CN106244601A - 水稻抗白叶枯病和细菌性条斑病基因OsHsp18.0‑CI及其应用 - Google Patents
水稻抗白叶枯病和细菌性条斑病基因OsHsp18.0‑CI及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种包含有水稻抗病相关基因OsHsp18.0‑CI的DNA片段的功能验证和应用，具体利用强启动子驱动和基于RNA干扰原理的转基因技术，将OsHsp18.0‑CI基因的超量表达载体和RNAi载体转入水稻品种圣稻806，超量及抑制水稻中OsHsp18.0‑CI基因的表达。OsHsp18.0‑CI基因表达量显著提高的遗传转化水稻对细菌性条斑病和白叶枯病的抗性明显增强，证明OsHsp18.0‑CI基因在水稻抗细菌性条斑病和白叶枯病中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一个水稻抗白叶枯病和细菌性条斑病基因OsHsp18.0-CI及其应用，该基因表达量显著提高的遗传转化水稻对细菌性条斑病和白叶枯病菌的抗性明显增强。
背景技术
植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
植物的抗病反应是多基因参与调控的复杂过程。参与植物抗病反应的基因分为两类：(1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。
根据目前人们对抗病基因功能的认识，这类基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Jones和Dangl，2006，Nature444：323-329；Zipfel，2014，Trends in immunology，35：345-351)。抗病基因介导的抗病反应强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：(1)抗病基因的资源有限；(2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。
抗病相关基因是指除抗病基因外所有参与抗病反应的基因，它们的编码产物参与合成植物体内抗病信号分子、参与信号传导或参与防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Maleck等，2000，Nature Genet.26：403-410；Schenk等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:11655-11660；Zhou等，2002，Science in China 45:449-467)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源：(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参与的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。但是，水稻中虽然鉴定了很多抗病相关基因(Zhou等，2002，Science in China Series C-Life Sciences 45:449-467；Chu等，2004，Molecular Genetics and Genomics 271:111-120)，这些基因在水稻抗病反应中的作用机理、以及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。
水稻是世界上重要的粮食作物，白叶枯病和细菌性条斑病是水稻生产中两种重要的细菌性病害，严重影响着水稻生产的产量和品质。因此，了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻品种的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。目前已报道克隆了至少37个水稻白叶枯病的主效抗病基因，但这些抗病基因除Xa21外，大多只对少数的生理小种具有抗性，抗谱较窄。目前尚未在水稻中克隆到细菌性条斑病的主效抗病基因，仅在玉米种克隆到一个非寄主抗病基因Rxo1(Zhao等，2005，Proc.Nati.Acad.Sci USA 102：15383-15388)。已有的试验结果显示，抗病相关基因能够参与到植物免疫***的信号路径中，通过激活或增强免疫信号来提高植物对病害的抗性，例如水稻中抗水稻细菌性条斑病菌基因DEPG1，OsWRKY45-1，OsPGIP4(Guo等,2012，Mol.Biol.rep.39：3491-3504；Tao等,2009，Plant Physiol.151：936-948；Feng等,2016，Planta 243：1297-1308)等。另外，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性，甚至对多种病害提供抗性例如超量表达Os2H16提高水稻对白叶枯病和纹枯病的抗性(Li等，2013，Plant Cel l Tiss.Org.115：429-441)。通过超量作为抗病反应正调控因子的抗病相关基因的功能进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。因此如何利用水稻抗病基因的克隆获得抗病植株成为亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一个从水稻中分离克隆出的抗病相关基因OsHsp18.0-CI完整编码区段的DNA片段，利用这个基因改良水稻或其它植物抵御病害的能力。其基因的序列如序列表SEQ ID NO.1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO.1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO.1所示序列的亚片段。该基因片段表达量显著提高的遗传转化水稻对细菌性条斑病和白叶枯病菌的抗性明显增强，可见采用超量表达之后可以赋予植物对由细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)和白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。
发明人首先提供了一个从水稻中分离克隆出的抗病相关基因OsHsp18.0-CI完整编码区段的DNA片段，该片段来源于水稻(Oryza sativa)圣稻806，其通过特殊设计的引物扩增水稻圣稻806基因组DNA获得，其中所述的引物包括引物1，5′-TGAGAATTGAGATCACCCTCTT-3′其序列如序列表SEQ ID NO.3所示，引物2，5′-GGACCAGATTTGACGCTTTTAT-3′其序列如序列表SEQ ID NO.4所示，最终获得的基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
之后利用强启动子驱动和基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)原理的转基因技术，将OsHsp18.0-CI基因的超量表达载体和RNAi载体转入水稻品种圣稻806，超量及抑制水稻中OsHsp18.0-CI基因的表达。OsHsp18.0-CI基因表达量显著提高的遗传转化水稻对细菌性条斑病菌和白叶枯病菌的抗性明显增强，表达量显著降低的遗传转化水稻对细菌性条斑病菌和白叶枯病菌的抗性明显减弱，证明OsHsp18.0-CI基因在水稻抗白叶枯病中发挥重要作用。因此证实了超量表达该基因后可以赋予植物对由细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzicola)和白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的，之所以采用上述的方法，主要是由于将克隆的抗病相关基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用遗传转化技术在植物中累加多个抗性基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的连锁基因组序列。而抗病相关基因的克隆是克服传统育种不能植物种间转移抗病相关基因问题的前提。
除了利用本发明所提供的基因之外，还可以采用其基因的核苷酸序列基本上相当于SEQ ID NO.1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO.1所示序列的亚片段，也就是说只要具备SEQ ID NO.1所示的DNA序列的基因片段均可以取得类似的效果。
综上所述，本发明的发明人在国际上首次提供了一个从水稻中分离克隆出的抗病相关基因完整编码区段的DNA片段，OsHsp18.0-CI，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后可以赋予植物对由细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)和白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。
附图说明
图1.用定量RT-PCR技术检测圣稻806分别接种细菌性条斑病菌RS105和白叶枯病菌PXO99后OsHsp18.0-CI基因的表达模式结果示意图；
图中黑色柱形图表示接种RS105后基因的表达，灰色的柱形图表示的是接种PXO99后基因的表达，可以看到在接种0h、6h、12h、24h和72h后取样的检测结果。以0h为对照，可见在接种RS105 12h和24h后，OsHsp18.0-CI基因表达与对照相比有明显的提高；接种PXO99后6h、12h和24h OsHsp18.0-CI基因都有显著的上调表达；
图2.OsHsp18.0-CI基因超量表达和抑制表达T0代遗传转化植株接种细菌性条斑病菌RS105两周后结果示意灰度图；
图中，“WT”为野生型圣稻806；抑制表达T0代遗传转化植株(OsHsp18.0-CI RNAi)接种细菌性条斑病菌RS105两周后形成的病斑明显比圣稻806(对照)的长；该基因超量表达的T0代转化植株(OsHsp18.0-CI OE)接种细菌性条斑病菌RS105两周后形成的病斑明显比圣稻806(对照)的短；
图3.OsHsp18.0-CI基因超量表达植株OE-7T1代材料接种细菌性条斑病菌RS105两周后发病结果示意图；
图中纵坐标表示每个单株接种RS105两周后的发病长度，“WT”为遗传转化受体野生型圣稻806，“﹡﹡”表示与对照圣稻806的发病长度相比，转化材料发病长度极显著降低(t检验，P<0.01),“﹡”表示与对照圣稻806的发病长度相比，转化材料发病长度显著降低(t检验，P<0.05)，图中琼脂糖凝胶电泳照片中条带是每个单株中抗潮霉素基因Hpt的PCR扩增示意图，能扩增出Hpt基因的即为阳性转化材料；
图4.OsHsp18.0-CI基因超量表达植株OE-11T1代材料接种细菌性条斑病菌RS105两周后发病结果示意图；
图中纵坐标表示每个单株接种RS105两周后的发病长度，“WT”为遗传转化受体野生型圣稻806，“﹡﹡”表示与对照圣稻806的发病长度相比，转化材料发病长度极显著降低(t检验，P<0.01),“﹡”表示与对照圣稻806的发病长度相比，转化材料发病长度显著降低(t检验，P<0.05)，图中琼脂糖凝胶电泳照片中条带是每个单株中抗潮霉素基因Hpt的PCR扩增示意图，能扩增出Hpt基因的即为阳性转化材料；
图5.OsHsp18.0-CI基因抑制表达植株RNAi-9T1代材料接种细菌性条斑病菌RS105两周后发病结果示意图；
图中纵坐标表示每个单株接种RS105两周后的发病长度，“WT”为遗传转化受体野生型圣稻806，“﹡﹡”表示与对照圣稻806的发病长度相比，转化材料发病长度极显著增加(t检验，P<0.01),“﹡”表示与对照圣稻806的发病长度相比，转化材料发病长度显著增加(t检验，P<0.05)，图中琼脂糖凝胶电泳照片中条带是每个单株中抗潮霉素基因Hpt的PCR扩增示意图，能扩增出Hpt基因的即为阳性转化材料；
图6.OsHsp18.0-CI基因抑制表达植株RNAi-12T1代材料接种细菌性条斑病菌RS105两周后发病结果示意图；
图中纵坐标表示每个单株接种RS105两周后的发病长度，“WT”为遗传转化受体野生型圣稻806，“﹡﹡”表示与对照圣稻806的发病长度相比，转化材料发病长度极显著增加(t检验，P<0.01),“﹡”表示与对照圣稻806的发病长度相比，转化材料发病长度显著增加(t检验，P<0.05)，图中琼脂糖凝胶电泳照片中条带是每个单株中抗潮霉素基因Hpt的PCR扩增示意图，能扩增出Hpt基因的即为阳性转化材料；
图7.OsHsp18.0-CI基因抑制和超量表达的转化植株T2代接种细菌性条斑病菌RS105两周后发病结果示意图，
图中WT为野生型圣稻806，OE-7为OsHsp18.0-CI基因超量表达植株OE-7T1代材料，OE-11为OsHsp18.0-CI基因超量表达植株OE-11T1代材料，RNAi-9为OsHsp18.0-CI基因抑制表达植株RNAi-9T1代材料，RNAi-12为OsHsp18.0-CI基因抑制表达植株RNAi-12T1代材料；
图8.OsHsp18.0-CI基因抑制和超量表达的转化植株T2代接种水稻白叶枯病菌PXO99两周后发病结果示意灰度图；
图9.OsHsp18.0-CI基因抑制和超量表达的转化植株T2代接种水稻白叶枯病菌PXO99两周后发病结果示意图，
图中WT为野生型圣稻806，OE-7为OsHsp18.0-CI基因超量表达植株OE-7T2代材料，OE-11为OsHsp18.0-CI基因超量表达植株OE-11T2代材料，RNAi-9为OsHsp18.0-CI基因抑制表达植株RNAi-9T2代材料，RNAi-12为OsHsp18.0-CI基因抑制表达植株RNAi-12T2代材料。
具体实施方式
以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；实施例1：OsHsp18.0-CI基因的分离克隆和结构分析
1.从水稻品种中分离克隆OsHsp18.0-CI基因
采用TIANGEN公司的植物基因组DNA提取试剂盒按照说明书抽提水稻品种圣稻806的基因组DNA,以该DNA为模板，通过PCR技术，利用引物1(5′-TGAGAATTGAGATCACCCTCTT-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.3所示)和引物2(5′-GGACCAGATTTGACGCTTTTAT-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.4所示)扩增获得OsHsp18.0-CI基因的DNA片段。
其PCR反应程序为预变性98℃2min，变性98℃10s，退火55℃25s，延伸72℃30s，反应30个循环，后延伸72℃5min。所获得的基因命名为OsHsp18.0-CI，其核苷酸序列如SEQNO.1所示，其中第75-557位为编码碱基，编码一种小分子量的热激蛋白，由161个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ NO.2所示。
实施例2：OsHsp18.0-CI基因在水稻品种中的表达模式分析
为了证实OsHsp18.0-CI基因参与抗病反应的调控，我们采用定量RT-PCR技术分析了水稻材料圣稻806在接种细菌性条斑病菌RS105和白叶枯病菌PXO99后OsHsp18.0-CI基因的表达模式。分别在接种后0h、6h、12h、24h和72h取接种叶片，抽提总RNA。利用iQTM5定量PCR仪(Bio-Rad公司)、SYBR Green荧光嵌入染料做定量RT-PCR分析接种后不同时间点OsHsp18.0-CI基因的表达差异。定量RT-PCR技术中的OsHsp18.0-CI基因特异PCR引物是引物3，5′-GGTGGAGAGCTTCGATTCGA-3′其序列如序列表SEQ ID NO.5所示和引物4，5′-GGACCAGATTTGACGCTTTTATTT-3′其序列如序列表SEQ ID NO.6所示。以水稻肌动蛋白的RT-PCR产物作为样品量一致性对照，肌动蛋白PCR引物序列是OsActin 1F(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′其序列如序列表SEQ ID NO.7所示)和OsActin 1R(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.8所示)。
分析结果显示水稻材料圣稻806接种细菌性条斑病菌后，12h和24hOsHsp18.0-CI基因的表达量12.2和15.7倍(图1)，说明OsHsp18.0-CI基因能被细菌性条斑病菌显著诱导表达；接种白叶枯病菌6h后，OsHsp18.0-CI基因上调了3倍，12h和24h分别上调了3.3和5.1倍，说明OsHsp18.0-CI也能被白叶枯病菌诱导表达。
实施例3：OsHsp18.0-CI基因的植物表达载体构建
本发明所用载体是pU1301。以圣稻806DNA为模板，用引物5(5′-ATGGGTACCTGAGAATTGAGATCACCCTCTT-3′，带下划线碱基为限制性内切酶KpnI识别位点，其序列如序列表SEQ ID NO.9所示)和引物6(5′-CGGGATCCGGACCAGATTTGACGCTTT-3′，带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点，其序列如序列表SEQ ID NO.10所示)扩增基因片段，PCR反应程序如下：预变性98℃2min，变性98℃10s，退火56℃25s，延伸72℃30s，反应30个循环，后延伸72℃5min，获得SEQ ID NO.1的片段。
PCR产物用KpnI和BamHI进行酶切，同时用KpnI和BamHI酶切携带玉米泛素启动子的遗传转化载体pU1301，酶切完毕，纯化酶切产物。用OsHsp18.0-CI基因的酶切片段和载体做连接反应,通过酶切筛选阳性克隆；命名为pU1301::OsHsp18.0-CI，用于超量表达使用。
同时，本发明采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，通过抑制水稻品种圣稻806中OsHsp18.0-CI基因的表达，验证该基因的功能。本发明用引物7(5′-AAGACTAGTGGTACCGCATCTTCCCGTCCTTCC-3′，带下划线碱基为限制性内切酶SpeI和KpnI识别位点，其序列如序列表SEQ ID NO.11所示)和引物8(5′-AAGGAGCTCGGATCCGGACCAGATTTGACGCTTT-3′，带下划线碱基为限制性内切酶SacI和BamHI识别位点，其序列如序列表SEQ ID NO.12所示)，OsHsp18.0-CI基因DNA片段为模板，PCR扩增待转化的DNA片段，PCR反应程序如下：预变性98℃2min，变性98℃10s，退火56℃25s，延伸72℃30s，反应30个循环，后延伸72℃5min。
构建OsHsp18.0-CI基因片段的第一重复链(正向链)：用KpnI和BamHI消化部分PCR产物及载体ds1301(如图4所示)，消化完全后在75℃水浴10min灭活限制性内切酶，置于冰上，用T4DNA连接酶进行连接反应。热激后获得的克隆质粒用引物7和8扩增筛选阳性克隆。
构建OsHsp18.0-CI基因片段的第二重复链(反向链)：用SpeI和SacI消化剩余的PCR产物和上述筛选出的连接了第一重复链的阳性克隆质粒，消化完全后再75℃水浴10min灭活限制性内切酶，置于冰上，用T4DNA连接酶进行连接反应。热激后获得的克隆质粒用SacI和SpeI双酶切消化反应筛选阳性克隆，命名为ds1301：：OsHsp18.0-CI，作为抑制表达载体。
将构建好的超量和抑制表达载体pU1301：：OsHsp18.0-CI和ds1301：：OsHsp18.0-CI电转化农杆菌感受态细胞EHA105，保存菌株用作农杆菌介导的水稻遗传转化。
实施例4：OsHsp18.0-CI基因的功能验证
采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005，Plant Cel l Rep.23：540-547)将超量和抑制表达载体导入水稻品种圣稻806。获得的遗传转化植株分别被命名为OE和RNAi。
本发明分别获得超量和抑制表达OsHsp18.0-CI基因的独立转化植株19和25株，分别命名OE-1至19和RNAi-1至25。
超量表达的转化植株分别用玉米泛素启动子特异引物UbiF(5′-TTTTAGCCCTGCCTTCATACGC-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.13所示)和OsHsp18.0-CI基因的特异引物2(5′-CGGGATCCGGACCAGATTTGACGCTTT-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.9所示)以及载体的筛选标记Hpt基因侧翼序列设计引物HptF(5′-GATCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.14所示)/HptR(5′-GTACTTCTACACAGCCATCGGTCCA-3′，其序列如序列表SEQ IDNO.15所示)分别对获得转化植株进行阳性鉴定，以两对引物鉴定均为阳性的材料作为阳性植株。用ds1301载体上二链克隆位点的侧翼序列设计引物S2F2(5′-TTCTAATCCCCAATCCAAA-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.16所示)/S2R2(5′-TAGGCGTCTCGCATATCTC-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.17所示)以及载体的筛选标记Hpt基因引物分别对获得的抑制表达OsHsp18.0-CI的转化材料进行阳性鉴定，以两对引物鉴定均为阳性的材料作为阳性植株，进行阳性鉴定的PCR反应程序如下：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，反应30个循环，后延伸72℃5min。
采用活体穿刺法在幼苗期接种细菌性条斑病菌RS105，发现超量植株抗性有不同程度的增强，抑制植株抗性有不同程度的减弱；与转基因的受体水稻圣稻806相比，抗性增强的转化植株的病斑长度缩短了0.3cm-0.8cm，抗性减弱的转化植株的病斑长度变长了0.2cm-1.0cm(表1)(如图2所示)。
表1.部分T0代转化植株对细菌性条斑病菌RS105的反应
为进一步验证转化植株的抗病能力是否与OsHsp18.0-CI基因的表达量相关，本发明分别对表1中所列的超量和抑制转化植株，抽提总RNA，利用iQTM5定量PCR仪(Bio-Rad公司)、SYBR Green荧光嵌入染料做定量RT-PCR分析，比较转化植株和对照材料中OsHsp18.0-CI基因表达量。其中超量植株的PCR反应引物是引物3(5′-GGTGGAGAGCTTCGATTCGA-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.5所示)和引物4(5′-GGACCAGATTTGACGCTTTTATTT-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.6所示)；抑制植株的PCR引物是引物9(5′-CAACCAAAAAACAGCAAGACACA-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.18所示)和引物10(5′-CCCAGAGGTCGAGGGAGAAG-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.19所示)，分别以水稻肌动蛋白的RT-PCR产物作为样品量一致性对照。
实验结果显示OsHsp18.0-CI基因的表达量与植株的抗性密切相关(表1)。抗病性增强的转化植株中OsHsp18.0-CI基因的表达量与对照材料圣稻806相比显著增加，抗病性减弱的转化植株中OsHsp18.0-CI基因的表达量与对照材料圣稻806相比显著减少。该结果说明了OsHsp18.0-CI基因的编码产物在水稻抗白叶枯病反应发挥正调控因子的作用。可见采用超量表达之后可以赋予植物对由细菌性条斑病菌所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。
为进一步证实OsHsp18.0-CI基因在水稻对细菌性条斑病菌抗性中的作用，本发明从T0代的超量和抑制转化植株中各选取了2个株系进行T1代和T2代的重复接种验证。结果显示，2个T1代株系中，OsHsp18.0-CI基因超量表达的转化植株(含载体pU1301：：OsHsp18.0-CI)抗性显著高于对照圣稻806(P<0.05),而不含pU1301：：OsHsp18.0-CI载体的植株对R105的抗性与对照圣稻806无显著差异(图3和图4)。同样，OsHsp18.0-CI基因抑制表达的2个T1代转化植株(含载体ds1301::OsHsp18.0-CI)对RS105的抗性显著减弱(P<0.05)，而不含ds1301：OsHsp18.0-CI载体的植株对R105的抗性与对照圣稻806无显著差异(图5和图6)。T2代植株的接种试验也显示了同样结果，如图7所示。这进一步说明了基因OsHsp18.0-CI在水稻对细菌性条斑病抗性中的作用。可见采用超量表达OsHsp18.0-CI之后可以赋予植物对由细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)所引起的病害产生抗病反应，从而可以改良水稻对细菌性条斑病菌的抗性。
另外，对OsHsp18.0-CI基因超量和抑制表达的T2代转化植株进行了水稻白叶枯病抗性的鉴定。对获得T2代转化植株在孕穗期接种白叶枯病菌PXO99，每个单株接种5片完全伸展的叶片，接种后14天进行数据统计，以圣稻806作为对照材料，进行t检验分析。结果显示，与对照圣稻806发病长度8.70±0.4cm相比，OsHsp18.0-CI超量表达的植株接种PXO99后的发病长度为7.2-8.2cm，均达到了显著差异水平(P<0.05),表明超量表达OsHsp18.0-CI基因能够增加水稻对白叶枯病的抗性(图8和图9)；而抑制OsHsp18.0-CI表达的转化植株接种PXO99后发病长度为8.9-11.2cm，比野生型圣稻806发病长度显著增加(P<0.05)。上述结果说明超量表达OsHsp18.0-CI之后也可以赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)所引起的病害产生抗病反应，从而可以改良水稻对白叶枯病的抗性。
Claims (3)
1.一种水稻抗病相关基因OsHsp18.0-CI，其基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的水稻抗病相关基因，其特征在于：其基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO.1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO.1所示序列的亚片段。
3.权利要求1所述水稻抗病相关基因在增加水稻对细菌性条斑病和白叶枯病抗性中的应用。
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