日益增多的HIV感染患者数已导致近年来PML疾病的大幅增加。根据目前的估计，PML发生在约2-5％的AIDS患者中。
BKV
BK病毒(BKV)是人多瘤病毒，最初从免疫受损患者的尿液分离出来，如美国专利6,605,602所述。其后，已分离出许多BKV变体(亚型)。BKV在多数10岁以下的一般人群中导致亚临床(无症状)感染。感染后，该病毒通常在肾脏中保持潜伏。然而，该病毒可由于免疫抑制而在之后的时间点(例如在肾移植后)再次激活。
BKV包含双链DNA(dsDNA)基因组。BKV的完整DNA序列约为5,100个碱基对，然而这在BKV变体之间不尽相同。例如，BKV的Dunlop毒株包含5,153个碱基对(参见例如Self等(1979)，Cell 18：963-77)。BKV基因组包含编码区和非编码控制区，但在功能上分为3个区域。编码区可进一步分为早期区和晚期区。早期区包含两种非结构蛋白(T-抗原蛋白和t-抗原蛋白)的编码序列。晚期区包含编码4种结构蛋白(VP-1、VP-2和VP-3)的序列。非编码控制区包含用于早期和晚期基因表达的转录控制元件，并包含病毒的复制起点。
天花
由大天花(variola major)病毒引起的天花(smallpox)被认为是最具危险性的潜在生物武器之一，因为它易于在人与人之间传播，还没有有效的疗法，并且几乎没有人具有针对该病毒的完全免疫力。尽管在1977年世界范围的免疫计划消灭了天花病，然而少量的天花病毒仍存在于美国和俄罗斯的两个安全机构中。然而，有可能在于世界的其它地方存在不为人知的天花病毒库。
天花感染的症状似乎在接触后大约12天(范围从7至17天)出现。最初的症状包括高烧、疲劳、头痛和背痛。在2至3天后出现特征性的疹，主要是在脸、臂和腿上。疹从扁平的红色损伤(斑丘疹)开始发展成小泡。与禽痘不同，与天花有关的损伤以同样的速率发展。在接触后的第二周前期，天花损伤充满脓并开始结痂。结痂在大约3周后发生、分离并脱落。从即将发生斑丘疹之前直至痂脱落的时间内，个体通常对其他人是具有传染性的。天花主要通过被感染的人排出的唾液飞沫直接在人与人之间传播。污染的衣物或床上用品也可以传播该病毒。天花感染的死亡率大约为30％，复原的患者常具有影响外表的瘢痕。
由于可能的接触导致的危险性，因此对于天花病毒尚未研究清楚。然而，对用作天花疫苗并与天花密切相关的痘苗病毒进行了深入研究。对两种病毒进行的少数比较研究已显示，主要的差异在于宿主范围：牛痘感染几种宿主，而天花仅天然地感染人类以及在人工实验室条件下感染短尾猴。可通过鸡胚绒膜***上损伤的外观以及通过组织培养的生长特征来区分这两种病毒。所述病毒共享抗原并产生交叉中和抗体，这种特征已经在使用牛痘疫苗预防天花时利用过。这两种病毒可通过PCR、ELISA、放射免疫测定和单克隆抗体进行区分。牛痘作为递送其它疫苗基因的载体现已得到广泛研究。
被感染的细胞中产生两种形式的感染性正痘病毒：停留在被感染细胞中的胞内成熟病毒(intracellular mature virus，IMV)以及在感染晚期从细胞中释放的胞外包膜病毒(extracellular enveloped virus，EEV)。EEV形式的病毒包含另外的脂质包膜以及细胞和病毒蛋白质，因此使得EEV在免疫学上异于IMV。另外，EEV和IMV形式通过不同的机制进入细胞、使用不同的细胞受体，并对抗体和补体具有不同的敏感性。痘病毒的免疫逃避通过与以下有关的机制实现：释放结合趋化因子的蛋白质、EEV对中和抗体的抗性，以及通过获得宿主补体控制蛋白而实现的EEV对补体破坏的抗性。
天花和牛痘属于正痘病毒属的痘病毒。这些双链DNA病毒在胞质中复制，这与依赖宿主细胞核DNA复制酶的其它DNA病毒是不同的。已对天花和牛痘的几种毒株进行了基因组测序。结构蛋白、膜蛋白和核心蛋白的基因似乎在正痘病毒中高度保守。还鉴定了负责在人类细胞中生长的基因。NIAID将在这些领域中积极地进行进一步研究。
节肢动物传播病毒
B类和C类节肢动物传播病毒(虫媒病毒)是病毒性脑炎和出血热的重要病原体，并包括许多类型。甲病毒与委内瑞拉马脑炎(Venezuelanequine encephalitis，VEE)病毒、东方马脑炎(eastern equine encephalitis，EEE)病毒和西方马脑炎(western equine encephalitis，WEE)病毒有关。黄病毒包括西尼罗病毒(WNV)、日本脑炎(JE)病毒、夸赛纳森林病(Kyasanur forest disease，KFD)病毒、蜱传脑炎(tick-borne encephalitis，TBE)病毒复合体和黄热病(YF)病毒。布尼亚病毒与加利福尼亚脑炎(CE)病毒、拉克罗斯(La Crosse，LAC)病毒、克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever，CCHF)病毒有关。
尽管节肢动物载体(如蚊、蜱或白蛉)负责多数病毒性脑炎和出血热病毒向人类的天然传播，但这些病毒作为潜在生物恐怖武器的威胁主要源自它们在雾化接触所具有的极端感染性。另外，仅对这些病毒中的极少数有可使用的疫苗或有效的特异性疗法。
许多虫媒病毒在北美洲(EEE、WEE、WNV、CE、LAC)、南美洲(VEE、WEE)、亚洲(JE、CCHF)和非洲(WNV、CCHF)是地方性的，其包括没有列出的病毒。目前在美国最主要的是WNV，其在1999年在北美洲纽约市首先鉴定出来。该病毒已在整个美国大陆传播，截至2002年夏天其导致数千病例以及超过一百人死亡。
通过被感染的蚊、蜱或白蛉(取决于病毒)叮咬使得虫媒病毒获得对人和其它动物的天然感染。通常，潜伏期为3至21天不等，这反映了病毒在局部进行复制并在侵入脑或其它靶器官前随血液扩散至外周部位的时间。在脑中，这些病毒中的某些在细胞间扩散，导致脑炎。其它病毒如YF和CCHF靶向肝和其它器官，导致出血和发热。对于这些脑炎和出血热病毒的发病机制了解相对很少。然而在小鼠接触雾化VEE的研究中，在感染后48小时内在脑部检测到病毒。
在人中，虫媒病毒感染通常是无症状的或者导致非特异性流感样症状如发热、疼痛和疲劳。少数被感染的人可发展为脑炎，并且尽管大多数会复原，但某些可遗留严重的残留神经性症状如失明、麻痹或癫痫发作。临床的疾病和死亡随特定的感染病毒而变化。例如，感染VEE的成人中少于1％发展为脑炎；另一方面，在感染JE(25％)或EEE(50％)病毒的人中的死亡率较高。对于LAC感染，疾病在儿童中更严重并且更普遍。然而对于WNV，特别是在美国，老年人和免疫抑制个体发生严重或危及生命的疾病的风险极高。这些病毒中的几种如VEE、EEE、WNV和JE还导致重要的兽医疾病，在马、禽类和其它动物中造成高致命性(高达90％)脑炎或其它症状。
甲病毒、黄病毒和布尼亚病毒(bunyavirus)的传播循环通常包括在节肢动物对宿主摄食期间病毒从被感染脊椎动物宿主(例如，鸟)到节肢动物/昆虫载体(例如，蚊子)的环状通道。病毒在节肢动物中大量增殖，然后当蚊子再次摄食/叮咬时传递并感染新的宿主。对于虫媒病毒的传播循环一般不够了解，包括参与天然维持和将病毒传播到新的地理区域和宿主的脊椎动物宿主和节肢动物载体的物种。
B类和C类虫媒病毒都是在被感染细胞的胞质中进行复制的包膜RNA病毒。已经鉴定了参与病毒与宿主结合、在病毒的向性中发挥功能、以及作为宿主中和抗体靶标的病毒包膜糖蛋白。该病毒还编码病毒复制过程中所需的非结构蛋白(如酶)。病毒的结构蛋白的和非结构蛋白的数目和类型对于每个病毒家族是特异性的；虽然已对某些进行了广泛的研究，而另一些还未进行。基因组测序和其它核酸研究已确立了这些病毒中某些之间的关系，并且已导致鉴定了基因和蛋白质上对于毒力、毒力衰减和相关发病机制具有重要性的的位点。对某些甲病毒和黄病毒的结构蛋白的晶体学研究提供了蛋白质功能以及鉴定用于开发抗病毒药物的潜在靶标的启示。
本文所述的方法可用于检测多种类型的病原体，包括但不限于来自任何以下病毒属的病原体：腺病毒科(Adenoviridae)、苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)、青葱病毒属(Allexivirus)、异轻小病毒属(Allolevivirus)、α-隐病毒属(Alphacryptovirus)、α-疱疹病毒科(Alphaherpesvirinae)、α-诺达病毒属(Alphanodavirus)、α-逆转录病毒属(Alpharetrovirus)、甲病毒属(Alphavirus)、口疮病毒属(Aphthovirus)、苹果锈果类病毒属(Apscaviroid)、双节RNA病毒属(Aquabirnavirus)、呼肠孤病毒属(Aquareovirus)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、沙粒病毒属(Arenavirus)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)、囊泡病毒科(Ascoviridae)、囊泡病毒属(Ascovirus)、非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)、星形病毒科(Astroviridae)、星形病毒属(Astrovirus)、黄金葛病毒属(Aureusvirus)、燕麦病毒属(Avenavirus)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)、双节RNA病毒属(Avibirnavirus)、禽肝DNA病毒属(Avihepadnavirus)、禽痘病毒属(Avipoxvirus)、鳄梨日斑类病毒属(Avsunviroid)、鳄梨日斑类病毒科(Avsunviroidae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、香蕉条纹病毒属(Badnavirus)、杆状RNA病毒科(Barnaviridae)、杆状RNA病毒属(Barnavirus)、蛭弧菌微小噬菌体属(Bdellomicrovirus)、菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)、甜菜坏死黄脉病毒属(Benyvirus)、β-隐藏病毒属(Betacryptovirus)、β-疱疹病毒亚科(Betaherpesvirinae)、β-野田村病毒属(Betanodavirus)、β-逆转录病毒属(Betaretrovirus)、β-四病毒属(Betatetravirus)、双节RNA病毒科(Birnaviridae)、博纳病毒科(Bornaviridae)、博纳病毒属(Bornavirus)、茧蜂病毒属(Bracovirus)、短浓稠病毒属(Brevidensovirus)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、雀麦花叶病毒属(Bromovirus)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、布尼亚病毒属(Bunyavirus)、大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)、“c2样病毒属”、杯状病毒科(Caliciviridae)、毛状病毒组(Capillovirus)、山羊痘病毒属(Capripoxvirus)、心脏病毒属(Cardiovirus)、香石竹潜病毒组(Carlavirus)、香石竹斑驳病毒组(Carmovirus)、木薯脉花叶病毒属(“Cassava vein mosaic-like viruses”)、花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)、花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)、衣原体微小噬菌体属(Chlamydiamicrovirus)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)、绿藻病毒属(Chlorovirus)、脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)、(Chrysovirus)、圆环病毒科(Circoviridae)、圆环病毒属(Circovirus)、线性病毒科(Closteroviridae)、线性病毒属(Closterovirus)、(Cocadviroid)、锦紫苏类病毒属(Coleviroid)、呼肠孤病毒属(Coltivirus)、豇豆花叶病毒科(Comoviridae)、豇豆花叶病毒属(Comovirus)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)、被盖病毒科(Corticoviridae)、被盖病毒属(Corticovirus)、类蟋蟀麻痹病毒属(“Cricket paralysis-like viruses”)、毛形病毒属(Crinivirus)、南瓜花叶病毒组(Cucumovirus)、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)、质型多角体病毒属(Cypovirus)、囊状病毒科(Cystoviridae)、囊状病毒属(Cystovirus)、巨细胞病毒属(Cytomegalovirus)、质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)、δ-逆转录病毒属(Deltarerovirus)、丁型肝炎病毒属(Deltavirus)、浓核病毒亚科(Densovirinae)、浓核病毒属(Densovirus)、依赖病毒属(Dependovirus)、香石竹病毒组(Dianthovirus)、“埃博拉样病毒属”、(Enamovirus)、肠道病毒属(Enterovirus)、昆虫双节段dsRNA病毒(Entomobirnavirus)、昆虫痘病毒亚科(Entomopoxvirinae)、A型昆虫痘病毒属(Entomopoxvirus A)、B型昆虫痘病毒属(Entomopoxvirus B)、C型昆虫痘病毒属(EntomopoxvirusC)、弹状病毒属(Ephemerovirus)、ε-逆转录病毒属(Epsilonretrovirus)、飘游病毒属(Errantivirus)、红病毒属(Erythrovirus)、蚕豆萎蔫病毒组(Fabavirus)、斐济病毒属(Fijivirus)、纤丝病毒科(Filoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)、凹陷病毒属(Foveavirus)、真菌传杆状病毒属(Furovirus)、小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、小纺锤形噬菌体属(Fusellovirus)、γ-疱疹病毒亚科(Gammaherpesvirinae)、γ-逆转录病毒属(Gammaretrovirus)、双生病毒科(Geminiviridae)、贾第虫病毒属(Giardiavirus)、颗粒体病毒属(Granulovirus)、汉滩病毒属(Hantavirus)、半病毒属(Hemivirus)、黄病毒属(Hepacivirus)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、“戊型肝炎样病毒”、肝病毒属(Hepatovirus)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、大麦病毒(Hordeivirus)、啤酒花矮化类病毒属(Hostuviroid)、减毒病毒科(Hypoviridae)、减毒病毒属(Hypovirus)姬蜂病毒(Ichnovirus)、鱼回鱼疱疹病毒属(“Ictalurid herpes-like viruses”)、悬钩子病毒属(Idaeovirus)、等轴不稳定环斑病毒组(Ilarvirus)、“传染性喉气管炎样病毒”、A型流感病毒(Influenzavirus A)、B型流感病毒(InfluenzavirusB)、C型流感病毒(Influenzavirus C)、丝状病毒科(Inoviridae)、丝状病毒(Inovirus)、(Ipomovirus)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、虹彩病毒(Iridovirus)、重复病毒属(Iteravirus)、“L5样病毒”、兔病毒属样病毒(Lagovirus“-like viruses”)、利什曼原虫病毒(Leishmaniavirus)、慢病毒属(Lentivirus)、兔痘病毒属(Leporipoxvirus)、轻小病毒科(Leviviridae)、轻小病毒属(Levivirus)、脂毛病毒科(Lipothrixviridae)、脂毛病毒属(Lipothrixvirus)、黄矮病毒科(Luteoviridae)、黄矮病毒属(Luteovirus)、淋巴潜伏病毒属(Lymphocryptovirus)、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)、狂犬病毒属(Lyssavirus)、玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)、柘树属病毒属(Macluravirus)、玉米雷亚多非纳病毒组(Marafivirus)、“马尔堡样病毒”、“马雷克病样病毒”、乳腺腺病毒属(Mastadenovirus)、玉米线条病毒属(Mastrevirus)、肺炎后病毒属(Metapneumovirus)、变位病毒科(Metaviridae)、变位病毒属(Metavirus)、微小病毒科(Microviridae)、微小病毒属(Microvirus)、线粒体病毒属(Mitovirus)、软体动物痘病毒属(Molluscipoxvirus)、麻疹病毒属(Morbillivirus)、“Mu样病毒”、(Muromegalovirus)、(Myoviridae)、内罗毕病毒属(Nairovirus)、极微小病毒属(Nanovirus)、裸露RNA病毒科(Narnaviridae)、裸露RNA病毒属(Narnavirus)、坏死病毒组(Necrovirus)、线虫传多面体病毒(Nepovirus)、野田村病毒科(Nodaviridae)、“诺沃克样病毒”、(Novirhabdovirus)、核型多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus)、细胞核弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)、油橄榄病毒属(Oleavirus)、Ω-四病毒属(Omegatetravirus)、蛇形病毒属(Ophiovirus)、环状病毒属(Orbivirus)、正嗜肝DNA病毒属(Orthohepadnavirus)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、正痘病毒属(Orthopoxvirus)、正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)、(Oryzavirus)、欧尔密病毒属(Ourmiavirus)、“P1样病毒”、“P2样病毒”、“P22样病毒”、(Panicovirus)、***状瘤病毒科(Papillomaviridae)、***状瘤病毒属(Papillomavirus)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)、副痘病毒属(Parapoxvirus)、副肠孤病毒(Parechovirus)、分体病毒科(Partitiviridae)、(Partitivirus)、细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒亚科(Parvovirinae)、细小病毒属(Parvovirus)、花生丛簇病毒属(Pecluvirus)、桃潜花叶类病毒属(Pelamoviroid)、瘟病毒属(Pestivirus)、牵牛花叶脉透明样病毒属(“Petunia vein clearing vein clearing-likeviruses”)、褐藻病毒属(Phaeovirus)，“-29样病毒”、“-H样病毒”、白蛉热病毒属(Phlebovirus)、藻DNA病毒科(Phycodnaviridae)、(Phytoreovirus)、微小RNA病毒科(Picornaviridae)、芽生病毒科(Plasmaviridae)、芽生病毒(Plasmavirus)、短杆状噬菌体属(Plectrovirus)、肺病毒亚科(Pneumovirinae)、肺病毒属(Pneumovirus)、短尾病毒科(Podoviridae)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)、多DNA病毒科(Polydnaviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、多瘤病毒属(Polyomavirus)、马铃薯帚顶病毒属(Pomovirus)、(Pospiviroid)、(Pospiv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Figure A20068005016300461
和亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus)。
细菌病原体
还可以使用本文所述的方法检测细菌微生物。下文描述了特定有意义的病原性细菌，包括对免疫受损个体特别有意义的细菌以及可能用于恐怖攻击的细菌。
炭疽
炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是导致炭疽的病原体，具有使其成为可怕的生物恐怖威胁的若干特征。这些特征包括其孢子形式的稳定性、其培养和生产的容易性、其雾化能力、其所致疾病的严重性以及广泛应用的有效疫苗的缺乏。
人炭疽有3种主要的临床形式：皮肤性、吸入性和胃肠性。如果不作治疗，这3种形式都可导致败血病和死亡。皮肤性和胃肠性炭疽的早期抗生素治疗通常是有效的；然而，即使用抗生素治疗，吸入性炭疽仍然是可能致死的疾病。虽然吸入性炭疽的病例死亡率估计是基于不完全的信息，但天然发生或偶然感染的历史死亡率仍然是很高的(75％)，即使使用适当的抗生素以及所有其它已有的支持性治疗也是如此。然而，最近在美国人为接触炭疽的前10个病例的存活率为60％。
吸入性炭疽发生在孢子存留在肺泡腔以及随后被肺泡巨噬细胞摄取之后。然后，存活的孢子被运送至纵隔***，在那里它们可萌发多达60天或更久。萌发后，复制的细菌释放导致疾病的毒素。主要的毒力因子包括抗吞噬的外部荚膜和至少两种已良好表征的毒素。这两种毒素叫做水肿因子(EF)和致死因子(LF)，它们可破坏细胞或抑制其正常功能。第三种组分叫做保护性抗原(PA)，当与EF和LF联合时使EF和LF能够结合哺乳动物细胞上的特定受体。该复合体被内化后，细菌的毒效应被激活。研究人员最近改造了结合天然受体的突变体重组PA(rPA)。这些突变体rPA还可通过阻断和干扰LF和EF向细胞中递送从而取代野生型PA。最近的研究还鉴定了与PA结合的哺乳动物细胞受体区域，并测定了LF结合位点的结构。包含毒素结合位点的受体可溶片段可作为假目标来保护细胞免受LF的损伤。另一些最近的研究已表征了LF结合MAPKK(丝裂原活化蛋白激酶激酶)的位点，MAPKK是重要的胞内酶，LF对它的破坏导致细胞死亡。
对炭疽芽孢杆菌染色体基因组的测序已接近完成。LF、EF和PA的基因包含在已测序的质粒中。NIAID正加大测序力度，对炭疽芽孢杆菌和相关芽孢杆菌进行广泛的基因组分析。研究人员将使用来自所选菌株、隔离群以及相关物种的序列数据来评估遗传变异和多样性的程度。这些遗传信息将提供一个框架，利用该框架来评估已在菌株间发现的致病性和毒力差异的基础。基因组数据的其它用途包括：支持基础研究从而鉴定用于菌株鉴定和分子的基因分型的特异性分子标志物和靶标；开发基于序列的检测技术；以及设计有效的疫苗、治疗方法和诊断工具。另外，所述数据将增强对与表型(抗药性、致病率和传染性)以及影响孢子在体内萌发的关键事件或过程相关的遗传多态性的检测。广泛的生物信息学资源将支持和维持微生物基因组数据库以及开发相关软件和生物信息学工具。这些方法将作为其它可能用作生物恐怖病原体的微生物的原型。
鼠疫
鼠疫由细菌鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)导致。它用作生物武器的潜力是基于已开发用于生产和雾化大量细菌的方法，并基于其以某种形式在人与人之间的传播性。另一因素是该细菌样品在全世界研究实验室中的广泛分布。即使吸入少量有毒的雾化鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)芽孢杆菌的感染也可导致肺鼠疫，这是一种可在人与人之间传播的高致死性鼠疫形式。天然流行的鼠疫主要为腺鼠疫，它通过来自被感染啮齿动物的跳蚤进行传播。
肺鼠疫的症状包括发热和咳嗽，这与另一些呼吸道疾病(如肺炎)的症状类似。症状似乎在接触后1～6天出现并迅速导致死亡。如果不加以治疗，肺鼠疫的死亡率几乎达到100％。抗生素对于鼠疫是有效的，然而有效疫苗还不是广泛可用的。
尽管鼠疫耶尔森氏菌能够非常有效地侵入宿主上皮细胞，然而协助其侵入的分子机制还是未知的。多种铁转运机制以及至少3种群感机制(quorum-sensing mechanisms)的相互作用似乎参与其中。
由于已对鼠疫耶尔森氏菌的基因组进行了完全测序，因此应该有可能加快对表征发病机制中关键事件的努力，这将有助于鉴定适当的候选疫苗、诊断试剂和用于药物介入的关键靶标。鼠疫耶尔森氏菌外表面膜蛋白(Y.pestis outer membrane protein，Yomp)(存在几种)似乎是重要的毒力因子，并在发病机制中扮演重要角色。鼠疫耶尔森氏菌具有质粒编码的一组毒力相关蛋白。室温和Ca++水平通过所谓“低Ca++应答(LCR)机制”来调节这些蛋白质的表达和分泌。对质粒编码蛋白及其在发病机制中的作用的进一步表征可提供有效亚基疫苗的基础。
为导致感染，鼠疫耶尔森氏菌和另一些病原性细菌需要从宿主的铁螯合蛋白和/或血红素螯合蛋白中除去铁(一种必要的微量营养物)。鼠疫耶尔森氏菌包含部分表征的3个铁转运***，所述铁转运***在铁转运和除去中扮演重要角色。这些***之一为铁载体依赖型，并涉及耶尔森菌素(Ybt)的合成。因为Ybt***对于鼠疫早期阶段铁的获得是必需的，所以它可能是用于早期介入和治疗的优良靶标。
肉毒中毒
肉毒杆菌毒素由产芽孢的厌氧菌肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生，它是剧毒的物质，其主要威胁来自人为接触。该毒素是高致死性的，并易于产生和释放进环境中。肉毒杆菌毒素穿过粘膜表面被吸收并与外周胆碱能神经突触不可逆结合。该毒素存在7种抗原类型(A-G)。所有这7种毒素均导致类似的临床表现和疾病；在美国，A、B和E型肉毒杆菌毒素与绝大多数食物传播疾病有关。
接触该毒素诱导的症状包括肌肉麻痹；语言、吞咽或视物困难；并且在严重的病例中需要机械辅助呼吸。接触该毒素的人需要立即和加强的支持性护理和治疗。症状的发病和严重程度取决于毒素吸收进入循环***的速度和量。对于食物传播的接触，潜伏期为2小时到8天不等，但通常限于72小时。当新的运动轴突小支使***肌肉恢复知觉(reenervate)时，症状得以平复，该过程在成人中需要几周或几个月。
肉毒杆菌通常不感染人类。然而，人在进食被该生物污染的食物之后接触毒素。对于肉毒杆菌毒素的作用机制已非常了解。该毒素由通过一个二硫键连接的重链和轻链组成，所述二硫键对神经毒性是必需的。该毒素的序列和三维结构均已确定。该结构由3个功能结构域组成：催化亚基、转运结构域和结合结构域。该毒素与外周胆碱能突触的突触前膜上的未知受体不可逆结合，所述外周胆碱能突触主要在神经肌肉的接合处。在毒素被内化并转运至细胞溶胶后，轻链上包含Zn++的内肽酶阻断从运动神经元中释放乙酰胆碱。通过阻止包含乙酰胆碱的小泡与端膜融合来阻断释放。这7种肉毒杆菌毒素表现出某些不同的蛋白酶活性，它们在不同位点切割3种SNARE蛋白(突触小泡蛋白/VAMP、SNAP-25和突触融合蛋白)。尚未完全了解这一蛋白水解特异性的分子基础。SNARE蛋白在将突触小泡运至突触前膜中是必需的。
土拉菌病
土拉菌病由于其高感染性水平(仅仅10个生物体即可导致疾病)以及可雾化的能力而是潜在的生物恐怖病原体。导致土拉菌病的土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)是不产芽孢的兼性胞内细菌，可在低温下存活几周。已表征了该生物的两种菌株-在北美洲发现的A型毒力高于在欧洲和亚洲发现的B型。该疾病不在人与人之间传播；它天然地从小哺乳动物或者被污染的食物、土壤或水传播到人类。在吸入空气传播的颗粒之后发生天然感染。
土拉菌病可采取几种形式之一，这取决于接触的途径。由吸入空气传播的土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)而引起的该疾病是最有可能的人为接触。吸入形式是急性的非特异性疾病，其在呼吸接触后3～5天发病；在某些病例中，在几天或几周后发生胸膜肺炎。如果不加以治疗，该病可导致呼吸衰竭。用抗生素治疗天然获得的病例使死亡率降低2～60％。已开发了活减毒土拉菌病疫苗，并已根据IND(investigational new drug，新试验药)应用将其施用给数以千计的志愿者。迄今，这种疫苗的使用限于实验室和其它高风险人员。
毒力和发病的基本机制还是未知的。土拉热弗朗西丝氏菌的细胞壁异乎寻常地富含脂肪酸。失去荚膜可导致毒力丧失，而不影响生存力；然而，荚膜既没有毒性也没有免疫原性。土拉热弗朗西丝氏菌感染涉及网状内皮***并导致细菌在肺、肝和脾中复制。在呼吸接触后，土拉热弗朗西丝氏菌感染吞噬细胞，包括肺的巨噬细胞。在肝中，土拉热弗朗西丝氏菌已表现出侵入肝细胞并在其中复制。被感染肝细胞的破坏导致细菌释放，随后被吞噬细胞摄取。当通过施用单克隆抗体阻止肝细胞裂解时，细菌继续在肝细胞中复制，导致迅速地致死。
吸入性细菌
B类和C类细菌具有通过气雾剂途径感染的潜力，所述细菌包括布鲁氏菌属物种，类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、伯氏考克斯氏体(Coxiellaburnetii)和选择立克次氏体属物种(Rickettsia spp.)。这些生物中大多数导致动物传染病或感染，即可从脊椎动物(例如，啮齿动物、鸟类、家畜)向人类传播的感染或者感染性疾病。不同的细菌通过不同的途径感染人类，所述途径包括摄取、吸入或节肢动物介导的传播。然而，相信所有这些病原体均能在吸入少量生物体后导致感染。因此，这些病原体在生物防御中受到特别关注，因为它们可作为气雾剂分散从而用作武器。
布氏菌病由布鲁氏菌属物种导致，它主要是绵羊、山羊和牛的动物传播感染，但也发生在某些野生物种中，如野牛、驼鹿和鹿。在中东、地中海盆地、印度和中国仍存在人类感染，但在美国(U.S.)较罕见。天然人类感染可在职业性接触或者摄取被污染的肉或未经高温消毒的乳制品后发生。潜伏期为5至60天不等。症状是多样的，从急性发热疾病到脑、骨、泌尿生殖道和心内膜的慢性感染。少于2％的感染导致死亡，主要由马尔他布鲁氏菌(B.melitensis)导致的心内膜炎所致。6种布鲁氏菌属物种中仅有4种——猪布鲁氏菌(B.suis)、马尔他布鲁氏菌、流产布鲁氏菌(B.abortus)和狗布鲁氏菌(B.canis)——已知在人类中导致布氏菌病；认为马尔他布鲁氏菌和猪布鲁氏菌比流产布鲁氏菌或狗布鲁氏菌对人类更具毒力。
在人类以及其它哺乳动物和鸟类中导致类鼻疽的类鼻疽伯克霍尔德氏菌发现于接近赤道的国家(尤其在亚洲)的土壤和地表水中。人类感染是由于破损的皮肤、摄取或吸入被污染的水或灰尘。该疾病的几种形式具有从几天到许多年的潜伏期。大多数人类接触导致无疾病的血清转化。在急性败血症性类鼻疽中，传播的类鼻疽伯克霍尔德氏菌可导致肺、肝、脾和/或淋巴节中的脓肿。在慢性或复发性类鼻疽中，肺和***最常患病。即使使用抗生素治疗，在重度或慢性疾病中死亡率仍很高(高达50％)。
导致鼻疽的生物——鼻疽伯克霍尔德氏菌主要是马、骡和驴的疾病。尽管在美国已经消灭，它仍然在亚洲、非洲和南美洲的家畜中发现。天然传播到人类是很少见的，通常由造成皮肤损伤的开放性伤口污染所致。已报道了气雾剂接触之后的感染，造成坏死性肺炎。全身传播可导致脓疱性疹和迅速致命的疾病。
家畜是伯氏考克斯氏体的主要贮主，伯氏考克斯氏体是引起Q热的原因。伯氏考克斯氏体是高感染性的，并分布在全世界。被感染的动物常常是无症状的，但是怀孕的动物可能流产或死产。Q热被认为是与感染动物和尸体近距离接触的工人的职业病，然而在未发生近距离接触的情况下感染也通过雾化细菌发生。仅吸入少量生物体即可导致感染。在2～3周的潜伏期后，发生由发热、头痛以及常有的单侧性肺炎组成的急性疾病。该生物在肺中增殖，然后可侵入血流，导致心内膜炎、肝炎、骨髓炎或在严重的情况下导致脑炎。多达65％的慢性感染者可死于所述疾病。伯氏考克斯氏体可以无活性状态在空气和土壤中保持活力几周至几个月，并对许多化学消毒剂以及脱水具有抗性。
斑疹伤寒组的立克次氏体(如普氏立克次氏体(Rickettsiaprowazekii))在虱和跳蚤的粪便中传播，其中存在维持稳定感染几个月的形式。斑疹热组的立克次氏体(包括立氏立克次氏体(R.rickettsii)和康氏立克次氏体(R.conorii))通过蜱的叮咬进行传播。有限的研究已提出，某些立克次氏体物种具有通过气雾剂途径的低剂量感染性。普氏立克次氏体和立氏立克次氏体导致最严重的感染，由扩散的血管内皮感染导致的病例死亡率平均为20-25％。康氏立克次氏体和伤寒立克次氏体(R.typhi)感染的病例死亡率为1-3％，感染个体表现出相似的临床表现，包括发热、头痛、肌痛、咳嗽、恶心、呕吐。常在症状开始后3～5天发生疹。在儿童中病例死亡率较低。
布鲁氏菌属物种是小的不产芽孢的不动需氧型革兰氏阴性球杆菌。一旦进入身体，布鲁氏菌属物种被多形核细胞(PMN)和巨噬细胞迅速吞噬，但仍可能在细胞内存活并保持活力。还不完全了解所述生物逃避细胞内PMN杀伤的机制；然而，可能包括抑制PMN中消除活性氧中间体的髓过氧化物(myeloperoxide)-H2O2-卤化物体系和铜-锌超氧化物歧化酶。在巨噬细胞内存活可能是由于通过布鲁氏菌的可溶产物抑制吞噬体-溶酶体融合所致。细胞壁外的光滑型脂多糖(S-LPS)组分是主要的细胞壁抗原和毒力因子。非光滑型菌株具有减弱的毒力，并且对正常血清的裂解更加敏感。刚刚完成了对猪布鲁氏菌菌株的一个菌株1330的基因组测序，并与绵羊布鲁氏杆菌病有关的另一菌株的接近完成的序列一起公开。马尔他布鲁氏菌菌株16M的基因组序列已完成早在2002年公开。
鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌都是需氧型革兰氏阴性杆菌：鼻疽伯克霍尔德氏菌是不动的，而类鼻疽伯克霍尔德氏菌是能动的。对伯克霍尔德氏菌毒力的分子机制知之甚少。类鼻疽伯克霍尔德氏菌的多糖荚膜是一种重要的毒力因子，毒素和II型脂多糖也被认为起作用。鼻疽伯克霍尔德氏菌的基因组测序几近完成，而类鼻疽伯克霍尔德氏菌的基因组测序正在进行中。
伯氏考克斯氏体是高度多型性的革兰氏阴性球杆菌。它通过存在的细胞受体被动进入宿主的吞噬细胞，它在所述吞噬细胞的吞噬溶酶体中存活。低pH是该生物的代谢必需的。实际上，伯氏考克斯氏体对补体具有抗性，并且是强免疫原。其细胞壁具有免疫调节活性，其在小鼠中产生毒性反应。伯氏考克斯氏体的Nine Mile菌株的基因组测序已完成。
立克次氏体是小的革兰氏阴性专性胞内细菌，主要位于内皮细胞的细胞溶胶中或其节肢动物宿主的细胞中。该生物在虱咬部位局部增殖，通过血液传播，然后感染毛细血管、小动脉和静脉的内皮细胞。斑疹热立克次氏体通过基于作用的移动性(acting-based mobility)在细胞之间扩散，并通过产生活性氧种类使被感染细胞受到损伤。斑疹伤寒组立克次氏体在细胞溶胶中增殖直至细胞破裂。普氏立克次氏体(Madrid E菌株)和康氏立克次氏体(Mulish 7菌株)的基因组测序已完成，伤寒立克次氏体和立氏立克次氏体的基因组测序几近完成。
古细菌
本文所述的方法可用于检测多种类型的病原体，包括但不限于来自以下古细菌域的任何属的病原体：酸叶菌属(Acidilobus)、气热菌属(Aeropyrum)、古生球菌属(Archaeoglobus)、暖球形菌属(Caldisphaera)、暖枝菌属(Caldivirga)、硫还原球菌属(Desulfurococcus)、硫还原叶菌属(Desulfurolobus)、亚铁球菌属(Ferroglobus)、铁原体属(Ferroplasma)、地丸菌属(Geoglobus)、盐盒菌属(Haloarcula)、盐杆菌属(Halobacterium)、盐棒菌属(Halobaculum)、盐二型菌属(Halobiforma)、盐球菌属(Halococcus)、富盐菌属(Haloferax)、盐几何菌属(Halogeometricum)、盐甲烷球菌属(Halomethanococcus)、盐棍菌属(Halorhabdus)、Halorubrobacterium、盐红菌属(Halorubrum)、盐简菌属(Halosimplex)、盐陆生菌属(Haloterrigena)、栖高温菌属(Hyperthermus)、燃球菌属(Ignicoccus)、生金球菌属(Metallosphaera)、甲烷微球菌属(Methanimicrococcus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷砾菌属(Methanocalculus)、甲烷暖球菌属(Methanocaldococcus)、拟甲烷球菌属(Methanococcoides)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷粒菌属(Methanocorpusculum)、甲烷袋状菌属(Methanoculleus)、甲烷泡菌属(Methanofollis)、产甲烷菌属(Methanogenium)、甲烷盐菌属(Methanohalobium)、甲烷嗜盐菌属(Methanohalophilus)、叶形甲烷菌属(Methanolacinia)、甲烷叶菌属(Methanolobus)、甲烷微菌属(Methanomicrobium)、甲烷微球菌属(Methanomicrococcus)、甲烷盘菌属(Methanoplanus)、甲烷嗜热菌属(Methanopyrus)、鬃毛甲烷菌属(Methanosaeta)、甲烷咸菌属(Methanosalsum)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、甲烷螺菌属(Methanospirillum)、甲烷热杆菌属(Methanothermobacter)、甲烷热球菌属(Methanothermococcus)、甲烷嗜热菌属(Methanothermus)、甲烷丝菌属(Methanothrix)、甲烷炎菌属(Methanotorris)、盐无色菌属(Natrialba)、钠线菌属(Natrinema)、嗜盐碱杆菌属(Natronobacterium)、嗜盐碱球菌属(Natronococcus)、嗜盐碱单胞菌属(Natronomonas)、盐碱红菌属(Natronorubrum)、古老球菌属(Palaeococcus)、嗜酸球菌属(Picrophilus)、热棒菌属(Pyrobaculum)、火球菌属(Pyrococcus)、热网菌属(Pyrodictium)、Pyrolobus、葡萄嗜热菌属(Staphylothermus)、斯特氏菌属(Stetteria)、栖冥河菌属(Stygiolobus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、厌硫球菌属(Sulfophobococcus)、硫磺球形菌属(Sulfurisphaera)、硫磺球菌属(Sulfurococcus)、热分支菌属(Thermocladium)、热球菌属(Thermococcus)、热盘菌属(Thermodiscus)、热丝菌属(Thermofilum)、热原体属(Thermoplasma)、热变形菌属(Thermoproteus)、热球形菌属(Thermosphaera)和火山鬃菌属(Vulcanisaeta)。
真细菌
本文所述的方法可用于检测多种类型的病原体，其包括但不限于来自以下细菌(或真细菌)域的任何属的病原体：乏养菌属(Abiotrophia)、聚乙酸菌属(Acetitomaculum)、醋弧菌属(Acetivibrio)、厌氧醋菌属(Acetoanaerobium)、醋杆菌属(Acetobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、线形醋菌属(Acetofilamentum)、产醋菌属(Acetogenium)、醋盐杆菌属(Acetohalobium)、醋微菌属(Acetomicrobium)、醋丝菌属(Acetonema)、醋热菌属(Acetothermus)、无胆甾原体属(Acholeplasma)、无色菌属(Achromatium)、无色杆菌属(Achromobacter)、氨基酸杆菌属(Acidaminobacter)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、嗜酸微菌属(Acidimicrobium)、嗜酸菌属(Acidiphilium)、嗜酸球形菌属(Acidisphaera)、嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)、酸杆菌属(Acidobacterium)、酸胞菌属(Acidocella)、酸单胞菌属(Acidomonas)、热酸菌属(Acidothermus)、食酸菌属(Acidovorax)、不动杆菌属(Acinetobacter)、Acrocarpospora、异壁放线菌属(Actinoalloteichus)、放线杆菌属(Actinobacillus)、放线棒菌属(Actinobaculum)、双孢放线菌属(Actinobispora)、珊瑚状放线菌属(Actinocorallia)、放线动孢菌属(Actinokineospora)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、放线菌属(Actinomyces)、游动放线菌属(Actinoplanes)、多态放线菌属(Actinopolymorpha)、放线多孢菌属(Actinopolyspora)、孢器放线菌属(Actinopycnidium)、孢囊放线菌属(Actinosporangium)、束丝放线菌属(Actinosynnema)、埃及小体属(Aegyptianella)、Aequorivita、气球菌属(Aerococcus)、气微菌属(Aeromicrobium)、气单胞菌属(Aeromonas)、阿菲波菌属(Afipia)、震球菌属(Agitococcus)、阿格雷氏菌属(Agreia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、土壤球菌属(Agrococcus)、土壤单胞菌属(Agromonas)、壤霉菌属(Agromyces)、Ahrensia、Albibacter、Albidovulum、产碱菌属(Alcaligenes)、碱湖生菌属(Alcalilimnicola)、食碱菌属(Alcanivorax)、噬冷菌属(Algoriphagus)、Alicycliphilus、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、Alishewanella、Alistipes、嗜盐嗜碱菌属(Alkalibacterium)、碱湖生菌属(Alkalilimnicola)、Alkaliphilus、碱螺菌属(Alkalispirillum)、Alkanindiges、Allisonella、Allochromatium、Allofustis、差异球菌属(Alloiococcus)、异单胞菌属(Allomonas)、异根瘤菌属(Allorhizobium)、交替球菌属(Alterococcus)、交替单胞菌属(Alteromonas)、小链菌属(Alysiella)、Amaricoccus、氨基杆菌属(Aminobacter)、Aminobacterium、氨基单胞菌属(Aminomonas)、Ammonifex、Ammoniphilus、可变杆菌属(Amoebobacter)、无定形孢囊菌属(Amorphosporangium)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、小瓶菌属(Ampullariella)、无枝酸菌属(Amycolata)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、Anaeroarcus、厌氧杆菌属(Anaerobacter)、厌氧棒菌属(Anaerobaculum)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、厌氧分支杆菌属(Anaerobranca)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、厌氧丝菌属(Anaerofilum)、Anaeroglobus、厌氧绳菌属(Anaerolinea)、Anaeromusa、Anaeromyxobacter、Anaerophaga、厌氧枝原体属(Anaeroplasma)、棍状厌氧菌属(Anaerorhabdus)、Anaerosinus、Anaerostipes、厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、Anaerovorax、无形体属(Anaplasma)、绿臂菌属(Ancalochloris)、臂微菌属(Ancalomicrobium)、弯杆菌属(Ancylobacter)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、囊球菌属(Angiococcus)、角微菌属(Angulomicrobium)、厌氧芽抱杆菌属(Anoxybacillus)、Anoxynatronum、Antarctobacter、水杆菌属(Aquabacter)、Aquabacterium、水微菌属(Aquamicrobium)、水螺菌属(Aquaspirillum)、产液菌属(Aquifex)、蛛菌属(Arachnia)、隐秘杆菌属(Arcanobacteiium)、原囊菌属(Archangium)、弓形菌属(Arcobacter)、Arenibacter、非红单胞菌属(Arhodomonas)、杀雄菌属(Arsenophonus)、节杆菌属(Arthrobacter)、Asaia、Asanoa、无甾醇原体属(Asteroleplasma)、不粘柄菌属(Asticcacaulis)、Atopobacter、阿托波氏菌属(Atopobium)、橙单胞菌属(Aurantimonas)、金杆菌属(Aureobacterium)、固氮弧菌属(Azoarcus)、氮单胞菌属(Azomonas)、固氮丝菌属(Azomonotrichon)、Azonexus、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、嗜氮根瘤菌属(Azorhizophilus)、Azospira、固氮螺菌属(Azospirillum)、固氮菌属(Azotobacter)、Azovibrio、芽孢杆菌属(Bacillus)、丝杆菌属(Bacterionema)、Bacteriovorax、拟杆菌属(Bacteroides)、Bactoderma、Balnearium、巴氏丝菌属(Balneatrix)、巴氏通氏体属(Bartonella)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、贝日阿托氏菌属(Beggiatoa)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、贝内克氏菌属(Beneckea)、伯杰氏菌属(Bergeyella)、Beutenbergia、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)、芽生杆菌属(Blastobacter)、芽生绿菌属(Blastochloris)、芽球菌属(Blastococcus)、芽单胞菌属(Blastomonas)、蟑螂杆状体属(Blattabacterium)、博戈里亚湖菌属(Bogoriella)、博德特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、Bosea、短状杆菌属(Brachybacterium)、短状单胞菌属(Brachymonas)、短螺旋体属(Brachyspira)、Brackiella、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、Brenneria、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、短螺旋体属(Brevinema)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、索丝菌属(Brochothrix)、布鲁氏菌属(Brucella)、Brumimicrobium、巴克纳氏菌属(Buchnera)、布戴约维采菌属(Budvicia)、Bulleidia、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、Caedibacter、Caenibacterium、热杆菌属(Calderobacterium)、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、暖绳菌属(Caldilinea)、Caldimonas、暖发菌属(Caldithrix)、喜热菌属(Caloramator)、Caloranaerobacter、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、Caminibacter、Caminicella、弯曲杆菌属(Campylobacter)、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)、荚膜菌属(Capsularis)、嗜碳菌属(Carbophilus)、Carboxydibrachium、Carboxydobrachium、Carboxydocella、氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)、心杆菌属(Cardiobacterium)、Carnimonas、肉杆菌属(Carnobacterium)、显核菌属(Caryophanon)、乳酪杆菌属(Caseobacter)、链孢菌属(Catellatospora)、Catertibacteriurn、链状球菌属(Catenococcus)、短链游动菌属(Catenuloplanes)、卡托氏菌属(Catonella)、柄杆菌属(Caulobacter)、西地西菌属(Cedecea)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、噬纤维素菌属(Cellulophaga)、纤维微杆菌属(Cellulosimicrobium)、纤维弧菌属(Cellvibrio)。蜈蚣菌属(Centipeda)、Cetobacterium、钦氏菌属(Chainia)、螯合杆菌属(Chelatobacter)、螯合球菌属(Chelatococcus)、噬几丁质菌属(Chitinophaga)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣体属(Chlamydophila)、绿棒菌属(Chlorobaculum)、绿菌属(Chlorobium)、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、绿滑菌属(Chloroherpeton)、绿丝菌属(Chloronema)、软骨霉状菌属(Chondromyces)、着色菌属(Chromatium)、色杆菌属(Chromobacterium)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、金色单胞菌属(Chryseomonas)、产金菌属(Chrysiogenes)、柠檬酸球菌属(Citricoccus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、棍状杆菌属(Clavibacter)、克里夫兰氏菌属(Clevelandina)、梭菌属(Clostridium)、Cobetia、Coenonia、柯林斯菌属(Collinsella)、科尔韦尔氏菌属(Colwellia)、从毛单胞菌属(Comamonas)、Conexibacter、Conglomeromonas、粪芽孢菌属(Coprobacillus)、粪球菌属(Coprococcus)、粪热杆菌属(Coprothermobacter)、科里氏杆菌属(Coriobacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、科氏游动菌属(Couchioplane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othrix)、特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、密螺旋体属(Treponema)、Trichlorobacter、毛球菌属(Trichococcus)、Tropheryma、冢村氏菌属(Tsukamurella)、苏黎士菌属(Turicella)、Turicibacter、Tychonema、尿枝原体属(Ureaplasma)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)、漫游球菌属(Vagococcus)、吸血弧菌属(Vampirovibrio)、Varibaculum、贪噬菌属(Variovorax)、韦荣球菌属(Veillonella)、疣微菌属(Verrucomicrobium)、Verrucosispora、弧菌属(Vibrio)、食物谷菌属(Victivallis)、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)、Virgisporangium、Virgosporangium、Vitellibacter、透明颤菌属(Vitreoscilla)、Vogesella、沃氏菌属(Volcaniella)、火山栖热菌属(Vulcanithermus)、华诊体属(Waddlia)、威克斯氏菌属(Weeksella)、魏斯氏菌属(Weissella)、Wigglesworthia、Williamsia、沃尔巴克氏体属(Wolbachia)、沃林氏菌属(Wolinella)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、Xenophilus、致病杆菌属(Xenorhabdus)、Xylanimonas、木杆菌属(Xylella)、嗜木杆菌属(Xylophilus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、预研菌属(Yokenella)、扎瓦尔金氏菌属(Zavarzinia)、Zobellia、动胶菌属(Zoogloea)、Zooshikella、发酵细菌属(Zymobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)和嗜发酵菌属(Zymophilus)。
迄今，大量细菌基因组和病毒基因组的完整序列已保存在多个数据库中并为公众利用，例如GenBank，基因组研究所，www.tigr.org；GOLD基因组在线数据库，Integrated Genomics；igweb.integratedgenomics.com/GOLD，www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/10239.html。真菌的基因组信息也是本领域已知的，例如参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes。
出人意料地，多达25％的微生物的开放读码框是该属或种独有的(即特异性的)，这表明了微生物中巨大的多样性(Pucci MJ，B.T.，DoughertyTJ.2002.Bacterial“genes-to screens”，83-96页.K.Shaw(编辑)，PathogenGenomics.Humana Press Lie，Totowa，NJ.)。利用这些数据，基于遗传序列分析的诊断变为有力的工具。而且，因为抗生素抗性基因已被表征，它们还成为基于核酸的检测和鉴定的潜在靶标。WFCC-MIRCEN世界微生物数据中心(WDCM)提供了培养物收集的综合目录、微生物和细胞系的数据库以及生物多样性、分子生物学和基因组计划的入口(参见http://wdcm.nig.ac.jp/)。WDCM提供了以下链接(1)微生物基因组计 划，包括：京都大学生物信息学中心和奈良科学技术学院的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)基因组数据库(BSORF)；美国杜克大学衣藻资源中心；NITE基因组分析数据库(DOGAN)；网柄菌(Dictyostelium)cDNA数据库盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)cDNA计划(Dicty_cDB)；贝勒医学院的网柄菌基因组测序计划；美国威斯康辛-麦迪逊大学的大肠杆菌基因组计划(K-12和-157)；日本奈良科学技术学院的大肠杆菌基因组分析计划(GenoBase)；Kazusa DNA研究所的蓝细菌基因组数据库(CyanoBase)；日本的基因组信息中介(GIB)DNA数据库(2002年5月的84种微生物)；基因组至蛋白质和功能；GOLD：美国的基因组在线数据库主页Integrated Genomics Inc.；JGI计划：微生物基因组学DOE联合基因组学会；MagnaportheDB；日本东京大学医学科学院的疟疾全长cDNA数据库(恶性疟原虫)；微生物的基因组数据库比较分析(MBGD)；PEDANT：德国MIPS的基因组分析和评注；大肠杆菌染色体模式(PEC)；酵母基因组信息服务器；京都大学和蓝细菌研究协会的集胞蓝细菌PCC6803基因评注数据库(SYORF)生物信息学中心；基因组研究机构；(2)微生物遗传保藏中心，包括：大肠杆菌遗传资源国家遗传学会；美国耶鲁大学的大肠杆菌遗传保藏中心(CGSC)；美国的真菌遗传学保藏中心(FGSC)；国际互联网生物技术资源目录；PGSC假单胞菌遗传保藏中心(美国)；MAFF基因库的微生物部分；世界大肠杆菌保藏和数据库；(3)其它的基因组计划，包括：东京大学的异常剪接数据库HGC；拟南芥信息资源TAIR；BODYMAP人类基因解剖学表达数据库；BodyMap：人类和小鼠基因表达数据库；人类基因组研究生物数据库丹麦中心，丹麦奥尔胡斯大学的丹麦生物技术数据库；DDBJ国际核苷酸序列数据库；DNA信息和保存中心(DISC)；FlyBase：日本的果蝇NIG遗传和分子数据库；Flybase：伯克利果蝇基因组计划；GDB：基因组数据库；GenomeNet生物信息学中心，京都大学化学研究学会；GENOTK：东京大学的人类cDNA数据库Otsuka GEN研究所和HGC；日本的HOWDY(人类基因组)日本科学技术公司；人染色体21序列图谱RIKEN基因组科学中心(GSC)，人类基因组科研组；未鉴定的人类基因编码大蛋白质(HUGE)，KazusaDNA研究所；人类基因组计划信息；人类基因组测序中心(前身是“生物学家的控制台”)；INE(水稻基因组研究项目，日本)；John Wiley&SonsLtd.；日本科学技术公司的JST人类基因组测序页；MAGEST：Maboya(真海鞘(H.roretzi)基因表达模式和序列标记，京都大学；医学研究委员会；代谢途径；Moulon WWW服务器；RIKEN基因组科学中心的小鼠百科全书索引；小鼠基因组信息学(MGI)；德国慕尼黑蛋白质序列信息中心；NCBI Genbank；NEXTDB：线虫表达模式数据库，国家遗传学学会；国立卫生研究院(NIH)；核酸数据库计划(NDB)；p53MDB：p53突变数据库HGC，东京大学；大鼠基因组图谱，Otsuka GEN研究所，牛津大学，剑桥大学，Research Genetics Inc.和东京大学的HGC；水稻基因组研究项目(RGP)；SPAD：信号途径数据库，九州大学；综合的分枝菌数据库(MycDB)；OGMP；英国MRC人类基因组作图计划资源中心。
本文所述的方法用于检测病原体特异性靶标核酸的存在并测量其水平，从而检测生物样品中(尤其是从免疫抑制患者获得的样品中)的病原体，所述病原体包括病毒、细菌、原生动物和真菌病原体，尤其是病毒、细菌和原生动物病原体。该方法允许定量病原体特异性靶标核酸，例如核酸样品中病原体来源的DNA或RNA，以单个形式和允许在单个反应中测定两种或更多靶标核酸水平(例如表达水平或拷贝数)的多元形式均可。
本文所述方法和试剂盒所包括的其它病原体包括以下原生动物：微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、人环孢子虫(Cyclosporacayetanensis)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、弓形虫和微孢子虫。
原生动物
本文所述方法可用于检测原生动物病原体。在美国，由于肠原生动物和原生生物可能通过受损的食物和供水进行传播，因此它们归为B类病原体。许多这些生物感染家养和野生的动物。这些生物包括原生动物微小隐孢子虫、人环孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫、溶组织内阿米巴和人刚地弓形虫，以及原生生物微孢子虫，如脑炎微孢子虫(Encephalitozoon)和肠微孢子虫(Enterocytozoon)。尽管通常被这些生物中的大多数感染对于健康人来说是无症状的或自限性的，但在免疫抑制的人中发生临床症状。
就生物恐怖潜力而言，最重要的生物包括微小隐孢子虫、溶组织内阿米巴和人刚地弓形虫。这些生物可通过被污染的水和/或食物感染大量的人。另外，所有这些感染(除弓形体病外)可容易地在人与人之间传播并难以诊断。大多数还可以被遗传操作从而提高毒力或抗感染剂抗性。
大多数借助食品和水传播的B类原生动物和原生生物的生活史已非常清楚。然而，对这些生物中某些进行实验研究的限制在于体外培养的困难和动物模型的缺乏。
摄取微小隐孢子虫的卵囊导致肠上皮细胞的感染，其中所述生物在保护性液泡内进行复制。因为当卵囊从所述细胞释放时可发生自身感染，所以仅摄食少量卵囊便可导致免疫受损患者中严重且持久的感染。虽然其发病机制还不清楚，但是微小隐孢子虫可破坏肠的离子转运。微小隐孢子虫的两种不同的基因型感染人类，基因型I的测序几乎完成，而基因型II的测序正在进行中。
尽管人环孢子虫的分类学鉴定直至1993年才得以解决，但是在1979年就鉴定其与痢疾有关。卵囊是感染形式，并对冰冻和氯化处理均有抗性。卵囊包含两个孢母细胞，每个孢母细胞包含两个子孢子。小肠的感染可导致绒毛萎缩和固有层炎性浸润。尚不知道人环孢子虫的发病机制是否由于对肠细胞的直接影响所致，或者是涉及分泌毒素。
在摄取仅为10～25个的孢囊之后，营养子形式的蓝氏贾第鞭毛虫就在小肠定殖。营养子由4根鞭毛和吸盘或固着器组成，包括作为宿主识别的重要抗原的微管结构。粘附于上皮的机制还不确定，但是可能涉及特定的受体。通过将富含胱氨酸的表面蛋白改变为变体特异性表面蛋白(VSSP)，营养子发生了抗原性变化；这些表面蛋白还结合对于刷状缘酶具有重要性的金属，如锌。细胞介导的免疫应答可在肠的组织学损伤中发挥作用；未鉴定出肠毒素。有蓝氏贾第鞭毛虫的基因组计划，基因表达数据也是可用的。
像贾第鞭毛虫一样，溶组织内阿米巴的生活史由营养子和孢囊组成。由于新培养基的开发，关于溶组织内阿米巴发病机制的信息已迅速增加。粘附肠上皮细胞对于发病机制是关键的，因为营养子仅凭直接接触便能杀死靶细胞；粘附通过寄生生物的表面凝集素来介导。已鉴定出降解分泌型IgA、粘蛋白和其他宿主细胞表面糖蛋白、并促进细胞杀伤的其它寄生因子。溶组织内阿米巴基因组的测序正在进行中。
人刚地弓形虫以3种形式存在：卵囊、含有慢殖子的组织孢囊和速殖子。卵囊形式仅存在于被感染猫的肠中。在摄取后，从卵囊释放的子胞子穿透肠上皮细胞并在其中繁殖。上皮细胞的侵入似乎通过类锥体(速殖子上的锥形结构)介导。速殖子包含在上皮细胞内的液泡中，保护其免受溶酶体融合，并在扩散到***和其它组织之前破坏宿主细胞。孢囊形成发生在被感染组织中，包括脑、视网膜和肌肉。延迟型超敏反应导致组织囊肿的破裂和周围组织的坏死，这在视网膜中是具有临床重要性的。在免疫受损的宿主中，再次激活可导致显著的组织损伤并导致死亡。也可发生经胎盘的感染，在怀孕期间首次感染人刚地弓形虫的妇女中30％～40％发生胎儿感染。利用现有的大规模的基因组数据库和EST序列，正在进行人刚地弓形虫的基因组测序。
微孢子虫是唯一的细胞内产芽胞原生生物组。感染人类的微孢子虫包括小肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)、何氏脑炎微孢子虫(Enc.hellem)、兔脑炎微孢子虫(Enc.cuniculi)和比氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)，其对治疗具有抗性。所述孢子由抗性壁、一个或两个细胞核、孢原质、固定盘和螺旋极性管组成。在感染期间，所述极性管伸出，刺穿宿主细胞并注入孢原质。复制导致成熟孢子的数目增加，最终使细胞破裂。对于微小隐孢子虫，自身感染的潜能增加了孢子的产生。感染通常局限于肠中，只是在免疫受损的个体中可波及许多组织。兔脑炎微孢子虫的完整基因组测序已完成，已计划对比氏肠微孢子虫的基因组进行测序。
本文所述方法的定量测定方面：
一方面，本文所述的方法使用通过外源加入的已知不同浓度竞争剂核酸而产生的内标，所述内标产生已知大小的扩增产物，其大小彼此不同，而且不同于病原体特异性靶标核酸的大小。将尺寸分离(例如通过毛细管电泳进行)与检测(例如通过荧光检测进行)联用生成了由竞争剂核酸相应扩增产物的丰度产生的标准曲线。所述标准曲线允许测定原始样品中的病原体特异性靶标核酸浓度。
另一方面，描述了估计和/或测定核酸样品中病原体特异性靶标核酸水平的方法。该方法包括以下步骤。首先，为给定病原体选择靶标分子，所述靶标分子是特异性针对该病原体的，即所述靶标分子不与该测定中存在的其它病原体靶标分子发生反应。然后，对每种给定的病原体特异性靶标核酸选择一对扩增引物，在使用该对引物进行逆转录(对于RNA靶标)和扩增(例如，PCR扩增，对于RNA和DNA靶标都是)后，所述引物将产生已知长度的靶标扩增子。引物设计中的考虑因素是本领域技术人员公知的；然而，其中更为关键的方面是特异性(即引物应该在至少一组扩增条件下仅扩增期望的靶标分子)以及与反应中可能使用的其它引物的相容性(例如进行多元分析时)。寡核苷酸引物的长度和核苷酸含量(例如G+C含量)对于决定引物的特异性和杂交特征(例如，解链温度)是很重要的。对于寡核苷酸引物选择或设计的其他考虑因素是本领域技术人员已知的和/或描述于下文中。
然后，产生至少为两种的一组竞争剂核酸。所述竞争剂核酸与病原体特异性靶标核酸对于所选扩增引物共有同样的引物结合序列(或其互补序列)，但是与使用同一组扩增引物扩增病原体特异性靶标序列时产生的扩增子长度不同。重要的是，当选定的扩增引物对用于产生各自的扩增产物时，所述至少两种竞争剂核酸具有相对于彼此并相对于病原体特异性靶标核酸来说相似的扩增效率(如本文对该术语的定义)。在至少两种竞争剂核酸的组中，优选在使用相同的引物时一种竞争剂产生较长的扩增子，另一种竞争剂产生较短的扩增子。(如下文所讨论的，也可以包含不同量的其它更长或更短的竞争剂，例如，用于改变该测定的分辨率)。在另一些实施方案中，所述至少两种竞争剂核酸中的每一种可产生比靶标核酸产生的扩增子更长的扩增子。应该理解，在这种情况下，每种竞争剂应该产生相对于彼此并且相对于靶标扩增子为不同已知长度的扩增子。在另一些实施方案中，所述至少两种竞争剂核酸中的每一种可产生比靶标核酸产生的扩增子更短的扩增子——同样，这时竞争剂扩增子彼此之间以及与靶标扩增子之间必须相差已知的长度。产生本文所述方法中所使用核酸的方法是本领域众所周知的，例如，PCR(对于DNA竞争剂)或者从质粒或其它分离的模板DNA进行体外转录(对于RNA竞争剂)，或者化学合成。用于PCR、体外转录以及产生与给定DNA模板长度不同的模板的方法对于本领域技术人员来说是公知的和/或描述于下文中。
竞争剂核酸扩增子的大小差异应该是可通过能区分大小相差10个核苷酸/碱基对或更少、优选地5个核苷酸/碱基对或更少或者甚至1个核苷酸或碱基对的核酸的方法检测到的差异。例如，非常适合的方法是毛细管电泳。使毛细管电泳允许检测少至1个核苷酸的长度差异的条件是公知的。虽然本文所述方法中旨在包括少至1个核苷酸的差异，然而优选竞争剂和靶标之间的差异至少为5个核苷酸，从而在通过例如毛细管电泳进行分离时可以更好地分辨所得扩增子与靶标扩增子。还考虑了大于5个核苷酸的差异，例如10、20、30、40或50个核苷酸。然而，差异不应大到使得靶标扩增子或至少一种其它竞争剂扩增子的扩增效率显著不同(即，导致扩增效率E的差异绝对值大于0.2，其中E＝(Pn+1-Pn)/(Pn-Pn-1)(其中Pn是PCR产物在第n循环时的量)。影响扩增效率的因素是本领域技术人员公知的，其包括例如引物的Tm、扩增子的长度、扩增子的核苷酸组成、靶标或引物中可能的二级结构以及例如反应中核苷酸修饰的存在。扩增效率及其影响因素的测量是本领域技术人员已知的和/或描述于下文中。
一种产生竞争剂核酸的简便方法包括在病原体特异性靶标扩增子的序列内部***或缺失序列。该方法使竞争剂核酸和靶标核酸之间的相似性最大化，这进而使得扩增效率更有可能是相似的。这样，将在对应于靶标核酸的克隆或扩增的序列拷贝(例如，克隆的cDNA)上进行定点诱变，从而添加或缺失足以改变扩增子大小的核苷酸序列，所述扩增子是将选定引物对用于扩增时产生的。当然，很明显不应诱变所选引物对所结合的序列。可以通过本领域公知的多种方法中任何方法来进行定点诱变。
针对每种病原体特异性靶标核酸产生3、4或更多竞争剂核酸的组可能是有用的。额外的竞争剂可以扩大或更精确地限定给定的测定中定量测定的范围。也就是说，当在反应中使用例如浓度范围为10～10,000个分子的第一和第二竞争剂时，可以通过所述竞争剂生成的标准曲线来测定给定体积初始样品中10～10,000个分子的靶标核酸浓度。尽管该测定可相当精确，然而更窄的竞争剂浓度范围(例如10至500或1,000个分子)可以提高精确度。类似地，在首先进行估计时，范围可以较宽(例如，10～50,000个分子)，如果期望更精确地测定靶标核酸浓度，则之后的反应在较窄的浓度下进行。对于给定反应中的给定靶标核酸来说，包含不同浓度的3、4或更多种竞争剂核酸可能是有利的。本领域的技术人员会了解，随着竞争剂浓度的提高，可能需要调整扩增引物的量或扩增反应的其它参数。
一旦选择了一对扩增引物并且产生了一组竞争剂核酸，可通过以下步骤来定量测定样品中的靶标核酸：将测试核酸样品与一组至少两种竞争剂分子组合，对靶标和竞争剂核酸进行逆转录以及使用所述扩增引物对来扩增靶标和竞争剂序列。在一个替代性方法中，可以在从测试样品中提取核酸之前将竞争剂核酸添加至样品中。在这种情况下，靶标和竞争剂核酸将一起被分离。
为了尽可能精确，加至样品中的竞争剂应该使得至少一种以低于靶标核酸浓度的已知浓度添加，并且至少一种以高于靶标核酸浓度的已知浓度添加。竞争剂核酸的已知浓度应该相差至少一个数量级(即10倍)，但相差几个数量级(例如100倍、1,000倍或更多)可能是有利的。如果靶标核酸的预计量完全未知，则使用不同范围的竞争剂进行一次或多次预实验以鉴定给定靶标的预计范围浓度可能是有利的。或者，可使用多种较不精确的定量扩增方法的一种或另一种从而获得粗略估计的预计浓度。这些方法在本领域是已知的，并使用例如针对单个参照模板在一系列平行反应中进行滴定。
当病原体特异性靶标核酸是RNA时使用逆转录。逆转录是本领域公知的，并可利用从用于扩增的酶中分离的酶(例如，使用逆转录酶如MMLV逆转录酶)或利用相同的酶(例如，Tth聚合酶或另一种本领域已知具有RNA模板依赖性和DNA模板依赖性引物延伸能力的聚合酶)来进行。可以在PCR步骤的同一反应混合物中进行逆转录(一步方案)，或者可以在应用PCR扩增之前进行逆转录(两步方案)。
类似地，DNA扩增是本领域公知的。可在逆转录RNA之后使用Taqman和QuantiTect SYBR***。
核酸扩增方法：
本文所述方法主要借助标准PCR，其中靶序列侧翼的一对选定引物指导模板依赖地合成复制的DNA。然而，这并不排除可适用于本文所述方法的其它方法(例如，连接酶介导的扩增或另外的等温扩增方法，例如自动维持序列扩增(Self Sustained Sequence Replication，3SR)，Gingeras等，1990，Annales de Biologie Clinique，48(7)：498-501；Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：1874；见下文)。在任何这样的替代方法中，关键要素仍然是实现靶标RNA和一组至少两种竞争剂核酸的相似扩增效率。
3SR是基于转录的扩增***(trancription-based amplification，TAS)的派生物，它利用高启动子序列特异性和噬菌体DNA依赖型RNA聚合酶的重复特性来降低实现高水平扩增所需的扩增循环数(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83：1173-1177)。
在3SR中，每种引发寡核苷酸包含噬菌体RNA聚合酶结合序列和优选的转录起始序列，例如T7 RNA聚合酶结合序列(TAATACGACTCACTATA)和优选的T7聚合酶转录起始位点。每种引物的其余序列是与待扩增分子的靶标序列互补的。
示例性3SR条件在下文中有所描述。所述3SR扩增反应在含有靶标RNA、40mM Tris-HCl(pH8.1)、20mM MgCl2、2mM亚精胺-HCl、5mM二硫苏糖醇、80μg/ml BSA、1mM dATP、1mM dGTP、1mM dTTP、4mM ATP、4mM CTP、1mM GTP、4mM dTTP、4mM ATP、4mMCTP、4mM GTP、4mM UTP和适量寡核苷酸引物(250ng的57聚体；该量根据引物序列的长度而按比例增加或降低)的100μl中进行。3SR反应使用3～6阿摩尔(attomole)的核酸靶标。作为背景对照，平行进行无任何靶标的3SR反应。将所述反应混合物加热至100℃1分钟，然后迅速冷却至42℃。1分钟后，加入10单位(通常体积约为2μl)逆转录酶(例如，鸟类成髓细胞血症(myoblastosis)病毒逆转录酶(AMV-RT)；LifeTechnologies/Gibco-BRL)。该反应在42℃孵育10分钟，然后加热至100℃1分钟。(如果使用单链模板进行3SR反应，则反应混合物改为加热至65℃1分钟。)然后，反应冷却至37℃2分钟，之后加入4.6μl的3SR酶混合物，其包含1.6μl AMV-RT(18.5单位/μl)、1.0μl T7 RNA聚合酶(100单位/μl)(二者例如均来自Stratagene；La Jolla，CA)和2.0μl大肠杆菌RNase H(4单位/μl)(例如来自Gibco/Life Technologies；Gaithersburg，MD)。本领域的技术人员熟知根据需要调整酶的体积来补偿取自不同生产批次或由不同的制造商提供的酶的比活性变化。如果必要的话，还可以改变酶的单位数。反应在37℃孵育1小时，并利用冷冻来终止。
想要通过取样来监测扩增进展时，可以在3SR反应的任何阶段进行取样。由于3SR在单一温度下连续进行，因此没有可取出等分试样的单个循环。因此，可以在扩增孵育期的设定时间(例如，每分钟、每两分钟、每3分钟等)进行取样。然后，分离所取出或挤出的等分试样中的核酸并检测核酸，从而允许产生扩增谱，从其中可以测定最初样品中的靶标丰度。
也有人将3SR称为基于核酸序列的扩增(或NASBA，Nucleic AcidBased Amplification)(实例参见Compton，1991，Nature，350：91-92；Kievits等，1991，J.Virol Meth.35：273-286，二者均通过参考并入本文中)。
可用于本发明的另一核酸扩增方法是DNA连接酶扩增反应(ligaseamplification reaction，LAR)，它已被描述为通过几种细菌DNA连接酶中任何一种的活性来允许特定的短序列指数增加(Wu和Wallace，1989，Genomics，4：560；Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189，二者均通过参考并入本文中)。这项技术是基于寡核苷酸探针的连接。将探针设计成精确匹配特定靶标核酸的两段邻近序列。在过量的探针存在时，扩增反应重复三个步骤：(1)双链核酸的热变性，(2)将探针退火至靶标核酸，以及(3)通过热稳定的DNA连接酶连接所述探针。所述反应通常重复20-30个循环。本文公开的取样方法允许产生详细的扩增谱。至于任何循环扩增方案，需要时(例如需要建立扩增谱时)，可在任意循环之后取样，然而优选在每个循环之后取样。
滚环扩增(rolling cirlce reaction，RCA)是已证明影响与PCR一样大的一种替代性扩增技术。该技术利用某些病毒的DNA复制机制。在RCA中，类似于许多病毒使用的复制技术，聚合酶沿着DNA环读出单个启动子，连续滚动出该环的线性多连体拷贝。在这样的线性RCA中，所述反应可进行3天，产生小环序列的几百万拷贝。已经开发出了指数式变化形式，其中另一启动子在每个重复时取代双链，并起始DNA复制中的超分枝(hyperbranching)，每小时产生多达1012个拷贝。
可得益于本文公开的取样方法的另一种扩增方法是链置换扩增(strand-displacement amplification，SDA；Walker等，1992，Nucleic AcidsRes.，20：1691-1696；Spargo等，1993，Mol.Cellular Probes 7：395-404，其中每篇均通过参考并入本文中)。SDA使用两种类型的引物和两种酶(DNA聚合酶和限制性内切核酸酶)来不同步地指数式产生单链扩增子。基本方法的变化形式降低了引物与引物的相互作用，所述方法中扩增引物组锚定到芯片上的特定区段。这种所谓的“锚定SDA”方法使得可以进行多元DNA或RNA而不会降低扩增效率(Westin等，2000，Nature Biotechnology18：199-204，其通过参考并入本文中)。SDA可受益于本文所述的取样和分离方法，因为重复取样可以产生详细的扩增谱。
在逆转录(必要或期望时)和扩增后，本文所述的方法包括通过尺寸来分离核酸扩增产物。核酸的尺寸分离是众所周知的，例如，通过琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳或通过柱层析法(包括HPLC分离)。优选使用既快速又精确的毛细管电泳方法，其容易实现分离尺寸差异小至仅为一个核苷酸的分子。毛细管电泳使用少量的样品，并且非常适于进行检测(例如荧光检测)。毛细管电泳是本领域公知的并详细描述于下文中。
如上所讨论的，在分离后检测对应于病原体特异性靶标核酸和竞争剂核酸的扩增核酸。所述检测同时记录给定大小核酸的给定条带的位置以及该核酸的丰度(例如通过UV吸收或优选地通过荧光信号)。可简单地通过在扩增前或扩增期间将一种或多种荧光核苷酸添加至扩增反应混合物，从而将这样的核苷酸掺入扩增核酸中。一种替代性方法是对一种或多种扩增引物进行荧光标记，使得从该引物扩增的每条链均包含至少一个与其相连的荧光标记。虽然本文所述方法意在完全包括使用荧光标记核苷酸类似物来标记扩增产物，然而标记一种或多种扩增引物的优势在于：不同靶标核酸的引物可用不同的荧光团有区别地进行标记，从而扩展用本文所述方法可实现的多元可能性范围。使用该方法，即使是大小相似的几组不同的病原体特异性靶标和竞争剂的扩增子也可以在同一反应中进行区分。
在对经过扩增、分离的病原体特异性靶标和竞争剂分子进行检测后，本文所述方法使用所检测的竞争剂量作为标准。因为竞争剂的原始浓度已知、扩增序列的信号与每个序列的初始量成比例，并且每个靶标和竞争剂分子的扩增效率相似，所以可根据竞争剂的量来测定原始样品中靶标核酸的量。当优选地作为内标的竞争剂最初以接近靶标分子浓度的浓度存在时，该方法的准确度进一步得到加强。
应注意到，所述扩增方法(如PCR)通常表现出动力学性质，这使得扩增过程存在有限的指数阶段，在所述指数阶段中扩增模板的量与反应中的原始模板量严格成比例。在给定的循环方案中该阶段的确切位置将根据以下因素而变化，所述因素包括靶标序列、引物序列和最初的靶标模板丰度。本文所述方法非常适于确定靶标序列在指数阶段中究竟何时被扩增(或者说正在扩增，这是说循环和检测同时或至少同时期进行时的情况)。因此，一方面，本文所述方法可受益于将扩增循环方案中的重复取样与所取出的样品中靶标及竞争剂核酸的分离和检测联用。例如，扩增期间的多个点或循环的荧光标记的靶标和竞争剂扩增子使得人们可以产生靶标(或者靶标和竞争剂)扩增子丰度对循环数的曲线(常为自动绘制)。该方法对任意给定的靶标或竞争剂准确鉴定其扩增以指数进行的阶段，这继而允许鉴定靶标模板的原始量。内标(例如已知浓度的较长和较短的竞争剂)的加入进一步加强了可通过该方式获得的数据的准确度。也就是说，不仅具有提供用于鉴定原始浓度的曲线的内标，而且还具有了解原始模板和扩增产物之间的对应在反应中的哪一点为最佳的优势。这个点对于一个反应中不同的扩增子来说可能不同。同样，取样方法及其得到的谱允许对反应中的每种不同扩增子确定这些不同的点，这允许针对给定测定中不同的目标病毒进行更精确的病毒载荷测定。
在扩增循环方案期间取出样品可手动进行，或者优选自动进行，例如在机器人控制下进行。自动化取样可增强取出样品时间的一致性，并可有助于避免在手动取样条件下可能发生的交叉污染。自动化取样和分析设备(包括毛细管电泳设备)描述于2003年3月12日提交的共同未决的美国专利申请No.10/387,286，其全部内容通过参考并入本文中。
本文所述的竞争性定量测定方法非常适于在单个反应中多元测定给定样品中多种不同的病原体特异性靶标核酸。这优选地通过选择靶标扩增子和竞争剂扩增子的大小，从而针对每种不同的靶标核酸得到可通过扩增子大小进行区分的不同靶标和竞争剂扩增子组来实现。作为替代或补充，可使用特异性针对不同靶标/竞争剂扩增子组的区别性标记扩增引物，从而在同一反应中区别性地检测不同的靶标扩增子。基本的多元PCR方法和成功进行该方法所必需考虑的因素是本领域已知的并且易于应用到本文所述方法中，其中有效分离和检测来自不同已知靶标的不同尺寸扩增子的能力允许在单个反应中检测多个(例如，2、3、5、10、20、50或更多)靶信号。多元PCR通常需要特异性针对不同靶标的引物之间的相互作用最小化，从而减少假象——就是说，人们设法避免反应中使用的任意两种引物彼此杂交而不与其各自靶标分子杂交的能力。通常可利用的软件包可以分析和预测给定引物组的引物-引物相互作用。
引物设计
本文所述方法依赖于将DNA寡核苷酸引物用于扩增病原体特异性靶标和竞争剂序列。这些方法中使用的寡核苷酸引物可根据本文所述的本领域公知的一般指导以及如本文所述的特殊需求，对所述特定方法的每个步骤进行设计。
1.引物设计的通用策略
寡核苷酸引物的长度为5～100个核苷酸，优选17～45个核苷酸，尽管不同长度的引物都可使用。用于合成cDNA的引物优选为10-45个核苷酸，而用于扩增的引物优选约17-25个核苷酸。还通过解链温度估计法将可用于本文所述方法中的引物设计成具有特定的解链温度(Tm)。可使用商品程序包括OligoTM、Primer Design和互联网上可利用的程序(包括Primer3和Oligo Calculator)来计算可用于本发明中的多核苷酸序列的Tm。优选地，可用于本发明的扩增引物的Tm(通过Oligo Calculator计算)优选为约45℃～65℃，更优选为约50℃～60℃。
多核苷酸的Tm影响其与另一多核苷酸的杂交(例如，寡核苷酸引物退火至模板多核苷酸)。在所述方法中，优选的是多个步骤中使用的寡核苷酸引物与靶标模板或者制备或分离自该靶标模板的多核苷酸(即，cDNA的第一和第二链以及扩增产物)选择性杂交。通常，选择性杂交发生在两种多核苷酸序列基本互补(在至少14～25个核苷酸的一段上至少约65％互补，优选至少约75％互补，更优选至少约90％互补)时。参见Kanehisa，M.，1984，Polynucleotides Res.12：203，其通过参考并入本文中。
因此，预计引发位点处一定程度的错配是可以容忍的。这样的错配可以很小，如1、2、3个核苷酸。或者，错配区可包含环，其定义为其中存在4个或更多个核苷酸的不间断序列的错配的区域。本文所述方法优选100％互补。
多种因素影响引物与另一多核苷酸分子杂交的效率和选择性。在设计可用于本文所述方法的引物时考虑了这些因素，包括引物长度、核苷酸序列和/或组成、杂交温度、缓冲液组成以及在引物需要杂交的区域中可能的空间位阻。
引物长度与引物退火至靶序列的效率和精确度之间均存在正相关。具体地，较长的序列具有比较短的序列更高的解链温度(TM)，并且在给定的靶序列内重复的可能性更小，因此使混杂杂交最小化。高G-C含量或包含回文序列的引物序列倾向于像与其目标靶位点杂交一样进行自身杂交，因为在溶液中单分子比双分子的杂交动力学通常更有利。然而，也很重要的是设计包含足够数目的G-C核苷酸对的引物，因为每个G-C对通过3个氢键结合，而不是像A和T碱基对结合靶序列时那样为2个氢键，因此形成更紧密更牢固的键。杂交温度与引物退火效率反方向变化，对于可能包含在引发反应或杂交混合物中的有机溶剂(例如甲酰胺)浓度也是如此，而盐浓度的提高则有助于结合。在严格退火条件下，较长的杂交探针或合成引物比较短的更有效地杂交，后者在更为宽松的条件下是足够的。优选地，在允许多核苷酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下(例如，对于PCR扩增为95℃)，在适当的缓冲液(例如1×RT缓冲液，Stratagene目录号_600085，1×Pfu缓冲液，Stratagene目录号_200536；或1×克隆Pfu缓冲液，Stratagene目录号_200532，或适于cDNA合成和扩增所使用其它酶的其它缓冲液)中进行严格杂交。严格杂交的条件可根据寡核苷酸引物的长度和/或多核苷酸组成而变化(例如盐浓度小于约1M，更通常小于约500mM，优选地小于约200mM)，杂交温度也可根据它们而变化(例如从低至0℃到高于22℃、高于约30℃以及(最常)高于约37℃)。对于特定的杂交，较长的片段可能需要较高的杂交温度。因为几种因素影响杂交的严格性，所以参数的组合比单个因素的绝对度量更加重要。
使用易于获得的计算机程序可有助于设计本文所述方法中使用的引物组，所述计算机程序开发用于辅助评估上述若干参数并优化引物序列。这样的程序的实例为DNAStarTM软件包(DNAStar，Inc.；Madison，WI)的“PrimerSelect”、OLIGO 4.0(National Biosciences，Inc.)、PRIMER、Oligonucleotide Selection Program、PGEN和Amplify(描述于如上引用的Ausubel等中)。
2.寡核苷酸合成
寡核苷酸引物本身使用本领域公知的技术合成。制备特定序列寡核苷酸的方法包括例如克隆和限制性消化适当的序列以及直接化学合成。设计完毕后，寡核苷酸也可通过适当的化学合成法来制备，所述方法包括例如描述于Narang等，1979，Methods in Enzymology，68：90的磷酸三酯法、公开于Brown等，1979，Methods in Enzymology，68：109的磷酸二酯法、公开在Beaucage等，1981，Tetrahedron Letters，22：1859中的二乙基氨基磷酸酯法，以及公开于美国专利号4,458,066中的固体支持法，或者通过使用商品化的自动化寡核苷酸合成仪(市售的)或VLSIPSTM技术的其它化学方法来制备。
竞争剂RNA的设计和合成：
当用于如本文所述的方法中时，竞争剂核酸应通过对给定病原体特异性靶标核酸选择的相同引物组进行扩增，并与使用相同选定引物组的靶标核酸具有相似的扩增效率。竞争剂核酸应该使用所选引物组获得扩增产物，所述扩增产物的长度彼此可区分，并与靶标核酸扩增产物的长度可区分。分离技术的分辨率将必然影响可区分的长度差异。如上所述，通常可实现少至一个核苷酸的差异，尽管即使是在这样的情况下使用更长的长度以提供对信号的更好区分也是有用的。一个关键因素是使得长度差异长至足以通过所选方法(例如，毛细管电泳)进行检测，但又短至足以不显著改变其相对于靶标核酸的扩增效率。也就是说，较长或较短的竞争剂核酸的扩增效率必须与靶标核酸的扩增效率相似。
如上所述，竞争剂核酸的特征在于存在允许其进行扩增的序列，所述扩增通过选择用于扩增给定的病原体特异性靶标核酸的寡核苷酸引物来进行。竞争剂核酸通过扩增病原体特异性靶标核酸的相同引物对进行扩增，这确保了引物对靶标和竞争剂序列的退火效率是相同的，这对于确保竞争剂和靶标核酸相似的扩增效率是重要的。
为了维持相似的扩增效率，重要的是竞争剂核酸(或更准确地说，其扩增产物)具有与靶标核酸(或其扩增产物)相似的Tm。用于对任何给定序列评估Tm的方法是本领域公知的。如果Tm相对于靶标核酸在例如1-2℃、优选0.5至1℃或更小的差异内，则Tm是相似的。优选竞争剂和靶标核酸包含至少20个序列一致的核苷酸或碱基对。这优选地作为共同引物结合序列的补充。靶标和竞争剂核酸的引物结合序列不需要一致，但应该允许利用同样的引物进行扩增。因为引物退火效率的差异影响扩增效率，所以最简单的是维持病原体特异性靶标和竞争剂序列之间这些序列的一致性。
为了得到扩增效率与病原体特异性靶标核酸必然相似的竞争剂核酸，一种最简单的方法是修饰对应于病原体特异性靶标核酸的克隆cDNA，所述修饰通过在病原体特异性靶标序列本身中***或缺失短(例如***或缺失1-20个核苷酸，例如***或缺失5-20个核苷酸或5-10个核苷酸)片段(即，内部***或缺失)来进行。这确保了退火和扩增效率的相似特征，仅有的差异是内部的***或缺失。虽然***或缺失短连续序列更容易实现，但本实施方案中所涵盖的***或缺失还可包括***或缺失不连续的核苷酸或碱基对，也就是说，在病原体特异性靶标序列内部的多于一个位置上取出或***。对于较短的靶标扩增子序列(例如50～75个核苷酸)，使长度差异保持在该范围的较短一侧(例如1～5个核苷酸)是有利的，因为这在百分比基础上使得序列组成的变化较小。对于较长的靶标扩增子序列，长度差异可以更长，而不显著影响分子的扩增特征。即使在较长靶标扩增子序列的情况下，***或缺失仍优选10个核苷酸(或碱基对)或更少，特别是使用能够分辨少至1个核苷酸或碱基对的方法(例如CE)进行大小分离时。
本领域的技术人员会理解，一种影响扩增效率的因素是存在相同核苷酸的重复片段(例如poly A、poly G等)，与没有所述重复的相似序列相比，这通常降低扩增效率。因此，当考虑所添加(或缺失)的序列时，最好添加或缺失核苷酸组成大致平衡的序列。添加或缺失的序列可以是氨基酸编码或非编码序列，并且需要时任选地可包括常规或非常规核苷酸。
使用本领域公知的定点诱变技术容易在竞争剂核酸组的产生中实现序列***或缺失。本领域已知允许DNA序列定向诱变的多种方法(参见如Ausubel等.Short Protocols in Molecular Biology(1995)第三版.JohnWiley & Sons，Inc.)。另外，有多种市售的试剂盒用于定点诱变，常规和基于PCR的方法均包括在内。实例包括GeneMorph随机诱变试剂盒(Stratagene目录号600550或200550)、可从Stratagene获得的EXSITETM基于PCR的定点诱变试剂盒(目录号No.200502)和来自Stratagene的QUIKCHANGETM定点诱变试剂盒(目录号No.200518)，以及同样来自Stratagene的
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双链定点诱变试剂盒(目录号No.200509)。
扩增效率的测量在下文进行描述。
一旦设计好竞争剂的序列，用于本文所述方法的竞争剂核酸可通过例如本领域已知的化学合成、PCR来产生，或者当竞争剂核酸是RNA时通过体外转录产生。体外转录技术是本领域技术人员公知的。简言之，将目的序列与用于原核生物聚合酶的启动子序列(如噬菌体T7、T3和Sp6RNA聚合酶启动子)连接，然后使用适当的聚合酶在体外转录DNA模板。所述模板本身可以是线性PCR产物，其中已引入启动子，例如通过在PCR扩增引物之一中包含适当的启动子序列来引入。如有需要，与各在一个末端的两个不同启动子连接产生了得到竞争剂RNA的互补序列的可能。
或者，可以将对应于期望竞争剂RNA的DNA序列***含有Sp6、T3或T7启动子的载体中。用适当的限制性酶将所述载体线性化，所述限制性酶在位于竞争剂序列下游的单个位点消化所述载体。在酚/氯仿抽提后，用乙醇沉淀DNA，在70％乙醇中洗涤、干燥并重悬在无菌水中。不管启动子/模板构建体的确切形式(即线性PCR产物或线性化的载体构建体)如何，体外转录反应均通过将所述线性DNA在转录缓冲液(200mMTris-HCl，pH8.0、40mM MgCl2、10mM亚精胺、250 NaCl[T7或T3]或者200mM Tris-HCl，pH7.5、30mM MgCl2、10mM亚精胺[Sp6])、二硫苏糖醇、RNase抑制剂、4种核糖核苷三磷酸中的每一种以及Sp6、T7或T3 RNA聚合酶中孵育(例如37℃30分钟)来进行。如果期望制备包含RNA的标记多核苷酸，则可以省略未标记的UTP并将标记的UTP包括在反应混合物中。标记可包括例如荧光标记或放射性标记。然后用DNaseI孵育从而除去DNA模板。可以使用苯酚抽提除去DNA酶和聚合酶，然后沉淀并定量RNA，例如通过UV吸收和/或通过电泳并相对于已知的标准品进行目测。
聚合酶链式反应：
PCR提供了用于快速扩增特定DNA序列的成熟方法，其通过使用由热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶所催化的多个DNA复制循环来扩增目的靶标序列。PCR需要存在待扩增的靶标核酸序列、待扩增序列侧翼的两种单链寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液和盐。
在Mullis和Faloona，1987，Methods Enzymol.，155：335(其通过参考并入本文中)中以及美国专利No.4,683,202、4,683,195和4,800,159(其全部也通过参考并入本文中)均描述了PCR。本领域的普通技术人员用最少的实验即可容易地选择或确定用于特异性扩增靶标序列的反应条件。本领域的技术人员还了解基本方案的多种变化。
根据实际的严格度要求来调整PCR循环每个步骤(变性、引物退火和延伸)的长度和温度以及循环数。退火温度和时间通过引物退火至模板的预期效率和能够容忍的错配程度来确定。优化引物退火条件的严格度的能力在本领域普通技术人员的能力之内。最常使用的退火温度为30℃～72℃。模板分子的最初变性通常发生在92℃～99℃，例如4分钟，然后为10-40个由变性(94℃-99℃，15秒～1分钟)、退火(如上所述确定的温度；30秒～2分钟)和延伸(72℃，30秒～1分钟；这对于Taq聚合酶是最佳的--本领域技术人员了解或者可以容易地确定针对不同热稳定聚合酶的适当延伸条件)组成的循环。取决于产物的预期用途，最终的延伸步骤常进行较长的时间，例如在72℃进行4分钟，并且之后可以在4℃进行无限期储存(0-24小时)。
聚合酶：
本文所述的方法可使用多种DNA聚合酶。用于所述方法中的合适DNA聚合酶可以是或不是热稳定，尽管热稳定的聚合酶对于使用热循环进行扩增的实施方案显然是优选的。已知的常规DNA聚合酶包括：例如激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶(Lundberg等，1991，Gene，108：1，由Stratagene提供)、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)DNA聚合酶(Hinnisdaels等，1996，Biotechniques，20：186-8，由Boehringer Mannheim提供)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶(Myers和Gelfand 1991，Biochemistry 30：7661)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶(Stenesh和McGowan，1977，Biochim Biophys Acta 475：32)、Thermococcus litoralis(Tli)DNA聚合酶(也叫作Vent DNA聚合酶，Cariello等，1991，Polynucleotides Res，19：4193，由New England Biolabs提供)、Vent exo(New EnglandBiolabs)、9°Nm DNA聚合酶(New England Biolabs的停产产品)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(Tma)DNA聚合酶(Diaz和Sabino，1998，Braz J.Med.Res，31：1239)、水生栖热菌(Tgermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶(Chien等，1976，J.Bacteoriol，127：1550)、Pyrococcuskodakaraensis KOD DNA聚合酶(Takagi等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：4504)、JDF-3 DNA聚合酶(来自热球菌属物种JDF-3，专利申请WO 0132887)、火球菌属GB-D(PGB-D)DNA聚合酶(也叫作Deep-Vent DNA聚合酶，Juncosa-Ginesta等，1994，Biotechniques，16：820，provided by New England Biolabs)、UlTma DNA聚合酶(来自嗜热菌海栖热袍菌；Diaz和Sabino，1998，Braz J.Med.Res.31：1239；由PEApplied Biosystems提供)、Tgo DNA聚合酶(来自thermococcusgorgonarim，由Roche Molecular Biochemicals提供)、大肠杆菌DNA聚合酶I(Lecomte和Doubleday，1983，Polynucleotides Res.11：7505)、T7DNA聚合酶(Nordstrom等，1981，J.Biol.Chem.256：3112)以及古细菌的DP1/DP2 DNA聚合酶II(Cam等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：14250-5)。
对于热循环反应，所述聚合酶优选热稳定的聚合酶如Taq、DeepVent、Tth、Pfu、Vent和UlTma，均易于从商业来源获得。类似地，使用每一种这些酶的指导可以在指南、产品资料、互联网(参见例如www.alkami.com)及其它来源的许多方案中容易找到。
对于非热循环反应以及在某些热循环反应中，所述聚合酶常为本领域普遍使用和市售的多种聚合酶中的一种，如DNA polI、Klenow片段、T7 DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶。在涉及转录的应用中，多种RNA聚合酶也是市售的，如T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。可以在产品资料和一般的分子生物学指南(如Sambrook或Ausubel，二者均在前引用)容易地找到使用这些聚合酶的指导。
聚合酶可在合成多核苷酸期间掺入标记的(例如荧光的)核苷酸或其类似物。参见，例如Hawkins等，U.S.专利号5,525,711，其中描述了通过Taq掺入的核苷酸类似物的用途。
如上所述，除另有说明，本文所述方法所需的扩增反应通常可使用标准反应条件和试剂来进行。这些试剂和条件是本领域技术人员公知的，并且描述在许多参考文献和实验方案中。参见，例如Innis(如上引用)；Sambrook(如上引用)；Ausubel，等编辑(1996)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，由Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.合资。还可参见Mullis等，(1987)美国专利号4,683,202和Arnheim & Levinson(1990)C&EN 6-47，The Journal OfNIE Research(1991)3：81-94；Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173；Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874；Lomell等(1989)J.Clin.Chem 35：1826；Landegren等，(1988)Science 241：1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology 8：291-294；Wu和Wallace，(1989)Gene 4：560；Barringer等(1990)Gene 89：117以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology 13：563-564。
扩增效率：
如上所述，在使用时，竞争剂核酸的扩增效率应该类似于病原体特异性靶标核酸的扩增效率。在一个方面中，扩增效率表达为每个PCR循环的扩增倍数，表示为相对于理想倍增的分数或百分比。100％或1.0的扩增效率表示理想倍增。
监测扩增效率的一种方式是测量当PCR产物的信号强度达到扩增样品的预定阈值(例如信号强度背景值的10倍标准差)时的阈值循环数(Ct)。例如，在扩增方案的每个循环时取出样品并分析靶标扩增子的量。比较初始量相等的两种不同扩增模板(例如靶标RNA和竞争剂RNA)的Ct将确定扩增效率是否相似。为了增加准确度，该测定可以在靶标和竞争剂RNA的几种不同的相等初始浓度下进行。如果相等初始量的每种竞争剂/靶标组的阈值循环(Ct)是相同的，则认为扩增效率是“相似的”。
Ct与初始DNA的原始拷贝数或浓度的关系通过以下简单的数学等式来表示：
Log(拷贝数)＝aCt+b，其中a和b是常量。
因此，通过测量来自两种不同样品的相同基因片段的Ct，可容易地估计这些样品中该基因的原始浓度。或者，通过测量连续的循环中扩增产物的量(例如，通过荧光强度或标记掺入)来监测扩增效率，使用公式E＝(Pn+1-Pn)/(Pn-Pn-1)计算效率，其中P是在第n个循环中扩增产物的量。
尽管扩增效率的相似性最终将经验性确定，但维持竞争剂中靶序列的一致性(除了为产生相对于靶标可检测的长度差异而必需的***或缺失以外)将有助于实现相似的效率。
已知在核酸样品制备物中存在的多种污染物可影响扩增效率。本文所述方法的优势在于：对于任意给定的病原体特异性靶标，任何这样的污染物很可能以相似的程度影响竞争剂和靶标扩增子的扩增效率，因为每一种所述扩增子在同一反应中产生。这通常会降低任何这种对有效扩增的抑制所带来的影响。
制备样品
本发明的病原体特异性靶标多核苷酸可以是单链或双链的，并且可以是DNA(例如gDNA或cDNA)、RNA、同时包含DNA和RNA的多核苷酸或者包含DNA、RNA和/或其类似物和衍生物的多核苷酸。如果希望测定病毒基因的表达水平，则靶标多核苷酸是RNA分子(例如mRNA分子)。
在扩增反应前，可以获得对于待使用的扩增方法来说为合适的量和性质的病原体特异性靶标多核苷酸。例如，在某些情形中，样品包含低水平的靶标多核苷酸，以至于进行预扩增反应以增加靶标多核苷酸的浓度是有用的。如果要扩增样品，通常根据已知的操作使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。在某些实施方案中，可能优选将已知量的竞争剂核酸添加至生物样品中，然后共分离样品中的竞争剂和测试核酸。
可以从大量的来源找到制备包含靶标多核苷酸的样品的指导，包括PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications(Innis等，如上引用；Sambrook等，如上引用；Ausubel等，如上引用)。本文所述的方法中可使用任何所述方法。通常，这些方法包括细胞裂解，然后通过如酚/氯仿抽提、电泳和/或层析的方法纯化多核苷酸。这些方法常包括以下步骤：沉淀多核苷酸(例如用乙醇)并重悬在用于加入PCR或类似反应物的适当缓冲液中。
在某些实施方案中，来源于一种或多种样品的两种或更多的病原体特异性靶标多核苷酸在一个反应中进行分析。在这些实施方案中，可以由单个样品或单个个体扩增多种病原体特异性靶标多核苷酸，从而可以评估来自一个个体的样品中可能存在的多种病原体，例如用于在免疫抑制个体中同时筛选多种病原体。使用本文所述的方法可以容易地完成上述任何应用。
反应混合物可包含一种病原体特异性靶标多核苷酸，或者它可包含两种或更多种病原体特异性靶标多核苷酸、多达例如15或16种病原体特异性靶标多核苷酸。因此，本方法允许同时分析单一样品中的两种或更多种多核苷酸，即多元分析。
一旦获得初始的细胞、组织、器官或其它样品，可通过本领域公知的方法从它们制备核酸(包括RNA和/或DNA)。来自免疫受损个体(例如维持免疫抑制治疗的移植或移植物受者)的样品通常是血液或血清样品。从血液样品中分离核酸的方法是本领域技术人员公知的。
可以根据以下方法从例如组织中纯化RNA。取出目的组织后，切下≤2g的组织块并速冻在液氮中，以防止RNA降解。在加入适当体积的胍溶液(例如每2g组织加入20ml胍溶液)后，用两次或三次的10秒冲击在组织研磨器中研磨组织样品。为了制备组织胍溶液(1L)，将590.8g异硫氰酸胍溶于约400ml的经DEPC处理的H2O中。加入25ml的2MTris-HCl，pH7.5(终浓度为0.05M)和20ml Na2EDTA(终浓度为0.01M)，将溶液过夜搅拌，体积调节至950ml，并加入50ml的2-ME。
匀浆的组织样品在120C以12,000×g离心10分钟。所得上清液在0.1倍体积的20％肌氨酰存在下在65℃孵育2分钟，在9ml的5.7M CsCl溶液(0.1g CsCl/ml)中分层，并通过在22℃以113,000×g过夜离心进行分离。小心地除去上清液后，将管倒置并干燥。将管的底部(含有RNA沉淀)置于50ml塑料管中并在4℃在3ml组织重悬缓冲液(5mM EDTA，0.5％(体积/体积)肌氨酰，5％(体积/体积)2-ME)中孵育过夜(或更久)，从而使所述RNA沉淀完全重悬。所得的RNA溶液依次用25∶24∶1酚/氯仿/异戊醇、24∶1氯仿/异戊醇进行萃取，通过加入3M乙酸钠(pH5.2)和2.5体积的100％乙醇进行沉淀，并重悬在DEPC水中(Chirgwin等，1979，Biochemistry，18：5294)。
或者，可根据以下的一步方案从组织中分离RNA。在玻璃特富龙匀浆器中，每100mg组织在1ml变性液(4M硫代硫酸胍、25mM柠檬酸钠，pH7.0、0.1M 2-ME，0.5％(重量/体积)N-十二烷基肌氨酸)中通过匀浆来制备目的组织。将匀浆转移至5ml聚丙烯管，依次加入0.1ml的2M乙酸钠(pH4)、1ml用水饱和的苯酚和0.2毫升49∶1氯仿/异戊醇。在加入每种组分后混合样品，并在所有组分加入后于0-4℃孵育15分钟。通过在4℃以10,000×g离心20分钟来分离样品，通过加入1ml的100％异丙醇进行沉淀，在-20℃孵育30分钟并通过4℃以10,000×g离心10分钟进行沉淀。所得的RNA沉淀溶于0.3ml变性液中，转移至微量离心管，通过在-20℃加入0.3ml的100％异丙醇30分钟进行沉淀，并在4℃以10,000×g离心10分钟。在70％乙醇中洗涤RNA沉淀，干燥并重悬在100-200μl经DEPC处理的水或经DEPC处理的0.5％SDS中(Chomczynski和Sacchi，1987，Anal.Biochem.，162：156)。
分离总RNA的试剂盒和试剂可从多个公司获得，例如，RNA分离试剂盒(Stratagene，La Lola，CA，目录号200345)；PicoPureTM RNA分离试剂盒(Arcturus，Mountain View，CA，目录号KIT0202)；RNeasyProtect小量、中量和大量试剂盒(Qiagen，目录号74124)。
在某些实施方案中，本方法使用的总RNA用于随后的分析，例如用于逆转录。在另一些实施方案中，mRNA可以从总RNA或直接从样品分离用于逆转录。分离mRNA的试剂盒和试剂从例如Oligotex mRNA试剂盒(Qiagen，目录号70022)获得。
标记的核苷酸
本文所述的方法可受益于使用标记，包括例如荧光标记。在一个方面中，荧光标记可以是嵌入或结合扩增的(通常是双链的)核酸分子从而发出信号的标记或染料。可用于该实施方案的一种染料是SYBR绿(SYBRGreen)(例如，SYBR绿I或II，从Molecular Probes Inc.，Eugene，OR获得)。本领域已知的其它染料也可使用在本文所述的方法中。该方法的一个优势是相对于使用例如标记核苷酸来说降低了成本。尽管如此，也可优选通过附着到标记的核苷酸或核苷酸类似物来掺入标记，所述标记的核苷酸或核苷酸类似是聚合酶的底物。或者，标记可附着于扩增引物。如上文所教导地，标记的核苷酸可以是与荧光染料连接的核苷酸，或者它可以是固有地发出荧光的核苷酸。在本文所述方法的一个实施方案中，使用了连有荧光染料的常规脱氧核苷酸。一些有用的标记核苷酸的非限制性实例列于表1中。
表1.标记核苷酸的实例
    荧光素标记     荧光团标记
    荧光素-12-dCTP     伊红-6-dCTP
    荧光素-12-dUTP     香豆素-5-ddUTP
    荧光素-12-dATP     四甲基罗丹明-6-dUTP
    荧光素-12-dGTP     德克萨斯红-5-dATP
    荧光素-N6-dATP     LISSAMINETM-罗丹明-5-dGTP
    FAM标记     TAMRA标记
    FAM-dUTP     TAMRA-dUTP
    FAM-dCTP     TAMRA-dCTP
    FAM-dATP     TAMRA-dATP
    FAM-dGTP     TAMRA-dGTP
    ROX标记     JOE标记
    ROX-dUTP     JOE-dUTP
    ROX-dCTP     JOE-dCTP
    ROX-dATP     JOE-dATP
    ROX-dGTP     JOE-dGTP
    R6G标记     R110标记
    R6G-dUTP     R110-dUTP
    R6G-dCTP     R110-dCTP
    R6G-dATP     R110-dATP
    R6G-dGTP     R110-dGTP
    生物素标记     DNP标记
    生物素-N6-dATP     DNP-N6-dATP
荧光染料标记的核苷酸可从商业来源购买。标记的多核苷酸核苷酸还可通过任何本领域已知的多种方法进行制备。
可用作可检测的标记荧光染料是本领域技术人员公知的，并且许多实例可以在Handbook of Fluoresdent Probes and Research Chemicals第六版，Richard Haugland，Molecular Probes，Inc.，1996(ISBN0-9652240-0-7)中找到。
优选地，荧光染料可基于与自动化毛细管电泳设备上检测的相容性进行选择，因此应该可通过光谱进行分辨并且不显著干扰电泳分析。用作可检测标记的适当荧光染料的实例可见于美国专利号5,750,409；5,366,860；5,231,191；5,840,999；5,847,162；4,439,356；4,481,136；5,188,934；5,654,442；5,840,999；5,750 409；5,066,580；5,750,409；5,366,860；5,231,191；5,840,999；5,847,162；5,486,616；5,569,587；5,569,766；5,627；027；5,321,130；5,410,030；5,436,134；5,534,416；5,582,977；5,658,751；5,656,449；5,863,753；PCT公开WO 97/36960；99/27020；99/16832；欧洲专利EP 0 050684；Sauer等，1995，J.Fluorescence 5：247-261；Lee等，1992，Nucl.AcidsRes.20：2471-2483；和Tu等，1998，Nucl.Acids Res.26：2797-2802等文献，以上所有均全部并入本文中。
可修饰核苷酸以使其包括用于连接荧光染料的官能团，如伯胺和仲胺、羟基、硝基和羰基(参见表2)。
表2
官能团 反应 产物
胺 染料-异硫氰酸酯 硫脲
胺 染料-琥珀酰亚胺酯 羧酰胺
胺 染料-磺酰氯 磺胺
胺 染料-醛 烷基胺
酮 染料-酰肼 腙
酮 染料-氨基脲 腙
酮 染料-碳酰肼 腙
酮 染料-胺 烷基胺
醛 染料-酰肼 腙
醛 染料-氨基脲 腙
醛 染料-碳酰肼 腙
醛 染料-胺 烷基胺
脱氢氨基丁酸 染料-巯基 甲基羊毛硫氨酸
脱氢丙氨酸 染料-巯基 羊毛硫氨酸
有用的荧光团包括但不限于：德克萨斯红TM(TR)、LissamineTM罗丹明B、Oregon绿TM 488(2’，7’-二氟荧光素)、羧基rhodol和羧基罗丹明、Oregon绿TM500、6-JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素、伊红F3S(6-羧基甲硫基-2’，4’，5’，7’-四溴-三氟荧光素)、Cascade蓝TM(CB)、氨甲基香豆素(AMC)、芘、丹磺酰氯(5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯)和其它萘、PyMPO、ITC(1-(3-异硫氰酸苯)-4-(5-(4-甲氧苯基)-噁唑-2-基)溴化吡啶)、香豆素、荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、萤光黄、罗丹明、BODIPY、四甲基罗丹明、Cy3、Cy5、Cy7、伊红和ROX。荧光团组合如荧光素-罗丹明二聚体(如Lee等(1997)，Polynucleotides Research 25：2816所述)同样适用。合适的荧光团包括在可见光谱或可见光谱外吸收和发射(如在紫外或红外范围内)的荧光团。合适的荧光染料标记可以从Molecular Probes，Lie，Eugene，OR，US和Research Organics，Inc.，Cleveland，OH，US等处获得，并可以在Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals第六版，Richard Haugland，Molecular Probes，Inc.，1996(ISBN 0-9652240-0-7)中找到。
可用于本文所述方法的标记核苷酸包括本领域已知的固有发出荧光的核苷酸，例如美国专利号6,268,132(其全部通过参考并入本文中)所述的新型荧光核苷类似物。美国专利号6,268,132的荧光类似物具有3种通用的类型：(A)C-核苷类似物；(B)N-核苷类似物；和(C)N-氮杂核苷酸和N-脱氮杂核苷酸类似物。所有这些化合物具有3个共同特征：1)它们是普通核苷的结构类似物，能够在寡核苷酸的酶合成或化学合成中替换天然存在的核苷；2)当用适当波长的光激发时，它们天然发出荧光，并且其检测不需要另外的化学或酶方法；以及3)它们与一般天然存在的DNA在光谱上显著不同。在美国专利号6,268,132中已鉴定至少125种特定的化合物。这些化合物已根据其分类、结构、化学名称、吸收光谱、发射光谱和合成方法进行表征，显示于美国专利号6,268,132的图21A-21F-1中。
本文所述的标记核苷酸还包括但不限于：荧光N-核苷和荧光结构类似物。间型霉素A(通常称为间型霉素)是荧光核苷类似物的原型，其最初作为抗肿瘤抗生素从中间型诺卡氏菌(Nocardia interforma)的培养滤出液中分离(Hori等[1966]J.Antibiotics，Ser.A 17：96-99)，其结构鉴定为7-氨基-3-b-D-呋喃核苷(ribafuranosyl)(1H-吡唑(pyrazolo)-[4，3d]嘧啶))。该抗生素还分离自淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)(Aizawa等[1965]Agr.Biol.Cheni.29：375-376)和关岛链霉菌(Streptomyces gummaensis)(日本专利号10,928，于1967年授权给Nippon Kayaku Co.，Ltd.)的培养液中，它是所有来源的RNA中普遍可见的N-核苷的多种微生物C-核糖核苷类似物之一。另一些分离自微生物的天然存在C-核糖核苷包括间型霉素B(Koyama等[1966]Tetrahedron Lett.597-602；Aizawa等，如上引用；Umezawa等[1965]Antibiotics Ser.A18：178-181)、氧间型霉素B(Ishizuka等[1968]J.Antibiotics 21：1-4；Sawa等[1968]Antibiotics 21：334-339)、假尿苷(Uematsu和Suahdolnik[1972]Biochemistry 11：4669-4674)、焦土霉素(Darnall等[1967]PNAS57：548-553)、吡唑霉素(Sweeny等[1973]Cancer Res.33：2619-2623)和最小霉素(Kusakabe等[1972]J.Antibiotics 25：44-47)。间型霉素、间型霉素B和氧间型霉素B是吡唑嘧啶核苷(pyrazolopyrimidinenucleoside)，分别是腺苷、肌苷和次黄嘌呤的结构类似物；文献中尚未报道从天然来源获得的鸟苷的吡唑嘧啶结构类似物。生物合成这些化合物的综述参见Ochi等(1974)J.Antibiotics xxiv：909-916。每篇参考文献的全部通过参考并入本文中。
分离和检测扩增产物：
检测多核苷酸存在或量的方法是本领域公知的，并且任何这些所述方法可用于本文所述的方法，只要它们至少通过竞争剂和靶标扩增子之间的长度差异能够分离各个多核苷酸即可。所用的分离技术应允许分辨长度为25～1000个核苷酸或碱基对，并且分辨率为10个核苷酸或碱基对或更高。所述分离可在变性或非变性或天然条件下进行，即分离可针对单链或双链核酸来进行。优选分离和检测所允许检测的长度差异小至1个核苷酸。更优选分离和检测可以高通量形式进行，其允许实时或同时测定在循环反应期间取出的多个反应物等分试样中的扩增子丰度。可用于分离和分析扩增产物的方法包括但不限于电泳(例如，毛细管电泳(CE)、层析(dHPLC)和质谱)。
在一个实施方案中，CE是优选的分离手段，因为它提供了至少10-1,000个碱基对的多核苷酸的良好分离，其分辨率为单个核苷酸或碱基对。可通过本领域公知的方法进行CE，例如公开于美国专利号6,217,731；6,001,230和5,963,456中，其通过参考并入本文中。高通量的CE仪器市面有售，例如来自Spectrumedix Corporation(State College，PA)的HTS9610高通量分析***和SCE 9610全自动96-毛细管电泳遗传分析***；来自Beckman Instruments Inc(Fullerton，CA)的P/ACE 5000系列和CEQ系列；以及ABI PRISM 3100遗传分析仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)。在这些仪器接近CE柱末端的位置，扩增的DNA片段经过测量荧光标记信号的荧光检测器。这些仪器提供为荧光标记PCR产物的检测提供了自动化的高通量。
与常规的平板凝胶电泳相比，在本文所述方法中使用CE可得到更高的生产力。平板凝胶电泳中的分离速度是有限的，因为当高电场应用于凝胶时产生热。因为毛细管大表面积的散热非常迅速，所以毛细管电泳中可施加较高的电场，从而加快了分离过程。通过使用毛细管凝胶，分离速度比常规的平板凝胶***提高约10倍。
使用CE还可以同时分析多种样品，这对于高通量是必需的。例如，这通过使用多重毛细管***来实现。在某些情形中，多孔基质和毛细管壁的光散射使得检测DNA碱基的荧光变得复杂。然而，可使用共聚焦荧光扫描仪来避免由于光散射造成的问题(Quesada等，1991，Biotechniques 10：616-25)。
在一个实施方案中，本文所述的方法测量样品中包含的用作扩增模板的特定病原体特异性靶标多核苷酸(例如，DNA或RNA)的量(即拷贝数)。
在另一实施方案中，可以在免疫治疗过程中或免疫抑制过程中监测病原体水平的差异，而不是测量样品中所包含的病原体特异性靶标多核苷酸的绝对拷贝数。例如，可以对两个独立样品中至少两种竞争剂和病原体特异性靶标核酸中的每一种记录尺寸分离后所检测的信号强度，并用于确定两种样品中靶标多核苷酸的相对比值。阈值循环数(Ct)计算为扩增产物的PCR产物的信号强度达到一组阈值(例如信号强度背景值的10倍标准差)时的循环数。特定靶标的运算差异性表达测定为在值大于1个循环的两个(或更多)样品中该靶标的阈值循环数(Ct)的差异。除了在这样的实施方案中通过参照来自至少两种竞争剂核酸的信号来实现定量以外，还可以使用给定反应中给定靶标的阈值循环数来推导出靶标多核苷酸的拷贝数以及通过该靶标在两种或更多种样品中拷贝数的比值来测量表达差异。
作为PCR或其它扩增反应的产物的核酸片段可使用本领域已知的标准方法分离(例如根据大小)和检测，包括但不限于凝胶电泳(如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管凝胶电泳)、层析(如高效液相层析(HPLC)和气相层析(GC))、光谱法(如质谱法(MS)和GC-MS)、红外光谱法和UV光谱测定法)、分光光度法(如荧光分光光度法)、大气压化学电离质谱法(atmospheric pressure chemical ionization massspectroscopy)、稳定电势电流测定法(potentiostatic amperometry)、免疫测定(如ELISA)、电化学检测和解链曲线分析。
已使用多种质谱分析技术分析不同大小的DNA(Nelson等，″Volatilization of High Molecular Weight DNA by Pulsed Laser Ablationof Frozen Aqueous Solutions，Science，246，1585-87(1989)；Huth-Fehre等，Rapid Communications in Mass Spectrometry，6，209-13(1992)；K.Tang等，Rapid Communications in Mass Spectrometry，8，727-730(1994)；Williams等，″Time-of Flight Mass Spectrometry of Nucleic Acids by LaserAblation and Ionization from a Frozen Aqueous Matrix，″RapidCommunications in Mass Spectrometry，4，348-351(1990))。
近年来，用于质谱分析的电离技术(称为基质辅助激光解吸电离(MALDI))的开发已在飞行时间质谱的用途及其性能的改进中产生了广泛的关注。MALDI对于电离大分子(例如肽和蛋白质、碳水化合物、糖脂、糖蛋白和寡核苷酸(DNA))以及其他多聚体尤其有效，(MALDI-TOFanalysis：Ross，High level multiplex genotyping by MALDI-TOF massspectrometry，Nature Biotechnology 16(1998)，1347-1351)。因此，质谱法可用于检测和/或定量本文所述方法的扩增核酸产物以及任何病原体特异性标志物或宿主基因产物，所述产物和标志物为核酸、蛋白质、脂质或其它多聚体。
宿主应答
寄生生物感染引发宿主针对病原体的应答。在宿主应答中活化基因的产物可作为病原体感染的标志物用于本文所述的方法中。或者，宿主基因可用作多元测定中的参考对照。在每种情形中，都可以与给定的生物样品中病原体特异性序列或其它标志物的鉴定和/或定量同时检测和/或定量宿主基因的产物(转录物或多肽)。在一个方面中，所述产物由早期宿主应答基因编码。宿主应答基因产物的实例包括但不限于：细胞因子、趋化因子、配体及其它可改变、增加或增强宿主对病原体的应答的分子。取决于免疫抑制的类型和过程，这些宿主应答基因中的一些在免疫抑制患者中可能不以与正常患者中相同的程度表达。然而，优选地所述宿主应答基因与目的病原体特异性标志物共表达，这使得可以同时检测二者。
针对一种或多种病原体的宿主应答通常引发炎性应答，其包括活化可在核酸和/或蛋白质水平检测到的因子级联。通常，病原体逃避或破坏宿主的初级屏障如上皮细胞或内皮细胞，导致组织损伤。所述组织损伤导致促炎介质(pro-inflammatory mediator，包括血浆蛋白酶***)、脂质介质以及促炎肽和细胞因子的产生。血浆蛋白酶包括补体途径中、激肽级联中以及涉及内稳态的酶。炎症的脂质介质包括***素、白三烯和血小板活化因子。促炎肽包括组胺和血清素、神经肽，急性期血浆蛋白包括C-反应性蛋白、血清淀粉状蛋白A和纤维蛋白原。促炎细胞因子包括但不限于：TNFα、IL-1-β和IL-6。其它的炎症介质包括但不限于瘦素和脂质运载蛋白。
本文所述方法还包括监测由于感染一种或多种目的病原体而在免疫受损患者或者具有发生由所述一种或多种目的病原体导致的传染病风险的个体中感染性疾病的发生情况，其中所述目的病原体选自病毒、细菌或原生动物及其任意组合，其包括a)从患者或个体获得的生物样品，b)检测和定量测定指示所述一种或多种目的病原体的一种或多种病原体特异性标志物，其中所述病原体特异性标志物可包括来源于所述样品中所述一种或多种病原体的核酸、蛋白质、多糖和/或脂质或其任意组合，以及c)计算样品中一种或多种所述目的病原体的量，其中所述量表示为每单位体积和/或重量所述样品中的微生物拷贝数。
在上述在生物样品中检测病原体的方法中，免疫受损患者可以并且很可能没有感染性疾病的症状。测试样品中一种或多种目的病原体的计算量允许评估发生由感染该一种或多种病原体所导致疾病的可能性，并且可以是确定向所测试免疫受损患者施用何种(如果有的话)预防性治疗的一个因素，或者可以是确定免疫抑制治疗方案将作何变化(如果有的话)的一个因素。所述免疫受损患者可以是移植或移植物受者，并且可以正在接受免疫抑制治疗。
在上述在生物样品中检测病原体的方法中，所述一种或多种目的病原体在多元测定中进行评估，并可以在对单个患者样品进行的一系列病原体特异性测试中进行评估。在一个方面中，所述患者样品可选自血液、唾液和尿液。每种病原体特异性标记的量可使用特异性针对每种所述病原体的抗体来测量，并可定期进行以监测感染性疾病的出现或发展。所述监测可以例如一月一次或者更频繁。
实施例
实施例1.设计和合成寡核苷酸
使用PrimerSelect软件(DNASTAR Inc，Madison，WI)基于以下标准来选择引物：
19-24个核苷酸的长度；解链温度(Tm)54.5-58.2℃；引物稳定性为-45.9至-39.9kcal/mol；7个核苷酸的独特引物3′序列；避免自身引物和形成长于2个连续碱基(忽略从3′端的开始的8个双链体碱基)的引物配对；避免长于2个碱基的内部引物发夹；3′五聚体的稳定性最低为-8.5kcal/mol或更高。
另外，对所选引物对评估不同对之间多元二聚体形成，以消除任何稳定性小于-6.0kcal/mol的潜在二聚体。另外，使用BLAST检索程序针对非冗余DNA数据库(Gene Bank，NCBI)来筛选引物，从而消除任何与哺乳动物多核苷酸具有显著(多于总体14个连续核苷酸或从3′端开始10个连续核苷酸)同源性的引物。
实施例2.PCR扩增和微生物的终点检测。
A.使用微生物特异性引物进行微生物RNA的一步式RT-PCR检测。
将RNA模板加入反应混合物中，所述反应混合物在总体积50或100μl中含有0.25μM的每种RT引物(可选的)、0.25μM的基因特异性PCR引物(微生物特异性引物对之一在5′端用FAM标记)、改良的1×Stratagene RT-PCR缓冲液(Brilliant Single Q RT-PCR试剂盒目录号600532)、0.1％ Triton X100、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2和1.25UStrataScript RTase(Stratagene，La Jolla，CA)，并用矿物油覆盖。在45℃进行逆转录50分钟，然后在94℃孵育2分钟以失活RTase。然后，样品使用94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟的44个循环组成的方案进行PCR扩增。当升至第一个72℃延伸时，加入1U热稳定DNA聚合酶(Vent exo(-)(New England Biolabs))。在44个循环后，将扩增等分试样(3-5μl)立即与甲酰胺混合以终止反应。如下所述，通过毛细管电泳分析样品。
为了确认无扩增产物的情况不是由于反应组分失效所致，在RT-PCR前将10-1000拷贝/反应的对照RNA模板和对照模板的一对引物(0.25μM)加至反应混合物中。不存在微生物特异性扩增产物时，存在扩增的对照模板被认为是不存在特定微生物的指示。
通过毛细管电泳分离样品。将3μl样品加入包含适当的荧光标记DNA大小标准品(Bio Ventures，Murfreesboro，TN)的7μl甲酰胺中。将样品热变性、涡旋并上样到3100遗传分析仪毛细管电泳设备(ABI，Foster City，CA)上。以3kV注射样品20秒，然后以15kV在POP4聚合物(ABI，FosterCity，CA)上进行分离。通过所述设备提供的Gene Scan v3.7.1软件分析数据的峰和相对面积。
B.两步式RT-PCR方案
对于逆转录来说，将RNA模板和RT特异性寡核苷酸引物加至10％甘油中，在70℃加热10分钟，然后置于冰上2分钟。加入缓冲液(终浓度：50mM Tris-HCl，pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、0.01M DTT、0.8mMdNTP、0.2mg/ml BSA、20％海藻糖)、160U的Superscript II RNAase H-逆转录酶(SSRTII；Invitrogen，Carlsbad，CA)和32U的RNA酶抑制剂(Ambion，Austin，TX)使总体积为40μl。在45℃进行逆转录20分钟，然后在75℃进行变性步骤。加入50U SSRTII起始在48℃进行30分钟的第二轮逆转录。所述样品在80℃进行另一2分钟的变性步骤，然后加入50USSRTII在52℃进行另一轮30分钟的逆转录。用0.04M NaOH(终浓度)对样品进行碱处理并在65℃孵育15分钟，之后加入终浓度为0.07M的Tris，pH 7.5，然后将该样品在室温孵育5分钟。然后，按照厂家说明书使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，cat.28704，Valencia，CA)回收样品，只是在提取前向每个RT样品加入360μl QG缓冲液来调整pH。以50μl10mM Tris，pH8.5洗脱样品。第二条链的合成包括将第一条DNA链加入总体积为60μl的4mM Tris-HCl(pH 7.5)、20mM MgCl2、50mM NaCl、0.2 dNTP和1.6μM的上游第二条链引物。将不包含引物的混合物加热至95℃，然后加入引物。在95℃将反应物变性4分钟，降至37℃并加入6.5USequenase DNA聚合酶。然后，在37℃孵育反应物0.5-1小时。如上所述使用Qiagen的QlAquick凝胶提取试剂盒(目录号28704)再次纯化样品并进行PCR扩增。反应缓冲液由以下组成：10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH 8.8)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、0.2mM dNTP、20％Q溶液(Stratagene，La Jolla，CA)、2％DMSO、2U Vent或Vent-exo(-)DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，Ma.)和10μM的适当引物(其中一种用荧光探针标记)。在95℃对没有引物和酶的样品变性1分钟。然后，加入PCR引物，再继续变性4分钟。扩增进行95℃30秒，62℃30秒和72℃1分钟的45个循环。当升至第一个72℃延伸循环时加入Vent聚合酶。在扩增44个循环后，或者在整个扩增循环中，取出等分试样(3-5μl)并立即与甲酰胺混合以终止反应。如上所述通过毛细管电泳分析样品。
实施例3.PCR扩增和微生物的实时检测。
A.使用基因特异性引物进行的微生物RNA一步式RT-PCR检测。
简言之，在50或100μl的总体积中，将RNA样品(1-5μl)加入反应混合物中，所述反应混合物含有0.25μM的每种RT引物(可选的)、0.25μM的微生物特异性PCR引物(微生物特异性引物对之一在5′端用FAM标记)、改良的1×Stratagene RT-PCR缓冲液(Brilliant SingleQ-RT-PCR试剂盒目录号600532)、0.1％Triton X100、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2和1.25U StrataScript RTase(Stratagene，La Jolla，CA)，并用矿物油覆盖。在45℃进行逆转录50分钟，然后在94℃孵育2分钟以失活RTase。然后，使用由94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟的44个循环组成的方案进行样品的PCR扩增。当升至第一个72℃延伸时，加入1U的热稳定DNA聚合酶(Vent exo(-)(New England Biolabs))。为了同时将DNA聚合酶加入多个管，预先将聚合酶分配至新的管盖中，并用包含DNA聚合酶的管盖替换覆盖PCR管的管盖。PCR扩增20个循环后，连续收集24个循环延伸期末的3μl等分试样。立即将所述等分试样与甲酰胺混合以终止反应。如下所述，通过毛细管电泳分析样品。
为了确认无扩增产物的情况不是由于反应组分失效所致，在RT-PCR前将10-1000拷贝/反应的对照RNA模板和对照模板的一对引物(0.25μM)加至反应混合物中。不存在微生物特异性扩增产物时，存在扩增的对照模板被认为是不存在特定微生物的指示。
通过毛细管电泳分离样品。将3μl样品加入包含适当的荧光标记DNA大小标准品(Bio Ventures，Murfreesboro，TN)的7μl甲酰胺中。将样品热变性、涡旋并上样至3100遗传分析仪毛细管电泳设备(ABI，FosterCity，CA)。在3kV下注射样品20秒，然后以15kV在POP4聚合物(ABI，Foster City，CA)上进行分离。通过与所述设备一起提供的Gene Scanv3.7.1软件分析数据的峰和相对面积。
数据分析：在Microsoft Excel中将对应于靶标微生物特异性扩增子的相对峰面积作为PCR循环数的对数函数作图。将每条曲线的线性部分外推至主观决定的阈值(例如，1000相对荧光单位)以计算阈值循环(Ct)数。使用反应中已知拷贝数微生物的Ct值生成校准曲线。
B.使用带标签的基因特异性引物的微生物RNA的两步式RT-PCR检测：
对于逆转录来说，将样品RNA和RT特异性寡核苷酸引物加至10％甘油中，在70℃加热10分钟，然后置于冰上2分钟。加入缓冲液(终浓度：50mM Tris-HCl，pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、0.01M DTT、0.8mMdNTP、0.2mg/ml BSA、20％海藻糖)、160U的Superscript II RNA酶H逆转录酶(SSRTII；Invitrogen，Carlsbad，CA)和32U的RNAsin(Ambion，Austin，TX)使总体积为40μl。在45℃进行逆转录20分钟，然后在75℃进行变性步骤。加入50U SSRTII起始在48℃进行30分钟的第二轮逆转录。所述样品在80℃进行另一2分钟的变性步骤，然后加入50U SSRTII在52℃进行另一轮30分钟的逆转录。用0.04M NaOH(终浓度)对样品进行碱处理并在65℃孵育15分钟，之后加入终浓度为0.07M的Tris，pH7.5，然后将该样品在室温孵育5分钟。然后，按照厂家说明书使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，目录号28704，Valencia，CA)回收样品，只是在提取前向每个RT样品加入360μl QG缓冲液来调整pH。以50μl 10mM Tris，pH8.5洗脱样品。第二条链的合成包括将第一条DNA链加入总体积为60μl的4mM Tris-HCl(pH 7.5)、20mM MgCl2、50mM NaCl、0.2 dNTP和1.6μM上游第二条链引物中。将不包含引物的混合物加热至95℃，然后加入引物。在95℃将反应变性4分钟，降至37℃并加入6.5U Sequenase DNA聚合酶。然后，在37℃孵育反应1小时。如上所述使用Qiagen的QlAquick凝胶提取试剂盒(目录号28704)再次纯化样品。在总体积100μl中进行PCR扩增，用无DNA酶的矿物油覆盖反应物以防止实验期间的蒸发。反应缓冲液由以下组成：10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.8)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、0.2mM dNTP、20％Q溶液(Stratagene，La Jolla，CA)、2％DMSO、2U Vent DNA聚合酶(NewEngland Biolabs，Beverly，Ma.)和10μM的适当引物(其中一种用荧光探针标记)。在95℃对没有引物和酶的样品变性1分钟。然后，加入PCR引物，再继续变性4分钟。进行由95℃30秒、62℃30秒和72℃1分钟的不同循环数(取决于实验)组成的扩增。当升至第一个72℃延伸循环时加入Vent聚合酶。在24个循环中连续取出3μl的等分试样，并立即加至包含合适的标准品的7μl甲酰胺中(见上文)。
实施例4：使用以荧光标记dNTP进行的PCR扩增和标记DNA片段的毛细管电泳分离对微生物进行终点检测。
将包含微生物RNA的5000个拷贝的血浆RNA提取物与未标记的微生物特异性引物(0.25μM)和dNTP(dATP、dCTP和dGTP每种100μM，dTTP 65μM)在50μL Brilliant单步定量RT-PCR核心试剂缓冲液(Stratagene目录号600532)中混合，并在45℃逆转录50分钟，所述缓冲液包含0.1％Triton X-100、1.5mM MgCl2和1.25U StrataScript RTase(Stratagene，La Jolla，CA)。通过在94℃加热2分钟终止反应。RT完成后，将1U的Vent(Exo-)DNA聚合酶(NE Biolabs目录号M0257S)和350μM荧光素-12-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸(从Roche目录号1 373 242获得)加入混合物中。进行40个循环的PCR扩增：94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒。在PCR扩增结束时取出3μl等分试样，并如上所述利用毛细管电泳进行分析。
实施例5：使用荧光标记的dNTP进行实时PCR扩增，以及利用毛细管电泳分离标记的DNA片段。
将血浆RNA提取物ARE中微生物RNA的连续稀释物与未标记的微生物特异性引物(0.25uM)和dNTP(dATP、dCTP和dGTP每种100μM，dTTP 65μM)在50μL Brilliant单步定量RT-PCR核心试剂缓冲液(Stratagene目录号600532)中混合，并在45℃逆转录50分钟，所述缓冲液包含0.1％ Triton X-100、1.5mM MgCl2和1.25U StrataScript RTase(Stratagene，La Jolla，CA)。通过在94℃加热2分钟终止反应。RT完成后，将1U的Vent(Exo-)DNA聚合酶(NE Biolabs目录号M0257S)和350μM荧光素-12-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸(得自Roche目录号1 373 242)加入混合物中。进行40-45个循环的PCR扩增：94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒。从第24个循环开始，在每个PCR循环结束时取出3μl等分试样，并如上所述利用毛细管电泳进行分析。在Microsoft Excel中将对应于靶标微生物特异性扩增子的相对峰面积作为PCR循环数对数的函数作图。将每条曲线的线性部分外推至主观决定的阈值(例如，1000相对荧光单位)以计算阈值循环(Ct)数。使用反应中已知拷贝数微生物的Ct值生成校准曲线。
或者，对于检测实验来说，在适当的无掺入对照RNA中将每种样品从初始浓度进行10倍连续稀释，并用于单步RT-PCR方案中。对于使用纯化的微生物RNA的实验来说，在20ng/μl大肠杆菌tRNA中进行稀释。简言之，在50或100μl的总体积中，将RNA模板和0.25μM的每种RT引物加至混合物中，所述混合物包含改良的1×Stratagene缓冲液(目录号600532)、0.1％Triton X-100、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2和1.25UStrataScript RTase(Stratagene，La Jolla，CA)，并在45℃逆转录50分钟，之后在94℃2分钟失活RTase。然后，使用由94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟的44个循环组成的方案进行样品的PCR扩增。当升至第一个72℃时，加入1U的热稳定DNA聚合酶。20个循环后，连续收集24个循环的延伸期结束时的3μl等分试样。立即将等分试样加入变性剂中终止反应。如上所述，利用毛细管电泳分析样品。
实施例6：用于检测样品中病原体的六元病毒测定
收集人全血到EDTA收集管中，使用标准方法在收集后24小时以内制备血浆。使用Corbett Xtractor提取DNA，并用75微升的洗脱液进行洗脱。一旦进行处理，在同一天进行样品筛选。在每个反应中测试10微升的提取DNA。反应以一式二份进行。
每个反应混和液中包含以下组分：1×Qiagen复合缓冲液、10％甜菜碱、浓度为0.05～0.400μM的针对每个靶标的引物、以及每个反应100个拷贝的针对每种病毒靶标的灵敏度对照质粒。用矿物油覆盖每种反应混和物以防止蒸发。每个反应都包含无模板对照。同时进行总共16个反应。
PCR清洁室里装配反应物，并转移到模板区，在这里将DNA提取样品加至每个反应物中。然后，将反应物转移至分配式热循环仪，使用以下流程进行PCR扩增：
a.1个循环：    95℃15分钟(酶活化)
b.3个循环：    95℃/30秒，62℃/90秒72℃/1分钟
c.3个循环：    95℃/30秒，60℃/90秒72℃/1分钟
d.3个循环：    95℃/30秒，58℃/90秒72℃/1分钟
e.31个循环：   95℃/30秒，57℃/90秒72℃/1分钟
为每组8个样品准备两个96孔收集板，用于在72℃延伸的最后1秒收集每个反应物的2μL等分试样。含有0.3μL ROX标记的MapMaker1000 DNA标准品(Bioventures)的8微升甲酰胺分配到96孔板的每一个孔中，并置于分配式热循环仪的收集区。
在72℃延伸期的最后1秒从每个反应物取出2微升等分试样并转移至收集板中，从第18个循环开始持续至第40个循环期。
在PCR扩增结束时，将收集板加热密封，离心并在ABI 3730XL(Applied Biosystems，Foster City，CA)遗传分析仪上进行片段分析(图2)。处理得到的数据以确定相对荧光单位(峰面积的对数)，并以对数标度对循环数作图(图3)。通过将每种特异性扩增子峰面积的对数对循环数作图以及选择对应于35000荧光单位的循环数(通过Gene Mapper数据分析软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)计算)来计算每种病毒靶标的阈值循环(图4)。通过测量预定数量病毒DNA的Ct得到校准曲线，该曲线用于确定作为每种特异性靶标病毒载荷的函数的阈值循环(Ct)。
可以使用针对每种病毒靶标的特异性校准曲线，通过选择该特异性病毒靶标的测量阈值循环相应的病毒载荷来测定临床样品中的病毒载荷。用于检测CMV、EBV、BK、HHV6、HHV7、JCV和人线粒体DNA的靶标特异性寡核苷酸在表5中提供。
该测定定量检测CMV、EBV、BK、HHV6、HHV7和JCV的存在情况。在该测定中还检测人线粒体序列作为质量度量，以证实从临床样品成功提取了DNA(如果线粒体扩增子的测量阈值循环在23-27个循环的范围内，则认为样品制备成功)。
其他实施方案
上述实施方案展示了本发明人在得到和实施本发明时考虑到的实验和技术。相信对用于向本领域报告本发明的实践以及用于证明其有用性的技术的公开均包含在了这些实施方案中。本领域技术人员会理解，本文公开的技术和实施方案仅为优选的实施方案，可使用许多等同的方法和技术得到同样的结果。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员的普遍理解相同的含义。尽管可使用与本文所述相似或等同的方法和材料来实施或测试本发明，但合适的方法和材料描述如下。将本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献通过参考整体并入本文中。在冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实施例仅为说明性，而不意在限制。
序列表
<110>弗拉基米尔·I·斯列普尼奥夫
卡祖米·希奥萨基
伊丽莎白·加西亚
凯尔·哈特
<120>病原体的多元定量检测
<130>66699WO(219781)
<150>60/735,085
<151>2005-11-09
<160>58
<170>PatentIn version 3.3
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Claims (89)

1.分析怀疑含有多种预定病原体中任何种的样品以检测病原体特异性靶标的方法，所述方法包括：
a)选择对应于所述多种预定病原体中每一种病原体的病原体特异性引物对，其中所述病原体特异性引物对能够介导从相应病原体的核酸病原体特异性靶标中扩增选定的已知长度多核苷酸扩增子；
b)在促进多核苷酸扩增子扩增的条件下，在扩增步骤中将来自所述怀疑含有多种预定病原体中任意种之样品的核酸与多种病原体特异性引物对在反应混合物中接触。
c)在扩增步骤期间以一个或多个间隔取出反应混合物的等分试样；
d)分离每个等分试样中的扩增子；和
e)检测每个等分试样中的扩增子。
其中，检测到一种或多种选定的已知长度扩增子指示样品中含有该扩增子相应的病原体特异性靶标。
2.权利要求1的方法，其还包括定量所检测到的扩增子以及建立所检测扩增子的量与样品中存在的病原体量之间的相关性。
3.权利要求1或2的方法，其中所述扩增步骤包括通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述来自样品的核酸在扩增步骤前进行逆转录(RT)。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中步骤(c)的扩增子通过毛细管电泳进行分离。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述一种或多种病原体特异性引物包含可检测标记。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述扩增子通过包含可检测标记的核酸结合染料进行检测。
8.权利要求6或7的方法，其中所述可检测标记选自荧光标记、放射性标记、比色标记、磁性标记和酶标记。
9.权利要求6至8中任一项的方法，其中所述可检测标记是荧光标记。
10.权利要求6至9中任一项的方法，其还包括通过对反应混合物等分试样中可检测标记的量进行定量，从而定量样品中病原体的量。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述病原体选自病毒、细菌、原生动物及其组合。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述多种特异性病原体靶标包括以下的特异性病毒靶标：HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少两种病原体。
14.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少3种病原体。
15.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少4种病原体。
16.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少5种病原体。
17.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少6种病原体。
18.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少8种病原体。
19.权利要求1至18中任一项的方法，其中所有病原体特异性引物对能够在至少一组共同的反应条件下促进多核苷酸扩增。
20.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述样品是病原体宿主样品。
21.权利要求20的方法，其中所述宿主是哺乳动物。
22.权利要求20或21的方法，其中所述宿主是人。
23.权利要求20至22中任一项的方法，其中所述宿主是免疫受损的人。
24.权利要求23的方法，其中所述免疫受损的个体已接受移植。
25.权利要求23的方法，其中所述免疫受损的个体已接受治疗癌症的化学治疗。
26.权利要求23至25中任一项的方法，其中所述方法用于监测免疫抑制治疗的过程。
27.权利要求22至26中任一项的方法，其中所述宿主是对病原体感染无症状的人。
28.权利要求20至27中任一项的方法，其中所述方法包括扩增宿主的核酸。
29.权利要求1至28中任一项的方法，其中所述方法还通过扩增来自对照核酸分子的扩增子来检测不来自该样品的对照核酸分子的存在情况。
30.权利要求29的方法，其中所述对照核酸分子是竞争剂核酸分子。
31.权利要求29或30的方法，其中检测多种不同的对照核酸分子。
32.权利要求29至31中任一项的方法，其中所述对照寡核苷酸以已知浓度存在于该反应物中。
33.权利要求31的方法，其中所述不同的对照寡核苷酸以不同的浓度存在于该反应物中。
34.权利要求29至33中任一项的方法，其中使用病原体特异性引物对来扩增对照寡核苷酸所扩增的扩增子。
35.权利要求29至33中任一项的方法，其中所述对照核酸以与该病原体特异性靶标核酸相似的效率进行扩增。
36.权利要求29至35中任一项的方法，其中所述对照核酸分子是DNA和/或RNA。
37.权利要求29至36中任一项的方法，其中所述病原体特异性引物以相似的效率扩增病原体核酸和对照核酸分子。
38.用于检测和定量样品中多种预定病原体的方法，该方法包括：
a)获得怀疑含有多种病原体中至少一种的样品，其中每种病原体包含病原体特异性多核苷酸；
b)从所述样品中分离核酸；
c)选择靶向所述多种病原体特异性多核苷酸中每一种的病原体特异性引物对，其中所述引物对能够介导扩增子的扩增，所述扩增子的长度明显不同于靶向所述多种病原体核酸中每种其它成员的每种其它病原体特异性引物对所产生扩增子的长度；
d)选择至少一种竞争剂多核苷酸，其中所述竞争剂多核苷酸能够作为模板来介导通过一种病原体特异性引物对进行的扩增子的扩增，其中所产生扩增子的长度明显不同于靶向所述多种病原体特异性核酸中每种其它成员以及其他竞争剂多核苷酸的每种其它病原体特异性引物对所产生的扩增子的长度；
e)向分离自该样品的核酸中加入预定量的至少一种竞争剂多核苷酸，以得到测试混合物；
f)在促进扩增子扩增的条件下，将所述测试混合物与多种病原体特异性引物对在反应混合物中接触；
g)分离步骤(f)中产生的扩增子；
h)检测步骤(f)中产生的每种扩增子的长度；
i)建立所检测每种扩增子的长度与反应混合物中所存在病原体或竞争剂多核苷酸之间的相关性。
j)定量步骤(f)中产生的每种扩增子的量；以及
k)基于加入该测试混合物中的竞争剂多核苷酸的预定量，确定样品中存在的病原体量。
39.权利要求38的方法，其中在扩增步骤期间，以一个或多个间隔取出步骤(f)的反应混合物的等分试样，并且其中对所述等分试样进行步骤(g)至步骤(k)。
40.权利要求38和39的方法，其中所述样品中存在的病原体的量检测不到。
41.权利要求38至40中任一项的方法，其中步骤(f)的扩增在单个反应中进行。
42.权利要求38至41中任一项的方法，其中通过毛细管电泳进行步骤(g)的分离。
43.权利要求38至42中任一项的方法，其中所述一种或多种病原体特异性引物包含可检测标记。
44.权利要求38至43中任一项的方法，其中所述扩增子通过包含可检测标记的核酸结合染料进行检测。
45.权利要求43或44的方法，其中所述可检测标记选自荧光标记、放射性标记、比色标记、磁性标记和酶标记。
46.权利要求43至45中任一项的方法，其中所述可检测标记是荧光标记。
47.权利要求43至47中任一项的方法，其还包括通过对反应混合物等分试样中可检测标记的量进行定量，从而定量该样品中病原体的量。
48.权利要求38至47中任一项的方法，其中所述病原体选自病毒、细菌、原生动物及其组合。
49.权利要求38至48中任一项的方法，其中所述多种特异性病原体靶标包括选自以下的特异性病毒靶标：HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒、EEEV、WNE、JCV和BKV。
50.权利要求38至49中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少两种病原体。
51.权利要求38至50中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少3种病原体。
52.权利要求38至50中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少4种病原体。
53.权利要求38至50中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少5种病原体。
54.权利要求38至50中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少6种病原体。
55.权利要求38至50中任一项的方法，其中所述方法能够检测样品中至少8种病原体。
56.权利要求38至55中任一项的方法，其中所有病原体特异性引物对能够在至少一组共同的反应条件下促进多核苷酸扩增。
57.权利要求38至56中任一项的方法，其中所述样品是病原体宿主样品。
58.权利要求57的方法，其中所述宿主是哺乳动物。
59.权利要求57或58的方法，其中所述宿主是人。
60.权利要求57至59中任一项的方法，其中所述宿主是免疫受损的人。
61.权利要求60的方法，其中所述免疫受损的个体已接受移植。
62.权利要求60的方法，其中所述免疫受损的个体已接受治疗癌症的化学治疗。
63.权利要求60至62中任一项的方法，其中所述方法用于监测免疫抑制治疗的过程。
64.权利要求59至63中任一项的方法，其中所述宿主是对该病原体感染无症状的人。
65.权利要求57至64中任一项的方法，其中所述方法包括扩增宿主的核酸。
66.权利要求38至65中任一项的方法，其中所述竞争剂多核苷酸以与该病原体特异性靶标核酸相似的效率进行扩增。
67.权利要求38至66中任一项的方法，其中所述竞争剂多核苷酸是DNA和/或RNA。
68.权利要求38至67中任一项的方法，其中所述来自该样品的核酸是DNA和/或RNA。
69.权利要求68的方法，其中DNA和RNA分别从该样品中分离。
70.权利要求38至69中任一项的方法，其中将对来自所述样品的多种预定病原体中至少两种的定量组合在单个反应中。
71.权利要求38至70中任一项的方法，其中将对来自所述样品的多种预定病原体中至少3种的定量组合在单个反应中。
72.权利要求38至71的方法，其中所述样品是血。
73.权利要求60至72中任一项的方法，其中所述方法用于监测免疫抑制治疗的过程。
74.对受试者监测由预定病原体感染所导致疾病的发生情况的方法，该方法包括：
从受试者获得样品；
定量5种或更多种指示至少一种预定病原体的病原体特异性标志物；
计算样品中至少一种预定病原体的量，其中该量表示为每体积或重量的样品中病原体的拷贝数。
75.权利要求74的方法，其中存在的病原体的量检测不到。
76.权利要求74或75的方法，其中所述样品中病原体的存在量为零。
77.权利要求74至76中任一项的方法，其中所述受试者是免疫受损的患者。
78.权利要求74至77中任一项的方法，其中所述受试者是无症状的患者。
79.权利要求74至78中任一项的方法，其中计算至少一种预定病原体的量。
80.权利要求74至79中任一项的方法，其中该样品中至少一种病原体的量用于确定免疫受损患者的治疗方案。
81.权利要求74至81中任一项的方法，其中所述患者是移植或移植物的受者，并且接受免疫抑制治疗。
82.权利要求74至80中任一项的方法，其中已向该免疫受损患者施用免疫抑制药物，或者该免疫受损患者目前正在接受免疫抑制药物。
83.权利要求81或82的方法，其中样品中一种或多种所述目的病原体的量是确定改变免疫抑制治疗方案的因素。
84.权利要求74至83中任一项的方法，其中该样品中多于一种病原体的量在单个反应中测定。
85.权利要求74至83中任一项的方法，其中该样品中多于一种病原体的量在多元测定中测定。
86.权利要求74至85中任一项的方法，其中所述样品是血、唾液或尿。
87.权利要求74至86中任一项的方法，其中所述多种病原体的量通过扩增靶标病原体特异性核酸来测定。
88.权利要求74至87中任一项的方法，其中所述监测方法以定期方案进行，以监测感染性疾病的出现或发展。
89.权利要求88的方法，其中定期方案约为每月一次。
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