CN109195993A - 串联fab免疫球蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够结合两个或多个抗原或两个或多个表位的多价和多特异性结合蛋白。本发明还提供制备和使用这些多价和多特异性结合蛋白的方法，包括使用这些结合蛋白用于预防或治疗各种疾病、或用于在体外或在体内检测特定抗原的方法。

Description

串联FAB免疫球蛋白及其用途
相关申请的交叉参考
本申请要求2016年2月6日提交的国际专利申请系列No.PCT/CN2016/073722的优先权和权益，将其全部按引用并入本文中用于所有目的。
发明领域
本发明涉及多价和多特异性结合蛋白，并涉及制备和使用多价和多特异性结合蛋白的方法。
电子提交的文本文件的描述
将与本申请随同电子提交的文本文件的内容全部按引用并入：序列表的计算机可读形式复本(文件名：EPBI_002_01WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2017年2月3日，文件大小510KB)。
发明背景
已经尝试产生了双特异性或多特异性抗体，以制备用于治疗各种炎性疾病、癌症和其他病症的分子。
已经使用四源杂交瘤(quadroma)技术，基于将表达具有双特异性抗体所需特异性的鼠单克隆抗体的两种不同杂交瘤细胞系进行体细胞融合，产生了双特异性抗体(参见Milstein,C.和A.C.Cuello,Nature,1983.305(5934):p.537-40)。还可以通过两个不同mAb的化学缀合来产生双特异性抗体(参见Staerz,U.D.等，Nature，1985.314(6012):p.628-31)。其他方法使用两个不同单克隆抗体或较小抗体片段的化学缀合(参见Brennan,M.等，Science，1985.229(4708):p.81-3)。
另一种方法是用异双官能交联剂偶联两个亲本抗体。特别地，以定点方式在铰链半胱氨酸残基处化学交联两个不同的Fab片段(参见Glennie,M.J.等，J Immunol,1987.139(7):p.2367-75)。
近年来研发了其他重组双特异性抗体形式(参见，Kriangkum,J.等，Biomol Eng，2001.18(2):p.31-40)。其中，串联单链Fv分子和双链抗体(diabodies)，及其各种衍生物，已经被用于构建重组双特异性抗体。通常，这些分子的构建从识别不同抗原的两个单链Fv(scFv)片段开始(参见Economides,A.N.等，Nat Med，2003.9(1):p.47-52)。串联scFv分子(taFv)是以另外的肽接头简单地连接两个scFv分子的一种直接形式。这些串联scFv分子中存在的两个scFv片段分开形成独立的折叠实体。可以使用各种接头来连接这两个scFv片段，且接头长度可以多达63个残基(参见Nakanishi,K.等，Annu Rev Immunol，2001.19:p.423-74)。
在最近的研究中，报导了通过转基因兔和牛在体内表达针对CD28和黑素瘤相关蛋白聚糖的串联scFv(参见，Gracie,J.A.等，J Clin Invest，1999.104(10):p.1393-401)。在这个构建体中，通过CH1接头连接两个scFv分子，并且发现双特异性抗体的血清浓度高达100mg/L。现有少数研究报导了使用极短的Ala3接头或富含甘氨酸/丝氨酸的长接头在细菌中表达可溶性串联scFv分子(参见Leung,B.P.等，J Immunol，2000.164(12):第6495-502页；Ito,A.等，J Immunol，2003.170(9):p.4802-9；Karni,A.等，J Neuroimmunol，2002.125(1-2):p.134-40页)。
在最近的研究中，使用了含有长度3或6个残基的随机化中间接头的串联scFv库的噬菌体展示，富集可以在细菌中以可溶性和活性形式产生的那些分子。这一方法使得分离出具有6个氨基酸残基接头的优选串联scFv分子(参见Arndt,M.和J.Krauss,Methods MolBiol，2003.207:p.305-21页)。
双特异性双链抗体(Db)利用双链抗体(diabody)形式进行表达。双链抗体由scFv片段制备，其中将连接VH和VL结构域的接头的长度减小到约5个残基(参见Peipp,M.和T.Valerius，Biochem Soc Trans，2002.30(4):p.507-11)。这种接头大小的减小有利于通过VH和VL结构域的交叉配对进行两条多肽链的二聚化。双特异性双链抗体可以通过在同一细胞内表达具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构象)或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构象)的两条多肽链而产生。近期的比较性研究证实，可变结构域的取向会影响活性结合位点的表达和形成(参见Mack,M.,G.Riethmuller和P.Kufer，Proc Natl Acad Sci U S A，1995.92(15):p.7021-5页)。
一种促使双特异性双链抗体产生的方法是产生杵进臼(knob-into-hole)双链抗体(参见Holliger,P.，T.Prospero和G.Winter，Proc Natl Acad Sci U S A，1993.90(14):p.6444-8.18)。针对HER2和CD3的双特异性双链抗体证实了这一点。在抗HER2可变结构域或抗CD3可变结构域中，通过将Val37交换为Phe以及将Leu45交换为Trp而在VH结构域中引入大杵，并且通过使Phe98突变成Met且使Tyr87突变成Ala而在VL结构域中产生互补臼。通过使用这种方法，双特异性双链抗体的产量可以从利用亲本双链抗体得到的72％增加到利用杵进臼双链抗体得到的90％以上。
单链双链抗体(scDb)是提高双特异性双链抗体样分子形成的一种替代策略(参见Holliger,P.和G.Winter，Cancer Immunol I mmunother，1997.45(3-4):p.128-30；Wu,A.M.等，Immunotechno logy，1996.2(1):p.21-36)。双特异性单链双链抗体通过用长度约15个氨基酸残基的另外的中间接头连接两个形成双链抗体的多肽链而产生。因此，具有对应于单体单链双链抗体(50-60kDa)的分子量的所有分子都是双特异性的。若干研究已经证实，双特异性单链双链抗体可以在细菌中以可溶性和活性形式表达，其中大多数纯化的分子以单体形式存在(参见Holliger,P.和G.Winter，Cancer Immunol Immunother，1997.45(3-4):p.第128-30；Wu,A.M.等，Immunotechnology，1996.2(1):p.第21-36；Pluckthun,A.和P.Pack，Immunotechnology，1997.3(2):p.83-105；Ridgway,J.B.等，Protein Eng,1996.9(7):p.617-21)。
双链抗体可以与Fc融合产生更类似Ig的分子，称为双-双链抗体(di-diabody)(参见Lu,D.等，J BiolChem，2004.279(4):p.2856-65页)。此外，在IgG的重链中包含两个Fab重复并且能够结合四个抗原分子的多价抗体构建体也已有描述(参见美国专利8,722,859B2，和Miller,K.等，J Immunol，2003.170(9):p.4854-61页)。
最近的实例是四价IgG-单链可变片段(scFv)融合体(Dong J等，2011MAbs 3:273-288；Coloma MJ，Morrison SL 1997Nat Biotechnol15:159-163；Lu D等，2002JImmunolMethods 267:213-226)、三功能大鼠/小鼠杂交双特异性表皮细胞粘附分子-CD3抗体卡妥索单抗(catumaxomab)(Lindhofer H等，1995J Immunol 155:219-225)、双特异性CD19-CD3 scFv抗体比那妥莫单抗(blinatumomab)(Bargou R等，2008 Science 321:974-977)、“双效Fab”(dual-acting Fab,DAF)抗体(BostromJ等，2009Science 323:1610-1614)、与催化性抗体共价连接的药效团肽(Doppalapudi VR等，2010Proc Natl Acad SciUSA 107:22611-22616)、在半IgG4分子之间使用动态交换产生双特异性抗体(van derNeut Kolfschoten M等，2007 Science 317:1554-1557；Stubenrauch K等，2010 DrugMetab Dispos 38:84-91)、或通过在一半双特异性抗体的抗原结合片段(Fab)内交换重链结构域与轻链结构域(交叉Mab形式)(Schaefer W等，2011Proc Natl Acad Sci 108:11187-92)。
本领域中需要具有双重抗原结合功能的单分子实体，以及产生此类多价和多特异性结合蛋白的方法。本发明满足了这些和其它需求。
发明概述
本发明提供多价和多特异性结合蛋白，以及制备和使用此类结合蛋白的方法。在一个实施方案中，本文提供的多价和多特异性结合蛋白是串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)，并且能够结合两个或更多个抗原、或同一抗原的两个或更多个表位、或同一表位的两个或更多个拷贝。本文提供的多价和多特异性结合蛋白可用于治疗和/或预防急性和慢性炎性疾病和病症、自体免疫性疾病、癌症、脊髓损伤、脓毒症、及其它疾病、病症和病状。本文提供了包含所述多价和多特异性结合蛋白的药物组合物。此外，本文还提供了用于制备此类FIT-Ig的核酸、重组表达载体和宿主细胞。使用本发明的FIT-Ig在体内或体外检测特定抗原的方法也涵盖在本发明中。
本发明提供能够(例如以高亲和力)结合两个或更多个抗原的结合蛋白的家族。在一个方面，本发明提供一种构建双特异性结合蛋白的方法，其中所述方法使用两种亲本单克隆抗体：结合抗原A的mAb A和结合抗原B的mAb B。在一个实施方案中，本文公开的结合蛋白能够结合抗原、细胞因子、趋化因子、细胞因子受体、趋化因子受体、细胞因子或趋化因子相关分子，或细胞表面蛋白。
因此，在一个方面，提供了能够结合两个或更多个抗原的结合蛋白。在一个实施方案中，本发明提供了一种包含至少两条多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链配对形成能够结合两个或更多个抗原的IgG-样分子。在一个实施方案中，所述结合蛋白包含两条、三条、四条、五条或更多条的多肽链。在一个实施方案中，所述结合蛋白包含至少一个VLA、至少一个VLB、至少一个VHA、至少一个VHB、至少一个CL和至少一个CH1，其中VL是轻链可变结构域，VH是重链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原。在另一个实施方案中，所述第一多肽链包含VLA、CL、VHB及CH1。在另一个实施方案中，所述结合蛋白另外包含Fc。在另一个实施方案中，Fc区是变体Fc区。在另一个实施方案中，变体Fc区呈现出改变的效应子功能，如ADCC或CDC。在另一个实施方案中，变体Fc区呈现出改变的针对一个或多个FcγR的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)。
在一个实施方案中，所述结合蛋白包含三条多肽链，其中第一多肽链包含VLA、CL、VHB和CH1，第二多肽链包含VHA和CH1，并且第三多肽链包含VLB和CL。在另一个实施方案中，所述结合蛋白的第一多肽链另外包含Fc。在另一个实施方案中，所述结合蛋白包含两条多肽链，其中第一多肽链包含VLA、CL、VHB和CH1，第二多肽链包含VHA、CH1、VLB和CL。在另一个实施方案中，第一多肽链另外包含Fc。
在一个实施方案中，所述结合蛋白包含三条多肽链，并且其相应cDNA在共转染期间是以1:1:1、1:1.5:1、1:3:1、1:1:1.5、1:1:3、1:1.5:1.5、1:3:1.5、1:1.5:3或1:3:3的第一:第二:第三链的摩尔比存在。在另一个实施方案中，所述结合蛋白包含两条多肽链，并且其相应cDNA在共转染期间以如下第一:第二链的摩尔比存在：1:1、1:1.5或1:3，或通过优化在任何给定转染中使单体FIT-Ig分数最大化的任何其它比率。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白不包含肽接头。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白包含至少一个氨基酸或多肽接头。在另一个实施方案中，接头选自G、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS(SEQ ID NO:489)、SGGG(SEQ ID NO:490)、GGGGS(SEQ ID NO:491)、GGGGSGS(SEQ ID NO:492)、GGGGSGGS(SEQ ID NO:493)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:494)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:495)、AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO:496)、AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:497)、AKTTPKLGG(SEQ ID NO:498)、SAKTTPKLGG(SEQ IDNO:499)、SAKTTP(SEQ ID NO:500)、RADAAP(SEQ ID NO:501)、RADAAPTVS(SEQ ID NO:502)、RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO:503)、RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO:504)、SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:505)、ADAAP(SEQ ID NO:506)、ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO:507)、TVAAP(SEQ IDNO:508)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:509)、QPKAAP(SEQ ID NO:510)、QPKAAPSVTLFPP(SEQID NO:511)、AKTTPP(SEQ ID NO:512)、AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO:513)、AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:514)、ASTKGP(SEQ ID NO:515)、ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:516)、GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO:517)、GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:518)、GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO:519)和AKTTAP(SEQ ID NO:80)。接头还可以是在体内可断裂的肽接头、蛋白酶(如MMP)敏感性接头、可以通过还原而断裂的基于二硫键的接头等，参见先前所描述的(FusionProtein Technologies for Biopharmaceuticals:Applications andChallenges，由Stefan R.Schmidt编辑)，或本领域已知的任何可断裂的接头。这些可断裂的接头可以用于在体内释放顶部的Fab用于各种目的，以便提高组织/细胞渗透和分布，增强与靶标的结合，减少潜在副作用，以及调节2个不同的Fab区的体内功能和物理半衰期。
在一个实施方案中，结合蛋白包含：第一多肽，从氨基到羧基端，其包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc；第二多肽链，从氨基到羧基端，其包含VHA-CH1；和第三多肽链，从氨基到羧基端，其包含VLB-CL；其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一表位或抗原，并且B是第二表位或抗原。在一个实施方案中，Fc区是人IgG1。在另一个实施方案中，Fc区是变体Fc区。在另一个实施方案中，Fc区的氨基酸序列与SEQ ID NO:20至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同。在另一个实施方案中，第一多肽链的CL与VHB直接融合。在另一个实施方案中，第一多肽链的CL经由氨基酸或寡肽接头连接VHB。在另一个实施方案中，所述接头是GSG(SEQ ID NO:26)或GGGGSGS(SEQ ID NO:28)。
在另一个实施方案中，结合蛋白包含：第一多肽，从氨基到羧基端，其包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc；第二多肽链，从氨基到羧基端，其包含VHA-CH1；和第三多肽链，从氨基到羧基端，其包含VLB-CL；其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一表位或抗原，并且B是第二表位或抗原。在一个实施方案中，Fc区是人IgG1。在另一个实施方案中，Fc区是变体Fc区。在另一个实施方案中，Fc区的氨基酸序列与SEQ ID NO:20至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同。在另一个实施方案中，第一多肽链的CH1与VLA直接融合。在另一个实施方案中，第一多肽链的CH1经由氨基酸或寡肽接头连接VLA。在另一个实施方案中，所述接头是GSG(SEQ ID NO:26)或GGGGSGS(SEQ ID NO:28)。
在另一个实施方案中，结合蛋白包含：第一多肽，从氨基到羧基端，其包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc；和第二多肽链，从氨基到羧基端，其包含VHA-CH1-VLB-CL；其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一表位或抗原，并且B是第二表位或抗原。在一个实施方案中，Fc区是人IgG1。在另一个实施方案中，Fc区是变体Fc区。在另一个实施方案中，Fc区的氨基酸序列与SEQ ID NO:20至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同。在再一个实施方案中，第一多肽链的CL与VHB直接融合。在另一个实施方案中，第一多肽链的CL经由氨基酸或寡肽接头连接VHB。在再一个实施方案中，所述接头是GSG(SEQ ID NO:26)或GGGGSGS(SEQ ID NO:28)。
在另一个实施方案中，结合蛋白包含：第一多肽，从氨基到羧基端，其包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc；和第二多肽链，从氨基到羧基端，其包含VLB-CL-VHA-CH1；其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一表位或抗原，并且B是第二表位或抗原。在一个实施方案中，Fc区是人IgG1。在另一个实施方案中，Fc区是变体Fc区。在另一个实施方案中，Fc区的氨基酸序列与SEQ ID NO:20至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同。在一个实施方案中，第一多肽链的CH1与VLA直接融合。在另一个实施方案中，第一多肽链的CH1经由氨基酸或寡肽接头连接VLA。在再一个实施方案中，所述接头是GSG(SEQ IDNO:26)或GGGGSGS(SEQ ID NO:28)。
本发明的结合蛋白能够结合细胞因子对。例如，本发明的结合蛋白能够结合选自以下的细胞因子对：IL-1α和IL-1β；IL-12和IL-18；TNFα和IL-23；TNFα和IL-13；TNF和IL-18；TNF和IL-12；TNF和IL-1β；TNF和MIF；TNF和IL-6；TNF和IL-6受体；TNF和IL-17；IL-17和IL-20；IL-17和IL-23；TNF和IL-15；TNF和VEGF；VEGFR和EGFR；PDGFR和VEGF；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAM8；以及TNFα和PGE4；IL-13和PED2；TNF和PEG2。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合IL-17和IL-20。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合IL-17和IL-20并且包含源自抗IL-17抗体LY和抗IL-20抗体15D2的可变重链和轻链。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合IL-17和TNF。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合IL-17和TNF并且包含源自抗IL-17抗体LY和TNF抗体戈利木单抗(golimumab)的可变重链和轻链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合IL-17和IL-20并且包含：第一多肽，其包含选自SEQ ID NO:15、25和27的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:23的序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合IL-27和IL-20并且包含：第一多肽链，其包含选自SEQ ID NO:15、25和27的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第二多肽链，其包含选自SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合TNF和IL-17并且包含：第一多肽，其包含根据SEQ ID NO:87的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:89的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:91的序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。在另一个实施方案中，结合蛋白能够结合选自以下的靶标对：CD137和CD20；CD137和EGFR；CD137和Her-2；CD137和PD-1；CD137和PDL-1；VEGF和PD-L1；Lag-3和TIM-3；OX40和PD-1；TIM-3和PD-1；TIM-3和PDL-1；EGFR和DLL-4；CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD3和CD33；CD3和CD133；CD47和CD20；CD38和CD138；CD38和CD20；CD20和CD22；CD38和CD40；CD40和CD20；CD-8和IL-6；CSPGs和RGM A；CTLA-4和BTNO2；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；IGF-1R和EGFR；EGFR和CD13；IGF-1R和ErbB3；EGFR-2和IGFR；VEGFR-2和Met；VEGF-A和血管生成素-2(Ang-2)；IL-12和TWEAK；IL-13和IL-1β；PDGFR和VEGF；EpCAM和CD3；Her2和CD3；CD19和CD3；EGFR和Her3；CD16a和CD30；CD30和PSMA；EGFR和CD3；CEA和CD3；TROP-2和HSG；TROP-2和CD3；MAG和RGM A；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGM A；PDL-1和CTLA-4；CTLA-4和PD-1；PD-1和TIM-3；RGM A和RGM B；Te38和TNFα；TNFα和Blys；TNFα和CD-22；TNFα和CTLA-4结构域；TNFα和GP130；TNFα和IL-12p40；以及TNFα和RANK配体；因子IXa和因子X；EGFR和PD-L1；EGFR和cMet；Her3和IGF-IR；DLL-4和VEGF；PD-1和PD-L1；以及Her3和PD-1。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合CD3和CD20。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合CD3和CD20并且包含源自抗CD3抗体OKT3或U.S.2009/0252683(将其全部按引用并入本文中)中公开的抗CD3抗体和抗CD20抗体奥法木单抗(ofatumumab)的可变重链和轻链。在一些实施方案中，源自CD3抗体的多肽在上结构域中，而源自CD20抗体的多肽在下结构域中。如本文中使用，上结构域是N-端或“近氨基端”结构域；而下结构域是C-端结构域、或更接近Fc的结构域(如果存在Fc的话)。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是CD3，和抗原B是CD20。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是CD3，和抗原A是CD20。在一些实施方案中，源自CD3抗体的多肽在下结构域中和源自CD20抗体的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是CD20，和抗原B是CD3。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是CD20，和抗原A是CD3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD3和CD20并包含：第一多肽链，其包含选自SEQ ID NO:41和48的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:46的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD20和CD3并包含：第一多肽链，其包含根据SEQ ID NO:114的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT018a相同的CD20表位和相同的CD3表位，其中双特异性结合蛋白FIT018a包含：第一多肽链，其包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列；第二多肽链，其包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列；和第三多肽链，其包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD3和CD20并包含在第一多肽上的VLA，其中所述第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:318的VLA CDR1、SEQ ID NO:319的VLA CDR2和SEQ ID NO:320的VLA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD3和CD20并包含在第一多肽上的VHB，其中所述第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:322的VHB CDR1、SEQ ID NO:323的VHB CDR2和SEQ ID NO:324的VHB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD3和CD20并包含在第二多肽上的VHA，其中所述第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:327的VHA CDR1、SEQ ID NO:328的VHA CDR2和SEQ ID NO:329的VHA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD3和CD20并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:332的VLB CDR1、SEQ ID NO:333的VLB CDR2和SEQID NO:334的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD3和CD20并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:318的VLA CDR1、SEQ ID NO:319的VLA CDR2和SEQ ID NO:320的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:322的VHB CDR1、SEQ ID NO:323的VHB CDR2和SEQ ID NO:324的VHB CDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:327的VHA CDR1、SEQ ID NO:328的VHA CDR2和SEQ IDNO:329的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:332的VLB CDR1、SEQ ID NO:333的VLB CDR2和SEQ ID NO:334的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD3和CD20，并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:317的序列的VLA和具有SEQ ID NO:321的序列的VHB；其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:326的序列的VHA；且其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:331的序列的VLB。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD3和CD20，并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD3和CD20，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸，同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性，而源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合CTLA-4和PD-1。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合CTLA-4和PD-1，并包含源自CTLA-4抗体伊匹单抗(ipilimumab)和PD-1抗体纳武单抗(nivolumab)的可变重链和轻链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA-4和PD-1，并包含：第一多肽链，其包含根据SEQ ID NO:92的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:95的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:97的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。在一个实施方案中，本文提供的结合蛋白能够结合CTLA-4上的一个或多个表位。在一个实施方案中，本文提供的结合蛋白能够结合PD-1上的一个或多个表位。在一些实施方案中，源自CTLA-4抗体的多肽在上结构域中和源自PD-1的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是CTLA-4，和抗原B是PD-1。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是CTLA-4，和抗原A是PD-1。在一些实施方案中，源自CTLA-4抗体的多肽在下结构域中和源自PD-1抗体的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是PD-1，和抗原B是CTLA-4。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是PD-1，和抗原A是CTLA-4。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与本文中所述的双特异性结合蛋白NBS3、NBS3R、NBS3-C或NBS3R-C相同的CTLA-4表位和相同的PD-1表位。
双特异性结合蛋白NBS3包含：包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的第三多肽链。
双特异性结合蛋白NBS3R包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第三多肽链。
双特异性结合蛋白NBS3-C包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第三多肽链。
双特异性结合蛋白NBS3R-C包含：包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:128的VLACDR1、SEQ ID NO:129的VLA CDR2和SEQID NO:130的VLA CDR3(例如，NBS3上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:147的VLACDR1、SEQ ID NO:148的VLA CDR2和SEQ ID NO:149的VLA CDR3(例如，NBS3R上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:166的VLACDR1、SEQ ID NO:167的VLA CDR2和SEQ ID NO:168的VLA CDR3(例如，NBS3-C上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:185的VLACDR1、SEQ IDNO:186的VLA CDR2和SEQ ID NO:187的VLA CDR3(例如，NBS3R-C上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:132的VHB CDR1，SEQ ID NO:133的VHB CDR2和SEQID NO:134的VHB CDR3(例如，NBS3上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:151的VHBCDR1，SEQ ID NO:152的VHB CDR2和SEQ ID NO:153的VHB CDR3(例如，NBS3R上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:166的VHB CDR1，SEQ ID NO:167的VHB CDR2和SEQ ID NO:168的VHB CDR3(例如，NBS3-C上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:185的VHB CDR1，SEQ IDNO:186的VHB CDR2和SEQ ID NO:187的VHB CDR3(例如，NBS3R-C上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:137的VHA CDR1、SEQ ID NO:138的VHA CDR2和SEQID NO:139的VHA CDR3(例如，NBS3上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:156的VHACDR1、SEQ ID NO:157的VHA CDR2和SEQ ID NO:158的VHA CDR3(例如，NBS3R上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:175的VHA CDR1、SEQ ID NO:176的VHA CDR2和SEQ ID NO:177的VHA CDR3(例如，NBS-C上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:194的VHA CDR1、SEQ IDNO:195的VHA CDR2和SEQ ID NO:196的VHA CDR3(例如，NBS3R-C上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:142的VLB CDR1、SEQ ID NO:143的VLB CDR2和SEQID NO:144的VLB CDR3(例如，NBS3上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:161的VLBCDR1、SEQ ID NO:162的VLB CDR2和SEQ ID NO:163的VLB CDR3(例如，NBS3R上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:180的VLB CDR1、SEQ ID NO:181的VLB CDR2和SEQ ID NO:182的VLB CDR3(例如，NBS3-C上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:199的VLB CDR1、SEQ IDNO:200的VLB CDR2和SEQ ID NO:201的VLB CDR3(例如，NBS3R-C上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:128的VLA CDR1、SEQ ID NO:129的VLA CDR2和SEQ ID NO:130的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:132的VHB CDR1、SEQ ID NO:133的VHB CDR2和SEQ ID NO:134的VHBCDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:137的VHA CDR1、SEQ ID NO:138的VHA CDR2和SEQID NO:139的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:142的VLB CDR1、SEQ ID NO:143的VLB CDR2和SEQ ID NO:144的VLB CDR3(例如，NBS3上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:147的VLA CDR1、SEQ ID NO:148的VLA CDR2和SEQ ID NO:149的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:151的VHB CDR1、SEQ ID NO:152的VHB CDR2和SEQ ID NO:153的VHBCDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:156的VHA CDR1、SEQ ID NO:157的VHA CDR2和SEQID NO:158的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:161的VLB CDR1、SEQ ID NO:162的VLB CDR2和SEQ ID NO:163的VLB CDR3(例如，NBS3R上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:166的VLA CDR1、SEQ ID NO:167的VLA CDR2和SEQ ID NO:168的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:170的VHB CDR1、SEQ ID NO:171的VHB CDR2和SEQ ID NO:172的VHBCDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:175的VHA CDR1、SEQ ID NO:176的VHA CDR2和SEQID NO:177的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:180的VLB CDR1、SEQ ID NO:181的VLB CDR2和SEQ ID NO:182的VLB CDR3(例如，NBS3-C上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:166的VLA CDR1、SEQ ID NO:167的VLA CDR2和SEQ ID NO:168的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:170的VHB CDR1、SEQ ID NO:171的VHB CDR2和SEQ ID NO:172的VHBCDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:175的VHA CDR1、SEQ ID NO:176的VHA CDR2和SEQID NO:177的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:180的VLB CDR1、SEQ ID NO:181的VLB CDR2和SEQ ID NO:182的VLB CDR3(例如，NBS3R-C上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1，并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:127的序列的VLA和具有SEQ ID NO:131序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:136的序列的VHA，且其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:141的序列的VLB(例如，NBS3上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:146的序列的VLA和具有SEQ ID NO:150序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:155的序列的VHA，且其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:160的序列的VLB(例如，NBS3R上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:165的序列的VLA和具有SEQ ID NO:169序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:174的序列的VHA，且其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:179的序列的VLB(例如，NBS3-C上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:184的序列的VLA和具有SEQ ID NO:188序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:193的序列的VHA，且其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:198的序列的VLB(例如，NBS3R-C上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含第一多肽链，第二多肽链和第三多肽链、或基本上由所述多肽链组成或由所述多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列(例如，NBS3上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含第一多肽链，第二多肽链和第三多肽链、或基本上由所述多肽链组成或由所述多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列(例如，NBS3R上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含第一多肽链，第二多肽链和第三多肽链、或基本上由所述多肽链组成或由所述多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列(例如，NBS3-C上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1并包含第一多肽链，第二多肽链和第三多肽链、或基本上由所述多肽链组成或由所述多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列(例如，NBS3R-C上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CTLA4和PD-1，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、且同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性而源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合EGFR和PD-L1。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合EGFR和PD-L1，并包含源自EGFR抗体帕尼单抗(panitumumab)和PD-L1抗体1B12的可变重链和轻链。在一些实施方案中，源自EGFR抗体的多肽在上结构域中，和源自PD-L1抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是EGFR，和抗原B是PD-L1。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是EGFR，和抗原A是PD-L1。在一些实施方案中，源自EGFR抗体的多肽在下结构域中，和源自PD-L1抗体的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是PD-L1，和抗原B是EGFR。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是PD-L1，和抗原A是EGFR。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含：第一多肽，其包含根据SEQ ID NO:99的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:100的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:101的序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT012a相同的EGFR表位和相同的PD-L1表位，其中双特异性结合蛋白FIT012a包含：包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的第三多肽链(例如，FIT012a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT012b相同的EGFR表位和相同的PD-L1表位，其中双特异性结合蛋白FIT012b包含：包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的第三多肽链(例如，FIT012b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT012d相同的EGFR表位和相同的PD-L1表位，其中双特异性结合蛋白FIT012d包含：包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列的第三多肽链(例如，FIT012d上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:204的VLA CDR1、SEQ ID NO:205的VLA CDR2和SEQID NO:206的VLA CDR3(例如，FIT012b上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:223的VLACDR1、SEQ ID NO:224的VLA CDR2和SEQ ID NO:225的VLA CDR3(例如，FIT012d上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:208的VHB CDR1、SEQ ID NO:209的VHB CDR2和SEQID NO:210的VHB CDR3(如FIT012b上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:227的VHBCDR1、SEQ ID NO:228的VHB CDR2和SEQ ID NO:229的VHB CDR3(如FIT012d上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:213的VHA CDR1、SEQ ID NO:214的VHA CDR2和SEQID NO:215的VHA CDR3(例如，FIT012b上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:232的VHACDR1、SEQ ID NO:233的VHA CDR2和SEQ ID NO:234的VHA CDR3(例如，FIT012d上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:218的VLB CDR1、SEQ ID NO:219的VLB CDR2和SEQID NO:220的VLB CDR3(例如，FIT012b上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:237的VLBCDR1、SEQ ID NO:238的VLB CDR2和SEQ ID NO:239的VLB CDR3(例如，FIT012d上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中VLA包含SEQ ID NO:204的VLACDR1、SEQ ID NO:205的VLA CDR2和SEQ ID NO:206的VLA CDR3，VHB包含SEQ ID NO:208的VHB CDR1、SEQ ID NO:209的VHB CDR2和SEQ ID NO:210的VHB CDR3，VHA包含SEQ ID NO:213的VHA CDR1、SEQ ID NO:214的VHA CDR2和SEQ ID NO:215的VHA CDR3，以及VLB包含SEQ IDNO:218的VLB CDR1、SEQ ID NO:219的VLB CDR2和SEQ ID NO:220的VLB CDR3(例如，FIT012b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:223的VLA CDR1、SEQ ID NO:224的VLA CDR2和SEQ ID NO:225的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:227的VHB CDR1、SEQ ID NO:228的VHB CDR2和SEQ ID NO:229的VHBCDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:232的VHA CDR1、SEQ ID NO:233的VHA CDR2和SEQID NO:234的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:237的VLB CDR1、SEQ ID NO:239的VLB CDR2和SEQ ID NO:239的VLB CDR3(例如，FIT012d上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:203的序列的VLA和具有SEQ ID NO:207的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:212的序列的VHA，且其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:217的序列的VLB(例如，FIT012b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:222的序列的VLA和具有SEQ ID NO:226的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:231的序列的VHA，且其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:236的序列的VLB(例如，FIT012d上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由所述多肽链组成或由所述多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列(例如，FIT012b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或基本上由所述多肽链组成或由所述多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列(例如，FIT012d上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合EGFR和PD-L1，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性、而源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合cMet和EGFR。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合cMet和EGFR并包含源自cMet抗体(h1332(13.3.2L-A91T,H-42K,S97T))和EGFR抗体帕尼单抗(panitumumab)的可变重链和轻链。在一些实施方案中，源自cMet抗体的多肽在上结构域中和源自EGFR抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是cMet，和抗原B是EGFR。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是cMet，和抗原A是EGFR。在一些实施方案中，源自cMet抗体的多肽在下结构域中，和源自EGFR抗体的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是EGFR，和抗原B是cMet。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是EGFR，和抗原A是cMet。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和EGFR并包含：第一多肽链，其包含根据SEQ ID NO:102的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:103的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:104的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT013a相同的cMet表位和相同的EGFR表位，其中双特异性结合蛋白FIT013a包含：包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:249的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和EGFR并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:242的VLA CDR1，SEQ ID NO:243的VLA CDR2和SEQID NO:244的VLA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和EGFR并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:246的VHB CDR1、SEQ ID NO:247的VHB CDR2和SEQID NO:248的VHB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和EGFR并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:251的VHA CDR1、SEQ ID NO:252的VHA CDR2和SEQID NO:253的VHA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和EGFR并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:256的VLB CDR1、SEQ ID NO:257的VLB CDR2和SEQID NO:258的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和EGFR并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:242的VLA CDR1、SEQ ID NO:243的VLA CDR2和SEQ ID NO:244的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:246的VHB CDR1、SEQ ID NO:247的VHB CDR2和SEQ ID NO:248的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:251的VHA CDR1、SEQ ID NO:252的VHA CDR2和SEQID NO:253的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:256的VLB CDR1、SEQ ID NO:257的VLB CDR2和SEQ ID NO:258的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和EGFR并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:241的序列的VLA和具有SEQ ID NO:245的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:250的序列的VHA，且其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:255的序列的VLB。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和EGFR并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或基本上由所述多肽链组成或由所述多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:249的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和EGFR，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性、而源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合因子IXa和因子X。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合因子IXa和因子X并包含源自抗因子IXa抗体的可变重链和轻链和源自抗因子X抗体的可变轻链和重链。在一些实施方案中，源自因子IXa抗体的多肽在上结构域中和源自因子X抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是因子IXa，和抗原B是因子X。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是因子IXa，和抗原A是因子X。在一些实施方案中，源自因子IXa抗体的多肽在下结构域中，和源自因子X抗体的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是因子X，和抗原B是因子IXa。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是因子X，和抗原A是因子IXa。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合因子IXa和因子X并包含：第一多肽，其包含根据SEQ ID NO:105的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:106的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:107的序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT014a相同的因子IXa表位和相同的因子X表位，其中双特异性结合蛋白FIT014a包含：包含SEQ IDNO:259的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:273的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合因子IXa和因子X并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:261的VLA CDR1，SEQ ID NO:262的VLA CDR2和SEQ ID NO:263的VLA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合因子IXa和因子X并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:265的VHB CDR1、SEQ ID NO:266的VHB CDR2和SEQ ID NO:267的VHB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合因子IXa和因子X并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:270的VHA CDR1、SEQ ID NO:271的VHA CDR2和SEQ ID NO:272的VHA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合因子IXa和因子X并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:275的VLB CDR1、SEQ ID NO:276的VLB CDR2和SEQ ID NO:277的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合因子IXa和因子X并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:261的VLA CDR1、SEQ ID NO:262的VLA CDR2和SEQ ID NO:263的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:265的VHB CDR1、SEQ ID NO:266的VHB CDR2和SEQ ID NO:267的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:270的VHA CDR1、SEQ ID NO:271的VHA CDR2和SEQID NO:272的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:275的VLB CDR1、SEQ ID NO:276的VLB CDR2和SEQ ID NO:277的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合因子IXa和因子X并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:260的序列的VLA和具有SEQ ID NO:264的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:269的序列的VHA，且其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:274的序列的VLB。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合因子IXa和因子X并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:273的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合因子IXa和因子X，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性、而源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合Her3和IGF-1R。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合Her3和IGF-1R并包含源自Her3抗体帕曲妥单抗(patritumab)和IGF-1R抗体非妥木单抗(figitumumab)的可变重链和轻链。在一些实施方案中，源自Her3抗体的多肽在上结构域中和源自IGF-1R抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是Her3，和抗原B是IGF-1R。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是Her3，和抗原A是IGF-1R。在一些实施方案中，源自Her3抗体的多肽在下结构域中，和源自IGF-1R抗体的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是IGF-1R，和抗原B是Her3。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是IGF-1R，和抗原A是Her3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和IGF-1R并包含：第一多肽链，其包含根据SEQ ID NO:108的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:109的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:110的序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT016a相同的Her3表位和相同的IGF-1R表位，其中双特异性结合蛋白FIT016a包含：包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:287的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和IGF-1R并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:280的VLA CDR1，SEQ ID NO:281的VLA CDR2和SEQID NO:282的VLA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和IGF-1R并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:284的VHB CDR1、SEQ ID NO:285的VHB CDR2和SEQID NO:286的VHB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和IGF-1R并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:289的VHA CDR1、SEQ ID NO:290的VHA CDR2和SEQID NO:291的VHA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和IGF-1R并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:294的VLB CDR1、SEQ ID NO:295的VLB CDR2和SEQID NO:296的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和IGF-1R并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:280的VLA CDR1、SEQ ID NO:281的VLA CDR2和SEQ ID NO:282的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:284的VHB CDR1、SEQ ID NO:285的VHB CDR2和SEQ ID NO:286的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:289的VHA CDR1、SEQ ID NO:290的VHA CDR2和SEQID NO:291的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:294的VLB CDR1、SEQ ID NO:295的VLB CDR2和SEQ ID NO:296的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和IGF-1R并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:279的序列的VLA和具有SEQ ID NO:283的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:288的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:293的序列的VLB。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和IGF-1R并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:287的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和IGF-1R，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性、而源自本文中所述的结合蛋白，。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合DLL-4和VEGF。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合DLL-4和VEGF并包含源自DLL-4抗体demcizumab和VEGF抗体bevicizumab的可变重链和轻链。在一些实施方案中，源自DLL-4抗体的多肽在上结构域中和源自VEGF抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是DLL-4，和抗原B是VEGF。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是DLL-4，和抗原A是VEGF。在一些实施方案中，源自DLL-4抗体的多肽在下结构域中，和源自VEGF抗体的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是VEGF，和抗原B是DLL-4。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是VEGF，和抗原A是DLL-4。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合DLL-4和VEGF并包含：第一多肽链，其包含根据SEQ ID NO:111的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:112的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:113的序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT017a相同的DLL-4表位和相同的VEGF表位，其中双特异性结合蛋白FIT017a包含：包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:306的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合DLL-4和VEGF并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:299的VLA CDR1，SEQ ID NO:300的VLA CDR2和SEQID NO:301的VLA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合DLL-4和VEGF并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:303的VHB CDR1、SEQ ID NO:304的VHB CDR2和SEQID NO:305的VHB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合DLL-4和VEGF并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:308的VHA CDR1、SEQ ID NO:309的VHA CDR2和SEQID NO:310的VHA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合DLL-4和VEGF并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:313的VLB CDR1、SEQ ID NO:314的VLB CDR2和SEQID NO:315的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合DLL-4和VEGF并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:299的VLA CDR1、SEQ ID NO:300的VLA CDR2和SEQ ID NO:301的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:303的VHB CDR1、SEQ ID NO:304的VHB CDR2和SEQ ID NO:305的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:308的VHA CDR1、SEQ ID NO:309的VHA CDR2和SEQID NO:310的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:313的VLB CDR1、SEQ ID NO:314的VLB CDR2和SEQ ID NO:315的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合DLL-4和VEGF并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:298的序列的VLA和具有SEQ ID NO:302的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:307的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:312的序列的VLB。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合DLL-4和VEGF并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:306的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合DLL-4和VEGF，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性、而源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合Her3和EGFR。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合Her3和EGFR并包含源自Her3抗体帕曲妥单抗和EGFR抗体帕尼单抗的可变重链和轻链。在一些实施方案中，源自Her3抗体的多肽在上结构域中和源自EGFR抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是Her3，和抗原B是EGFR。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是Her3，和抗原A是EGFR。在一些实施方案中，源自Her3抗体的多肽在下结构域中，和源自EGFR的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是EGFR，和抗原B是Her3。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是EGFR，和抗原A是Her3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含：第一多肽链，其包含根据SEQ ID NO:117的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:118的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:119的序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT019a相同的Her3表位和相同的EGFR表位，其中双特异性结合蛋白FIT019a包含：包含SEQ ID NO:335的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:344的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:349的氨基酸序列的第三多肽链。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT019b相同的Her3表位和相同的EGFR表位，其中双特异性结合蛋白FIT019b包含：包含SEQ ID NO:354的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:363的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:368的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:337的VLA CDR1，SEQ ID NO:338的VLA CDR2和SEQID NO:339的VLA CDR3(例如，FIT019a上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:356的VLACDR1，SEQ ID NO:357的VLA CDR2和SEQ ID NO:358的VLA CDR3(例如，FIT019b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:341的VHB CDR1、SEQ ID NO:342的VHB CDR2和SEQID NO:343的VHB CDR3(例如，FIT019a上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:360的VHBCDR1、SEQ ID NO:361的VHB CDR2和SEQ ID NO:362的VHB CDR3(例如，FIT019b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:346的VHA CDR1、SEQ ID NO:347的VHA CDR2和SEQID NO:348的VHA CDR3(例如，FIT019a上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:365的VHACDR1、SEQ ID NO:366的VHA CDR2和SEQ ID NO:367的VHA CDR3(例如，FIT019b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:351的VLB CDR1、SEQ ID NO:352的VLB CDR2和SEQID NO:353的VLB CDR3(例如，FIT019a上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:370的VLBCDR1、SEQ ID NO:371的VLB CDR2和SEQ ID NO:372的VLB CDR3(例如，FIT019b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:337的VLA CDR1、SEQ ID NO:338的VLA CDR2和SEQ ID NO:339的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:341的VHB CDR1、SEQ ID NO:342的VHB CDR2和SEQ ID NO:343的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:346的VHA CDR1、SEQ ID NO:347的VHA CDR2和SEQID NO:348的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:351的VLB CDR1、SEQ ID NO:352的VLB CDR2和SEQ ID NO:353的VLB CDR3(例如，FIT019a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:356的VLA CDR1、SEQ ID NO:357的VLA CDR2和SEQ ID NO:358的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:360的VHB CDR1、SEQ ID NO:361的VHB CDR2和SEQ ID NO:362的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:365的VHA CDR1、SEQ ID NO:366的VHA CDR2和SEQID NO:367的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:370的VLB CDR1、SEQ ID NO:371的VLB CDR2和SEQ ID NO:372的VLB CDR3(例如，FIT019b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:336的序列的VLA和具有SEQ ID NO:340的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:345的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:350的序列的VLB(例如，FIT019a上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:355的序列的VLA和具有SEQ ID NO:359的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:364的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:369的序列的VLB(例如，FIT019b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:335的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:344的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:349的氨基酸序列(例如，FIT019a上的那些)。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:354的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:363的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:368的氨基酸序列(例如，FIT019b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和EGFR，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性、而源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合PD-1和PD-L1。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合PD-1和PD-L1并包含源自PD-1抗体纳武单抗和PD-L1抗体1B12的可变重链和轻链。在一些实施方案中，源自PD-1抗体的多肽在上结构域中和源自PD-L1抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是PD-1，和抗原B是PD-L1。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是PD-1，和抗原A是PD-L1。在一些实施方案中，源自PD-1抗体的多肽在下结构域中和源自PD-L1的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是PD-L1，和抗原B是PD-1。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是PD-L1，和抗原A是PD-1。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含：第一多肽链，其包含根据SEQ ID NO:120的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:121的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:122的序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT020a相同的PD-1表位和相同的PD-L1表位，其中双特异性结合蛋白FIT020a包含：包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT020b相同的PD-1表位和相同的PD-L1表位，其中双特异性结合蛋白FIT020b包含：包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:306的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:389的VLA CDR1，SEQ ID NO:390的VLA CDR2和SEQID NO:391的VLA CDR3(例如，FIT020a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含SEQ ID NO:375的VLA，SEQ ID NO:376的VLA CDR2和SEQ ID NO:377的VLA CDR3(例如，FIT020b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:384的VHB CDR1、SEQ ID NO:385的VHB CDR2和SEQID NO:386的VHB CDR3(例如，FIT020a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含SEQ ID NO:379的VHB CDR1、SEQ ID NO:380的VHB CDR2和SEQ ID NO:381的VHB CDR3(例如，FIT020b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:379的VHA CDR1、SEQ ID NO:380的VHA CDR2和SEQID NO:381的VHA CDR3(例如，FIT020a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:384的VHA CDR1、SEQ ID NO:385的VHA CDR2和SEQID NO:386的VHA CDR3(例如，FIT020b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:375的VLB CDR1、SEQ ID NO:376的VLB CDR2和SEQID NO:377的VLB CDR3(例如，FIT020a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:389的VLB CDR1、SEQ ID NO:390的VLB CDR2和SEQID NO:391的VLB CDR3(例如，FIT020b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:389的VLA CDR1、SEQ ID NO:390的VLA CDR2和SEQ ID NO:391的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:384的VHB CDR1、SEQ ID NO:385的VHB CDR2和SEQ ID NO:386的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:379的VHA CDR1、SEQ ID NO:380的VHA CDR2和SEQID NO:381的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:375的VLB CDR1、SEQ ID NO:376的VLB CDR2和SEQ ID NO:377的VLB CDR3(例如，FIT020a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:375的VLA CDR1、SEQ ID NO:376的VLA CDR2和SEQ ID NO:377的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:379的VHB CDR1、SEQ ID NO:380的VHB CDR2和SEQ ID NO:381的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:384的VHA CDR1、SEQ ID NO:385的VHA CDR2和SEQID NO:386的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:389的VLB CDR1、SEQ ID NO:390的VLB CDR2和SEQ ID NO:391的VLB CDR3(例如，FIT020b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:388的序列的VLA和具有SEQ ID NO:383的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:378的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:374的序列的VLB(例如，FIT020a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:374的序列的VLA和具有SEQ ID NO:378的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:383的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:388的序列的VLB(例如，FIT020b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列(例如，FIT020a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，第一多肽链包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:382的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:387的氨基酸序列(例如，FIT020b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合PD-1和PD-L1，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性、而源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合Her3和PD-1。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合Her3和PD-1并包含源自Her3抗体帕曲妥单抗和EGFR抗体纳武单抗的可变重链和轻链。在一些实施方案中，源自Her3抗体的多肽在上结构域中和源自PD-1抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是Her3，和抗原B是PD-1。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是Her3，和抗原A是PD-1。在一些实施方案中，源自Her3抗体的多肽在下结构域中和源自PD-1抗体的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是PD-1，和抗原B是Her3。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是PD-1，和抗原A是Her3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和PD-1并包含：第一多肽链，其包含根据SEQ ID NO:123的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；第二多肽链，其包含根据SEQ ID NO:124的氨基酸序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成；和第三多肽链，其包含根据SEQ ID NO:125的序列，或者基本上由所述序列组成或由所述序列组成。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT022a相同的Her3表位和相同的PD-1表位，其中双特异性结合蛋白FIT022a包含包括SEQ ID NO:411的氨基酸序列的第一多肽链；包括SEQ ID NO:420的氨基酸序列的第二多肽链；和包括SEQID NO:425的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和PD-1并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:413的VLA CDR1，SEQ ID NO:414的VLA CDR2和SEQID NO:415的VLA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和PD-1并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:417的VHB CDR1、SEQ ID NO:418的VHB CDR2和SEQID NO:419的VHB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和PD-1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:422的VHA CDR1、SEQ ID NO:423的VHA CDR2和SEQID NO:424的VHA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和PD-1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:427的VLB CDR1、SEQ ID NO:428的VLB CDR2和SEQID NO:429的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和PD-1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:413的VLA CDR1、SEQ ID NO:414的VLA CDR2和SEQ ID NO:415的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:417的VHB CDR1、SEQ ID NO:418的VHB CDR2和SEQ ID NO:419的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:422的VHA CDR1、SEQ ID NO:423的VHA CDR2和SEQID NO:424的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:427的VLB CDR1、SEQ ID NO:428的VLB CDR2和SEQ ID NO:429的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和PD-1并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:412的序列的VLA和具有SEQ ID NO:416的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:421的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:426的序列的VLB。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和PD-1并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:420的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:425的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合Her3和PD-1，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性、而源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合cMet和PD-L1。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合cMet和PD-L1并包含源自cMet抗体h1332和PD-L1抗体1B12的可变重链和轻链。在一些实施方案中，源自cMet抗体的多肽在上结构域中和源自PD-L1抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是cMet，和抗原B是PD-L1。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是cMet，和抗原A是PD-L1。在一些实施方案中，源自cMet抗体的多肽在下结构域中和源自PD-L1抗体的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是PD-L1，和抗原B是cMet。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是PD-L1，和抗原A是cMet。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT023a相同的cMet表位和相同的PD-L1表位，其中双特异性结合蛋白FIT023a包含：包含SEQ ID NO:430的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:444的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和PD-L1并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:432的VLA CDR1，SEQ ID NO:433的VLA CDR2和SEQID NO:434的VLA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和PD-L1并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:436的VHB CDR1、SEQ ID NO:437的VHB CDR2和SEQID NO:438的VHB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和PD-L1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:441的VHA CDR1、SEQ ID NO:442的VHA CDR2和SEQID NO:443的VHA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和PD-L1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:446的VLB CDR1、SEQ ID NO:447的VLB CDR2和SEQID NO:448的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和PD-L1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:432的VLA CDR1、SEQ ID NO:433的VLA CDR2和SEQ ID NO:434的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:436的VHB CDR1、SEQ ID NO:437的VHB CDR2和SEQ ID NO:438的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:441的VHA CDR1、SEQ ID NO:442的VHA CDR2和SEQID NO:443的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:446的VLB CDR1、SEQ ID NO:447的VLB CDR2和SEQ ID NO:448的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和PD-L1并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:431的序列的VLA和具有SEQ ID NO:435的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:440的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:445的序列的VLB。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和PD-L1并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:430的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:444的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合cMet和PD-L1，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性、源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合BTLA和PD-1。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合BTLA和PD-1并包含源自BTLA抗体6A5和PD-1抗体纳武单抗的可变重链和轻链。在一些实施方案中，源自BTLA抗体的多肽在上结构域中和源自PD-1抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是BTLA，和抗原B是PD-1。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是BTLA，和抗原A是PD-1。在一些实施方案中，源自BTLA抗体的多肽在下结构域中和源自PD-1的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是PD-1，和抗原B是BTLA。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是PD-1，和抗原A是BTLA。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT024a相同的BTLA表位和相同的PD-1表位，其中双特异性结合蛋白FIT024a包含:包含SEQ ID NO:449的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:458的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:463的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT024b相同的BTLA表位和相同的PD-1表位，其中双特异性结合蛋白FIT024b包含：包含SEQ ID NO:468的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:477的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:482的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:451的VLA CDR1，SEQ ID NO:452的VLA CDR2和SEQID NO:453的VLA CDR3(例如，FIT024a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:470的VLA CDR1，SEQ ID NO:471的VLA CDR2和SEQID NO:472的VLA CDR3(例如，FIT024b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:455的VHB CDR1、SEQ ID NO:456的VHB CDR2和SEQID NO:457的VHB CDR3(例如，FIT024a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:474的VHB CDR1、SEQ ID NO:475的VHB CDR2和SEQID NO:476的VHB CDR3(例如，FIT024b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:460的VHA CDR1、SEQ ID NO:461的VHA CDR2和SEQID NO:462的VHA CDR3(例如，FIT024a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:479的VHA CDR1、SEQ ID NO:480的VHA CDR2和SEQID NO:481的VHA CDR3(例如，FIT024b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:465的VLB CDR1、SEQ ID NO:466的VLB CDR2和SEQID NO:467的VLB CDR3(例如，FIT024a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:484的VLB CDR1、SEQ ID NO:485的VLB CDR2和SEQID NO:486的VLB CDR3(例如，FIT024b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:451的VLA CDR1、SEQ ID NO:452的VLA CDR2和SEQ ID NO:453的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:455的VHB CDR1、SEQ ID NO:456的VHB CDR2和SEQ ID NO:457的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:460的VHA CDR1、SEQ ID NO:461的VHA CDR2和SEQID NO:462的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:465的VLB CDR1、SEQ ID NO:466的VLB CDR2和SEQ ID NO:467的VLB CDR3(例如，FIT024a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:470的VLA CDR1、SEQ ID NO:471的VLA CDR2和SEQ ID NO:472的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:474的VHB CDR1、SEQ ID NO:475的VHB CDR2和SEQ ID NO:476的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:479的VHA CDR1、SEQ ID NO:480的VHA CDR2和SEQID NO:481的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:484的VLB CDR1、SEQ ID NO:485的VLB CDR2和SEQ ID NO:486的VLB CDR3(例如，FIT024b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:450的序列的VLA和具有SEQ ID NO:454的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:459的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:464的序列的VLB(例如，FIT024a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:469的序列的VLA和具有SEQ ID NO:473的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:478的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:483的序列的VLB(例如，FIT024b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:449的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:458的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:463的氨基酸序列(FIT024a上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:468的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:477的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:482的氨基酸序列(FIT024b上的那些)。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合BTLA和PD-1，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性、而源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合CD20和CD22。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合CD20和CD22并包含源自CD20抗体Ofatumumab和CD22抗体Epratuzumab的可变重链和轻链。在一些实施方案中，源自CD20抗体的多肽在上结构域中和源自CD22抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是CD20，和抗原B是CD22。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是CD20，和抗原A是CD22。在一些实施方案中，源自CD20抗体的多肽在下结构域中和源自CD22的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是CD22，和抗原B是CD20。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是CD22，和抗原A是CD20。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT021b相同的CD20表位和相同的CD22表位，其中双特异性结合蛋白FIT021b包含：包含SEQ ID NO:392的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:401的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的第三多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD20和CD22并包含在第一多肽上的VLA，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:394的VLA CDR1，SEQ ID NO:395的VLA CDR2和SEQID NO:396的VLA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD20和CD22并包含在第一多肽上的VHB，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:398的VHB CDR1、SEQ ID NO:399的VHB CDR2和SEQID NO:400的VHB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD20和CD22并包含在第二多肽上的VHA，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:403的VHA CDR1、SEQ ID NO:404的VHA CDR2和SEQID NO:405的VHA CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD20和CD22并包含在第三多肽上的VLB，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:408的VLB CDR1、SEQ ID NO:409的VLB CDR2和SEQID NO:410的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD20和CD22并包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:394的VLA CDR1、SEQ ID NO:395的VLA CDR2和SEQ ID NO:396的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:398的VHB CDR1、SEQ ID NO:399的VHB CDR2和SEQ ID NO:400的VHBCDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:403的VHA CDR1、SEQ ID NO:404的VHA CDR2和SEQID NO:405的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:408的VLB CDR1、SEQ ID NO:409的VLB CDR2和SEQ ID NO:410的VLB CDR3。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD20和CD22并包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:393的序列的VLA和具有SEQ ID NO:397的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:402的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:407的序列的VLB。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD20和CD22并包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链、或者基本上由这些多肽链组成或由这些多肽链组成，其中第一多肽链包含SEQ ID NO:392的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:401的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白结合CD20和CD22，并且通过用保守性氨基酸置换替代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多(包括其间的所有值)个氨基酸、同时仍然保持与没有置换的相应结合蛋白等价的活性、而源自本文中所述的结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合PD-L1和TIM3。在一些实施方案中，源自PD-L1抗体的多肽在上结构域中和源自TIM3抗体的多肽在下结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是PD-L1，和抗原B是TIM3。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是PD-L1，和抗原A是TIM3。在一些实施方案中，源自PD-L1抗体的多肽在下结构域中和源自TIM3的多肽在上结构域中。例如，在一些实施方案中，结合蛋白包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc的第一多肽，VHA-CH1的第二多肽和VLB-CL的第三多肽，其中抗原A是TIM3，和抗原B是PD-L1。对于另一个实例，在一些实施方案中，结合蛋白包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc的第一多肽，VLB-CL的第二多肽和VHA-CH1的第三多肽，其中抗原B是TIM3，和抗原A是PD-L1。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合T细胞上的一个或多个免疫检查点蛋白上的一个或多个表位，如免疫检查点蛋白TIM-3、Lag3、ICOS、BTLA、CD160、2B4、KIR、CD137、CD27、OX40、CD40L及A2aR。在另一个实施方案中，结合蛋白能够结合参与免疫检查点路径的一种或多种肿瘤细胞表面蛋白上的一个或多个表位，如蛋白PD-L1、PD-L2、半乳糖凝集素9(Galectin 9)、HVEM、CD48、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CD70和CD40。
在一个方面中，本发明提供了药物组合物，其包含本文中所述的结合蛋白。在一个实施方案中，本文中提供了包含之前任一项权利要求的结合蛋白和一种或多种药学可接受载体的药物组合物。
在另一个方面中，本发明提供在有需要的受试者中治疗或预防炎性疾病、自体免疫性疾病、神经退行性疾病、癌症、脓毒症或脊髓损伤的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用有效量的一种或多种本文所提供的结合蛋白，或一种或多种包含本文提供的结合蛋白和药学可接受载体的药物组合物。本文还提供了本文所述的结合蛋白在制造药物中的用途，所述药物用于治疗或预防炎性疾病、自体免疫性疾病、神经退行性疾病、癌症、脊髓损伤或其他病症。在一个实施方案中，所述炎性疾病、自体免疫性疾病、癌症、神经退行性疾病和其他病症包括，但不限于，哮喘、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、多发性硬化、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、感染性疾病和病症，如牛皮癣、牛皮癣关节炎、皮炎、***性硬化病、炎性肠病(IBD)、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、肾小球肾炎、湿疹、哮喘、动脉粥样硬化、白细胞粘附缺陷、雷诺氏综合征、综合征、青少年型糖尿病、Reiter's病、病、免疫复合物性肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病、免疫介导的血小板减少症(如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜)、溶血性贫血、重症肌无力、狼疮肾炎、特应性皮炎、天疱疮、Graves'病、严重急性呼吸窘迫综合征、choreoretinitis、Hashimoto's甲状腺炎、Wegener's肉芽肿病、Omenn's综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV、疱疹病毒相关疾病、1型糖尿病、移植物对宿主疾病(GVHD)；与移植排异相关的免疫病症；T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、睾丸血管中心性T细胞淋巴瘤、良性淋巴细胞性血管炎、原发性粘液水肿、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、爱迪生病、胰岛素依赖性糖尿病、goodpasture综合征、交感性眼炎、特发性血小板减少、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎、溃疡性结肠炎、Sjogren's综合征、类风湿性关节炎、多肌炎、硬皮病、混合性***病、寻常型天疱疮、类天疱疮、强直性脊柱炎、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、乳糜泻、皮肌炎、Goodpasture综合征、Guillain-Barré综合征、特发性白细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、***、晶状体源性葡萄膜炎、原发性粘液水肿、Reiter's综合征、僵人综合征、甲状腺毒症、溃疡性结肠炎、乳癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌、***癌、***癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、食道癌、***癌、***、脾脏癌、睾丸癌、胸腺癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胚细胞瘤、肉瘤、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、真皮癌、真皮或眼内黑素瘤、直肠癌、肛周癌、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、男性/女性生殖道癌、神经癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、肝细胞瘤、胃癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肝癌、肝肿瘤、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、妊娠糖尿病、慢性血栓栓塞性疾病或与血纤维蛋白形成相关的疾病，包括血管病症，如深静脉血栓形成、动脉血栓形成、中风、肿瘤转移、溶栓、动脉粥样硬化和血管成形术后的再狭窄，脓毒性休克、败血症、低血压、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、弥散性血管内凝血病(DIC)、结节病、动脉硬化、消化性溃疡、烧伤、胰腺炎、多囊性卵巢病(POD)、子宫内膜异位、子宫纤维瘤、良性***肥大、T-细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、常染色体显性脑动脉病伴皮层下梗死和脑白质病(CADASIL)、法洛四联症(TOF)、Alagille综合征(AS)、黄斑变性和年龄相关性黄斑变性疾病、炎性纤维化(例如，硬皮病、肺纤维化和肝硬化)、骨关节炎、骨质疏松、哮喘(包括过敏性哮喘)、过敏、慢性梗阻性肺病(COPD)、青少年早发型I型糖尿病、移植排斥和SLE。
在一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗或预防类风湿性关节炎、牛皮癣、骨质疏松症、中风、肝病或口腔癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的FIT-Ig结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合IL-17和IL-20。在另一个实施方案中，所述FIT-Ig结合蛋白包含选自SEQ ID NO:15、25和27的氨基酸序列；和根据SEQID NO:21的氨基酸序列；和根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述FIT-Ig结合蛋白包含选自SEQ ID NO:15、25和27的氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗或预防B细胞癌症的方法，所述方法包括向受试者施用FIT-Ig结合蛋白，其中所述FIT-Ig结合蛋白能够结合一个或多个B细胞抗原。在另一个实施方案中，所述FIT-Ig结合蛋白能够结合CD20。在另一个实施方案中，所述FIT-Ig结合蛋白能够结合CD20和另一个抗原。在另一个实施方案中，所述结合蛋白能够结合CD3和CD20。在另一个实施方案中，所述癌症是B细胞癌症。在又另一个实施方案中，B细胞癌症选自：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤[NHL]、前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、成熟B细胞赘瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞性骨髓瘤、移植后淋巴增生病症、移瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗或预防B细胞癌症的方法，所述方法包括向受试者施用FIT-Ig结合蛋白，其中所述FIT-Ig结合蛋白包含根据SEQ ID NO:41或48的氨基酸序列；和根据SEQ ID NO:44的氨基酸序列；和根据SEQID NO:46的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗或预防自体免疫性疾病、炎性疾病或感染的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的FIT-Ig结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合TNF和IL-17。在另一个实施方案中，FIT-Ig结合蛋白包含根据SEQID NO:87、89和91的序列。在另一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于治疗或预防自体免疫或炎性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用FIT-Ig结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合TNF和IL-17，并且其中所述自体免疫或炎性疾病选自：节段性回肠炎、牛皮癣(包括斑块状牛皮癣)、关节炎(包括类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、骨关节炎或青少年特发性关节炎)、多发性硬化、强直性脊椎炎、椎关节强硬关节病变(spondylosing arthropathy)、全身性红斑狼疮、葡萄膜炎、脓毒症、神经退行性疾病、神经元再生、脊髓损伤、原发性和转移性癌症、呼吸道病症；哮喘；过敏性和非过敏性哮喘；由感染引起的哮喘；由感染呼吸道合胞病毒(RSV)引起的哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及气道炎症的病状；嗜酸性粒细胞增多症；纤维化和过量粘液产生；囊性纤维化；肺纤维化；特应性病症；特应性皮炎；荨麻疹；湿疹；过敏性鼻炎；过敏性肠胃炎；炎性和/或自体免疫性皮肤病状；炎性和/或自体免疫性胃肠器官病状；炎性肠病(IBD)；溃疡性结肠炎；炎性和/或自体免疫性肝病症；肝硬化；肝纤维化；以及由乙型和/或丙型肝炎病毒引起的肝纤维化；硬皮病。在另一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的FIT-Ig结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合TNF和IL-17。在另一个实施方案中，所述癌症是肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma)；成胶质细胞瘤；淋巴瘤；或霍奇金淋巴瘤。在另一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗或预防感染的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的FIT-Ig结合蛋白，其中所述感染是病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、HTLV-1感染。在一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于抑制1型保护性免疫反应的表达和抑制在疫苗接种期间1型保护性免疫反应的表达的方法。
在一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用FIT-Ig结合蛋白，其中所述结合蛋白包含根据SEQ ID NO:87、89和91的序列。
在一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的FIT-Ig结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合CTLA-4和PD-1。在另一个实施方案中，FIT-Ig结合蛋白包含含有SEQ ID NO:92、95和97的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗或预防癌症的方法，其中所述结合蛋白能够结合CTLA-4和PD-1，并且其中所述癌症是典型地应答免疫疗法的癌症。在另一个实施方案中，所述癌症是与免疫疗法无关的癌症。在另一个实施方案中，所述癌症是属于难治性或复发性恶性疾病的癌症。在另一个实施方案中，所述结合蛋白抑制肿瘤细胞的生长或存活。在另一个实施方案中，癌症选自：黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、***癌(例如，激素难治性***腺癌)、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、***、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤及其它赘生性恶性疾病。
在一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗或预防黑素瘤的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的FIT-Ig结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合CTLA-4和PD-1。在另一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗或预防黑素瘤的方法，其中所述方法包括向受试者施用包含根据SEQ ID NO:92、95和97的氨基酸序列的FIT-Ig结合蛋白。
在另一个实施方案中，本发明公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗或预防感染或感染性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的FIT-Ig结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合CTLA-4和PD-1。在一个实施方案中，FIT-Ig结合蛋白是单独施用或与疫苗组合施用，以刺激对病原体、毒素及自体抗原的免疫反应。因此，在一个实施方案中，本文提供的结合蛋白可以用于刺激针对感染人的病毒(如，但不限于，人免疫缺陷病毒；甲型、乙型和丙型肝炎病毒；Epstein Barr病毒；人巨细胞病毒；人***状瘤病毒；疱疹病毒)、细菌、真菌、寄生虫或其它病原体的免疫反应。
附图简述
图1A显示由三个构建体(如FIT1-Ig、FIT2-Ig和FIT3-Ig)构成的FIT-Ig的结构。图1B显示用于制备此类FIT1-Ig的三个构建体。
图2A显示由两个构建体构成的FIT-Ig的基本结构。图2B显示用于制备此类FIT-Ig的两个构建体。
图3提供了通过Biacore测量的FIT1-Ig的双特异性抗原结合。图3的上图显示其中首先通过IL-17接着通过IL-20使FIT1-Ig饱和的Biacore结合测定的结果。图3的下图显示其中首先通过IL-20接着通过IL-17使FIT1-Ig饱和的Biacore测定的结果。
图4显示，通过PEG诱导的沉淀进行测量，抗IL-17/IL-20FIT Ig或单克隆抗体利妥昔单抗在一定pH范围下的溶解度。
图5显示，通过ELISA评价，FIT10-Ig或亲本抗体伊匹单抗和纳武单抗与CTLA-5(图5A)或PD-1(图5B)的结合。
图6显示，针对CTLA-4和PD-1两者，FIT10-Ig的多重结合研究。图6中显示在结合CTLA-4后结合PD-1；以及在PD-1结合后结合CTLA-4。
图7a-7i显示FIT12a-Ig(EGFR/PD-L1；图7a)、FIT13a-Ig(cMet/EGFR；图7b)、FIT14-Ig(因子IXa/因子X；图7c)、FIT16a-Ig(Her3/IGF-1R；图7d)、FIT17a-Ig(DLL-4/VEGF；图7e)、FIT18a-Ig(CD20/CD3；图7f)、FIT19a-Ig(Her3/EGFR；图7g)、FIT20a-Ig(PD-1/PD-L1；图7h)，和FIT22a-Ig(Her3/PD-1；图7i)的SEC谱。
图8显示针对cMet和EGFR两者的FIT13a-Ig的多重结合研究。
图9A和图9B显示，通过ELISA测量，NBSR或亲本抗体纳武单抗与PD-1(图9A)或CTLA-4(图9B)的结合。包括人IgG1作为对照。
图10显示针对CTLA-4和PD-1的NBS3的多重结合研究。如所示的，显示了结合CTLA-4接着结合PD-1；以及结合PD-1接着结合CTLA-4。
图11A显示静脉内(IV)或皮下(SC)给药的5mg/kg NBS3的平均血清浓度-时间曲线。图11B提供此研究的详细PK参数。
图12显示，与亲本抗体纳武单抗相比，NBS3、NBS3-C、NBS3R-C的基于细胞的报告分子阻断测定。包括人IgG4作为对照。
图13A显示，与浓度为0、0.01、0.1、1或10μg/ml的亲本抗体纳武单抗相比时，MLR测定试验中NBS3、NBS3-C和NBS3R-C的功能活性。针对每个抗体，测定了IFN-γ诱导。包括人IgG作为对照。图13B显示由这些抗体诱导的IL-2。
图14显示，在0.016、0.08、0.4、2或10μg/ml浓度下，与亲本抗体lpilimumab相比，PBMC SEB-刺激测定中NBS3、NBS3-C和NBS3R-C的功能活性。通过ELISA检测了上清液中的IL-2细胞因子产生。
图15显示针对EGFR和PD-L1两者的FIT012b的多重结合研究。如所示的，显示了结合人EGFR接着结合人PD-L1；和结合人PD-L1接着结合人EGFR。
图16A和图16B显示针对人EGFR和人PD-L1两者的FIT012d的多重结合研究。如所示的，显示了结合人EGFR接着结合人PD-L1(图16A)；和结合人PD-L1接着结合人EGFR(图16B)。
图17显示针对cMet和EGFR两者的FIT013a的多重结合研究。如所示的，显示了结合cMet接着结合EGFR；和结合EGFR接着结合cMet。
图18A至图18C显示FACS测定试验，其中测定了FIT013a与膜c-Met和EGFR的结合活性。图18A(右图)显示，通过BD FACSVerse流式细胞仪测量的，与MKN-45的双重结合。图18A(左图)显示在MKN-45细胞中c-Met膜表达水平比EGFR高得多，因此FIT-013a和FIT013a-Fab的c-Met结合位点可以被膜c-Met占据，通过生物素化的EGFR可以检测到FIT013a和FIT013a-Fab的游离EGFR结合位点。图18B(右图)显示通过BD FACSVerse流式细胞仪测量的、与SGC-7901细胞的双重结合。图18B(左图)显示在SGC-7901细胞中EGFR膜表达水平比c-Met高得多，因此FIT013a和FIT013-Fab的EGFR结合位点可以被膜EGFR占据，通过生物素化的c-Met可以检测FIT013a和FIT013a-Fab的游离c-Met结合位点。图18C(右图)显示，如通过BD FACSVerse流式细胞仪测量的，与NCI-H1975细胞的双重结合。图18C(左图)显示在NCI-H1975细胞中c-Met膜表达水平与EGFR相等，因此FIT013a和FIT013a-Fab的c-Met和EGFR结合位点同时被占据，不能检测到FIT013a和FIT013a-Fab上的游离EGFR或c-Met结合位点。
图19显示FTI013a抑制NCI-H292细胞中HGF诱导的AKT磷酸化的能力。将FIT013a、h1332、帕尼单抗、h1332/帕尼单抗的组合、和人IgG1加入细胞中并孵育30min，随后将40ng/ml HGF加入测定板5min。将细胞裂解并通过ERK磷酸-T202/Y204试剂盒来检测AKT磷酸化。
图20显示，如通过AKT磷酸化测量的，在HGF不存在下，FIT013a的激动剂效果。将连续稀释的FIT013a或其他Ab(h1332，h1332/帕尼单抗的组合，emibetuzumab，9.1.2和人IgG1)加入细胞中并孵育30min。将细胞裂解，并通过ERK磷酸-T202/Y204试剂盒来检测AKT磷酸化。
图21A显示，在雄性SD大鼠中5mg/kg IV给药后FIT013a(c-met/EGFR)的血清浓度-时间曲线(N＝4/时间点，c-met平板)。图21B显示，在雄性SD大鼠中5mg/kg SC给药后FIT013a(c-met/EGFR)的血清浓度-时间曲线(N＝4/时间点，c-met平板)。图21C显示，在雄性SD大鼠中5mg/kg IV给药后FIT013a(c-met/EGFR)的血清浓度-时间曲线(N＝4/时间点，EGFR平板)。图21D显示，在雄性SD大鼠中5mg/kg SC给药后FIT013a(c-met/EGFR)的血清浓度-时间曲线(N＝4/时间点，EGFR平板)。
图22显示，在接种了NCI-H1975-HGF肿瘤细胞的BALB/c裸鼠(N＝3只动物/组)中，FIT013a、帕尼单抗和H1332在血清和肿瘤中的分布。
图23显示，在接种了NCI-H1975-HGF肿瘤细胞的BALB/c裸鼠(N＝8只动物/组)中，FIT013a、帕尼单抗、H1332、溶媒(vehicle)在抑制肿瘤大小中的功效。抗体i.p.给药两次/周，持续三周。FIT013a的剂量为16mg/kg，H1332或帕尼单抗的剂量为10mg/kg。
图24显示使用BIOPHEM FVIII:C试剂盒(Hyphen-Biomed)，针对因子VIIIa-样活性的酶测定。分析了含有mAb FIX、mAb FX、mAb FIX和mAb FX的组合、Emicizumab,FIT014a和纯化的FVIIIa的样品。
图25显示针对FIX和FX两者的FIT014a的多重结合研究。如所示的，显示了结合FIX接着结合FX；以及结合FX接着结合FIX。
图26显示在hIgG平板或因子X平板上，静脉内(IV)或皮下(SC)给药5mg/kgFIT014a的平均血清浓度-时间曲线。使用62.5ng/mL的LLOQ，通过ELISA检测了大鼠血清样品中的抗体浓度。在hIgG平板上，包被蛋白质是抗-hIgG Fc，并且检测抗体是抗-hIgG Fab。在因子X平板上，包被蛋白是因子X，而检测抗体是抗人-IgG Fc。
图27显示针对Her3和IGF1R两者的FIT016a的多重结合研究。如所示的，显示了结合Her3接着结合IGF1R；以及结合IGF1R接着结合Her3。
图28显示针对DLL4和VEGF两者的FIT017a的多重结合研究。如所示的，显示了结合DLL4接着结合VEGF；以及结合VEGF接着结合DLL4。
图29A和图29B显示基于细胞的FACS结合测定试验，比较了FIT018a与其相关亲本抗体(CD3mAb，Ofatumumab，以及CD3mAb和Ofatumumab的组合)和人IgG1在结合人B细胞和人T细胞上的CD20和CD3方面的能力。在图29A的测定试验中，使用人B细胞系Raji。在图29B的测定试验中，使用人T细胞系Jurkat。
图30A显示基于细胞的FACS结合测定试验，比较了FIT018a与ofatumumab(CD20)和抗RAC-人IgG1在结合食蟹猴CD20细胞方面的能力。图30B显示基于细胞的FACS结合测定试验，比较了FIT018a与ofatumumab(CD20)、CD3mAb在结合食蟹猴T细胞方面的能力。
图31A和图31B显示，在B-细胞耗竭测定试验中测量，在第2天(图31A)和第3天(图31B)，FIT018a、Ofatumumab、CD3mAb以及ofatumumab和CDA mAb(1:1)的组合在诱导人B细胞(Raji)凋亡中的能力。
图32显示针对Her3和EGFR的FIT019a的多重结合研究。如所示的，显示了结合Her3接着结合EGFR；以及结合EGFR接着结合Her3。
图33A和图33B显示针对Her3和hEGFR的FIT019b的多重结合研究。如所示的，显示了结合EGFR接着结合Her3(图33A)；以及结合Her3接着结合EGFR(图33B)。
图34A显示，通过诱导的IL-2水平测量的，在0、0.01、0.1、1、10或100nM浓度下，与亲本抗体纳武单抗、1B12以及纳武单抗和1B12(1:1)的组合相比时，MLR测定试验中FIT020b的功能活性。图34B显示这些抗体在0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30和100nM浓度下对IL-2的诱导。
图35显示针对PD-L1和PD-1两者的FIT020b的多重结合研究。如所示的，显示了结合PD-L1接着结合PD-1；以及结合PD-1接着结合PD-L1。
图36A和图36B显示基于细胞的FACS结合测定试验，其中针对结合人B细胞的能力，比较了FIT021b与其相关亲本抗体(Ofatumumab、Epratuzumab、以及ofatumumab和Epratuzumab(1:1)的组合)和人IgG1。在图36A的测定试验中，使用了人B细胞系Raji。在图36B的测定试验中，使用了人B细胞系Daudi。
图37显示针对Her3和人PD-1两者的FIT022a的多重结合研究。如所示的，显示了结合Her3接着结合人PD-1；以及结合人PD-1接着结合Her3。
图38A显示，在0、0.01、0.1、1或10μg/ml浓度下，与亲本抗体纳武单抗和帕曲妥单抗相比时，MLR测定试验中FIT022a的功能活性。针对每个抗体测量了LI-2的诱导。包括人IgG1和人IgG4作为对照。图38B显示这些抗体对IFN-γ的诱导。
图39A和图39B显示针对cMet-his和PD-L1-his两者的FIT023a的多重结合研究。如所示的，显示了结合cMet-his接着结合PD-L1-his(图39A)；以及结合PD-L1-his接着结合cMet-his(图39B)。
图40A和图40B显示针对BTLA-his和PD1-his两者的FIT024a的多重结合研究。如所示的，显示了结合BTLA-his接着结合PD1-his(图40A)；以及结合PD1-his接着结合BTLA-his(图40B)。
图41A和图41B显示针对BTLA-his和PD1-his的FIT024b的多重结合研究。如所示的，显示了结合BTLA-his接着结合PD1-his(图41A)；以及结合PD1-his接着结合BTLA-his(图41B)。
图42A显示，在0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30或100nM浓度下，与亲本抗体纳武单抗相比时，MLR测定试验中FIT024a和FIT024b的功能活性，由诱导的IL-2的水平来量度。包括人IgG1作为对照。图42B显示通过这些抗体在0、0.01、0.1、1、10或100浓度下诱导的IL-2。
发明详述
本发明涉及多价和多特异性结合蛋白、制备所述结合蛋白的方法及其在预防和/或治疗急性和慢性炎性疾病和病症、癌症和其他疾病中的用途。本发明涉及能够结合两个或更多个抗原的多价和/或多特异性结合蛋白。具体地，本发明涉及串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)及其药物组合物，以及用于制备此类FIT-Ig的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明还涵盖使用本发明的FIT-Ig在体外或体内检测特定抗原的方法。
本文提供的新型结合蛋白家族能够(例如以高亲和力)结合两个或更多个抗原。具体地，本发明提供一种使用2个亲本单克隆抗体：结合至抗原a的mAb A和结合至抗原b的mAbB，来构建双特异性结合蛋白的方法。
在一个方面中，本发明提供了一种结合蛋白，其包含第一抗原或表位特异性的可变轻链、第一轻链恒定结构域、第二抗原或表位特异性的可变重链、第一重链CH1、第一抗原或表位特异性的可变重链、第二重链CH1、第二抗原或表位特异性的可变重链、及第二轻链恒定结构域。在一个实施方案中，所述结合蛋白还包含Fc区。所述结合蛋白可以还包含连接所述结合蛋白的两个或更多个组分的一个或多个氨基酸或多肽接头。例如，所述结合蛋白可以包含将轻链可变区连接至轻链恒定区的多肽接头。
在一个实施方案中，本公开提供了一种结合蛋白，其包含含有VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)n的多肽链，其中VLA是mAb A的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，X1表示氨基酸或寡肽接头，VHB是mAb B的重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，X2表示Fc区或不同的二聚化结构域，并且n是0或1。
在一个实施方案中，本发明提供了一种结合蛋白，其包含三条不同的多肽链(图1)，其中第一条多肽链(构建体#1)包含VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)n，其中VLA是mAb A的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，X1表示氨基酸或寡肽接头，VHB是mAb B的重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，X2表示Fc区或不同的二聚化结构域，并且n是0或1。第二条多肽链(构建体#2)包含VHA-CH1，其中VHA是mAb A的重链可变结构域，并且CH1是重链的第一恒定结构域。第三条多肽链(构建体#3)包含VLB-CL，其中VLB是mAb B的轻链可变结构域，并且CL是轻链的恒定结构域。
在另一个实施方案中，本发明提供一种结合蛋白，其包含三条不同的多肽链，所述多肽链的总体分子设计类似于前一个实施方案，除了可变结构域的次序颠倒。在所述实施方案中，第一条多肽链包含VHB-CH1-(X1)n-VLA-CL-(X2)n，其中VLA是mAb A的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，X1表示氨基酸或寡肽接头，VHB是mAb B的重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，X2表示Fc区或不同的二聚化结构域，并且n是0或1。第二条多肽链包含VHA-CH1，其中VHA是mAb A的重链可变结构域，并且CH1是重链的第一恒定结构域。第三多肽链包含VLB-CL，其中VLB是mAb B的轻链可变结构域，并且CL是轻链的恒定结构域。
在另一个实施方案中，本发明提供一种结合蛋白，其包含两条不同的多肽链(图2)，其中第一条多肽链(构建体#1)包含VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)n，其中VLA是mAb A的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，X1表示氨基酸或寡肽接头，VHB是mAb B的重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，X2表示Fc区或不同的二聚化结构域，并且n是0或1。第二条多肽链(构建体#4)包含VHA-CH1-(X3)n-VLB-CL，其中VHA是mAb A的重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，X3表示不为恒定结构域的氨基酸或多肽，n是0或1，VLB是mAbB的轻链可变结构域，并且CL是轻链的恒定结构域。
在另一个实施方案中，本发明提供一种结合蛋白，其包含两条多肽链，所述多肽链的总体分子设计类似于前一个实施方案，除了可变结构域的次序颠倒。在这个实施方案中，第一条多肽链包含VHB-CH1-(X1)n-VLA-CL-(X2)n，其中VLA是mAb A的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，X1表示氨基酸或寡肽接头，VHB是mAb B的重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，X2表示Fc区或不同的二聚化结构域，并且n是0或1。第二条多肽链包含VLB-CL-(X3)n-VHA-CH1，其中VHA是mAb A的重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，X3表示氨基酸或寡肽接头，n是0或1，VLB是mAb B的轻链可变结构域，并且CL是轻链的恒定结构域。
在一个实施方案中，所述结合蛋白中的VH和VL结构域选自：鼠重链/轻链可变结构域、完全人重链/轻链可变结构域、CDR嫁接的重链/轻链可变结构域、人源化重链/轻链可变结构域、及其混合物。在优选实施方案中，VHA/VLA和VHB/VLB能够结合相同抗原。在另一个实施方案中，VHA/VLA和VHB/VLB能够结合不同抗原。
在一个实施方案中，第一条多肽链包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc，并且第一条多肽链的CL和VHB直接融合在一起。在另一个实施方案中，C L和VHB通过氨基酸或寡肽接头连接。在另一个实施方案中，第一条多肽链包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc，并且CH1和VLA直接融合在一起。在另一个实施方案中，CH1和VLA通过氨基酸或寡肽接头连接。在另一个实施方案中，寡肽或多肽接头包含了提供柔性的任何合理序列的一个或多个氨基酸。优选地，接头选自：G、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS(SEQ ID NO:489)、SGGG(SEQ ID NO:490)、GGGGS(SEQ ID NO:491)、GGGGSGS(SEQ ID NO:492)、GGGGSGGS(SEQ ID NO:493)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:494)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:495)、AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO:496)、AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:497)、AKTTPKLGG(SEQ ID NO:498)、SAKTTPKLGG(SEQ IDNO:499)、SAKTTP(SEQ ID NO:500)、、RADAAP(SEQ ID NO:501)、RADAAPTVS(SEQ ID NO:502)、RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO:503)、RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO:504)、SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:505)、ADAAP(SEQ ID NO:506)、ADAAPTVSIFPP(SEQ IDNO:507)、TVAAP(SEQ ID NO:508)、TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:509)、QP KAAP(SEQ ID NO:510)、QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO:511)、AKTTPP(SEQ ID NO:512)、AKTTPPSVTPLAP(SEQ IDNO:513)、AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:514)、ASTKGP(SEQ ID NO:515)、ASTKGPSVFPLAP(SEQID NO:516)、GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO:517)、GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:518)、GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO:519)和AKTTAP(SEQ ID NO:80)。在一个实施方案中，接头的氨基酸序列可以选自SEQ ID NO.26、28和49-86。在一个实施方案中，接头是GSG(SEQ IDNO:26)或GGGGSGS(SEQ ID NO:28)。接头也可以是在体内可断裂的肽接头、蛋白酶(如MMP)敏感性接头、可以通过还原进行断裂的基于二硫键的接头等，如先前所描述的(FusionProtein Technologies for Biopharmaceuticals:Applications and Challenges,由Stefan R.Schmidt编辑)或本领域中已知的任何可断裂的接头。这些可断裂的接头可以用于在体内释放顶部的Fab用于各种目的，以便改善组织/细胞渗透和分布、增进与靶标的结合、减少潜在副作用、以及调节2个不同Fab区的体内功能和物理半衰期。在一个实施方案中，结合蛋白包含Fc区。如本文所用，术语“F c区”是指IgG重链的C末端区。含有人IgG1Fc区的氨基酸序列的实例是SEQ ID NO:20。IgG的Fc区包含两个恒定结构域，即CH2和CH3。
在一个实施方案中，Fc区是变体Fc区。在一个实施方案中，相对于亲本Fc区，变体Fc区具有一个或多个氨基酸修饰，如取代、缺失或***。在另一个实施方案中，相对于亲本Fc区活性，Fc区的氨基酸修饰改变了效应子功能活性。例如，在一个实施方案中，变体Fc区可以具有改变的(即，增加的或降低的)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CDC)、吞噬作用、调理作用(opsonization)或细胞结合。在另一个实施方案中，相对于亲本Fc区，Fc区氨基酸修饰可以改变(即，增加或降低)变体Fc区对FcγR的亲和力。例如，变体Fc区可以改变对FcγRI、FcγRII、FcγRIII的亲和力。
在一个优选实施方案中，本文提供的结合蛋白能够结合一个或多个靶标。在一个实施方案中，靶标选自：细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体。优选地，结合蛋白能够调节一个或多个靶标的生物功能。更优选地，结合蛋白能够中和一个或多个靶标。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合选自淋巴因子、单核因子和多肽激素的细胞因子。在另一个实施方案中，结合蛋白能够结合选自以下的细胞因子对：IL-1α和IL-1β；IL-12和IL-18；TNFα和IL-23；TNFα和IL-13；TNF和IL-18；TNF和IL-12；TNF和IL-1β；TNF和MIF；TNF和IL-6；TNF和IL-6受体；TNF和IL-17；IL-17和IL-20；IL-17和IL-23；TNF和IL-15；TNF和VEGF；VEGFR和EGFR；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAM8；以及TNFα和PGE4、IL-13和PED2、TNF和PEG2。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合选自以下的靶标对：CD137和CD20、CD137和EGFR、CD137和Her-2、CD137和PD-1、CD137和PDL-1、VEGF和PD-L1、Lag-3和TIM-3、OX40和PD-1、TIM-3和PD-1、TIM-3和PDL-1、EGFR和DLL-4、VEGF和EGFR、HGF和VEGF、VEGF和VEGF(相同或不同的表位)、VEGF和Ang2、EGFR和cMet、PDGF和VEGF、VEGF和DLL-4、OX40和PD-L1、ICOS和PD-1、ICOS和PD-L1、Lag-3和PD-1、Lag-3和PD-L1、Lag-3和CTLA-4、ICOS和CTLA-4、CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD3和CD33；CD3和CD133；CD38&CD138；CD38和CD20；CD20和CD22；CD38和CD40；CD40和CD20；CD47和CD20、CD-8和IL-6；CSPGs和RGM A；CTLA-4和BTNO2；CTLA-4和PD-1；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；IGF-1R和EGFR；EGFR和CD13；IGF-1R和ErbB3；EGFR-2和IGFR；Her2和Her2(相同或不同的表位)；因子IXa和因子X、VEGFR-2和Met；VEGF-A和Angiopoietin-2(Ang-2)；IL-12和TWEAK；IL-13和IL-1β；MAG和RGM A；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGM A；PDL-1和CTLA-4；PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3；RGM A和RGM B；Te38和TNFα；TNFα和Blys；TNFα和CD-22；TNFα和CTLA-4结构域；TNFα和GP130；TNFα和IL-12p40；TNFα和RANK配体；EGFR和PD-L1；EGFR和cMet；Her3和IGF-IR；DLL-4和VEGF；PD-1和PD-L1；Her3和PD-1、Her3和EGFR、cMet和PD-L1、以及BTLA和PD-1。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自CD20抗体的可变区或CDR，所述CD20抗体包括，但不限于，ofatumumab、rituximab、碘131 tositumomab，obimutuzumab，ibritumomab，以及美国专利No.9228008、8206711、7682612、8562992、7799900、7422739、7850962、8097713、8057793、8592156、6652852、6893625、6120767、8084582、8778339、9184781、7381560、8101179、9382327、7151164、7435803、8529902、9416187、7812116、8329181、8034902、9289479、9234045、4987084、9173961、9175086、6410319中所述的那些，每篇专利文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自CD3抗体的可变区或CDR，所述CD3抗体包括，但不限于，muromonab-CD3、otelixizumab、teplizumab和visilizumab，以及美国专利No.8569450、7635472、5585097、6706265、5834597、9056906、9486475、7728114、8551478、9226962、9192665、9505849、8394926、6306575、5795727、8840888、5627040、9249217、8663634、6491917、5877299中所述的那些，每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自CTLA-4抗体的可变区或CDR，所述CTLA-4抗体包括，但不限于，伊匹单抗，和美国专利No.5434131、5968510、5844095、7572772、6090914、7311910、5885796、5885579、5770197、5851795、5977318、7161058、6875904、7504554、7034121、6719972、7592007中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自PD-1抗体的可变区或CDR，所述PD-1抗体包括，但不限于，pembrolizumab、纳武单抗、atezolizumab，和美国专利No.8741295、7029674、7722868、9243052、8927697、9181342、8552154、9102727、9220776、9084776、8008449、9387247、9492540、8779105、9358289、9492539、9205148、8900587、8952136、8460886、7414171、8287856、8580247、7488802、7521051、8088905、7709214、8617546、9381244、8993731、8574872、7432059、8216996、9499603、9102728、9212224中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自PD-L1抗体的可变区或CDR，所述PD-L1抗体包括，但不限于，durvalumab、avelumab和美国专利No.8741295、9102725、8168179、8952136、8552154、8617546、9212224、8217149、8383796中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自EGFR抗体的可变区或CDR，所述EGFR抗体包括，但不限于，gefitinib、erlotinib、lapatinib、cetuximab、帕尼单抗、vandetanib、necitumumab、osimertinib和美国专利No.7723484、9044460、9226964、8658175、7618631、8748175、9499622、9527913、9493568、8580263、7514240、9314536、9051370、9233171、9029513、8592152、8597652、9327035、8628773、9023356、9132192、8637026、9283276、9540440、9545442、8758756、9120853、7981605、8546107、7598350、5212290、8017321、7589180、9260524、8790649、9125896、9238690、8071093中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自TIM3(CD366)抗体的可变区或CDR，所述TIM3(CD366)抗体包括，但不限于，4C4G3、7D3、B8.2C12、F38-2E2和美国专利No.8841418、8552156、9556270中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自cMet抗体的可变区或CDR，所述cMet抗体包括，但不限于，h1332、71-8000、ab74217和美国专利No.8673302、9120852、7476724、7892550、9249221、9535055、9487589、8329173、9101610、8101727、9068011、9260531、9296817、8481689、8546544、8563696、8871909、8889832、8871910、9107907、8747850、9469691、8765128、8729249、8741290、8637027、8900582、9192666、9201074、9505843、8821869、8163280、7498420、8562985、8545839、9213031、9213032、8217148、8398974、9394367、9364556、8623359、9011865、9375425、9233155、9169329、9150655中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自因子IXa抗体的可变区或CDR，所述因子IXa抗体包括，但不限于，ab97619、ab128048、ab128038和美国专利No.7279161、7033590、4786726、6624295、7049411、7297336中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自因子X抗体的可变区或CDR，所述因子X抗体包括，但不限于，PA5-22059、ab97632、B122M。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自Her3(ErbB3)抗体的可变区或CDR，所述Her3(ErbB3)抗体包括，但不限于，duligotumab、elgemtumab、lumretuzumab、帕曲妥单抗(patritumab)、seribantumab，和美国专利No.9346883、9321839、8859737、8362215、8828388、9220775、9217039、9527913、9085622、9192663、8735551、9011851、7846440、9284380、8791244、8691225、9487588、8961966、9034328、5968511、9346889、9217039、9346890中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自IGF-1R(CD221)抗体的可变区或CDR，所述IGF-1R(CD221)抗体包括，但不限于，cixutumumab、dalotuzumab、非妥木单抗、ganitumab、robatumumab、teprotumumab，和美国专利No.7572897、7579157、7968093、7638605、7329745、7037498、7982024、8642037、7700742、9234041、7815907、8945871、8361461、9056907、8168410、7241444、7914784、9150644、7985842、7538195、8268617、8034904、8344112、7553485、8101180、8105598、7824681、8124079、8420085、7854930中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自DLL4抗体的可变区或CDR，所述DLL4抗体包括，但不限于，demcizumab、enoticumab、navicixizumab和美国专利No.9469689、9115195、8623358、9132190、9469688、9403904、8663636、8192738、750124中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自VEGF抗体的可变区或CDR，所述VEGF抗体包括，但不限于，Bevacizumab、Brolucizumab、Ranibizumab和美国专利No.8921537、7910098、7365166、7060269、7169901、6884879、7297334、7375193、9388239、8834883、8287873、7998931、8007799、7785803、9102720、8486397、6730489、6383484、9441034、7097986、9079953、8945552、8236312、7740844、6403088、9018357、8975381、7691977、7758859、8512699、8492527、9353177、8092797、7811785、8101177、8592563、9090684、8349322中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自CD22抗体的可变区或CDR，所述CD22抗体包括，但不限于，bectumomab，epratuzumab，inotuzumab，moxetumomab，pinatuzumab和美国专利No.9181343、5484892、9279019、8591889、9499632、8481683、7355012、7777019、8809502、8389688、7829086中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有源自BTLA(CD272)抗体的可变区或CDR，所述BTLA(CD272)抗体包括，但不限于，MIH26、AAP44003、MA5-16843、6A5和美国专利No.8563694、9346882、8580259、8247537中所述的那些，将每篇文献全部按引用并入。
在一些实施方案中，结合蛋白含有WO2015103072中所述的抗体，将其全部按引用并入本文中。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合人IL-17和人IL-20。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合人IL-17和人IL-20并且包含：与选自SEQ ID NO.15、25和27的序列具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.21具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；与SEQ ID NO.23具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。在另一个实施方案中，结合蛋白能够结合人IL-17和人IL-20并且包含：与选自SEQ ID NO:15、25和27的序列具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；以及与选自SEQ ID NO.29、30和31的序列具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#4序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合人CD3和人CD20。在进一步的实施方案中，结合蛋白包含：与选自SEQ ID NO.41、48和316的序列具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.325具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.46或SEQ ID NO.330具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合人IL-17和人TNF。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合人IL-17和人TNF并且包含：与SEQ ID NO.87具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQID NO.89具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.91具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合人CTLA-4和人PD-1。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合人CTLA-4和人PD-1并且包含：与SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.126、SEQID NO.145、SEQ ID NO.164或SEQ ID NO.183具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.95、SEQ IDNO.135、SEQ ID NO.154、SEQ ID NO.173或SEQ ID NO.192具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.140、SEQ ID NO.159、SEQ ID NO.178或SEQ ID NO.197具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合EGFR和PD-L1。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合EGFR和PD-L1并且包含：与SEQ ID NO.99、SEQ ID NO.202或SEQ ID NO.221具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.211或SEQ ID NO.230具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQID NO.101、SEQ ID NO.216或SEQ ID NO.235具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合cMet和EGFR。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合cMet和EGFR并且包含：与SEQ ID NO.102或SEQ ID NO.240具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.103或SEQ ID NO.249具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.104或SEQ IDNO.254具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合因子IXa和因子X。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合因子IXa和因子X并且包含：与SEQ ID NO.105或SEQ ID NO.259具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.106或SEQ ID NO.268具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.107或SEQID NO.273具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合Her3和IGF-1R。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合Her3和IGF-1R并且包含：与SEQ ID NO.108、SEQ ID NO.278具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.109或SEQ ID NO.287具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.110或SEQ IDNO.292具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合DLL-4和VEGF。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合DLL-4和VEGF并且包含：与SEQ ID NO.111或SEQ ID NO.297具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.112或SEQ ID NO.306具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.113或SEQ IDNO.311具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合CD20和CD3。在进一步的实施方案中，结合蛋白能结合CD20和CD3并且包含：与SEQ ID NO.114或SEQ ID NO.316具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.115或SEQ ID NO.325具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.116或SEQ ID NO.330具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合Her3和EGFR。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合Her3和EGFR并且包含：与SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.335或SEQ ID NO.354具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.118、SEQ ID NO.344或SEQ ID NO.363具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ IDNO.119、SEQ ID NO.349或SEQ ID NO.368具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合PD-1和PD-L1。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合PD-1和PD-L1并且包含：与SEQ ID NO.120或SEQ ID NO.373具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.121或SEQ ID NO.382具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.122或SEQ IDNO.387具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合Her3和PD-1。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合Her3和PD-1并且包含：与SEQ ID NO.123或SEQ ID NO.411具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.124或SEQ ID NO.420具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.125或SEQ IDNO.425具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合cMet和PD-L1。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合cMet和PD-L1并且包含：与SEQ ID NO.430具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ IDNO.439具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.444具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合BTLA和PD-1。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合BTLA和PD-1并且包含：与SEQ ID NO.449或SEQ ID NO.468具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ ID NO.458或SEQ ID NO.477具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.463或SEQ IDNO.482具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
在一个实施方案中，结合蛋白能够结合CD20和CD22。在进一步的实施方案中，结合蛋白能够结合CD20和CD22并且包含：与SEQ ID NO.392具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的FIT-Ig多肽链#1序列；与SEQ IDNO.401具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#2序列；以及与SEQ ID NO.406具有约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约99％或100％相同的多肽链#3序列。
本文中描述的示例性结合蛋白的生物活性变体或功能变体也是本发明的一部分。如本文中使用的，关于蛋白质的短语“生物活性变体”或“功能变体”是指，相对于参照序列有一个或多个氨基酸改变但仍然维持参照序列的实质性生物活性的氨基酸序列。变体可以具有“保守性”变化，其中置换的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如，用异亮氨酸替代亮氨酸。下表显示示例性的保守性氨基酸置换。在一些实施方案中，变体具有一个或多个氨基酸置换，其中一个或多个或全部置换是酸性氨基酸，如天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺。
或者，变体可以具有“非保守性”变化，例如，用色氨酸替换甘氨酸。类似的小变化还可以包括氨基酸缺失或***，或两者。可以使用本领域公知的计算机程序(例如，DNASTAR软件)，找到确定哪个氨基酸可以被置换、***或缺失而不消除生物或免疫活性的指导。
能够与本文中描述的示例性双特异性结合蛋白结合给定靶标组上的相同表位的结合蛋白也是本发明的一部分。表位可以是线性表位、构象表位或其混合物。在一些实施方案中，可以通过合适的表位作图技术来鉴定这样的相同表位，所述技术包括但不限于，X-射线共结晶学、基于阵列的寡肽扫描、定点诱变、高通量诱变作图、噬菌体表面展示和氢-氘交换。其他方法描述于美国专利No.5955264、65796676、6984488和8802375，将每篇文献全部按引用并入用于所有目的。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合选自以下的的一种或两种细胞因子、细胞因子相关蛋白和细胞因子受体：BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNG、IFNW1、FIL1、FIL1(EPSILON)、FIL1(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、FGER1、FGFR2、FGFR3、EGFR、ROR1、2B4、KIR、CD137、CD27、OX40、CD40L、A2aR、CD48、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CD70、CD40、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA(TNF-b)、LTB、TNF(TNF-a)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、FIGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(leptin)、PTN和THPO。
本发明的结合蛋白能够结合选自以下的一种或多种趋化因子、趋化因子受体和趋化因子相关蛋白：CCL1(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(eotaxin)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/eotaxin-2)、CCL25(TECK)、CCL26(eotaxin-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1(GRO1)、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP 10)、CXCL11(I-TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(lymphotactin)、XCL2(SCM-1b)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HIF1A、IL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合细胞表面蛋白，如，例如，整联蛋白。在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合选自激酶和蛋白酶的酶。在再另一个实施方案中，本发明的结合蛋白能结合选自淋巴因子受体、单核因子受体和多肽激素受体的受体。
在一个实施方案中，结合蛋白是多价的。在另一个实施方案中，结合蛋白是多特异性的。上述多价和或多特异性结合蛋白具有期望的特性，特别是从治疗的观点看。例如，所述多价和或多特异性结合蛋白可以(1)比二价抗体更快地被表达抗体所结合的抗原的细胞内在化(和/或分解代谢)；(2)是激动剂抗体；和/或(3)诱导表达所述多价抗体能够结合的抗原的细胞的细胞死亡和/或细胞凋亡。提供多价和或多特异性结合蛋白的至少一种抗原结合特异性的“亲本抗体”，可以是这样一种抗体，所述抗体可被表达抗体所结合的抗原的细胞内化(和/或分解代谢)；和/或可以是激动剂、细胞死亡诱导性抗体和/或细胞凋亡诱导性抗体，并且如本文所述的多价和或多特异性结合蛋白可以展现这些特性中的一种或多种特性的改善。此外，亲本抗体可以缺乏这些特性中的任一种或多种，但当构建为如本文所描述的多价结合蛋白形式时可以被赋予这些特性。
在另一个实施方案中，如通过表面等离子体共振测量的，本发明的结合蛋白针对一个或多个靶标的结合速率常数(Kon)选自：至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1；至少约105M-1s-1；及至少约106M-1s-1(包括其间的所有值)。优选，如通过表面等离子体共振测量的，本发明的结合蛋白针对一个或多个靶标的结合速率常数(Kon)介于102M-1s-1至103M-1s-1之间；103M-1s-1至104M-1s-1之间；104M-1s-1至105M-1s-1之间；或105M-1s-1至106M-1s-1之间(包括其间的所有值)。
在另一实施方案中，如通过表面等离子体共振测量的，结合蛋白针对一个或多个靶标的解离速率常数(Koff)选自：至多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1；和至多约10-6s-1(包括其间的所有值)。优选，如通过表面等离子体共振测量的，本发明的结合蛋白针对一个或多个靶标的解离速率常数(Koff)为：10-3s-1至10-4s-1；10-4s-1至10-5s-1；或10-5s-1至10-6s-1(包括其间的所有值)。
在另一个实施方案中，结合蛋白针对一个或多个靶标的解离常数(KD)选自：至多约10-7M；至多约10-8M；至多约10-9M；至多约10-10M；至多约10-11M；至多约10-12M；和至多10-13M(包括其间的所有值)。优选地，本发明的结合蛋白针对IL-12或IL-23的解离常数(KD)是：10-7M至10-8M；10-8M至10-9M；10-9M至10-10M；10-10至10-11M；10-11M至10-12M；或10-12M至10-13M(包括其间的所有值)。
在另一个实施方案中，使用大小排阻色谱(SEC)-HPLC，本发明的结合蛋白在一步蛋白A纯化中具有至少约75％，约76％，约77％，约78％，约79％，约80％，约81％，约82％，约83％，约84％，约85％，约86％，约87％，约88％，约89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.1％，约99.2％，约99.3％，约99.4％，约99.5％，约99.6％，约99.7％，约99.8％，约99.9％，或更高，或100％(包括其间的所有值)的单体％。
在另一个实施方案中，在优化条件下，本发明的结合蛋白具有至少约0.01mg/L，0.05mg/L，0.1mg/L，约0.2mg/L，约0.3mg/L，约0.4mg/L，约0.5mg/L，约0.6mg/L，约0.7mg/L，约0.8mg/L，约0.9mg/L，约1.0mg/L，约2mg/L，约3mg/L，约4mg/L，约5mg/L，约6mg/L，约7mg/L，约8mg/L，约9mg/L，约10mg/L，约11mg/L，约12mg/L，约13mg/L，约14mg/L，约15mg/L，约16mg/L，约17mg/L，约18mg/L，约19mg/L，约20mg/L，约21mg/L，约22mg/L，约23mg/L，约24mg/L，约25mg/L，约26mg/L，约27mg/L，约28mg/L，约29mg/L，约30mg/L，约40mg/L，约50mg/L，约60mg/L，约70mg/L，约80mg/L，约90mg/L，约100mg/L，约200mg/L，约300mg/L，约400mg/L，约500mg/L，约600mg/L，约700mg/L，约800mg/L，约900mg/L，约1000mg/L(包括其间的所有值)或更高的表达水平。在一些实施方案中，本发明的结合蛋白在293E细胞中表达或适用于所述目的的任何其他细胞中表达。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白具有通过差示扫描量热法(DSC)测量的Tm1转变温度，其为至少约50℃，约51℃，约52℃，约53℃，约54℃，约55℃，约56℃，约57℃，约58℃，约59℃，约60℃，约61℃，约62℃，约63℃，约64℃，约65℃，约66℃，约67℃，约68℃，约69℃，约70℃，约71℃，约72℃，约73℃，约74℃，约75℃，约76℃，约77℃，约78℃，约79℃，约80℃，约81℃，约82℃，约83℃，约84℃，约85℃，约86℃，约87℃，约88℃，约89℃，约90℃，约95℃，约99℃(包括其间的所有值)或更高。
本发明的结合蛋白在冻融试验中具有高稳定性。在一些实施方案中，将本发明的结合蛋白样品融化并在4℃、25℃和40℃下孵育1天、3天或7天后，如通过SEC-HPLC测量的，由于聚集引起的完整结合蛋白的减少低于约5％，约4％，约3％，约2％，约1％，约0.5％，约0.1％，约0.05％，约0.01％(包括其间的所有值)、或更低。
在另一个实施方案中，静脉内给药本发明的结合蛋白时，其具有一个或多个以下的PK参数：(1)约0.1，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50(包括其间的所有值)或更高的药物从血浆的表观总身体清除(CL，mL/天/kg)；(2)约1，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200(包括其间的所有值)或更高的表观稳定态分布体积(Vss，mL/kg)；(3)约1，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200(包括其间的所有值)或更高的两室模型中表观中央室或血浆室体积(V1，mL/kg)；(4)约0.01，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30(包括其间的所有值)或更高的初始或处置(disposition)半衰期(αt1/2，天)；(5)约0.01，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30(包括其间的所有值)或更高的末端消除半衰期(βt1/2，天)；(6)约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500，2000，2500，3000(包括其间的所有值)或更高的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC，天×μg/mL)；和(6)约0.01，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30(包括其间的所有值)或更高的中值滞留时间(MRT，天)。在一些实施方案中，以上参数与约1mg/kg，5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg，50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg(包括其间的所有值)或更高的剂量相关。
在另一个实施方案中，皮下给药本发明的结合蛋白时，其具有一个或多个以下的PK参数：(1)约0.05、0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30(包括其间的所有值)或更高的给药后达到最大(峰)血浆浓度的时间(Tmax，天)；(2)约0.1，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，150，200，250，300，350，400，450，500(包括其间的所有值)或更高的最大(峰)血浆药物浓度(Cmax，μg/ml)；(3)约0.01，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30(包括其间的所有值)或更高的消除半衰期(末端t1/2，天)；(4)约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500，2000，2500，3000(包括其间的所有值)或更高的从时间零至持续可测量浓度的时间的血浆浓度-时间曲线下面积(AUClast，天×μg/mL)；(5)约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500，2000，2500，3000(包括其间的所有值)或更高的从时间零至无限的血浆浓度-时间曲线下面积(AUCinf，天×μg/mL)；(6)0.1，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50(包括其间的所有值)或更高的药物至代谢物的形成清除率(CL/F，mL/天/kg)；(7)约1，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200(包括其间的所有值)或更高的生物利用率(F，％)。在一些实施方案中，以上参数与约1mg/kg，5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg，50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg(包括其间的所有值)或更高的剂量相关。
在另一个实施方案中，上述结合蛋白是还包含选自以下试剂的缀合物：免疫粘附分子、成像剂、治疗剂及细胞毒性剂。在一个实施方案中，成像剂选自：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。在另一个实施方案中，成像剂选自以下的放射性标记：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。在一个实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂选自：免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝***剂、蒽环霉素、毒素和细胞凋亡剂。在一个实施方案中，结合蛋白与所述试剂直接缀合。在另一个实施方案中，结合蛋白经由接头与所述试剂缀合。合适的接头包括但不限于，本文所公开的氨基酸和多肽接头。接头可以是可断裂的或不可断裂的。
在另一个实施方案中，上述结合蛋白是结晶的结合蛋白并且作为晶体存在。优选，晶体是无载体的药学控制释放的晶体。更优选，结晶的结合蛋白在体内的半衰期比所述结合蛋白的可溶性对应物长。最优选，结晶的结合蛋白保持生物活性。
在另一个实施方案中，上述结合蛋白是糖基化。优选，糖基化是人糖基化模式。
本发明的一个方面涉及编码以上公开的任一种结合蛋白的分离核酸。另一个实施方案提供包含以上公开的分离核酸的载体，其中所述载体选自：pcDNA；pTT(Durocher等，Nucleic Acids Research 2002，第30卷，第2期)；pTT3(具有另外的多克隆位点的pTT；pEFBOS(Mizushima,S.和Nagata,S.(1990)Nucleic acids Research第18卷，第17期)；pBV；pJV；pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO和pBJ。提供了多特异性结合蛋白及其制备方法。结合蛋白可以使用各种技术产生。本公开提供产生结合蛋白的表达载体、宿主细胞及方法。
本发明公开内容的结合蛋白的抗原结合可变结构域可以获自亲本结合蛋白，所述亲本结合蛋白包括多克隆Ab、单克隆Ab和或能够结合目标抗原的受体。这些亲本结合蛋白可以是天然存在的，或者可以通过重组技术来产生。本领域普通技术人员熟悉用于产生抗体和/或分离的受体的许多方法，包括，但不限于，使用杂交瘤技术，选择性淋巴细胞抗体法(SLAM)，使用噬菌体、酵母或RNA-蛋白质融合物展示或其它文库，对包含至少一些人免疫球蛋白基因座的非人动物进行免疫接种，以及制备嵌合抗体、CDR嫁接的抗体和人源化抗体。参见，例如，美国专利公开No.20090311253 A1。还可以使用亲和力成熟技术来制备可变结构域。结合蛋白的结合可变结构域也可以获自通过本领域中已知的提取工艺(例如，使用溶剂、去污剂和/或亲和纯化)得到的分离的受体分子，或可以通过本领域中已知的生物物理方法(例如，X射线结晶、NMR、干涉测量法和/或计算机建模)确定。
提供一个实施方案，其中包括选择具有结合蛋白分子所需的至少一种或多种特性的亲本结合蛋白。在一个实施方案中，所需的特性是用于表征抗体参数的一种或多种特性，例如抗原特异性、抗原亲和力、效力、生物功能、表位识别、稳定性、溶解性、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用率、组织交叉反应性或直系同源抗原结合。参见例如，美国专利公开No.20090311253。
多特异性抗体还可以被设计成使得一个或多个抗原结合结构域没有功能。可变结构域可以使用重组DNA技术，由通过本文所述任一种方法产生的亲本结合蛋白获得。在一个实施方案中，可变结构域是鼠重链或轻链可变结构域。在另一个实施方案中，可变结构域是CDR嫁接的或人源化的可变重链或轻链结构域。在一个实施方案中，可变结构域是人重链或轻链可变结构域。
在一个实施方案中，使用重组DNA技术将一个或多个恒定结构域连接至可变结构域。在一个实施方案中，将包含一个或多个重链可变结构域的序列连接至重链恒定结构域，并且将包含一个或多个轻链可变结构域的序列连接至轻链恒定结构域。在一个实施方案中，恒定结构域分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域。在一个实施方案中，将重链进一步连接至Fc区。Fc区可以是原始序列Fc区或变体Fc区。在另一个实施方案中，Fc区是人Fc区。在另一个实施方案中，Fc区包括来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区。
另外地，本文提供的结合蛋白可以用于组织特异性递送(靶向组织标记物和疾病介质以增强局部PK，由此达成较高功效和/或较低毒性)，包括胞内递送(靶向内化受体和细胞内分子)，递送到大脑内部(靶向转铁蛋白受体和CNS疾病介质以穿过血脑屏障)。结合蛋白也可充当载体蛋白，经由结合至抗原的非中和性表位而将所述抗原递送到特定位置并增加所述抗原的半衰期。此外，结合蛋白可以被设计成以物理方式连接植入患者体内的医疗装置或靶向这些医疗装置(参见Burke等(2006)Advanced Drug Deliv.Rev.58(3):437-446；Hildebrand等(2006)Surface and Coatings Technol.200(22-23):6318-6324；Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis，Wu(2006)Biomaterials 27(11):2450-2467；Mediation of the cytokine network in theimplantation of orthopedic devices，Marques(2005)Biodegradable Systems inTissue Engineer.Regen.Med.377-397)。将适当类型的细胞引至医疗植入物的位置可以促进治愈和恢复正常组织功能。或者，也可以通过与装置偶联或靶向装置的受体抗体融合蛋白来抑制在装置植入后释放的介质(包括但不限于，细胞因子)。
在一个方面中，用以上公开的载体转化宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(Escherecia coli)。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞及真菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于，293、COS、NS0和CHO；和/或真菌细胞，如酿酒酵母，或昆虫细胞，如Sf9。
本发明的另一个方面提供制备以上公开的结合蛋白的方法，所述方法包括在足以产生结合蛋白的条件下，在培养基中培养以上公开的任一宿主细胞。优地，由此方法产生的结合蛋白中有50％-75％是双特异性四价结合蛋白。更优选，由此方法产生的结合蛋白中有75％-90％是双特异性四价结合蛋白。最优选，所产生的结合蛋白中有90％-95％是双特异性四价结合蛋白。
另一个实施方案提供了根据以上公开的方法制备的结合蛋白。
一个实施方案提供用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物包含制剂,所述制剂包含以上公开的结晶的结合蛋白和一种成分；以及至少一种聚合物载体。优选，聚合物载体是选自以下的一种或多种聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(缩肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚(b-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二氧环己酮)、聚(乙二醇)、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、顺丁烯二酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、普洛尼克多元醇(pluronic polyol)、白蛋白、海藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、葡糖胺聚糖、硫酸化多糖、其混合物和共聚物。优选，所述成分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一个实施方案提供一种用于治疗哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用有效量的以上公开的组合物的步骤。
本发明还提供一种药物组合物，其包含如以上公开的结合蛋白和药学可接受载体。药学上可接受的载体包括但不限于，磷酸盐缓冲液或盐水。其它常用的胃肠外载体包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内载体包括流体和营养补充液、电解质补充液，如基于林格氏右旋糖的那些等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。更具体地，适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的情况)或分散液和用于即配无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。在一些情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖类、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。通过在组合物中包括例如单硬脂酸铝和明胶等延迟吸收的试剂，可以使注射组合物的吸收延长。
在另一个实施方案中，药物组合物包含至少一种用于治疗病症的其他治疗剂。在一个实施方案中，所述另外的药剂选自：治疗剂、成像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂(包括但不限于，抗VEGF抗体或VEGF-阱)；激酶抑制剂(包括但不限于，KDR和TIE-2抑制剂)；共刺激分子阻断剂(包括但不限于，抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗PD-1、抗CD20)；粘附分子阻断剂(包括但不限于，抗LFA-1抗体、抗E/L选择素抗体、小分子抑制剂)；抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于，抗IL-18、抗TNF及抗IL-6/细胞因子受体抗体)；甲氨蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506、可检测标记或报告分子；TNF拮抗剂；抗风湿药；肌肉松弛剂；***(narcotic)；非类固醇抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂(anesthetic)、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗牛皮癣药、皮质类固醇、合成代谢类固醇(anabolicsteroid)、红细胞生成素(erythropoietin)、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药剂、抗抑郁剂、抗精神病药、***、哮喘药物、β激动剂、吸入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子和细胞因子拮抗剂。
在另一方面，本发明提供一种用于治疗罹患病症的人受试者的方法，其中在所述病症中能够被以上公开的结合蛋白结合的一个或多个靶标是有害的，所述方法包括向所述人受试者施用以上公开的结合蛋白以使得所述人受试者体内的所述一个或多个靶标的活性得到抑制并且实现所述病症的预防或治疗。在一个实施方案中，所述疾病或病症是炎性病状、自体免疫性疾病或癌症。在一个实施方案中，所述疾病或病症选自：关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆氏关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、全身性红斑狼疮、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、过敏性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反应、与器官移植相关的急性或慢性免疫疾病、结节病、动脉粥样硬化、弥漫性血管内凝血、川崎氏病、格雷夫斯氏病、肾病综合症、慢性疲劳综合症、韦格纳氏肉芽肿、亨-舍二氏紫癜、肾脏显微镜下脉管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒休克综合征、脓毒症综合症、恶病质、感染性疾病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合症、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性硬化、溶血性贫血、恶性疾病、心脏衰竭、心肌梗塞、埃迪逊氏病、散发性I型多腺体缺陷和II型多腺体缺陷、施密特氏综合症、成人(急性)呼吸窘迫综合症、秃头症、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、瑞特氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠源性滑膜炎、衣原体病、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊柱关节病、粉瘤病/动脉硬化、异位性过敏、自体免疫性大疱病、寻常性天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自体免疫性溶血性贫血、Coombs试验阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年恶性贫血、肌痛性脑炎/Royal Free疾病、慢性皮肤黏膜念珠菌病、巨细胞动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐源性自体免疫性肝炎、获得性免疫缺陷疾病综合症、获得性免疫缺陷相关疾病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见变异性免疫缺陷(常见变异性低丙种球蛋白血症)、扩张性心肌病、女性***、卵巢衰竭、卵巢早衰、纤维性肺病、隐原性纤维性肺泡炎、发炎后间质性肺病、间质性肺炎、***疾病相关性间质性肺病、混合型***疾病相关性肺病、***性硬化相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、修格连氏疾病相关性肺病、强直性脊椎炎相关性肺病、脉管炎性弥漫性肺病、含铁血黄素沉积病相关性肺病、药物诱发的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸细胞性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、感染后间质性肺病、痛风性关节炎、自体免疫性肝炎、1型自体免疫性肝炎(典型性自体免疫性或狼疮样肝炎)、2型自体免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自体免疫介导的低血糖、B型胰岛素抵抗伴发黑色棘皮病、甲状旁腺功能减退、器官移植相关性急性免疫疾病、器官移植相关性慢性免疫疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白血球减少病、自体免疫性中性粒细胞减少症、肾病NOS、肾小球肾炎、肾脏显微镜下脉管炎、莱姆氏病、盘状红斑狼疮、特发性或NOS型男性不育、***自体免疫、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、***疾病继发的肺高压、古帕斯捷氏综合症、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、斯蒂尔氏病、***性硬化、修格连氏综合症、高安氏病/动脉炎、自体免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自体免疫性甲状腺疾病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿自体免疫性甲状腺功能减退(桥本氏病)、萎缩性自体免疫性甲状腺功能减退、原发性黏液水肿、晶状体源性葡萄膜炎、原发性脉管炎、白癜风、急性肝病、急性肝病、酒精性肝硬化、酒精诱发的肝损伤、胆汁郁积、特异体质性肝病、药物诱发的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、过敏和哮喘、B型链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神***症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性疼痛(不同形式的疼痛)，以及癌症，如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、***癌和直肠癌，以及血液恶性疾病(白血病和淋巴瘤)、Aβ脂蛋白血症、四肢发绀、急性和慢性寄生虫或感染过程、急性白血病、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾衰竭、腺癌、心房异位搏动、AIDS痴呆复合征、酒精诱发的肝炎、过敏性结膜炎、过敏性接触性皮炎、过敏性鼻炎、同种异体移植物排斥反应、α-l抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗cd3疗法、抗磷脂综合症、抗受体过敏性反应、主动脉瘤和周围动脉瘤、主动脉剥离、动脉高压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植排斥反应、骨髓移植(BMT)排斥反应、房室束支传导阻滞、伯基特氏淋巴瘤、烧伤、心律不整、心肌顿抑综合症(cardiacstun syndrome)、心脏肿瘤、心肌病、心肺旁路炎症反应、软骨移植物排斥反应、小脑皮质退化、小脑功能失调、紊乱性或多灶性房性心动过速、化疗相关性病症、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理过程、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水杨酸中毒、结直肠癌、充血性心脏衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、克雅二氏病、培养阴性脓毒症、囊性纤维化、细胞因子疗法相关性病症、拳击手痴呆、脱髓鞘疾病、登革出血热、皮炎、皮肤病状、糖尿病(diabete)、糖尿病(diabetesmellitus)、糖尿病性动脉粥样硬化病、弥漫性莱维小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合症、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱发的药物诱发性运动障碍、药物敏感、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、epstein-barr病毒感染、红斑性肢痛症、锥体束外和小脑病症、家族性嗜血细胞性淋巴组织细胞增生症、胚胎胸腺移植排斥反应、弗立特里希氏共济失调、功能性周围动脉病症、真菌性脓毒症、气性坏疽、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥反应、革兰氏阴性脓毒症、革兰氏阳性脓毒症、由细胞内生物体引起的肉芽肿、毛细胞白血病、哈-斯二氏病、桥本氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥反应、血色素沉着病、血渗析、溶血***综合症/血栓性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律不整、HIV感染/HIV神经病、霍奇金氏病、多动型运动障碍、过敏反应、过敏性肺炎、高血压、低动型运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发***迪生氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱(Asthenia)、婴儿型脊髓性肌肉萎缩症、主动脉炎症、a型流感、电离辐射曝露、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌肉萎缩症、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥反应、军团杆菌病、利什曼病、麻风病、皮质脊髓***病变、脂肪水肿、肝移植排斥反应、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢/特发性偏头痛、线粒体多***病症、混合型***疾病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多***退化(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分枝杆菌病、结核分枝杆菌感染、骨髓增生异常综合症、心肌梗塞、心肌缺血病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾病、神经退行性疾病、神经源性I型肌萎缩、中性白细胞减少性发热、非霍奇金氏淋巴瘤、腹部主动脉及其分支阻塞、动脉阻塞性病症、okt3疗法、***/***、***/输精管复通术、脏器肿大、骨质疏松症、胰脏移植排斥反应、胰腺癌、副肿瘤综合症/恶性高钙血症、甲状旁腺移植排斥反应、***性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、周围动脉硬化疾病、周围血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫肺炎、肺炎、POEMS综合症(多发性神经病、脏器肿大、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变综合症)、灌注后综合症、泵后综合症、MI心切开术后综合症、先兆子痫、进行性核上性麻痹、原发性肺高压、放射疗法、雷诺氏现象和疾病、雷诺氏病、雷弗素姆氏病、规律性窄QRS波群心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制型心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、莱维小体型老年痴呆、血清反应阴性关节病、休克、镰刀细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥反应、皮肤改变综合症、小肠移植排斥反应、实体肿瘤、特异性心律失常、脊髓性共济病症、脊髓小脑退化、链球菌肌炎、小脑结构损害、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管***梅毒、全身性anaphalaxis、全身炎性反应综合症、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细管扩张、血栓闭塞性脉管炎(thromboangitis obliteran)、血小板减少症、中毒、移植、外伤/出血、III型过敏反应、IV型过敏反应、不稳定型心绞痛、***、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜病、静脉曲张、脉管炎、静脉疾病、静脉血栓、心室纤颤、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、嗜血细胞综合症(vital-associated hemaphagocytic syndrome)、维-柯二氏综合症、威尔逊氏病、任何器官或组织的异种移植排斥反应。
在另一个方面中，本发明提供一种治疗罹患病症的患者的方法，所述方法包括以下步骤：在施用如以上所述的第二药剂之前、同时或之后,施用以上公开的任一种结合蛋白。在一个优选实施方案中，第二药剂选自：布替耐德(budenoside)，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺胺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝哒唑，脂加氧酶抑制剂，美沙拉嗪，奥沙拉嗪，巴柳氮(balsalazide)，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗IL-1β单克隆抗体，抗IL-6单克隆抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF的抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，甲氨蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸吗啉乙酯，来氟米特，NSAID；布洛芬；皮质类固醇；***龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓剂，补体抑制剂，肾上腺素能药剂，IRAK、NIK、IKK、p38、MAP激酶抑制剂，IL-1β转化酶抑制剂，TNFα转化酶抑制剂，T细胞信号传导抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转化酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55TNF受体，可溶性p75TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ。
在一个实施方案中，以上公开的药物组合物是通过至少一种选自以下的方式施用给受试者：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、intracelial、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、***内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊椎内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、快速浓注、经***、经直肠、经颊、舌下、鼻内和经皮施用。
本发明的一个方面提供针对至少一种本发明结合蛋白的至少一种抗独特型抗体。抗独特型抗体包括任何这样的含蛋白质或肽分子，所述分子包含可以并入本发明结合蛋白中的免疫球蛋白分子的至少一部分，所述至少一部分为例如但不限于，重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够结合一个或多个选自以下的靶标：ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；Aggrecan；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；ANGPT1；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLR1(MDR15)；BlyS；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B；BMPR2；BPAG1(网蛋白plectin)；BRCA1；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(I-309)；CCL11(eotaxin嗜酸性粒细胞趋化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP-1d)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3b)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3a)；CCL21(MIP-2)；SLC；exodus-2；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/eotaxin-2)；CCL25(TECK)；CCL26(eotaxin-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MIP-1a)；CCL4(MIP-1b)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKR1/HM145)；CCR2(mcp-1RB/RA)；CCR3(CKR3/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD-22；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD47,CD48,CD52；CD69；CD70、CD72；CD74；CD79A；CD79B；CD8；CD80；CD81；CD83；CD86；CD137、CD138、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CDH1(E-钙粘着蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21Wap1/Cip1)；CDKN1B(p27Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(p16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；壳多糖酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(封闭素-7)；CLN3；CLU(聚集素蛋白)；cMet；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSF1(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA-4；CTNNB1(b-连环蛋白)；CTSB(组织蛋白酶B)；CX3CL1(SCYD1)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DLL-4；DNCL1；DPP4；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FGF；FGF1(aFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FIL1(EPSILON)；FIL1(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRT1(纤连蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNAS1；GNRH1；GPR2(CCR10)；GPR31；GPR44；GPR81(FKSG80)；GRCC10(C10)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HIP1；组胺和组胺受体；Her3；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOX1；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；ID2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；IFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-1；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；IL1F10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2IL1RN；IL2；IL20；IL20RA；IL21R；IL22；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；IL7；IL7R；IL8；IL8RA；IL8RB；IL8RB；IL9；IL9R；ILK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整联蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整联蛋白)；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GC Box BP)；KLF6；KLK10；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)；LAMA5；LEP(瘦素)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；MACMARCKS；MAG或Omgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MIB1；midkine；MIF；MIP-2；MKI67(Ki-67)；MMP2；MMP9；MS4A1；MSMB；MT3(metallothionectin‐III)；MTSS1；MUC1(粘蛋白)；MYC；MYD88；NCK2；神经聚糖(neurocan)；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR1I2；NR1I3；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZ1；OPRD1；PCSK9；P2RX7；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-1；PD-L1；α4β7、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDF8、CGRP、Lingo-1、因子IXa、因子X、ICOS、GARP、BTLA、CD160、ROR1、2B4、KIR、CD27、OX40、CD40L、A2aR、PDGFA；PDGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；phosphacan；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PPBP(CXCL7)；PPID；PR1；PRKCQ；PRKD1；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21Rac2)；RARB；RGS1；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(亲脂性蛋白B)；SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)；SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)；SCYE1(内皮单核细胞激活细胞因子)；SDF2；SERPINA1；SERPINA3；SERPINB5(maspin)；SERPINE1(PAI-1)；SERPINF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPP1；SPRR1B(Spr1)；ST6GAL1；STAB1；STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCP10；TDGF1；TEK；TGFA；TGFB1；TGFB1I1；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBR1；TGFBR2；TGFBR3；TH1L；THBS1(血小板反应蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TIMP3；组织因子；TLR10；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TNF；TNF-a；TNFAIP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSF11A；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(APO3L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配体)；TNFSF8(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP；Toll-样受体；TOP2A(拓扑异构酶Iia)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TRPC6；TSLP；TWEAK；VEGF；VEGFB；VEGFC；versican(多功能蛋白聚糖)；VHL C5；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化因子)；XCL2(SCM-1b)；XCR1(GPR5/CCXCR1)；YY1；和ZFPM2。
基于其结合两种或更多种抗原的能力，本发明的结合蛋白可以用于检测抗原(例如，在生物样本，如血清或血浆中)，使用常规免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或组织免疫组织化学法。可以用可检测物质直接或间接标记FIT-Ig，以利于检测结合或未结合的抗体。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质及放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质的实例包括鲁米诺；合适的放射性物质的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够在体外和体内中和抗原的活性。因此，这样的FIT-Ig可以用于，例如在含有抗原的细胞培养物中、在具有与本发明的结合蛋白交叉反应的抗原的人受试者中或其它哺乳动物受试者中，抑制抗原的活性。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于在罹患其中抗原活性是有害的疾病或病症的受试者中降低抗原活性的方法。本发明的结合蛋白可以被施用给人受试者用于治疗目的。
如本文中使用的，术语“其中抗原活性是有害的病症”意图包括这样的疾病和其它病症，在所述疾病或其它病症中在罹患病症的受试者中抗原的存在已显示出或怀疑会造成病症的病理生理学或是促成病症恶化的因素。因此，其中抗原活性是有害的病症是其中预期降低抗原活性会减轻病症的症状和/或发展的病症。此类病症可以例如通过在罹患所述病症的受试者的生物流体中抗原浓度的增加(例如受试者的血清、血浆、滑液等中的抗原浓度增加)来表明。可以用本发明的结合蛋白治疗的病症的非限制性实例包括以下及关于本发明抗体的药物组合物的章节中所述的那些病症。
本发明的FIT-Ig可以结合一种抗原或多种抗原。这些抗原包括但不限于，以下数据库中所列的靶标，将这些数据库按引用并入本文中。这些靶标数据库包括但不限于，以下列表：
●治疗性靶标(http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp)；
●细胞因子和细胞因子受体(http://www.cytokinewebfacts.com/,http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi，和
●http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html)；
●趋化因子(http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html)；
●趋化因子受体和GPCR(http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html/http://www.gpcr.org/7tm/)；
●嗅觉受体(http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp)；
●受体(http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm)；
●癌症靶标(http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi)；
●作为潜在抗体靶标的分泌蛋白质(http://spd.cbi.pku.edu.cn/)；
●蛋白激酶(http://spd.cbi.pku.edu.cn/)，和
●人CD标记物(http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf)和(Zola H,2005CD molecules 2005:human cell differentiationmolecules Blood,106:3123-6)。
FIT-Ig可用作治疗剂以同时阻断两种不同靶标来增强功效/安全性和/或增加患者覆盖范围。所述靶标可以包括可溶性靶标(例如，IL-13和TNF)和细胞表面受体靶标(例如，VEGFR和EGFR)。它也可以用于诱导在肿瘤细胞与T细胞(Her2和CD3)之间的(针对癌症疗法)，或在自体反应性细胞与效应细胞之间的(针对自体免疫/移植)，或在任何靶标细胞与效应细胞之间的细胞毒性重定向，以消除任何给定疾病中的致病细胞。
此外，当FIT-Ig被设计以靶向同一受体上的两个不同表位时，其还可以用于触发受体聚集和活化。这在制备激动性和拮抗性抗GPCR治疗剂方面可具有益处。在这一情况下，可以使用FIT-Ig靶向一个细胞上的两个不同表位，以用于聚集/信号传导(两个细胞表面分子)或用于信号传导(在一个分子上)。类似地，FIT-Ig分子可以被设计成通过靶向CTLA-4细胞外结构域的两个不同表位(或同一表位的2个拷贝)来触发CTLA-4连接(ligation)和负信号，从而引起免疫反应下调。CTLA-4是在临床上得到验证的用于治疗性治疗多种免疫病症的靶标。CTLA-4/B7相互作用通过削弱细胞周期进程、IL-2产生及活化后的T细胞增殖来负调控T细胞活化，并且CTLA-4(CD152)的结合(engagement)可以下调T细胞活化并促进诱导免疫耐受性。然而，通过激动性抗体结合CTLA-4来削弱T细胞活化的策略，由于CTLA-4活化需要连接而是不成功的。如通过晶体结构分析所证实，CTLA-4/B7的分子相互作用呈“歪斜拉链(skewed zipper)”阵列(Stamper 2001Nature410:608)。然而，目前可用的CTLA-4结合试剂都不具有连接特性，包括抗CTLA-4单克隆抗体。已作出若干尝试来解决此问题。在一种情况中，产生了与细胞成员结合的单链抗体，并且显著抑制了小鼠中的同种异体排斥反应(Hwang 2002JI 169:633)。在另一情况中，产生了针对CTLA-4的人工APC表面连接的单链抗体，并证实可削弱T细胞反应(Griffin 2000 JI 164:4433)。在两种情况中，通过人工***中与紧密定位的成员结合的抗体，达成了CTLA-4连接。尽管这些实验验证了通过触发CTLA-4负信号传导来下调免疫的概念，但这些报导中所用的试剂不适于治疗用途。为此，可以通过使用靶向CTLA-4细胞外结构域的两个不同表位(或同一表位的2个拷贝)的FIT-Ig分子来达成CTLA-4连接。基本原理是：横跨IgG的两个结合位点的距离约该距离对于CTLA-4的活性连接(2个CTLA-4同二聚体之间的距离是)而言过大。但FIT-Ig(一个臂)上的两个结合位点之间的距离要短得多，也在范围内，从而允许CTLA-4的适当连接。
类似地，FIT-Ig可以靶向细胞表面受体复合物的两个不同成员(例如IL-12Rα和β)。此外，FIT-Ig可以靶向CR1和可溶性蛋白/病原体以驱动靶标可溶性蛋白/病原体的快速清除。
另外，本发明的FIT-Ig可以用于组织特异性递送(靶向组织标记物和疾病介质以增强局部PK，因此达成较高功效和/或较低毒性)，包括细胞内递送(靶向内化受体和细胞内分子)、递送到大脑内部(靶向转铁蛋白受体和CNS疾病介质以穿过血脑屏障)。FIT-Ig还可以充当载体蛋白，经由结合至抗原的非中和性表位而将所述抗原递送到特定位置以及还增加所述抗原的半衰期。此外，FIT-Ig可以被设计成以物理方式连接至植入患者体内的医疗装置或靶向这些医疗装置(Burke，Sandra E.；Kuntz,Richard E.；Schwartz，Lewis B，Zotarolimus(ABT-578)eluting stents.Advanced Drug Delivery Reviews(2006)，58(3)，437-446.；Surface coatings for biological activation and functionalizationof medical devices.Hildebrand,H.F.；Blanchemain,N.；Mayer,G.；Chai,F.；Lefebvre,M.；Boschin,F.Surface and Coatings Technology(2006)，200(22-23)，6318-6324.；Drug/device combinations for local drug therapies and infectionprophylaxis.Wu，Peng；Grainger，David W.Biomaterials(2006)，27(11)，2450-2467.；Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedicdevices.Marques，A.P.；Hunt，J.A.；Reis，Rui L.Biodegradable Systems in TissueEngineering and Regenerative Medicine(2005)，377-397；第52页。Mediation of thecytokine network in the implantation of orthopedic devices.Marques，A.P.；Hunt,J.A.；Reis，Rui L.Biodegradable Systems in Tissue Engineering and RegenerativeMedicine(2005)，377-397。)。简而言之，将适当类型的细胞引导到医学植入物的位置可以促进治愈和恢复正常组织功能。或者，也可以通过与装置偶联或靶向装置的FIT-Ig来抑制在装置植入后释放的介质(包括但不限于，细胞因子)。例如，多年来，支架已被用于介入心脏病学中以清理阻塞的动脉以及改善血液向心肌的流动。然而，已知传统的裸金属支架在一些患者中会导致再狭窄(使治疗区域中的动脉再变窄)并且会产生血块。近来，已描述用抗CD34抗体涂布的支架，所述支架通过捕集在整个血液中循环的内皮祖细胞(EPC)来减少再狭窄并防止出现血块。内皮细胞是内衬于血管的细胞，从而允许血液平稳流动。EPC粘附于支架的硬表面，形成光滑的层，其不仅促进治愈，而且还防止先前与使用支架相关的并发症，即再狭窄和血块(Aoji等，2005J Am Coll Cardiol.45(10):1574-9)。除改善需要支架的患者的结果之外，对于需要心血管旁路手术的患者也具有意义。例如，用抗EPC抗体涂布的人造血管(人造动脉)将消除使用来自患者腿或臂的动脉来进行旁路手术移植的需求。这将减少手术和麻醉时间，而这又将减少冠状动脉手术的死亡。可以设计FIT-Ig，使得其结合至细胞表面标记物(如CD34)以及已经涂布于植入装置上的蛋白质(或任何种类的表位，包括但不限于脂质和多糖)以促进细胞募集。此类方法也可以一般性地应用于其它医学植入物。或者，可以将FIT-Ig涂布于医疗装置上，并且在植入装置及从所述装置释放所有FIT(或可能需要添加新鲜FIT-Ig的任何其它需要情况，包括已装载的FIT-Ig的老化和变性)后，所述装置可以通过将新鲜的FIT-Ig全身性施用到患者来进行重新装载，其中FIT-Ig被设计成通过一组结合位点结合至所关注的靶标(细胞因子、细胞表面标记物(如CD34)等)并且通过另一组结合位点结合至装置上涂布的靶标(包括蛋白质、任何种类的表位，包括但不限于脂质、多糖及聚合物)。这一技术具有扩大经过涂布的植入物的有用性的优势。
本发明的FIT-Ig分子还可用作治疗各种疾病的治疗分子。这些FIT-Ig分子可以结合特定疾病中所涉及的一个或多个靶标。各种疾病中此类靶标的实例描述于以下。
一般的自体免疫和炎性反应涉及许多蛋白质，包括C5、CCL1(I-309)、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL13(mcp-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19、CCL2(mcp-1)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(mcp-3)、CCL8(mcp-2)、CXCL1、CXCL10(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13(mcp-4)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CR1、IL8RA、XCR1(CCXCR1)、IFNA2、IL10、IL13、IL17C、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL22、IL5、IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、SCYE1(内皮单核细胞激活细胞因子)、SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、IL10RB、IL13、IL13RA1、IL5RA、IL9、IL9R、ABCF1、BCL6、C3、C4A、CEBPB、CRP、ICEBERG、IL1R1、IL1RN、IL8RB、LTB4R、TOLLIP、FADD、IRAK1、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、CNR1、CTLA-4、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1、AMH、AMHR2、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、C19orf10(IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、IL1A、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF11A、TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、VEGF、ZFPM2和RNF110(ZNF144)。本发明也涵盖能够结合以上所列的一个或多个靶标的FIT-Ig。
过敏性哮喘的特征在于存在嗜酸性粒细胞增多症、杯状细胞化生、上皮细胞变化、气道过度反应(AHR)，以及Th2和Th1细胞因子表达，以及血清IgE水平升高。现广泛认可气道炎症是引起哮喘发病的潜在关键因素，涉及如T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞及巨噬细胞等炎性细胞及其分泌介质(包括细胞因子和趋化因子)的复杂相互作用。皮质类固醇是当今针对哮喘的最重要的抗炎治疗剂，不过其作用机制是非特异性的并且存在安全问题，尤其是在青少年患者群体中。因此，有必要开发更具特异性和靶向性的疗法。越来越多的证据表明，IL-13在小鼠中可以模拟哮喘的许多特征，包括AHR、粘液分泌亢进及气道纤维化，而独立于嗜酸细胞炎症(Finotto等，International Immunology(2005)，17(8)，993-1007；Padilla等，Journal of Immunology(2005)，174(12)，8097-8105)。
IL-13在引起与哮喘相关的病理反应中起到关键作用。开发抗IL-13单克隆抗体疗法以降低IL-13在肺中的作用是一种激动人心的新方法，作为针对哮喘的新型治疗，这一方法提供了广阔前景。然而，除IL-13外，哮喘的发病机理中还涉及不同免疫路径的其它介质，而阻断这些介质可以提供另外的治疗益处。这样的靶标对包括但不限于，IL-13和促炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。TNF-α可以增大哮喘的炎性反应并且可能与疾病的严重程度有关(McDonnell等,Progress in Respiratory Research(2001)，31(New Drugsfor Asthma,Allergy and COPD)，247-250.)。这提示，同时阻断IL-13和TNF-α可以具有有益作用，特别是在严重气道疾病中。在一个优选的实施方案中，本发明的FIT-Ig结合靶标IL-13和TNFα并且用于治疗哮喘。
可以同时评估炎症与AHR的动物模型(如OVA诱发的哮喘小鼠模型)在本领域中是已知的并且可以用于测定各种FIT-Ig分子治疗哮喘的能力。Coffman等，Journal ofExperimental Medicine(2005)，201(12)，1875-1879；Lloyd等，Advances in Immunology(2001)，77，263-295；Boyce等，Journal of Experimental Medicine(2005)，201(12)，1869-1873；及Snibson等，Journal of the British Society for Allergy and ClinicalImmunology(2005)，35(2)，146-52中公开了用于研究哮喘的动物模型。除对这些靶标对的常规安全性评估外，还可以进行免疫抑制程度的特定测定并且这些测定有助于选择最佳靶标对(参见Luster等，Toxicology(1994)，92(1-3)，229-43；Descotes等，Developments inbiological standardization(1992)，7799-102；Hart等，Journal of Allergy andClinical Immunology(2001)，108(2)，250-257)。
基于以上公开的基本原理并使用相同的针对功效和安全性的评价模型，可以确定FIT-Ig分子能够结合并且可用于治疗哮喘的其它靶标对。优选，此类靶标包括但不限于，IL-13和IL-1β，因为IL-1β也牵涉到哮喘的炎性反应中；IL-13以及参与炎症的细胞因子和趋化因子，如IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；以及IL-13和ADAM8。本发明还涵盖能够结合哮喘中所涉及的一个或多个靶标的FIT-Ig，所述靶标选自：CSF1(MCSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、组胺和组胺受体、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、KITLG、PDGFB、IL2RA、IL4R、IL5RA、IL8RA、IL8RB、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、TSLP、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL22、CCL24,CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、XCL1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR和壳多糖酶。
类风湿性关节炎(RA)是一种全身性疾病，其特征在于关节滑膜中的慢性炎性反应，与软骨退化和关节旁骨骼侵蚀相关。许多促炎性细胞因子，包括TNF、趋化因子及生长因子，都在患病关节中有表达。经显示，将抗TNF抗体或sTNFR融合蛋白全身性施用到RA小鼠模型，具有抗炎作用并且具有关节保护作用。有关通过静脉内施用英夫利昔单抗(infliximab；一种嵌合抗TNF单克隆抗体(mAB))阻断RA患者体内的TNF活性的临床研究(Harriman G，Harper LK，Schaible TF.1999Summary of clinical trials inrheumatoid arthritis using infliximab，an anti-TNFalpha treatment.Ann RheumDis 58增刊1:I61-4.)已证实，TNF调控IL-6、IL-8、MCP-1及VEGF的产生、免疫细胞和炎性细胞向关节的募集、血管生成、以及基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3血液含量的降低。对于类风湿性关节炎中炎性路径的更好了解，已经导致鉴别出类风湿性关节炎中所涉及的其它治疗性靶标。在过去的时间里，已经通过随机化控制试验测试了多种颇具前景的治疗，如白细胞介素-6拮抗剂(MRA)、CTLA4Ig(abatacept，Genovese Mc等，2005 Abatacept forrheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition.NEngl J Med.353:1114-23)和抗B细胞疗法(利妥昔单抗，Okamoto H，KamataniN.2004Rituximab for rheumatoid arthritis.N Engl J Med.351:1909)。已鉴别出其它细胞因子并且经显示，这些细胞因子在动物模型中具有益处，包括白细胞介素-15、白细胞介素-17及白细胞介素-18，而且目前正在进行这些药剂的临床试验。组合了抗TNF和另一介质的双重特异性抗体疗法在增强临床功效和/或患者覆盖范围方面具有巨大潜力。举例来说，阻断TNF与VEGF两者可以潜在根除炎症和血管生成，这两者都参与RA的病理生理学。也涵盖用特异性FIT-Ig Ig阻断RA中所涉及的其它靶标对，包括但不限于，TNF与IL-18；TNF与IL-12；TNF与IL-23；TNF与IL-1β；TNF与MIF；TNF与IL-17；以及TNF与IL-15。除针对这些靶标对的常规安全性评估外，还可以针对免疫抑制程度进行特定测定并且这些测定有助于选择最佳靶标对(参见Luster等，Toxicology(1994)，92(1-3)，229-43；Descotes等，Developments in biological standardization(1991)，77 99-102；Hart等，Journal ofAllergy and Clinical Immunology(2001)，108(2)，250-257)。关于FIT-Ig Ig分子是否适用于治疗类风湿性关节炎，可以使用临床前动物RA模型，如胶原蛋白诱发的关节炎小鼠模型进行评估。其它有用的模型也是本领域中众所周知的(参见Brand DD.，Comp Med.(2005)55(2):114-22)。
全身性红斑狼疮(SLE)的一个免疫致病性标志是多克隆B细胞活化，其导致高球蛋白血症、自体抗体的产生及免疫复合物形成。主要的异常看来是由于泛化的T细胞失调导致了T细胞不能抑制这些被禁止的B细胞克隆。此外，引发第二信号的若干细胞因子(如IL-10)以及共刺激分子(如CD40和CD40L、B7与CD28和CTLA-4)也促进B细胞与T细胞的相互作用。这些相互作用，连同削弱的对免疫复合物和细胞凋亡物质的吞噬细胞清除作用一起，使免疫反应得以保持和由此引起组织损伤。以下靶标可能参与SLE并且可潜在地用于FIT-Ig方法用于治疗干预：B细胞靶向疗法：CD-20、CD-22、CD-19、CD28、CD4、CD80、HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFSF5、TNFSF6、BLR1、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、SLA2、CD81、IFNB1、IL10、TNFRSF5、TNFRSF7、TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、INHBA、KLF6、TNFRSF7、CD28、CD38、CD69、CD80、CD83、CD86、DPP4、FCER2、IL2RA、TNFRSF8、TNFSF7、CD24、CD37、CD40、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、MS4A1、ST6GAL1、CD1C、CHST10、HLA-A、HLA-DRA和NT5E；共刺激信号：CTLA-4或B7.1/B7.2；B细胞存活的抑制：BlyS、BAFF；补体失活：C5；细胞因子调节：关键原理是，任何组织中的净生物反应都是促炎性细胞因子与抗炎细胞因子的局部水平之间平衡的结果(参见Sfikakis PP等，2005Curr Opin Rheumatol 17:550-7)。SLE被认为是血清IL-4、IL-6、IL-10被证明升高的一种由Th-2驱动的疾病。本发明也涵盖能够结合选自以下的一个或多个靶标的FIT-Ig Ig：IL-4、IL-6、IL-10、IFN-a及TNF-a。以上论述的靶标的组合将增强针对SLE的治疗功效，这可以在许多狼疮临床前模型中进行试验(参见Peng SL(2004)Methods Mol Med.；102:227-72)。
多发性硬化(MS)是一种病因基本上未知的复杂人自体免疫性疾病。整个神经***中的髓磷脂碱性蛋白(MBP)的免疫破坏是多发性硬化的主要病理。MS是具有复杂病理的一种疾病，其涉及CD4+和CD8+T细胞的浸润及中枢神经***内的反应。CNS中细胞因子、活性氮物质及共刺激分子的表达都在MS中被描述过。主要的考虑因素是促成自体免疫性发生的免疫机制。特别地，抗原表达、细胞因子与白细胞相互作用、以及帮助平衡/调节其它T细胞(如Th1和Th2细胞)的调控性T细胞，是治疗性靶标鉴别的重要方面。
IL-12是由APC产生并促进Th1效应细胞分化的一种促炎性细胞因子。IL-12在MS患者的正在发展的病变中以及在受EAE影响的动物中产生。先前已显示，干扰IL-12路径在啮齿动物中有效地防止EAE，并且使用抗IL-12mAb在体内中和IL-12p40在髓磷脂诱发的EAE普通狨模型中具有有益作用。
TWEAK是在中枢神经***(CNS)中组成性表达的TNF家族的一员，取决于细胞类型而具有促炎性作用、增殖作用或细胞凋亡作用。其受体Fn14在CNS中是由内皮细胞、反应性星形胶质细胞和神经元表达。在实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)期间，脊髓中TWEAK和Fn14mRNA的表达增加。在C57BL/6小鼠中，在髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱发的EAE中，当在引发期(priming phase)之后使用抗TWEAK抗体治疗小鼠时，该治疗引起疾病严重程度的降低及白细胞浸润的减少。
本发明一方面涉及能够结合一个或多个，优选两个选自以下的靶标的FIT-Ig Ig分子：IL-12、TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、IL-18、VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200、IFNγ、GM-CSF、FGF、C5、CD52及CCR2。优选的实施方案包括双重特异性抗IL-12/TWEAK FIT-Ig Ig作为对MS治疗有益的治疗剂。本领域中已知若干动物模型可以用于评估FIT-Ig分子治疗MS的适用性(参见Steinman L等，(2005)Trends Immunol.26(11):565-71；L ublinFD.等，(1985)Springer Semin Immunopathol.8(3):197-208；Ge nain CP等，(1997)J MolMed.75(3):187-97；Tuohy VK等，(1999)J Exp Med.189(7):1033-42；Owens T等，(1995)Neurol Clin.13(1):51-73；和't Hart BA等，(2005)J Immunol 175(7):4761-8)。除针对这些靶标对的常规安全性评估外，可以进行免疫抑制程度的特定测定并且这些测定有助于选择最佳靶标对(参见Luster等，Toxicology(1994)，92(1-3)，229-43；Descotes等，Developments in biological st andardization(1992)，77 99-102；JonesR.2000Rovelizumab(ICOS Corp).IDrugs.3(4):442-6)。
脓毒症的病理生理学是由革兰氏阴性生物体(脂多糖[LPS]、脂质A、内毒素)与革兰氏阳性生物体(脂磷壁酸、肽聚糖)的外膜组分引起。这些外膜组分能够结合至单核细胞表面上的CD14受体。借助于近来描述的toll样受体，随后将信号传输给细胞，从而导致最终产生促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1(IL-1)。巨大的炎性反应和免疫反应是脓毒性休克的主要特征并且在由脓毒症诱发的组织损伤、多器官衰竭及死亡的发病机制中起主要作用。经显示，细胞因子，尤其是肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素(IL-1)是脓毒性休克的关键介质。这些细胞因子对于组织具有直接毒性作用；它们还活化磷脂酶A2。这些和其它作用引起血小板活化因子的浓度增加，促进一氧化氮合酶活性，促进嗜中性粒细胞的组织浸润以及促进嗜中性粒细胞活性。
脓毒症和脓毒性休克的治疗仍是临床难题，而且最近使用针对炎性反应的生物反应调节剂(即，抗TNF、抗MIF)进行的前瞻性试验仅显示适度的临床益处。近来，关注点已转向旨在逆转伴随的免疫抑制期的疗法。在实验动物和垂危患者中进行的研究证实，淋巴器官和一些实质组织中细胞凋亡的增加促成此免疫抑制、无细胞免疫反应性、及器官***功能障碍。在脓毒症综合症期间，IL-2的缺乏、或糖皮质激素、颗粒酶(granzyme)或所谓的‘死亡’细胞因子：肿瘤坏死因子α或Fas配体的释放，可以触发淋巴细胞凋亡。细胞凋亡经由胞浆和/或线粒体胱天蛋白酶(caspase)的自活化而继续，这可受到Bcl-2家族的促细胞凋亡成员和抗细胞凋亡成员影响。在实验动物中，用细胞凋亡抑制剂治疗不仅可以预防淋巴细胞的细胞凋亡；而且它还可以改善结果。尽管用抗细胞凋亡剂进行临床试验在很大程度上由于与其施用和组织靶向有关的技术难题而仍有距离，但抑制淋巴细胞凋亡对于脓毒症患者而言是有吸引力的治疗靶标。同样地，靶向炎性介质与细胞凋亡介质两者的双重特异性药剂可以具有附加益处。本发明一方面涉及能够结合脓毒症所涉及的一个或多个靶标，优选两个靶标的FIT-Ig Ig，所述靶标选自：TNF、IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、IL-12、IL-23、FasL、LPS、Toll样受体、TLR-4、组织因子、MIP-2、ADORA2A、CASP1、CASP4、IL10、IL1B、NFKB1、PROC、TNFRSF1A、CSF3、IL10、IL1B、IL6、ADORA2A、CCR3、IL10、IL1B、IL1RN、MIF、NFKB1、PTAFR、TLR2、TLR4、GPR44、HMOX1、midkine、IRAK1、NFKB2、SERPINA1、SERPINE1及TREM1。此类FIT-Ig Ig对于脓毒症的功效可以在本领域中已知的临床前动物模型中进行评估(参见Buras JA等(2005)Nat Rev Drug Discov.4(10):854-65；及Calandra T等，(2000)NatMed.6(2):164-70)。
慢性神经退行性疾病通常是以神经元功能进行性丧失(神经元细胞死亡、脱髓鞘)、活动力丧失及记忆丧失为特征的年龄相关性疾病。有关慢性神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)潜在机制的新兴认识显示出复杂的病因，而且多种因素被认为促成其发生和发展，例如年龄、血糖状态、淀粉样蛋白的产生和多聚化、结合受体RAGE(AGE的受体)的糖化终末产物(AGE)的积累、脑部氧化应激的增加、大脑血流的减少、神经炎症(包括炎性细胞因子和趋化因子的释放)、神经元功能障碍及小胶质细胞活化。因此，这些慢性神经退行性疾病是多种细胞类型与介质之间的复杂相互作用。对于此类疾病的治疗策略有限，而且主要在于用非特异性抗炎剂(例如，皮质类固醇、COX抑制剂)或药剂阻断炎性过程以防止神经元损失和/或突触功能。这些治疗无法停止疾病发展。近期的研究表明，更为靶向的疗法，如针对可溶性A-β肽(包括A-b寡聚物形式)的抗体，不仅能帮助停止疾病发展，而且还可以帮助维持记忆。这些初步观察结果表明，靶向超过一种疾病介质(例如A-β和促炎性细胞因子如TNF)的特定疗法，对于慢性神经退行性疾病，可以提供更好的治疗功效，甚至优于用靶向单一疾病机制(例如单独可溶性A-β)所观察到的功效(参见C.E.Shepherd等，NeurobiolAging.2005年10月24日；Nelson RB.，Curr Pharm Des.2005；11:3335；William L.Klein.；Neurochem Int.2002；41:345；Michelle C Janelsins等，J Neuroinflammation.2005；2:23；Soloman B.，Curr Alzheimer Res.2004；1:149；Igor Klyubin等，Nat Med.2005；11:556-61；Arancio O等，EMBO Journal(2004)1-10；Bornemann KD等，Am J Pathol.2001；158:63；Deane R等，Nat Med.2003；9:907-13；及Eliezer Masliah等，Neuron.2005；46:857)。
本发明的FIT-Ig分子可以结合慢性神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏病)中所涉及的一个或多个靶标。此类靶标包括但不限于，AD发病机理中所牵涉到的任何可溶性或细胞表面的介质，例如AGE(S100A，amphoterin)、促炎性细胞因子(例如IL-1)、趋化因子(例如MCP 1)、抑制神经再生的分子(例如Nogo、RGM A)、增进神经突生长的分子(神经营养蛋白)。FIT-Ig分子的功效可以在临床前动物模型，如过表达淀粉样前体蛋白或RAGE并且显现阿尔茨海默氏病样症状的转基因小鼠中进行验证。此外，FIT-Ig分子可以被构建并在动物模型中测定功效，可以选择最佳的治疗性FIT-Ig以供在人患者中进行测试。FIT-Ig分子还可以用于治疗其它神经退行性疾病，如帕金森氏病。α-突触核蛋白参与帕金森氏病的病理。能够靶向α-突触核蛋白和炎性介质(如TNF、IL-1、MCP-1)的FIT-Ig可以证明是帕金森氏病的有效疗法并且涵盖于本发明中。
尽管对病理机制的认识增加，但脊髓损伤(SCI)仍是一种破坏性病状并且是一种具有较高医学需求的医学适应症。大多数的脊髓损伤是挫伤或压迫损伤，并且原发损伤之后通常是继发损伤机制(炎性介质，例如细胞因子和趋化因子)，这些继发损伤机制使初始损伤恶化并导致病变区域显著扩大，有时超过10倍。SCI的这些原发和继发机制与由例如中风等其它方式引起的脑损伤中的机制极其类似。不存在令人满意的治疗，高剂量快速浓注甲基泼尼龙(MP)是在损伤后8小时的窄时窗内唯一使用的疗法。然而，这一治疗只旨在防止继发损伤，不引起任何显著的功能恢复。该疗法由于缺乏明确功效和具有严重不良作用(如免疫抑制伴继发感染、和严重组织病理学肌肉变化)而受到严厉批评。尚无刺激内源再生潜力的其它药物、生物药或小分子获得批准，但近年来，颇具前景的治疗原理和药物候选物在SCI动物模型中显示出功效。在很大程度上，人SCI功能恢复的缺乏是由病变部位上、瘢痕组织中、髓磷脂中以及损伤相关细胞上抑制神经突生长的因子引起。这些因子是髓磷脂相关蛋白NogoA、OMgp和MAG、RGM A、瘢痕相关CSPG(硫酸软骨素蛋白聚糖)，以及反应性星形细胞上的抑制因子(一些semaphorin和ephrin)。然而，在病变部位处，不仅发现了生长抑制分子，而且还发现了神经突生长刺激因子，如神经营养因子、层粘连蛋白、L1等。神经突生长抑制和生长促进分子的该组合可以用于解释为何阻断单一因子(如NogoA或RGM A)在啮齿动物SCI模型中可以引起显著功能恢复，因为抑制性影响的减小可以使平衡从生长抑制向生长促进迁移。然而，通过阻断单一神经突生长抑制分子所观察到的恢复是不全面的。为了达成更快并且更明显的恢复，阻断两种神经突生长抑制分子(例如Nogo和RGM A)，或阻断神经突生长抑制分子并增强神经突生长增强分子的功能(例如Nogo和神经营养因子)，或阻断神经突生长抑制分子(例如Nogo)和促炎性分子(例如TNF)，可能是合乎需要的(参见McGee AW等，Trends Neurosci.2003；26:193；Marco Domeniconi等，J Neurol Sci.2005；233:43；Milan Makwana1等，FEBS J.2005；272:2628；Barry J.Dickson，Science.2002；298:1959；Felicia Yu Hsuan Teng等，J Neurosci Res.2005；79:273；Tara Karnezis等，NatureNeuroscience 2004；7,736；Gang Xu等，J.Neurochem.2004；91；1018)。
本发明考虑的其它FIT-Ig是能够结合如以下靶标对的FIT-Ig：NgR和RGM A；NogoA和RGM A；MAG和RGM A；OMGp和RGM A；RGM A和RGM B；CSPGs和RGM A；聚集蛋白聚糖(aggrecan)、midkine、神经聚糖、多功能蛋白聚糖(versican)、磷酸蛋白聚糖(phosphacan)、Te38和TNF-a；Aβglobulomer特异性抗体与促进树突和轴突出芽的抗体的组合。树突病理是AD的极早期征候，并且已知NOGO A限制树突生长。可以将所述类型的抗体与任何SCI-候选(髓磷脂-蛋白质)抗体组合。其它FIT-Ig靶标可以包括以下的任何组合：NgR-p75、NgR-Troy、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-Lingo、Lingo-Troy、Lingo-p75、MAG或Omgp。另外，靶标还可以包括与抑制神经突有关的任何可溶性介质或细胞表面介质，例如Nogo、Ompg、MAG、RGM A、semaphorin、ephrin、可溶性A-b、促炎性细胞因子(例如IL-1)、趋化因子(例如MIP 1a)、抑制神经再生的分子。抗nogo/抗RGM A或类似FIT-Ig分子的功效可以在临床前脊髓损伤动物模型中验证。此外，这些FIT-Ig分子可以被构建并在动物模型中测定功效，并且可以选择最佳的治疗性FIT-Ig在人患者中进行测试。此外，可构建靶向单一受体上的两个不同配体结合位点的FIT-Ig分子，所述受体例如结合三个配体Nogo、OMGp及MAG的Nogo受体，以及结合A-b和S100A的RAGE。另外，神经突生长抑制剂(例如nogo和nogo受体)也可以在免疫学疾病(如多发性硬化)中在防止神经再生中起作用。已经显示，在多发性硬化的动物模型中抑制nogo-nogo受体相互作用可增进恢复。因此，可阻断一种免疫介质(例如细胞因子，如IL-12)和神经突生长抑制剂分子(例如nogo或RGM)的功能的FIT-Ig分子，可以提供比仅阻断免疫或神经突生长抑制剂分子更快并且更强的功效。
单克隆抗体疗法是作为癌症的重要治疗模式而出现(von Mehren M等，2003Monoclonal antibody therapy for cancer.Annu Rev Med.；54:343-69)。抗体可以通过诱导细胞凋亡、细胞毒性的重定向、干扰配体-受体相互作用或阻止对于赘生性表型至关重要的蛋白质的表达来发挥抗肿瘤作用。此外，抗体还可以靶向肿瘤微环境的组分，从而扰乱极为重要的结构，如肿瘤相关血管结构的形成。抗体也可以靶向配体是生长因子的受体，如表皮生长因子受体。因此，抗体可以抑制刺激细胞生长的天然配体结合至所靶向的肿瘤细胞。或者，抗体可以诱导抗独特型网络、补体介导的细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。与单特异性疗法相比，使用靶向两个分开的肿瘤介质的双重特异性抗体将可能产生附加益处。本发明也涵盖能够结合以下靶标对以***疾病的FIT-Ig Ig：IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；VEGFR和EGFR；CD20和CD3；CD138和CD20；CD38和CD20；CD38&CD138；CD40和CD20；CD138和CD40；CD38和CD40。其它靶标组合包括EGF/erb-2/erb-3家族的一个或多个成员。FIT-Ig Ig可以结合的涉及肿瘤疾病的其它靶标(一个或多个)包括但不限于，选自以下的那些：CD52、CD20、CD19、CD3、CD4、CD8、BMP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、FGF1、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GRP、IGF1、IGF2、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、VEGF、CDK2、EGF、FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、IGF1、IGF1R、IL2、VEGF、BCL2、CD164、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、GNRH1、IGFBP6、IL1A、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、TGFB1I1、AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、E2F1、EGFR、ENO1、ERBB2、ESR1、ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、MYC、NOX5、NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、NR1H3、NR1I3、NR2F6、NR4A3、ESR1、ESR2、NR0B1、NR0B2、NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR5A1、NR5A2、NR6A1、PGR、RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT1、APOC1、BRCA1、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1、COL6A1、EGF、ERBB2、ERK8、FGF1、FGF10、FGF11、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GNRH1、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGFBP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、INSL3、INSL4、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1、PAP、PLAU、PRL、PSAP、SERPINA3、SHBG、TGFA、TIMP3、CD44、CDH1、CDH10、CDH19、CDH20、CDH7、CDH9、CDH1、CDH10、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH7、CDH8、CDH9、ROBO2、CD44、ILK、ITGA1、APC、CD164、COL6A1、MTSS1、PAP、TGFB1I1、AGR2、AIG1、AKAP1、AKAP2、CANT1、CAV1、CDH12、CLDN3、CLN3、CYB5、CYC1、DAB2IP、DES、DNCL1、ELAC2、ENO2、ENO3、FASN、FLJ12584、FLJ25530、GAGEB1、GAGEC1、GGT1、GSTP1、HIP1、HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、KRT2A、MIB1、PART1、PATE、PCA3、PIAS2、PIK3CG、PPID、PR1、PSCA、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、ECGF1、EREG、FGF1、FGF2、FIGF、FLT1、JAG1、KDR、LAMA5、NRP1、NRP2、PGF、PLXDC1、STAB1、VEGF、VEGFC、ANGPTL3、BAI1、COL4A3、IL8、LAMA5、NRP1、NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINF1、TNFAIP2、CCL11、CCL2、CXCL1、CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IFNA1、IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CCL2、CDH5、COL18A1、EDG1、ENG、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、BAD、BAG1、BCL2、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CDH1(E-钙粘蛋白)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN2A(p16INK4a)、COL6A1、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、ERBB2(Her-2)、ESR1、ESR2、F3(TF)、FOSL1(FRA-1)、GATA3、GSN(凝溶胶蛋白)、IGFBP2、IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST(糖蛋白130)、ITGA6(a6整联蛋白)、JUN、KLK5、KRT19、MAP2K7(c-Jun)、MKI67(Ki-67)、NGFB(NGF)、NGFR、NME1(NM23A)、PGR、PLAU(uPA)、PTEN、CTLA-4、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDF8、CGRP、Lingo-1、ICOS、GARP、BTLA、CD160、ROR1、SERPINB5(mapsin)、SERPINE1(PAI-1)、TGFA、THBS1(血小板反应蛋白-1)、TIE(Tie-1)、TNFRSF6(Fas)、TNFSF6(FasL)、TOP2A(拓扑异构酶Iia)、TP53、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、BPAG1(网蛋白)、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CLDN7(封闭素-7)、CLU(聚集素蛋白)、ERBB2(Her-2)、FGF1、FLRT1(纤连蛋白)、GABRP(GABAa)、GNAS1、ID2、ITGA6(a6整联蛋白)、ITGB4(b 4整联蛋白)、KLF5(GC Box BP)、KRT19(角蛋白19)、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、MACMARCKS、MT3(metallothionectin-III)、MUC1(粘蛋白)、PTGS2(COX-2)、RAC2(p21Rac2)、S100A2、SCGB1D2(lipophilin B)、SCGB2A1(mammaglobin2)、SCGB2A2(mammaglobin1)、SPRR1B(Spr1)、THBS1、THBS2、THBS4和TNFAIP2(B94)。
在一个实施方案中，可以用本文提供的组合物和方法治疗或诊断的疾病包括但不限于，原发性和转移性癌症，包括乳癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、咽下癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌和胆管癌、小肠癌、泌尿道癌(包括肾癌、膀胱癌及尿路上皮癌)、女性生殖道癌(包括***、子宫癌和卵巢癌，以及绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)、男性生殖道癌(包括***、精囊、睾丸及生殖细胞肿瘤)、内分泌腺癌(包括甲状腺癌、肾上腺癌及垂体腺癌)和皮肤癌，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤(包括起源于骨骼和软组织的那些，以及卡波西氏肉瘤)、脑肿瘤、神经肿瘤、眼肿瘤和脑膜瘤(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、许旺氏瘤和脑膜瘤)、源于血液恶性疾病的实体肿瘤(如白血病)，以及淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)。
在一个实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合部分在单独或与放射疗法和/或其它化学治疗剂组合使用时用于治疗癌症或用于防止本文所述的肿瘤转移。
根据本发明的另一个实施方案，人免疫效应细胞是人淋巴细胞谱系的成员。在这一实施方案中，效应细胞可有利地为人T细胞、人B细胞或人自然杀伤(NK)细胞。有利地，此类细胞将对靶标细胞具有细胞毒性或细胞凋亡作用。特别有利地，人淋巴细胞是细胞毒性T细胞，当其活化时对靶标细胞发挥细胞毒性作用。根据这个实施方案，人效应细胞的募集活性则是这一细胞的细胞毒性活性。
根据优选实施方案，细胞毒性T细胞的活化可通过由本发明此实施方案的双特异性抗体结合细胞毒性T细胞表面上作为效应抗原的CD3抗原而发生。人CD3抗原存在于辅助型T细胞和细胞毒性T细胞上。人CD3表示在T细胞上作为多分子T细胞复合物的一部分表达并且包含以下三条不同链的抗原：CD3-ε、CD3-δ和CD3-γ。
T细胞的细胞毒性潜能的活化是需要多种蛋白质的相互作用的一种复杂现象。T细胞受体(“TCR”)蛋白是由两个不同糖蛋白亚基组成的膜结合、二硫键连接的异二聚体。TCR识别并且结合外来肽抗原，其中所述抗原自身已经被高度多样化的主要组织相容性复合物(“MHC”)蛋白质的成员所结合并且以结合至MHC的形式呈现于抗原呈递细胞(“APC”)的表面上。
尽管如以上所述，可变TCR结合外来抗原，但向T细胞传导此结合已经发生的信号则取决于与TCR缔合的其它不变的信号传导蛋白的存在。这些呈缔合形式的信号传导蛋白统称为CD3复合物，在此统称为CD3抗原。
T细胞细胞毒性的活化通常首先取决于TCR与MHC蛋白的结合，其中MHC蛋白自身结合至外来抗原并位于分开的细胞上。只有在这一初始TCR-MHC结合发生后，才能接着发生负责T细胞克隆扩增并最终引起T细胞的细胞毒性的CD3依赖性信号传导级联。
然而，本发明的双特异性抗体的第一或第二部分与人CD3抗原的结合可以使T细胞活化，以在不存在独立的TCR-MHC结合的情况下对其它细胞发挥细胞毒性作用。这意味着，T细胞可以通过一种不依赖于克隆的方式，即以独立于T细胞所携带的特定TCR克隆的方式，而被细胞毒性活化。这允许活化整个T细胞室而不是仅活化具有某一克隆身份的特定T细胞。
根据前述，本发明一个特别优选的实施方案提供一种双特性抗体，其中效应抗原是人CD3抗原。根据本发明这一实施方案的双特异性抗体可以具有总共两个或三个抗体可变结构域。
根据本发明的其它实施方案，可以用本发明的双特异性抗体结合的其它淋巴细胞缔合性效应抗原可以是人CD16抗原、人NKG2D抗原、人NKp46抗原、人CD2抗原、人CD28抗原或人CD25抗原。
根据本发明的另一个实施方案，人效应细胞是人髓细胞样谱系的成员。有利地，所述效应细胞可以是人单核细胞、人嗜中性粒细胞或人树突状细胞。有利地，此类细胞将对靶标细胞具有细胞毒性或细胞凋亡作用。这个实施方案内可以由本发明的双特异性抗体结合的有利抗原可以是人CD64抗原或人CD89抗原。
根据本发明的另一个实施方案，靶标抗原是在疾病情况下于靶细胞或效应细胞上独特表达，但在健康情况下不表达、以低水平表达或不可接近的抗原。可被本发明的双特异性抗体特异性结合的此类靶标抗原的实例有利地可以选自EpCAM、CCR5、CD19、HER-2neu、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1(粘蛋白)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、βhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖基GM1、poly SA、GD2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CD44v6、音猬因子(Shh)、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合)IgE、黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素、A33抗原、***干细胞抗原(PSCA)、Ly-6；桥粒芯蛋白4、E-钙粘着蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、CA19-9标记物、CA-125标记物及II型苗勒(Muellerian)抑制物质(MIS)受体、sTn(唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(纤维原细胞活化抗原)、内皮唾液酸蛋白、EGFRvIII、LG、SAS和CD63。
根据特定实施方案，由双特异性抗体特异性结合的靶标抗原可以是癌症相关抗原，即与恶性病状相关的抗原。此类抗原在恶性细胞上表达或可接近，而所述抗原在非恶性细胞上不存在、不明显存在或无法接近。因此，根据本发明这个实施方案的双特异性抗体是募集人免疫效应细胞针对带有靶标抗原或使靶标抗原可接近的恶性靶标细胞的活性的双特异性抗体。
基因疗法：在特定实施方案中，施用编码本文提供的结合蛋白或本文提供的另一预防剂或治疗剂的核酸序列，以通过基因疗法治疗、预防、管理或改善病症或其一种或多种症状。基因疗法是指通过向受试者施用已表达或可表达的核酸所进行的治疗。在此实施方案中，核酸产生其所编码的、介导预防或治疗作用的、本文提供的抗体或者预防剂或治疗剂。
本领域中可用的任何基因疗法的方法都可以用于本文提供的方法中。关于基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel等(1993)Clin.Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu(1991)Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev(1993)Ann Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan(1993)Science 260:926-932；Morgan 和Anderson(1993)Ann Rev.Biochem.62:191-217；以及May(1993)TIBTECH 11(5):155-215。可以使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于以下文献中：Ausubel等(编辑)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，NY(1993)；以及Kriegler，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)。基因疗法的各种方法的详细描述公开于美国专利公开No.US20050042664中。
诊断：本文的公开内容还提供了诊断应用，包括但不限于，诊断测定法、含有一种或多种结合蛋白的诊断试剂盒，以及用于自动化和/或半自动化***的方法和试剂盒的改进形式。所提供的方法、试剂盒和改进形式可以用于检测、监测和/或治疗个体的疾病或病症。这一点在下文进一步说明。
A.测定方法：本公开还提供了使用至少一种本文所述的结合蛋白确定试验样本中分析物或其片段的存在、量或浓度的方法。本领域中已知的任何合适的测定法都可以用于所述方法中。实例包括但不限于，免疫测定法和/或使用质谱法的方法。本公开提供的免疫测定法可以包括夹心免疫测定、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、竞争性抑制免疫测定、荧光偏振免疫测定(FPIA)、酶放大免疫测定技术(EMIT)、生物发光共振能量转移(BRET)、和均质化学发光测定试验等。化学发光微粒免疫测定试验，特别是采用自动分析仪(Abbott Laboratories，Abbott Park，Ill.)的化学发光微粒免疫测定，是免疫测定的一个实例。本公开也提供了采用质谱的方法并且包括但不限于，MALDI(基质辅助激光解吸/电离)或SELDI(表面增强激光解吸/电离)。
使用免疫测定法和质谱法收集、处理、加工及分析生物测定样本的方法是本领域技术人员众所周知的，并可以提供用于本发明公开内容的实施(US 2009-0311253A1)。
B.试剂盒：也提供一种用于测定试验样本中的分析物或其片段的存在、含量或浓度的试剂盒。所述试剂盒包括：至少一种用于测定试验样本中的分析物或其片段的组分、和有关测定试验样本中的分析物或其片段的说明书。所述至少一种用于测定试验样本中的分析物或其片段的组分可以包括，包含如本文公开的结合蛋白和/或抗分析物结合蛋白(或其片段、变体或其变体的片段)的组合物，其中结合蛋白任选地可以固定于固相上。所述试剂盒任选地可以包含校准剂或对照物，其可以包含分离的或纯化的分析物。所述试剂盒可以包含至少一种用于通过免疫测定和/或质谱法测定试验样本中的分析物的组分。所述试剂盒组分，包括分析物、结合蛋白和/或抗分析物结合蛋白或其片段，可以任选地使用任何本领域已知的可检测标记进行标记。可以提供以用于实施本发明公开内容的物质及产生方法是本领域技术人员所已知的(US 2009-0311253A1)。
C.试剂盒和方法的改进形式：如本文所述的通过免疫测定等测定法用于测定试验样本中分析物的存在、量或浓度的试剂盒(或其组分)以及方法，可以被改进以用于多种自动化和半自动化***(包括其中固相包括微粒的***)，例如美国专利No.5,089,424和5,006,309中所述的***，以及商售***，例如由Abbott Laboratories(Abbott Park，IL)以出售的***。可自Abbott Laboratories获得的其它平台包括但不限于，(参见，例如，美国专利No.5,294,404)、EIA(珠粒)和QuantumTMII，以及其它平台。另外，所述测定、试剂盒和试剂盒组分可以以其它形式被采用，例如在电化学或其它手持型或即时检测型(point-of-care)测定***上采用。本发明公开内容可以例如适用于执行夹心免疫测定的商业Abbott即时检测型(AbbottLaboratories)电化学免疫测定***。免疫传感器以及其制造方法和在一次性测定装置中操作的方法描述于例如美国专利No.5,063,081、7,419,821和7,682,833；以及美国公开No.20040018577、20060160164和US 20090311253中。本领域技术人员易于明了的是，对本文所述方法的其它合适修改和改进是明显的并且可以在不脱离本文公开的实施方案的范围的情况下使用合适等价物来进行。现已详细描述某些实施方案，通过参考以下实施例将对其有更明确理解，这些实施例仅出于举例说明目的而包括在此，而不意图构成限制。
尽管出于清楚理解的目的，已经通过举例说明和实施例相当详细地描述了前述发明，但是本领域的普通技术人员将明了，根据本发明的教导，在不背离所附权利要求的精神和范围情况下，可以对本发明进行某些改变和修改。以下实施例仅以举例说明方式提供，而并不起限制作用。本领域的技术人员将易于认识到多种非关键性参数，这些参数可以改变或修改以得到基本上类似的结果。
实施例
实施例1.抗IL17/IL-20串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的构建、表达、纯化和分析
为了证实FIT-Ig技术，我们产生了一组抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子：FIT1-Ig、FIT2-Ig和FIT3-Ig，全部都含有3种不同多肽，如图1中所示，其中抗原A是IL-17并且抗原B是IL-20。用于产生能够结合IL-17和IL-20的FIT-Ig的DNA构建体示于图1B中。简而言之，亲本mAb包括两种高亲和力抗体，即抗IL-17(克隆LY)(美国专利No.7,838,638)和抗hIL-20(克隆15D2)(美国专利申请公开No.US2014/0194599)。为了产生FIT-Ig构建体#1，将LY的VL-CL直接(FIT1-Ig)或通过具有3个氨基酸(FIT2-Ig)或7个氨基酸(FIT3-Ig)的接头与15D2重链的N末端融合(如表1中所示)。构建体#2是LY的VH-CH1，而第三构建体是15D2的VL-CL。每个FIT-Ig的三个构建体在293细胞中共转染，引起FIT-Ig蛋白的表达和分泌。
我们还产生了一组抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子：FIT4-Ig、FIT5-Ig和FIT6-Ig，其各自含有2种不同多肽，如图2中所示。用于产生能够结合IL-17和IL-20的FIT-Ig的DNA构建体示于图2B中，其中抗原A是IL-17并且抗原B是IL-20。简而言之，亲本mAb包括两种高亲和力抗体，即抗IL-17(克隆LY)和抗hIL-20(克隆15D2)。为了产生FIT-Ig构建体#1，将LY的VL-CL直接(FIT4-Ig)或通过具有3个氨基酸(FIT5-Ig)或7个氨基酸(FIT6-Ig)的接头与15D2重链的N末端融合(如表1中所示)。为了产生FIT-Ig构建体#4，将LY的VH-CH1直接(FIT4-Ig)或通过具有3个氨基酸(FIT5-Ig)或7个氨基酸(FIT6-Ig)的接头与15D2轻链的N末端融合。每个FIT-Ig的2个DNA构建体(构建体#1和#4)在293细胞中共转染，引起FIT-Ig蛋白的表达和分泌。PCR克隆的详细程序描述于下。
实施例1.1:抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子的分子克隆：
对于构建体#1克隆，使用与轻链信号序列退火的正向引物以及与轻链的C末端退火的反向引物，通过PCR扩增LY轻链。使用与15D2VH的N末端退火的正向引物以及与CH的C末端退火的反向引物，通过PCR扩增15D2重链。对这两个PCR片段进行凝胶纯化，并使用信号肽和CH引物对，通过重叠PCR将其合并。将合并的PCR产物克隆到已含有人Fc序列的293表达载体中。
表1.抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子和DNA构建体
对于构建体#2克隆，使用与重链信号肽退火的正向引物以及与CH1的C末端退火的反向引物，通过PCR扩增LY VH-CH1。对PCR产物进行凝胶纯化，随后将其克隆到293表达载体中。
对于构建体#3，使用与轻链信号肽N末端退火的正向引物以及与CL的末端退火的反向引物，通过PCR扩增15D2轻链。对PCR产物进行凝胶纯化，随后将其克隆到293表达载体中。
对于构建体#4克隆，使用与重链信号肽N末端退火的正向引物以及与CH1的末端退火的反向引物，通过PCR扩增LY VH-CH1。使用与15D2VL的末端退火的引物扩增15D2VL。对这两种PCR产物进行凝胶纯化并通过重叠PCR将其合并。对合并的PCR产物进行凝胶纯化并将其克隆到293表达载体中。表2显示用于以上分子克隆中的PCR引物的序列。
表2.用于抗IL-17/抗CD20FIT-Ig的分子构建的PCR引物
hIL-17/hIL-20FIT1-Ig、FIT2-Ig、FIT3-Ig、FIT4-Ig、FIT5-Ig和FIT6-Ig的最终序列列于表3中。
表3.抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子的氨基酸序列
实施例1.2:抗IL-17/IL-20FIT-Ig蛋白的表达、纯化和分析
将每个FIT-Ig的所有DNA构建体都亚克隆至基于pBOS的载体中，并进行测序以确保准确性。在293E细胞中，使用聚乙烯亚胺(PEI)，对每个FIT-Ig(1、2和3)的构建体#1、构建体#2和构建体#3或每个FIT-Ig(4、5和6)的构建体#1和构建体#4进行瞬时共表达。简而言之，将FreeStyleTM293表达培养基中的DNA与PEI混合，其中DNA与PEI的最终浓度比为1:2，在室温下孵育15min(不超过20min)，接着以60μg DNA/120ml培养物加入293E细胞(1.0-1.2×106/ml，细胞活力>95％)中。在振荡器中培养6-24小时之后，在37℃、8％CO2、125rpm/min振荡下，将蛋白胨以5％的终浓度加入经过转染的细胞中。在第6天-第7天，通过离心和过滤来收获上清液，并根据制造商的说明，使用蛋白A色谱法(Pierce，Rockford，IL)纯化FIT-Ig蛋白。通过SDS-PAGE分析这些蛋白质，并通过A280和BCA(Pierce，Rockford，IL)测定其浓度。
为表达FIT1-Ig、FIT2-I和FIT3-Ig，使用了3种构建体的不同DNA摩尔比，包括构建体#1:#2:#3＝1:1:1、构建体#1:#2:#3＝1:1.5:1.5和构建体#1:#2:#3＝1:3:3(表4)。通过蛋白质A色谱法纯化FIT-Ig蛋白。纯化产率(7-16mg/L)与每一种蛋白质的表达培养基中的hIgG定量一致。通过SDS-PAGE，在还原条件和非还原条件下分析纯化的FIT-Ig的组成和纯度。在非还原条件下，FIT-Ig以约250KDa的单一带迁移。在还原条件下，FIT-Ig蛋白各自产生两条带，一条较高MW的带是约75KDa的构建体#1，而一条较低MW的带对应于在约25KDa处重叠的构建体#2和构建体#3。SDS-PAGE显示，每个FIT-Ig表达为单一物质，并且这3条多肽链有效配对形成IgG样分子。FIT-Ig分子的这些链以及全长蛋白的大小与基于氨基酸序列计算的其分子量是一致的。
表4.hIL-17/IL-20FIT-Ig蛋白的表达和SEC分析
为了进一步研究FIT-Ig在溶液中的物理特性，使用尺寸排阻色谱法(SEC)来分析每一种蛋白质。对于FIT-Ig的SEC分析，将在PBS中的纯化的FIT-Ig施加于TSKgelSuperSW3000的300×4.6mm柱(TOSOH)上。使用U3000型HPLC仪器(DIONEX)进行SEC。所有蛋白质都使用UV检测，在280nm和214nm下测定。洗脱是以0.25mL/min流速进行的等度洗脱。全部3种FIT-Ig蛋白都呈现出单一主峰，证明了作为单体蛋白质的物理均质性(表4)。对于全部3种FIT-Ig蛋白，通过SEC，构建体#1:#2:#3比＝1:3:3显示更佳的单体性质(表4)。
表4还显示，所有这些FIT-Ig蛋白的表达水平都与常规mAb的表达水平相当，表明这些FIT-Ig可以在哺乳动物细胞中有效地表达。为了表达FIT4-Ig、FIT5-Ig和FIT6-Ig，构建体#1:#4的DNA比＝1:1，并且表达水平在1-10mg/L范围内，并且由SEC测定的峰单体级分％在58-76％范围内。基于这一特定的mAb组合(LY和15D2)，3-多肽FIT-Ig构建体(FIT1-Ig、FIT2-Ig和FIT3-Ig)显示出比2-多肽FIT-Ig构建体(FIT4-Ig、FIT5-Ig和FIT6-Ig)更佳的表达谱，因此进一步分析了FIT1-Ig、FIT2-Ig和FIT3-Ig的功能特性。
实施例1.3抗IL-17/IL-20FIT-Ig的抗原结合亲和力的测定
利用Biacore X100仪器(Biacore AB，Uppsala，瑞典)，使用HBS-EP(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20)通过表面等离子共振(表5)在25℃下测定FIT-Ig结合rhIL-17和rhIL-20的动力学。简而言之，根据制造商的说明，使用标准胺偶联试剂盒，将山羊抗人IgG Fcγ片段特异性多克隆抗体(Pierce Biotechnology Inc，Rockford，IL)直接固定在CM5研究级生物传感器芯片上。为在山羊抗人IgG Fc特异性反应表面上进行捕获，在HEPES缓冲生理盐水中稀释纯化的FIT-Ig样本，并且以5μl/min的流速注射在反应基质上。在30μL/min连续流速下测定结合速率常数kon(M-1s-1)和解离速率常数koff(s-1)。通过在1.25至1000nM范围的十种不同抗原浓度下进行动力学结合测量来得到速率常数。接着，通过以下公式，由动力学速率常数计算出FIT-Ig与靶标蛋白之间的反应的平衡解离常数(M)：KD＝koff/kon。另外，也将抗原样本的等分试样同时注射在空白参照和反应CM表面上，以记录并扣除任何非特异性结合背景，从而消除大部分的折射率变化和注射噪音。随后，通过以10μL/min流速两次相继注射25ml的10mM甘氨酸(pH 1.5)使表面再生。使固定有抗Fc抗体的表面完全再生并且在十二个循环内保持其完全的捕获能力。
表5.抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子的功能表征
Biacore分析表明，三种FIT-Ig与hIL-17和hIL-20的总体结合参数类似，而且FIT-Ig的亲和力与亲本mAb LY和15D2极为接近，并且针对任一抗原结合结构域的结合亲和力没有损失(表5)。
此外，还通过Biacore分析FIT-Ig的四价双重特异性抗原结合。首先在Biacore传感器芯片上，经由山羊抗人Fc抗体捕获FIT1-Ig，并注射第一抗原，同时观察结合信号。当FIT1-Ig被第一抗原饱和时，则注射第二抗原并观察第二信号。对于FIT2-Ig，这是通过首先注射IL-17然后注射IL-20或通过首先注射IL-20然后注射IL-17进行的(图3)。以任一顺序，均检测到双重结合活性，并且两种抗原结合在25-30RU均被饱和。对于FIT2-Ig和FIT3-Ig获得类似结果。由此，每个FIT-Ig均能够作为双重特异性四价分子同时结合两种抗原。
FIT-Ig的表达谱和双重结合特性清楚地证实，在FIT-Ig分子内，两个VL-CL都正确地与其对应VH-CH1配对，形成2个功能性结合结构域，并且表达为单一单体、四价、双特异性的全长FIT-Ig蛋白。这与呈现四价但具有对一个靶抗原的单特异性结合活性的多价抗体分子类型(Miller和Presta，美国专利8722859)是不同的。
实施例1.4抗IL-17/IL-20FIT-Ig生物活性的测定
使用GROα生物测定试验，测量FIT-Ig中和IL-17功能的生物活性。简而言之，将Hs27细胞以10000个细胞/50μL/孔接种到96孔板中。一式两份，将FIT-Ig或抗IL-17对照抗体(25μL)添加到孔中，其中起始浓度是2.5nM，随后以1:2进行连续稀释，直到5pM。接着向每个孔中添加IL-17A(25μL)。IL-17A的最终浓度是0.3nM。在37℃下孵育细胞17小时，随后收集细胞培养物上清液。根据制造商的方案(R&D systems)，通过人CACL1/GROαQuantikine试剂盒测量细胞培养物上清液中GRO-α的浓度。
使用IL-20R+BAF3细胞增殖测定试验，测量FIT-Ig中和IL-20功能的生物活性。简而言之，将25μL 0.8nM重组人IL-20添加到96孔板的每个孔中(IL-20的最终浓度是0.2nM)。将抗IL20抗体或FIT-Ig或另一对照抗体稀释到400nM(工作浓度是100nM)，随后进行5倍连续稀释，并将其添加到96孔测定板中(每孔25μL)。接着，在50μL体积的RPMI 1640加10％FBS、浓度800μg/ml的潮霉素B、浓度800μg/ml的G418中，以10000个细胞/孔浓度，将IL-20受体稳定转染的BaF3细胞添加到每个孔中。在48小时孵育后，将100μL CellTiter-Glo发光缓冲液添加到每个孔中。在定轨振荡器上混合内容物2分钟以诱导细胞溶解并在室温下孵育板10分钟以使发光信号稳定。通过SpectraMax M5记录发光。
如表5中所示，所有FIT-Ig都能够中和hIL-20和hIL-17两者，并且亲和力类似于亲本抗体的亲和力。基于使用Biacore和基于细胞的中和测定试验进行的功能分析，很明显，全部3种FIT-Ig都完全保持了亲本mAb的活性。三种FIT-Ig间不存在显著功能差异，表明接头是可选的，并且FIT-Ig构建体提供了足够的柔性和特定尺寸以允许在2个Fab结合区之间不存在肽间隔子的情况下实现双重结合。这与DVD-Ig型分子不同，在DVD-Ig型分子中2条多肽链的每一条上的2个可变结构域之间都需要接头以保持下部(第2)可变结构域的活性。
实施例1.5抗IL-17/IL-20FIT-Ig的稳定性研究
将含FIT1-Ig蛋白质样本的柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.0)分别在恒定的4℃、25℃和40℃下孵育1天、3天或7天；类似地，将FIT1-Ig蛋白质样本冻-融一次、两次或三次。利用SEC-HPLC，通过将各蛋白质样本10μg以0.3mL/min流速注射到装备Superdex200 5/150GL的Utimate 3000HPLC中15分钟，检测了所有样本中完整的完全单体蛋白级分，并使用由制造商供应的Chromeleon软件记录并分析数据。表6显示在这些热攻击条件下，FIT1-Ig和FIT3-Ig仍是完全完整的单体分子。
表6.通过SEC测量完全单体级分％的FIT-Ig稳定性分析
实施例1.6抗IL-17/IL-20FIT-Ig的溶解度研究
通过测量在递增浓度的PEG6000(PEG6000购自Shanghai lingfeng chemicalreagent co.Ltd)存在下沉淀的迹象，分析了FIT1-Ig的溶解度。简而言之，作为PEG6000浓度(0、5％、10％、15％、20％、25％和30％)的函数，获得在PEG6000存在下蛋白质的溶解度。溶解度研究在25℃的温度下以pH 6.0的溶液进行。简而言之，通过混合适量的蛋白质缓冲储备液、PEG和缓冲液以达到所需的组分浓度，使蛋白质沉淀。使最终体积达200μl并且蛋白质浓度设置在1.0mg/mL。充分混合最终溶液并平衡16小时。平衡后，以13000rpm离心溶液10分钟以分离蛋白质沉淀。使用Spectra Max Plus384(Molecular Device)在280nm下测量并从上清液的吸光度获得蛋白质溶解度，并且基于蛋白质浓度的标准曲线计算浓度(图4A)。另外，使用相同实验方法，在3种不同pH条件下分析市售抗体利妥昔单抗(Rituxan)(图4B)。很明显，蛋白质溶解度取决于pH条件，而且预测的FIT-Ig溶解度将在单克隆抗体的范围内。
实施例1.7抗IL-17/IL-20FIT-Ig的药代动力学研究
在雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠中评估FIT1-Ig的药代动力学特性。将FIT-Ig蛋白以5mg/kg单次静脉内剂量经由颈静脉插管或在背部皮肤下皮下施用给雄性SD大鼠。在28天时间内，在不同时间点收集血清样本，其中在0、5、15和30min；1、2、4、8和24hr；以及2、4、7、10、14、21和28天经由尾静脉连续抽血来进行取样，并通过人IL-17捕获和/或人IL-20捕获ELISA加以分析。简而言之，用山羊抗生物素抗体(5μg/ml，4℃，过夜)包被ELISA板，用Superblock(Pierce)阻断，在室温下与含50ng/ml生物素化人IL-17(IL-17捕获ELISA)或IL-20(IL-20捕获ELISA)的10％Superblock TTBS一起孵育2小时。对血清样本进行连续稀释(含0.5％血清、10％Superblock的TTBS)并在室温下在板上孵育30分钟。用HRP标记的山羊抗人抗体进行检测，借助于标准曲线使用四参数逻辑斯蒂拟合确定浓度。几只动物，尤其是在皮下组中，显示在第10天后FIT-Ig浓度的突然下降，原因可能是发生抗人反应。将这些动物从最终计算中去除。通过非房室模型，使用WinNonlin软件(Pharsight Corporation，Mountain View，Calif.)测定药代动力学参数的值。
在大鼠PK研究中，当通过两种不同的ELISA方法测定时，FIT1-Ig血清浓度极为相似，表明所述分子是完整的，并且能够在体内结合两种抗原。在IV给药后，FIT1-Ig展现由分配相随后消除相组成的双相药代动力学曲线，类似于常规IgG分子的PK曲线。基于这两种不同的分析方法计算的药代动力学参数极为相似并且显示于表7中。FIT-Ig的清除率较低(约12mL/天/kg)并具有较低分配体积(Vss是～130mL/kg)，由此产生较长半衰期(T1/2>10天)。在皮下施用后，FIT-Ig缓慢吸收，并且在给药后4天达到约26.9μg/ml的最大血清浓度。终末半衰期是约11天并且皮下生物利用率接近100％。如由这些结果所证实的，FIT1-Ig在体内的特性与常规IgG分子极为类似，表明有可能在治疗应用中使用相当的给药方案。
FIT-Ig的药代动力学研究在多特异性Ig样生物制剂开发领域展示了令人惊讶的突破。大鼠药代动力学***在制药行业中常用于治疗性mAb的临床前评价，并且它可以良好地预测mAb在人体中的药代动力学特征。FIT-Ig的较长半衰期和较低清除率使其能够用于以较低给药频率对慢性适应症进行治疗应用，与治疗性mAb类似。此外，FIT-Ig比IgG大100-kDa，基于由PK研究得到的其IgG样分布体积参数，FIT-Ig看来可以有效地渗透到组织中。
表7.SD大鼠中FIT1-Ig的药代动力学分析
实施例1.8FIT-Ig的稳定CHO细胞系开发研究
已经观察到，FIT-Ig在瞬时转染的293E细胞中有效表达。为了进一步确定FIT-Ig的制造可行性，在CHO-DG44细胞系和CHO-S细胞系中进行稳定转染，随后进行克隆选择和生产力分析。简而言之，通过用含8×106个细胞的400μl转染溶液加亚克隆到Freedom pCHO载体(Life Technologies)中的20μg DNA(对于CHO DG44细胞)或25μg DNA(对于CHO-S细胞)进行电穿孔来转染CHO细胞。使用常规程序进行稳定细胞系选择。简而言之，对于CHO-DG44选择，在转染后，选出稳定汇合物(-HT/2P/400G，其中P是μg/mL嘌呤霉素，G是μg/mL G418)，并通过IgG ELISA分析蛋白质的产生。选择顶部汇合物，并用递增浓度的MTX(50、100、200和500nM)进行数轮扩增，随后通过IgG ELISA分析蛋白质的产生。然后，选择顶部汇合物进行亚克隆。对于CHO-S细胞选择，在含有10P/400G/100M(M是nM MTX)的培养基中进行第一阶段选择，随后分析蛋白质的产生。接着，选择顶部汇合物并在30P/400G/500M或50P/400G/1000M中进行第2阶段选择，随后通过ELISA测量蛋白质的产生。然后，选择顶部汇合物进行亚克隆。对于蛋白质生产力分析，使用30mL新鲜培养基(补充有6mM L-谷氨酰胺的CDFortiCHOTM培养基)将完全回收的细胞汇合物(活力>90％)以5×105个活细胞/毫升(CHODG44)或3×105个活细胞/毫升(CHO-S)接种于125mL振荡瓶中。在37℃、80％相对湿度、8％CO2和130rpm下，在振荡平台上孵育细胞。每天或以规律时间间隔(例如，在第0天、第3天、第5天、第7天、第10天、第12天和第14天)对培养物取样以测定细胞密度、活力及生产力，直到培养物活力降到50％以下或达到培养的第14天。取样后，必要时向培养物补料葡萄糖。
FIT1-Ig CHO稳定细胞系开发的整个过程显示出类似于在CHO细胞中开发单克隆抗体的特征。例如，在2P/400G下分析DG44汇合物期间，VCD持续增加直到第10-12天，达到约1.3E7，而细胞活力到第13-14天时仍高于80％，而且生产力在第14天时达到约40mg/mL。在5P/400G/50M下扩增后，生产力在第14天时达到50mg/mL以上。对于CHO-S细胞选择，在第I阶段选择期间，滴度达到200mg/mL以上，并且在第2阶段选择时达到370mg/mL以上。这些生产力水平与先前在我们的实验室中针对常规人mAb开发所观察到的生产力水平类似，表明FIT-Ig对于商业应用展示出mAb-样的制造可行性。
实施例2：抗CD3/CD20串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的构建、表达和纯化
为了证实FIT-Ig是否能结合至细胞表面抗原，产生抗CD3/CD20FIT-Ig分子FIT7-Ig和FIT8-Ig，其为3-多肽构建体，如图1中所示。用于产生能够结合细胞表面CD3和CD20的FIT-Ig的构建体示于图1B中。简单地说，亲本mAb包括两种高亲和力抗体，即抗CD3(OKT3)和抗CD20(奥法木单抗Ofatumumab)。为了产生FIT7-Ig构建体#1，将OKT3的VL-CL直接(FIT7-Ig)或通过具有7个氨基酸的接头(FIT8-Ig)与奥法木单抗重链的N末端融合(如表8中所示)。构建体#2是OKT3的VH-CH1，并且第3构建体是奥法木单抗的VL-CL。FIT-Ig的这3种构建体在293细胞中共转染，引起FIT-Ig蛋白的表达和分泌。PCR克隆的详细程序描述于下：
实施例2.1抗CD3/CD20FIT-Ig的分子克隆：
分子克隆方法与抗hIL-17/hIL-20FIT-Ig的类似。
表8.抗CD3/CD20FIT-Ig分子和构建体
表9显示用于分子构建的PCR引物的序列。
表9.用于抗IL-17/IL-20FIT-Ig的分子构建的PCR引物
抗CD3/CD20FIT-Ig的最终序列描述于表10中。
表10.抗CD3/CD20FIT-Ig的氨基酸序列
实施例2.2抗CD3/CD20FIT-Ig的表达和纯化
将每个FIT-Ig的所有DNA构建体都亚克隆到基于pBOS的载体中，并进行测序以确保准确性。使用聚乙烯亚胺(PEI)，在293E细胞中，对每个FIT-Ig的构建体#1、构建体#2和构建体#3进行瞬时共表达。简而言之，将FreeStyleTM293表达培养基中的DNA与PEI混合，其中DNA与PEI的最终浓度比率是1:2，在室温下孵育15min(不超过20min)，接着以60μg DNA/120ml培养物添加到293E细胞(1.0-1.2×106/ml，细胞活力>95％)中。在振荡器中培养6-24小时之后，在37℃、8％CO2和125rpm/min振荡下，将蛋白胨以5％的终浓度添加到经过转染的细胞中。在第6天-第7天，通过离心和过滤来收集上清液，并根据制造商的说明，使用蛋白A色谱法(Pierce，Rockford，IL)纯化FIT-Ig蛋白。通过SDS-PAGE分析这些蛋白质，并通过A280和BCA(Pierce，Rockford，IL)测定其浓度(表11)。
表11.抗CD3/CD20FIT-Ig蛋白的表达和SEC分析
实施例2.3抗CD3/CD20FIT-Ig分子的结合活性：
使用在细胞表面上表达CD3的Jurkat细胞，以及在细胞表面上表达CD20的Raji细胞，通过FACS分析抗CD3/CD20FIT-Ig与两种靶标的结合。简而言之，在冰冷的PBS中洗涤5×105个细胞并在冰上用2％FBS阻断1小时。将细胞与抗体FIT-Ig(100nM)或同种型对照物一起在冰上孵育1小时，并用PBS洗涤3次。添加二抗(标记有Alexa Fluor 488的山羊抗人IgG，Invitrogen)并将其与细胞在冰上于暗处孵育1小时，随后用PBS洗涤三次。在FACs calibur中分析样本。细胞表面结合显示，FIT7-Ig和FIT8-Ig两者都能够以浓度依赖性方式结合细胞表面抗原CD3和CD20。相较于亲本mAb的结合活性，FIT-Ig对于Jurkat细胞上的CD3显示出降低的结合强度，而对Raji细胞上的CD20显示出增强的结合强度。在所有结合研究中，FIT7-Ig和FIT8-Ig对于两种抗原显示类似的结合活性，表明接头对于FIT8-Ig的结合能力没有显著影响(表12)。
表12.抗CD3/CD20FIT-Ig蛋白的细胞表面抗原结合研究
实施例3：抗TNF/IL-17串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的构建、表达和纯化
使用抗IL-17mAb克隆LY和抗TNF mAb戈利木单抗,也产生了可结合至人IL-17和人TNFα的另一FIT-Ig(FIT9-Ig)，其为3-多肽构建体形式，如图1中所示。为了产生FIT9-Ig构建体#1，将戈利木单抗的VL-CL与LY重链的N末端直接融合(如表13中所示)。构建体#2是戈利木单抗的VH-CH1并且第3构建体是LY的VL-CL。将FIT9-Ig的3种构建体共转染到293细胞中，从而引起FIT9-Ig蛋白的表达和分泌。抗TNF/IL-17FIT-Ig的最终序列描述于表14中。
实施例3.1抗TNF/IL-17FIT-Ig的分子克隆：
分子克隆方法与抗hIL-17/hIL-20FIT-Ig的类似。
表13.抗TNF/IL-17FIT-Ig分子和构建体
表14：抗TNF/IL-17FIT-Ig分子的氨基酸序列
实施例3.2抗TNF/IL-17FIT-Ig蛋白的表达、纯化和分析
将每个FIT-Ig的所有DNA构建体都亚克隆到基于pBOS的载体中，并进行测序以确保准确性。如先前所述，使用聚乙烯亚胺(PEI)，在293E细胞中对FIT9-Ig的构建体#1、构建体#2及构建体#3进行瞬时共表达，并利用蛋白质A色谱法纯化FIT9-Ig蛋白质。表达水平是10-23mg/L。使用针对IL-17(通过Hs27细胞产生GROα)和TNF(通过L929细胞产生IL-8)的基于细胞测定试验，对纯化蛋白质进行功能分析。FIT9-Ig针对人TNF的中和效力是11.6pM(相比而言，在相同实验中戈利木单抗为15.9pM)，而针对人IL-17的中和效力是122pM(相比而言，在相同实验中LY为51.5pM)。总体而言，FIT9-Ig保持了亲本mAb的生物活性。
实施例4：抗CTLA-4/PD-1串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的构建、表达和纯化
使用抗CTLA-4mAb伊匹单抗和抗PD-1mAb纳武单抗，产生可结合至人CTLA-4和人PD-1的呈3-多肽构建体形式的另一个FIT-Ig(FIT10-Ig)，如图1中所示。为了产生FIT10-Ig构建体#1，将伊匹单抗的VL-CL与纳武单抗重链的N末端直接融合(如表15中所示)。构建体#2是伊匹单抗的VH-CH1并且第3构建体是纳武单抗的VL-CL。将FIT10-Ig的3种构建体共转染到293细胞中，从而引起FIT10-Ig蛋白表达和分泌。
实施例4.1抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig的分子克隆：
分子克隆方法与抗hIL-17/hIL-20FIT-Ig的类似。抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig的最终序列描述于表16中。
表15.抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig分子和构建体。
表16.抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig分子的氨基酸序列
实施例4.2抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig蛋白的表达、纯化和功能分析：
将每个FIT-Ig的所有DNA构建体都亚克隆到基于pBOS的载体中，并进行测序以确保准确性。如先前所述，使用聚乙烯亚胺(PEI)，在293E细胞中对FIT10-Ig的构建体#1、构建体#2及构建体#3进行瞬时共表达，并通过蛋白A色谱法将FIT9-Ig蛋白纯化至98％单体完全蛋白。表达水平高达43mg/L。使用ELISA对纯化的蛋白质进行针对重组CTLA-4Ig和PD-1的结合分析。简而言之，对于结合至CTLA-4，将人CTLA-4Ig(R&D Systems)固定于96孔板上，随后进行常规洗涤和阻断程序。接着，将各种浓度的FIT-10-Ig或伊匹单抗添加到板中，随后是孵育和多次洗涤的步骤，并用抗人Fab–HRP进行检测。对于结合至PD-1，将人PD-1(带有his标签)(R&D Systems)固定于96孔板上，随后进行常规洗涤和阻断程序。接着，将各种浓度的FIT-10-Ig或纳武单抗添加到板中，随后是孵育和多次洗涤的步骤，并用抗人Fc–HRP进行检测(图5)。看起来，FIT10-Ig能够以与亲本mAb伊匹单抗和纳武单抗分别类似的活性，结合CTLA-4(A)和PD-1(B)两者。
此外，使用OctetRed进行多抗原结合研究以确定FIT10-Ig是否能够同时结合重组CTLA-4和PD-1。简单地说，将浓度是10μg/ml的FIT10-Ig固定于AR2G传感器上，随后在测定缓冲液(PBS pH 7.4，0.1％BSA，0.02％Tween)中结合CTLA-4Ig和然后结合PD-1(或先结合PD-1，然后结合CTLA-4Ig)，其中浓度是80nM。在实验结束时，表面用pH1.5的10mM甘氨酸再生五次(图6)。这一实验显示，FIT10-Ig当已结合至CTLA-4后能够结合PD-1，并且反之亦然，表明FIT10-Ig能够同时结合CTLA-4Ig和PD-1。
实施例5：其他串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的构建、表达和纯化
按照之前实施例中所述的，构建了对EGFR和PD-L1；cMet和EGFR；因子IXa和因子X；Her3和IGF-1R；DLL-4和VEGF；CD20和CD3；Her3和EGFR；PD-1和PD-L1；以及Her3和PD-1具有特异性的FIT-Ig。这些示例性FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表17中。表18提供了每个FIT-Ig在293E细胞中的表达水平和SEC特征。
表17.其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表18.FIT-Ig在293E细胞中的表达水平和SEC特征
图7a-7i中也提供了表17和18的每个FIT-Ig的SEC特征。
以下表19中提供了FIT13a-Ig的功能结合数据。此外，进行多抗原结合研究以确定IFT13a-Ig是否能够结合cMet和EGFR。研究结果显示于图8，并且显示IFT13a-Ig能够同时结合cMet和EGFR两者。
表19.FIT13a-Ig的功能结合数据
以下表20中提供了FIT14-Ig的因子IXa结合活性的功能结合数据。
表20.FIT14-Ig的功能结合数据
研究结果表明,可以构建、表达和纯化其他的FIT-Ig并且其将呈现出与靶标蛋白的功能性结合。
实施例6：新的抗CTLA-4/PF-1串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的构建、表达和纯化
按照之前实施例中所述的，构建了新的对CTLA4和PD1具有特异性的FIT-Ig。这些示例性FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表21中。表21提供了每个FIT-Ig在293E细胞中的表达水平和SEC特征。
表21.针对CTLA4和PD1的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
长链和短链包含前导序列，其可以是MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC(SEQ ID NO:487)，或MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:488)。
表22.SEC特征/293E细胞中的表达水平：
FIT-Ig SEC中的单体％ 表达水平(mg/L)
NBS3 >95％ 24.6
NBS3R 100％ 6.3
NBS3-C 98.28 9.6
NBS3R-C 100％ 4.0
在小规模生产中评价了表达水平，除了NBS3外没有进行任何优化。所有SEC样品在一步蛋白A纯化下。IgG1和IgG4形式的FIT-Ig均可以作为均一蛋白质从293细胞生产。
功能研究
以下表23中提供了这些抗体的功能结合数据。所述数据表明，改变IgG恒定序列不影响亲和力，但可以通过在上结构域中放置特定Fab来提高亲和力。
表23.功能结合数据
ELISA结合研究：测定了NBS3R的ELISA结合。简而言之，对于与CTLA-4的结合，将人CTLA-4Ig(R&D Systems)固定于96-孔平板上，接着进行常规洗涤和阻断程序。随后将不同浓度的FIT-Ig或相关单克隆抗体加入平板中，接着进行孵育和多个洗涤步骤，并用抗人Fab-HRP检测。对于与PD-1的结合，将人PD-1(具有his标签)(R&D Systems)固定于96-孔平板上，接着进行常规的洗涤和阻断程序。随后将不同浓度的NBS3R或纳武单抗加入平板中，接着进行孵育和多个洗涤步骤，并用抗人Fc-HRP检测。显示出NBS3R能够结合CTLA-4(A)和PD-1(B)两者。结果显示于图9A和图9B中。
多重结合研究：还进行了NBS3的多重结合研究。结果显示于图10中。
热稳定性研究：还对这些抗体进行了热稳定性研究，其结果显示于表24中。通过DSC测量了熔化温度。
表24.热稳定性测定
存储稳定性研究：通过SEC-HPLC方法评价了NBS3的存储稳定性，并且结果显示于表25中。通过冻/融循环一次、两次或三次来处理样品，通过SEC-HPLC曲线没有观察到聚集或降解。将样品在4℃、25℃或40℃处理1天、3天或7天，通过SEC-HPLC曲线没有观察到聚集或降解。
表25.NBS3的存储稳定性
样品名称 相对面积％ 相对面积％ 相对面积％
1 2 3
NBS3_D0 0.77 99.23 n.a.
NBS3_F/T1 1.23 98.77 n.a.
NBS3_F/T2 1.32 98.68 n.a.
NBS3_F/T3 1.39 98.61 n.a.
NBS3_4C-D1 1.45 98.55 n.a.
NBS3_25C-D1 1.45 98.55 n.a.
NBS3_40C-D1 1.44 98.56 n.a.
NBS3_4C-D3 1.49 98.51 n.a.
NBS3_25C-D3 1.50 98.50 n.a.
NBS3_40C-D3 1.62 97.85 0.53
NBS3_4C-D7 1.61 98.39 n.a.
NBS3_25C-D7 1.67 98.33 n.a.
NBS3_40C-D7 1.76 97.70 0.55
进一步在大鼠PK研究中了NBS3，并且结果显示于图11A和图11B中。这个研究的目的是为了评价SD大鼠中单次静脉内(IV)或皮下(SC)给药后NBS3的药物动力学。经由足背静脉注射给药IV剂量，以及经由皮下注射给药SC剂量。在指定的时间点，手动固定动物，并且经由尾静脉刺穿或心脏穿刺，将大约240μL血液/时间点收集至试管中。将血样在室温下放置0.5hr。随后将血样离心(10000g，4℃下5min)，以获得血清样品。将血清样品立即存储在-80℃下，直至分析。经由ELISA，与给药溶液一起分析样品。将测量的给药浓度用于PK参数计算。
在基于细胞的受体阻断分析中测定了NBS3、NBS3-C和NBS3R-C。简而言之，将PD1-Fc固定于96孔平板上，接着进行常规洗涤和阻断程序。随后将稀释的FIT-Ig和生物素化的PD-L1-Fc加入每个孔中，接着进行孵育和多个洗涤步骤，并用链霉亲和素-HRP检测。结果显示于图12中。
在MLR(混合淋巴细胞反应)试验和PBMC SEB刺激试验中进一步测定了NBS3、NBS3-C和NBS3R-C的功能活性。
在MLR试验中，使用来自一个供体的单核细胞衍生的树突细胞和来自另一个供体的同种异体CD4T细胞，进行了混合淋巴细胞反应。从健康供体收集全血样，并且使用Ficoll-Pague梯度离心，从全血分离PBMC。在第1天，分离来自一个供体的PBMC，并且用无血清RPMI1640稀释为1×106/ml。将稀释的PBMC以3ml/孔接种于6-孔组织培养平板中，并且孵育3h。除去上清液并洗掉未贴壁的细胞。在含有10％FBS的RPMI1640中，用250U/ml IL-4和500U/ml GM-CSF，将贴壁的单核细胞极化成树突细胞。在第4天，将培养基替换成新鲜的IL-4和GM-CSF。在第7天，收集未成熟的DC，并在含有10％FBS的RPMI 1640中，用1μg/ml LPS再处理24h，使其成熟。在第8天，通过负选择，从另一个供体PBMC分离CD4T细胞，并调节至2×106细胞/ml的终浓度。用丝裂霉素C在37℃下处理成熟DC 1.5hr。随后用PBS洗涤DC并调节至1×106细胞/ml的终浓度。将CD4T细胞(应答者细胞)以100μl/孔加入96孔平板中，并用稀释浓度的试验抗体预处理30分钟。随后，将成熟DC(刺激者细胞)以100μl/孔加入孔中。每个孔的最终体积为200μl。使用ELISA，将MLR在37℃孵育72hr(对于IL-2测定试验)或120hr(对于IFN-γ测定试验)。结果显示于图13A和图13B中。
在PBMC SEB-刺激试验中，通过Ficoll-Pague梯度离心，从健康供体血液分离PBMC。将分离的PBMC以1×105细胞/孔接种于96-孔组织培养平板中。随后用稀释的试验抗体将PBMC预处理30min。将葡萄球菌肠毒素B(SEB)以100ng/ml的终浓度加入细胞培养基中。最终试验体积为200μl/孔。将细胞培养96hr，并且收集培养上清液。通过ELISA检测了上清液中的IL-2细胞因子产生。结果显示于图14中。
实施例7：其他抗-EGFR/PD-L1串联免疫球蛋白(FIT-Ig)的构建、表达和纯化
按照之前实施例中所述的，构建了对EGFR和PD-L1具有特异性的新FIT-Ig。这些示例性FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表26中。表27提供了每个FIT-Ig在293E细胞中的表达水平和SEC特征。
表26.其他示例性的针对EGFR和PD-L1的FIT-Ig的氨基酸序列
表27.SEC特征/293E细胞中的表达水平：
SEC特征和表达数据表明，通过改变PD-L1抗体序列，FIT012d呈现出优于FIT012b的纯度。
对于这两个抗体的功能结合数据提供于以下的表28和表29中。数据表明亲和力没有受到改变IgG恒定序列的影响，但可以通过在上结构域中放置特定的Fab来提高。
表28.FIT012b的功能结合数据
表29.FIT012d的功能结合数据
还进行了FIT012b和FIT012d的多重结合研究。结果显示于图15(FIT012b)和图16A至图16B(FIT012d)中。
实施例8：抗-cMet/EGFR串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的构建、表达和纯化
按照之前实施例中所述的，构建了对cMet和EGFR具有特异性的新FIT-Ig。这个示例性FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表30中。表31提供了每个FIT-Ig在293E细胞中的表达水平和SEC特征。
表30.针对cMet和EGFR的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表31.SEC特征/293E细胞中的表达水平
FIT-Ig SEC中的单体％ 表达水平(mg/L)
FIT013a 98.48％ 22
稳定性数据
通过SEC-HPLC方法评价了FIT013a的存储稳定性，并且结果显示于表32中。通过冻/融循环一次、两次或三次来处理样品，由SEC-HPLC曲线没有观察到聚集或降解。将样品在4℃、25℃或40℃下处理1天、3天或7天，由SEC-HPLC曲线没有观察到聚集或降解。
表32.FIT013a的存储稳定性
样品名称 相对面积％ 相对面积％ 相对面积％
agg mono clip
FIT013a_D0 2.95 97.05 n.a.
FIT013a_F/T1 3.26 96.74 n.a.
FIT013a_F/T2 3.38 96.62 n.a.
FIT013a_F/T3 3.47 96.53 n.a.
FIT013a_4C-D1 3.56 96.44 n.a.
FIT013a_25C-D1 3.66 96.34 n.a.
FIT013a_40C-D1 3.72 96.22 0.06
FIT013a_4C-D3 3.63 96.37 n.a.
FIT013a_25C-D3 3.65 96.35 n.a.
FIT013a_40C-D3 3.76 96.16 0.08
FIT013a_4C-D7 3.64 96.36 n.a.
FIT013a_25C-D7 3.72 96.28 n.a.
FIT013a_40C-D7 3.95 95.92 0.12
功能研究：FIT013a的基于蛋白质的结合数据提供于以下的表33和表34中。
表33.FIT013a的功能结合数据(人cMet/人EGFR)
表34.FIT013a的功能结合数据(食蟹猴cMet/食蟹猴EGFR)
还进行了FIT013a的多重结合研究。结果显示于图17中。
此外，使用BD FACSVerse，通过流式细胞术测定了FIT013a在癌细胞系中的结合活性。用无胰蛋白酶培养基，将培养物中生长的细胞与烧瓶分离并收集。将收集的细胞在含有2％FBS的PBS缓冲液中洗涤。随后将细胞等分并用1:5连续稀释的FIT013a在冰上孵育1hr。FIT013a的起始工作浓度为20μg/ml。将细胞洗涤、重悬浮并用1:100稀释的Alexa 488标记的小鼠抗人IgG1(Invitrogen，目录号No.A-10631)在冰上避光孵育1hr。将细胞洗涤，并根据制造商的实验方案，用BD FACSVerse流式细胞仪检测信号。
这些实验证明了FIT013a可以结合许多癌细胞系，如NCI-H1993、HCC827、MKN-45、SGC-7901、EBC-1、A549、KP4、NCI-H292、NCI-H1975等。每个细胞系的几何平均荧光强度(MFI)和EC50列于表35中。
表35.FIT013a的基于细胞的结合数据
细胞系 MFI EC50(nM)
NCI-H1993 447 37.14
HCC827 2000 41.33
MKN-45 2050 8.89
SGC-7901 590 2.53
EBC-1 6000 1.5
A549 1000 0.62
KP4 345 0.31
NCI-H292 920 0.58
HCI-H1975 507 -
此外，进行了FACS分析来测量FIT013a与膜c-Met和EGFR的双重结合，来显示其多重结合活性。
在这个分析中使用了几个细胞系。MKN-45(人胃腺癌细胞)表达高水平的c-Met和低水平的EGFR。SGC-7901(人胃癌)表达高水平的EGFR和低水平的c-Met。NCI-H1975(人非小细胞肺癌)表达相等水平的c-Met和EGFR。
用无胰蛋白酶的培养基，将培养物中生长的细胞与烧瓶分离并收集。将收集的细胞在含有2％FBS的PBS缓冲液中洗涤。将细胞等分并用连续稀释的FIT013a或FIT013a-Fab在冰上孵育1hr。随后将细胞洗涤并用1μg/ml生物素化的人c-MET或生物素化的EGFR在冰上孵育1hr。将细胞重悬浮并用4μg/ml Alexa 488标记的链霉亲和素(Invitrogen，目录号No S32354)在冰上避光孵育1hr。将细胞洗涤，并根据制造商的实验方案，用BDFACSVerse流式细胞仪检测信号。
当细胞膜表达水平c-Met比EGFR高得多(例如，在MKN-45细胞上)时，FIT013a和FIT013a-Fab的c-Met结合位点可以被膜c-Met占据，通过生物素化的EGFR可以检测FIT013a和FIT013a-Fab的游离EGFR结合位点。当细胞膜表达水平EGFR比c-Met高得多(例如，在SGC-7901上)时，FIT013a和FIT013a-Fab的EGFR结合位点可以被膜EGFR占据，通过生物素化的c-Met可以检测FIT013a和FIT013a-Fab的游离c-Met结合位点。当细胞膜表达水平c-Met等于EGFR(例如，在NCI-H1975细胞上)时，FIT013a和FIT013a-Fab的c-Met和EGFR结合位点同时被占据，不能检测到FIT013a和FIT013a-Fab的游离EGFR或c-Met结合位点。如图18A至图18C中证明的，FIT013a和FIT013a-Fab可以同时结合细胞表面上的两种受体c-Met和EGFR。
信号传导试验：接着，使用FIT013a来抑制细胞中HGF诱导的AKT磷酸化。将NCI-H292细胞以2×105/孔涂布于96孔平板中，并且实施血清饥饿过夜。将连续稀释的FIT013a或其他相关Ab加入平板中并孵育30min，并随后将40ng/ml HGF加入试验平板中5min。将细胞溶解，通过ERK磷酸-T202/Y204试剂盒(Cisbio，目录号：64AKSPEG)来检测AKT磷酸化。实验证明，对于中和NCI-H292细胞中HGF诱导的AKT磷酸化，FIT013a显示出优于mAb组合的活性。FIT013a抑制80％的AKT磷酸化，而EGFR和c-Met抗体组合抑制60％的AKT磷酸化，参见图19。
激动剂试验：通过AKT磷酸化测定了FIT013a中c-Met、EGFR抗体的激动剂效应。将NCI-H441细胞以2×105/孔涂布于96孔平板中，并且血清饥饿过夜。将连续稀释的FIT013a或其他相关Ab加入平板中并孵育30min。将细胞溶解，并通过ERK磷-T202/Y204试剂盒(Cisbio，目录：64AKSPEG)检测了AKT磷酸化。如图20中显示的，实验证明，FIT013a在HGF不存在下显示出弱的激动剂效应。
受体耗竭研究：测定了FIT013a以观察其是否可以耗竭细胞膜上的c-Met和EGFR。用H441细胞在37℃下孵育c-Met抗体、EGFR抗体和FIT013a超过16hr，并且随后通过FACS检测了细胞表面上剩余的EGFR和c-Met。结果表明，FIT013a可以耗竭接近70％的细胞膜c-Met和EGFR，高于c-Met抗体或EGFR抗体，参见表36。
表36.FIT013a引起的受体耗竭
大鼠PK研究：这个研究的目的是为了评价SD大鼠中单次静脉内(IV)或皮下(SC)给药后FIT013a(c-met/EGFR)的药代动力学。对于IV和SC给药，将试验物质FIT013a(c-met/EGFR)以2.3mg/mL(批号：160408001)溶解(在10mM柠檬酸钠，50mM NaCl，pH6.0中)。总共8只雄性SD大鼠，大约195-208g体重，购自SLAC Laboratory Animal Co.LTD.，具有Qualification No.：SCXK(SH)2008001659659，用于此研究中。按照表37设计给药和取样。
表37.给药和取样设计
经由足背静脉注射给药IV剂量，并且经由皮下注射给药SC剂量。在指定的时间点，手动固定动物，并且经由尾静脉刺穿或心脏穿刺，将大约240μL血液/时间点收集至试管中。将血样在室温下放置0.5hr。随后将血样离心(10000g，4℃下5min)，以获得血清样品。将血清样品立即存储在-80℃下，直至分析。分别使用c-Met和EGFR蛋白，通过ELISA检测了样品。针对IV和SC研究，FIT013a(c-met/EGFR)在大鼠血清中的浓度-时间数据列于表38至表41中，并且举例说明于图21A至图21D中。
表38.雄性SD大鼠中5mg/kg的IV给药后FIT013a(c-met/EGFR)的血清浓度-时间数据和药物动力学参数(c-met平板)
表39.雄性SD大鼠中5mg/kg的SC给药后FIT013a(c-met/EGFR)的血清浓度-时间数据和药物动力学参数(c-met平板)
*：由于抗药物抗体的可能性，从平均值和PK参数计算中排除这些时间点的血清浓度。
表40.雄性SD大鼠中5mg/kg的IV给药后FIT013a(c-met/EGFR)的血清浓度-时间数据和药物动力学参数(EGFR平板)
表41.雄性SD大鼠中5mg/kg的SC给药后FIT013a(c-met/EGFR)的血清浓度-时间数据和药物动力学参数(EGFR平板)
*：由于抗药物抗体的可能性，从平均值和PK参数计算中排除这些时间点的血清浓度。
NCI-H1975-HGF异种移植模型肿瘤分布研究
在这个研究中，在带有NCI-H1975-HGF肿瘤的BALB/c裸鼠中，在单次IP给药后24hr，测量了FIT013a的血清和肿瘤浓度。
将NCI-H1975-HGF细胞皮下接种至BALB/c裸鼠中。当平均肿瘤体积达到200-250mm3时，将小鼠随机分配成四组，FIT013a、H1332,Panitumumab和溶媒组。FIT013a组单次IP给药，16mg/kg；H1332或Panitumumab单次IP给药，10mg/kg。溶媒组用配制缓冲液10mM柠檬酸钠、50mM NaCl，pH6.0给药。给药后24hr，收集肿瘤和血清。将肿瘤均质化，并收集上清液，用于之后的ELISA研究。对于血清和肿瘤，通过使用一般hIgG ELISA，定量了FIT013a、Panitumumab和H1332。
实验证明,FIT013a显示出与单克隆抗体相当的血清和肿瘤分布活性，参见图22。
NCI-H1975-HGF异种移植模型功效研究
在这个研究中，在NCI-H1975-HGF异种移植模型中测量了FIT013a的功效。
将NCI-H1975-HGF细胞皮下接种至BALB/c裸鼠中。当平均肿瘤体积达到100-130mm3，并且最大肿瘤体积小于140mm3时，将小鼠随机分配成四组，FIT013a、H1332、Panitumumab和溶媒组。将抗体i.p.给药两次/周，持续三周。FIT013a的剂量为16mg/kg，H1332或Panitumumab为10mg/kg。溶媒组用配制缓冲液10mM柠檬酸钠、50mM NaCl，pH6.0给药。每周测量肿瘤体积和小鼠体重两次。将肿瘤生长抑制百分比(％TGI)定义为对照处理组平均肿瘤体积(MTV)和试验抗体处理组MTV之间的差异。
实验证明，FIT013a显示出优于EGFR或c-Met单克隆Ab的功效，参见图23。
实施例9：抗因子IXa/因子X串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的研究
按照之前的实施例，构建了对因子IXa和因子X具有特异性的FIT-Ig。示例性的FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表42中。表43提供了每个FIT-Ig在293E细胞中的表达水平以及SEC特征。
表42.针对cMEt和EGFR的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表43.SEC特征/293E细胞中的表达水平：
功能研究
通过表面等离子体共振的亲和力测量：在25℃下，使用HBS-EP(10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20)，使用Biacore X100仪器(BiacoreAB，Uppsala，瑞典)，通过表面等离子体共振测定了FIT-Ig结合hFactor IX和hFactor X(Enzyme Research Laboratory)的动力学。简而言之，根据制造商的说明，使用标准胺偶联试剂盒，将山羊抗人IgG Fc片段特异性多克隆抗体(Pierce Biotechnology Inc，Rockford，IL)直接固定在CM5研究级生物传感器芯片上。将纯化的FIT-Ig样品在HEPES缓冲盐水中稀释用于在山羊抗人IgG Fc特异性反应表面上的捕获，并以5μl/min的流速注射在反应基质上。在30μL/min的连续流速下，测定了结合和解离速率常数，kon(M-1S-1)和koff(s-1)。通过在500nM抗原浓度下进行动力学结合测量来获得速率常数。随后通过以下公式：KD＝koff/kon，从动力学速率常数计算FIT-Ig和靶标蛋白之间反应的平衡解离常数(M)。同时还将等份的抗原样品注射在空白参照和反应CM表面上，来记录和扣除任何非特异性结合背景，从而消除大部分的折射率变化和注射噪音。以10μL/min流速用相继两个25ml的10mM甘氨酸(pH1.5)注射，使表面再生。将抗Fc抗体固定的表面完全再生并在十二循环内保留其完全捕获能力。针对FIT014a的基于蛋白质的结合数据提供于以下表44中。
表44.FIT014的功能结合数据
因子VIIIa样活性试验：根据BIOPHEN FVIII:C试剂盒(Hyphen-Biomed，221402-RUO)的制造商说明，通过酶试验，评价了FIT-Ig的FVIIa-样活性。结果表明，FIT014a与Emicizumab和纯化的FVIIIa具有相当的FVIIIa样活性，而因子IX和因子X的单克隆抗体及其组合不具有活性，参见图24。
多抗原结合研究：使用OctetRed进行了这个研究，以确定FIT014a是否能够同时结合hFactor IX和hFactor X。简而言之，将FIT014a以10μg/ml的浓度固定于AR2G传感器上，接着在试验缓冲液(PBS pH7.4，0.1％BSA，0.02％Tween)中结合hFactor IX以及随后结合hFactor X(Enzyme Research Laboratory)，其中使用500nM的浓度。在实验结束时，在pH1.5下，用10mM甘氨酸，将表面再生五次。这个实验表明，已经结合hFactor IX后FIT014a能够结合hFactorX，表明FIT014a能够同时结合hFactor IX和hFactor X，参见图25。
稳定性研究：将柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.0)中的FIT014a蛋白样品在4℃、25℃和40℃下分别孵育1天、3天或7天。相似地，将FIT014a蛋白样品冻融一次、两次或三次。通过SEC-HPLC检测所有样品的完整全单体蛋白的级分，其中将每种蛋白质10μg样品以0.3mL/min流速注入配备了Superdex200 5/150GL的Utimate 3000 HPLC中15分钟，使用制造商供应的Chromeleon软件记录和分析数据。表45显示在这些热攻击条件下，FIT014a保留了完整全单体分子。
表45.FIT014的存储稳定性
样品名称 相对面积％ 相对面积％ 相对面积％
1 2 3
FIT014_D0 6.28 93.32 0.40
FIT014_F/T1 6.86 92.25 0.89
FIT014-F/T2 6.72 92.36 0.93
FIT014_F/T3 6.80 92.03 1.16
FIT014_4C-D1 6.19 93.51 0.30
FIT014_25C-D1 6.81 92.24 0.95
FIT014_40C-D1 6.60 92.36 1.04
FIT014_4C-D3 6.63 92.42 0.95
FIT014_25C-D3 6.92 92.02 1.07
FIT014_40C-D3 6.60 92.15 1.25
FIT014_4C-D7 6.68 92.45 0.87
FIT014_25C-D7 6.58 92.39 1.03
FIT014_40C-D7 6.94 91.74 1.32
大鼠PK研究：将FIT014a进行大鼠中的PK研究，并且结果显示于图26和表46中。通过ELISA检测了大鼠血清样品中的抗体浓度，使用62.5ng/mL的LLQQ。在hIgG平板上，包被蛋白是抗hIgG Fc，并且检测抗体是抗hIgG Fab。在因子X平板上，包被蛋白是hFactorX，而检测抗体是抗人IgG Fc。
表46.FIT014a的大鼠PK数据
实施例10：抗-HER3/IGF-1R串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的研究
按照之前的实施例，构建了对HER3和IGF-1R具有特异性的FIT-Ig。示例性的FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表47中。表48提供了在293E细胞中的表达水平以及FIT-Ig的SEC特征。
表47.针对HER3和IGF-1R的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表48.SEC特征/293E细胞中的表达水平：
功能研究
功能结合研究：FIT016a的功能结合数据提供于以下的表49中。
表49.功能结合数据
多重抗原结合研究：使用OctetRed进行了这个研究，以确定FIT016a是否能够同时结合Her3和IGF1R。这个实验表明，已经结合IGF1R后FIT016a能够结合Her3，表明FIT016a能够同时结合Her3和IGF-1R，参见图27。
实施例11：抗DLL4/VEGF串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的研究
按照之前的实施例，构建了对DLL4和IGF1R具有特异性的FIT-Ig。示例性的FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表50中。表51提供了在293E细胞中的表达水平以及FIT-Ig的SEC特征。
表50.针对HER3和IGF-1R的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表51.SEC特征/293E细胞中的表达水平：
FIT-Ig SEC中的单体％ 表达水平(mg/L)
FIT017a >82％ 2.2
功能研究
功能结合研究：FIT017a的功能结合数据提供于以下的表52中。
表52.功能结合数据
多重抗原结合研究：使用OctetRed进行了这个研究，以确定FIT017a是否能够同时结合DLL4和VEGF。这个实验表明，已经结合VEGF后FIT017a能够结合DLL4，表明FIT016a能够同时结合DLL4和VEGF，参见图28。
实施例12：抗CD20/CD3串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的研究
按照之前的实施例，构建了对CD20和CD3具有特异性的FIT-Ig。示例性的FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表53中。表54提供了在293E细胞中的表达水平以及FIT-Ig的SEC特征。
表53.针对CD20和CD3的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表54.SEC特征/293E细胞中的表达水平：
FIT-Ig SEC中的单体％ 表达水平(mg/L)
FIT017a 97.03％ 7.8
功能研究：
功能结合研究：FIT018a的功能结合研究提供于以下的表55中。
表55.功能结合数据
基于细胞的结合研究：使用BD FACSVerse，通过流式细胞术测定了FIT018a对人或食蟹猴B细胞和T细胞的结合活性。将Raji细胞用于检测人B细胞结合。将Jurakt细胞用于检测人T细胞结合。将原代食蟹猴T细胞用于检测食蟹猴T细胞结合。将瞬时转染了cynoCD20的HEK293细胞用于检测食蟹猴B细胞结合。将细胞在含有2％FBS的PBS缓冲液中洗涤。随后将细胞等分，并且用1:5连续稀释的FIT018a在冰上孵育1hr。FIT018a的起始工作浓度为20μg/ml。将细胞洗涤、重悬浮并用1:100稀释的Alexa 488标记的小鼠抗人IgG1(Invitrogen，目录号No.A-10631)在冰上避光孵育1hr。将细胞洗涤，并根据制造商的实验方案，用BD FACSVerse流式细胞仪检测信号。这些实验证明，FIT018a可以结合人B细胞和T细胞(Raji是人B细胞系，而Jurkat是人T细胞系)，参见图29A和图29B。FIT018a还可以结合食蟹猴CD20和CD3，参见图30A和图30B。
B细胞耗竭试验：通过B细胞耗竭试验，测量了FIT018a的体外活性。根据制造商的说明，通过Ficoll Paque Plus(GE HEALTHCARE，目录号：GE17144002)分离了人PBMC。收集靶细胞Raji，并以5×104/孔接种于试验平板。将抗体连续稀释，并加入试验平板中。将每孔2.5×105PBMC加入试验平板中并孵育2天或3天。孵育后，使用FACS仪器，通过抗CD19抗体，检测了B细胞。实验证明，FIT018a可以诱导B细胞凋亡，参见图31A和图31B。
实施例13：抗HER3/EGFR串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的研究
按照之前的实施例，构建了对HER3和EGFR具有特异性的FIT-Ig。示例性FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表56中。表57提供了在293E细胞中的表达水平和FIT-Ig的SEC特征。
表56.针对HER3和EGFR的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表57.SEC特征/293E细胞中的表达水平：
FIT-Ig SEC中的Monomer％ 表达水平(mg/L)
FIT019a >86％ 15.6
FIT019b 96.7％ 10.2
功能研究
功能结合研究：针对FIT019a和FIT019b的功能结合数据分别提供于以下的表58和表59中。
表58.FIT019a的功能结合数据
表59.FIT019b的功能结合数据
多重结合研究：进行了FIT019a和FIT019b的多重结合研究。结果分别显示于图32(FIT019a)和图33A至图33B(FIT019b)中。结果表明FIT019a和FIT019b都能同时结合HER3和EGFR。
实施例14：抗PD-L1/PD-1串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的研究
按照之前的实施例，构建了对PD-L1和PD-1具有特异性的FIT-Ig。示例性FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表60中。表61提供了在293E细胞中的表达水平和FIT-Ig的SEC特征。
表60.针对PD-L1和PD-1的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表61.SEC特征/293E细胞中的表达水平
FIT-Ig SEC中的单体％ 表达水平(mg/L)
FIT020b 100％ 6.2
功能研究
通过表面等离子体共振的亲和力测量：在25℃下，使用HBS-EP(10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20)，使用Biacore X100仪器(BiacoreAB，Uppsala，瑞典)，通过表面等离子体共振测定了FIT-Ig结合rhPD-L1和rhPD-1的动力学。简而言之，根据制造商的说明，使用标准胺偶联试剂盒，将rhPD-L1和rhPD-1以40RU直接固定在CM5研究级生物传感器芯片上。通过在1至40nM范围的七个不同抗原浓度下进行动力学结合测量来获得速率常数。随后通过以下公式：KD＝koff/kon，从动力学速率常数计算FIT-Ig和靶标蛋白之间反应的平衡解离常数(M)。同时还将等份的FIT-Ig/Ab样品注射到空白参照和反应CM表面上，来记录和扣除任何非特异性结合背景，从而消除大部分的折射率变化和注射噪音。用相继两个25ml的10mM甘氨酸(pH1.5)以10μL/min流速注射，使表面再生。FIT020b的功能结合数据提供于以下的表62中。
表62.功能结合数据
通过MLR试验的功能活性测定：使用来自一个供体的单核细胞衍生的树突细胞和来自另一个供体的同种异体CD4T细胞，进行了混合淋巴细胞反应。从健康供体收集全血样品，并且使用Ficoll-Pague梯度离心，从全血分离PBMC。在第1天，从一个供体分离PBMC并用无血清RPMI 1640稀释至1×106/ml。将稀释的PBMC以3ml/孔接种于6-孔组织培养平板中并孵育3h。除去上清液并洗掉未贴壁的细胞。在含有10％FBS的RPMI 1640中用250U/ml IL-4和500U/ml GM-CSF，将贴壁的单核细胞极化成树突细胞。在第4天，用新鲜IL-4和GM-CSF替代培养基。在第7天，收集未成熟的DC并在含有10％FBS的RPMI 1640中用1μg/ml LPS再处理24h用于成熟。在第8天，通过负向选择从另一个供体PBMC分离CD4T细胞，并且调节至2×106细胞/ml的终浓度。用丝裂霉素C在37℃下处理成熟DC 1.5hr。随后用PBS洗涤DC，并调节至1×106细胞/ml的终浓度。将100μl/孔的CD4T细胞(应答者细胞)加入96孔平板中并用稀释浓度的试验抗体预处理30分钟。随后将100μl/孔的成熟DC(刺激者细胞)加入孔中。每个孔的终体积为200μl。对于IL-2测定试验，将MLR在37度下孵育72hr。结果显示于图34A和图34B中。
多重结合研究：进行了FIT020b的多重结合研究。结果显示于图35中。结果表明FIT020b可以同时结合PD-L1和PD-1。
实施例15：抗CD20/CD-22串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的研究
按照之前的实施例，构建了对CD20和CD22具有特异性的FIT-Ig。示例性FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表63中。表64提供了在293E细胞中的表达水平和FIT-Ig的SEC特征。
表63.针对CD20和CD22的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表64.SEC特征/在293E细胞中的表达水平
FIT-Ig SEC中的单体％ 表达水平(mg/L)
FIT021b 100％ 4.9
功能研究
基于细胞的结合研究：使用BD FACSVerse，通过流式细胞术，测定了FIT021b与B淋巴瘤细胞系Raji或Daudi的结合活性。将细胞在含有2％FBS的PBS缓冲液中洗涤。随后将细胞等分并用1:5连续稀释的FIT021b在冰上孵育1hr。FIT021b的起始工作浓度为20μg/ml。将细胞洗涤，重悬浮，用1:100稀释的Alexa 488标记的小鼠抗人IgG1(Invitrogen，目录No.A-10631)在冰上避光孵育1hr。将细胞洗涤，并根据制造商的实验方案，用BDFACSVerse流式细胞仪检测信号。这个实验证明，FIT021b可以结合B淋巴瘤细胞系Raji或Daudi，参见图36A和图36B。
实施例16：抗HER3/PD-1串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的研究
按照之前的实施例，构建了对HER3和PD1具有特异性的FIT-Ig。示例性FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表65中。表66提供了在293E细胞中的表达水平和FIT-Ig的SEC特征。
表65.针对HER3和PD-1的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表66.SEC特征/在293E细胞中的表达水平
FIT-Ig SEC中的单体％ 表达水平(mg/L)
FIT022a 100％ 1.6
功能研究
通过表面等离子体共振的亲和力测量：通过表面等离子体共振测定了FIT022a-Ig结合Her3-his和hPD-1-Fc的动力学。结果显示于表67中。
表67.FIT022a的功能结合数据
多重结合研究：进行了FIT022a的多重结合研究。结果显示于图37中。结果表明FIT022a可以同时结合PD-L1和PD-1。
MLR功能试验：使用来自一个供体的单核细胞衍生的树突细胞和来自另一个供体的同种异体CD4T细胞，进行了混合淋巴细胞反应。从健康供体收集全血样品，并且使用Ficoll-Pague梯度离心从全血分离PBMC。在第1天，从一个供体分离PBMC并用无血清RPMI1640稀释至1×106/ml。将稀释的PBMC以3ml/孔接种于6-孔组织培养平板中并孵育3h。除去上清液并洗掉未贴壁的细胞。在含有10％FBS的RPMI 1640中用250U/ml IL-4和500U/mlGM-CSF，将贴壁的单核细胞极化成树突细胞。在第4天，用新鲜IL-4和GM-CSF替代培养基。在第7天，收集未成熟的DC并在含有10％FBS的RPMI 1640中用1μg/ml LPS再处理24h，用于成熟。在第8天，通过负向选择从另一个供体PBMC分离CD4T细胞，并且调节至2×106细胞/ml的终浓度。用丝裂霉素C在37℃下处理成熟DC 1.5hr。随后用PBS洗涤DC，并调节至1×106细胞/ml的终浓度。将100μl/孔的CD4T细胞(应答者细胞)加入96孔平板中并用稀释浓度的试验抗体预处理30分钟。随后将100μl/孔的成熟DC(刺激者细胞)加入孔中。每个孔的终体积为200μl。使用ELISA，将MLR在37度下孵育72hr(对于IL-2测定试验)或120hr(对于IFN-γ测定试验)。结果显示于图38A和图38B中。
实施例17：抗cMet/PD-L1串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的研究
按照之前的实施例，构建了对cMet和PD-L1具有特异性的FIT-Ig。示例性FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表68中。表69提供了在293E细胞中的表达水平和FIT-Ig的SEC特征。
表68.针对cMet和PD-L1的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表69.SEC特征/在293E细胞中的表达水平
FIT-Ig SEC中的单体％ 表达水平(mg/L)
FIT023a 97.49％ 5.94
功能研究
通过表面等离子体共振的亲和力测量：通过表面等离子体共振，测定了FIT023a-Ig结合cMet和PD-L1的动力学。结果显示于表70中。
表70.FIT023a的功能结合数据
多重结合研究：进行了FIT023a的多重结合研究。结果显示于图39A和图39B中。结果表明FIT023a可以同时结合cMet和PD-L1。
实施例18：抗BTLA/PD-1串联Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的研究
按照之前的实施例，构建了对BTLA和PD-L1具有特异性的FIT-Ig。这个示例性的FIT-Ig及其相应的序列提供于以下的表71中。表72提供了在293E细胞中的表达水平和FIT-Ig的SEC特征。在一步蛋白A纯化后，FIT024a和FIT024b都具有良好的纯度。
表71.针对BTLA和PD-1的其他示例性FIT-Ig的氨基酸序列
表72.SEC特征/在293E细胞中的表达水平：
FIT-Ig SEC中的单体％ 表达水平(mg/L)
FIT024a 99.68％ 9.3
FIT024b 98.61％ 13.0
功能研究
通过表面等离子体共振的亲和力测量：通过表面等离子体共振测定了FIT024a-Ig和FIT024b-Ig与BTLA4和PD-1结合的动力学。结果显示于表73中。
表73.FIT024a和FIT024b的功能结合数据
多重结合研究：进行了FIT024a和FIT024b的多重结合研究。结果显示于图40A至图40B和图41A至图41B中。结果表明FIT024a和FIT024b都可以同时结合BTLA4和PD-1。
MLR功能试验：使用来自一个供体的单核细胞衍生的树突细胞和来自另一个供体的同种异体CD4T细胞，进行了混合淋巴细胞反应。从健康供体收集全血样品，并且使用Ficoll-Pague梯度离心从全血分离PBMC。在第1天，从一个供体分离PBMC并用无血清RPMI1640稀释至1×106/ml。将稀释的PBMC以3ml/孔接种于6-孔组织培养平板中并孵育3h。除去上清液并洗掉未贴壁的细胞。在含有10％FBS的RPMI 1640中用250U/ml IL-4和500U/mlGM-CSF，将贴壁的单核细胞极化成树突细胞。在第4天，用新鲜IL-4和GM-CSF替代培养基。在第7天，收集未成熟的DC并在含有10％FBS的RPMI 1640中用1μg/ml LPS再处理24h，用于成熟。在第8天，通过负向选择从另一个供体PBMC分离CD4T细胞，并且调节至2×106细胞/ml的终浓度。用丝裂霉素C在37℃下处理成熟DC 1.5hr。随后用PBS洗涤DC，并调节至1×106细胞/ml的终浓度。将100μl/孔的CD4T细胞(应答者细胞)加入96孔平板中并用稀释浓度的试验抗体预处理30分钟。随后将100μl/孔的成熟DC(刺激者细胞)加入孔中。每个孔的终体积为200μl。对于IL-2测定试验，将MLR在37度下孵育72hr。结果显示于图42A和图42B中。与Nivolumab(纳武单抗)相比，FIT024a和FIT024b在MLR研究中都具有更高的增强T细胞激活的活性。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和授权专利以引用的方式并入本文中，就如同特定地并且个别地指示将每一个出版物、专利申请或授权专利以引用的方式整体并入一般。
除非另外限定，本文中的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文中描述了优选的方法和材料，但与本文中所述的那些相似或相等的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试。
在此讨论的出版物仅因其公开早于本申请的申请日而提供。本文无一处应被理解为承认本发明无权基于在先发明而先于此类出版物。
尽管已经结合其特定的实施方案描述了本发明，但将理解能够对其做进一步改变，并且本申请旨在涵盖基于一般本发明原理的任何变化、用途或适应性改变，包括根据本发明所属领域内的已知或惯常实践而对本公开的偏离，这样的偏离可以应用于前文中所列的必要技术特征，并且这样的偏离落入所附权利要求范围中。

Claims (99)

1.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链从N-至C-末端顺序包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT013a相同的c-Met表位和相同的c-Met表位，其中双特异性结合蛋白FIT013a包含：包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:249的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列的第三多肽链。
2.权利要求87的双特异性抗体，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:242的VLACDR1，SEQ ID NO:243的VLA CDR2和SEQ ID NO:244的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:246的VHB CDR1、SEQ ID NO:247的VHB CDR2和SEQ ID NO:248的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:251的VHA CDR1、SEQ ID NO:252的VHA CDR2和SEQ ID NO:253的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:256的VLB CDR1、SEQ ID NO:257的VLB CDR2和SEQ ID NO:258的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB，在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:242的VLA CDR1、SEQ ID NO:243的VLA CDR2和SEQID NO:244的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:246的VHB CDR1、SEQ ID NO:247的VHB CDR2和SEQ ID NO:248的VHB CDR3，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:251的VHACDR1、SEQ ID NO:252的VHA CDR2和SEQ ID NO:253的VHA CDR3；和其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:256的VLB CDR1、SEQ ID NO:257的VLB CDR2和SEQ ID NO:258的VLB CDR3。
3.权利要求87的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:241的序列的VLA和具有SEQ ID NO:245的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:250的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:255的序列的VLB。
4.权利要求87的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:249的氨基酸序列的第二多肽链和包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列的第三多肽链。
5.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一条多肽链从N-至C-末端顺序包括(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合表皮生长因子受体(EGFR)上的一个或多个表位，和结合程序化死亡配体1(PD-L1)上的一个或多个表位。
6.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链从N-至C-末端顺序包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合人表皮生长因子受体3(Her3)上的一个或多个表位，和结合***1受体(IGF-1R)上的一个或多个表位。
7.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链从N-至C-末端顺序包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合δ样4(DLL4)上的一个或多个表位，和结合血管内皮生长因子(VEGF)上的一个或多个表位。
8.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链从N-至C-末端顺序包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合人表皮生长因子受体3(Her3)上的一个或多个表位，和结合表皮生长因子受体(EGFR)上的一个或多个表位。
9.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链从N-至C-末端顺序包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合程序化细胞死亡1(PD-1)上的一个或多个表位，和结合程序化死亡配体1(PD-L1)上的一个或多个表位。
10.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链从N-至C-末端顺序包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合人表皮生长因子受体3(Her3)上的一个或多个表位，和结合程序化细胞死亡1(PD-1)上的一个或多个表位。
11.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链从N-至C-末端顺序包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合间充质上皮转移因子(c-Met)上的一个或多个表位，和结合程序化死亡配体1(PD-L1)上的一个或多个表位。
12.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链从N-至C-末端顺序包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合B和T淋巴细胞相关蛋白(BTLA)上的一个或多个表位，和结合程序化死亡1(PD-1)上的一个或多个表位。
13.权利要求5至权利要求12任一项的结合蛋白，其中结合蛋白包含三条多肽链，其中第二多肽链包含VHA和CH1，或VLB和CL，并且其中第三多肽链包含VLB和CL，或VHA和CH1。
14.权利要求5至权利要求12任一项的结合蛋白，其中结合蛋白包含两条多肽链，并且其中第二多肽链包含VHA、CH1、VLB和CL，或VLB、CL、VHA和CH1。
15.权利要求5的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT012b相同的EGFR表位和相同的PD-L1表位，其中双特异性结合蛋白FIT012b包含：包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的第三多肽链。
16.权利要求15的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中VLA包含SEQ ID NO:204的VLA CDR1、SEQID NO:205的VLA CDR2和SEQ ID NO:206的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中VHB包含SEQ ID NO:208的VHB CDR1、SEQID NO:209的VHB CDR2和SEQ ID NO:210的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中VHA包含SEQ ID NO:213的VHA CDR1、SEQ ID NO:214的VHA CDR2和SEQ ID NO:215的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中VLB包含SEQ ID NO:218的VLB CDR1、SEQID NO:219的VLB CDR2和SEQ ID NO:220的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中VLA包含SEQ ID NO:204的VLA CDR1、SEQ ID NO:205的VLA CDR2和SEQ ID NO:206的VLA CDR3，VHB包含SEQ ID NO:208的VHB CDR1、SEQ ID NO:209的VHB CDR2和SEQ ID NO:210的VHB CDR3，VHA包含SEQ ID NO:213的VHA CDR1、SEQ ID NO:214的VHA CDR2和SEQ ID NO:215的VHA CDR3，以及VLB包含SEQ ID NO:218的VLB CDR1、SEQ ID NO:219的VLB CDR2和SEQID NO:220的VLB CDR3。
17.权利要求15的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:203的序列的VLA和具有SEQ ID NO:207的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:212的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:217的序列的VLB。
18.权利要求15的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，第一多肽链包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列；第二多肽链包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列；和第三多肽链包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列。
19.权利要求5的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白能够结合与双特异性蛋白FIT012d相同的EGFR表位和相同的PD-L1表位，其中双特异性结合蛋白FIT012d包含：包含SEQ IDNO:221的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列的第三多肽链。
20.权利要求19的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:223的VLACDR1、SEQ ID NO:224的VLA CDR2和SEQ ID NO:225的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:227的VHB CDR1、SEQ ID NO:228的VHB CDR2和SEQ ID NO:229的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:232的VHA CDR1、SEQ ID NO:233的VHA CDR2和SEQ ID NO:234的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:237的VLB CDR1、SEQ ID NO:238的VLB CDR2和SEQ ID NO:239的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:223的VLA CDR1、SEQ ID NO:224的VLA CDR2和SEQID NO:225的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:227的VHB CDR1、SEQ ID NO:228的VHB CDR2和SEQ ID NO:229的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:232的VHACDR1、SEQ ID NO:233的VHA CDR2和SEQ ID NO:234的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:237的VLB CDR1、SEQ ID NO:238的VLB CDR2和SEQ ID NO:239的VLB CDR3。
21.权利要求19的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:222的序列的VLA和具有SEQ ID NO:226的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:231的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:236的序列的VLB。
22.权利要求19的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列的第三多肽链。
23.权利要求6的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT016a相同的Her3表位和相同的IGF-1R表位，其中双特异性结合蛋白FIT016a包含：包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:287的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列的第三多肽链。
24.权利要求23的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:280的VLACDR1，SEQ ID NO:281的VLA CDR2和SEQ ID NO:282的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:284的VHB CDR1、SEQ ID NO:285的VHB CDR2和SEQ ID NO:286的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:289的VHA CDR1、SEQ ID NO:290的VHA CDR2和SEQ ID NO:291的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:294的VLB CDR1、SEQ ID NO:295的VLB CDR2和SEQ ID NO:296的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:280的VLA CDR1，SEQ ID NO:281的VLA CDR2和SEQID NO:282的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:284的VHB CDR1、SEQ ID NO:285的VHB CDR2和SEQ ID NO:286的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:289的VHACDR1、SEQ ID NO:290的VHA CDR2和SEQ ID NO:291的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:294的VLB CDR1、SEQ ID NO:295的VLB CDR2和SEQ ID NO:296的VLB CDR3。
25.权利要求23的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:279的序列的VLA和具有SEQ ID NO:283的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:288的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:293的序列的VLB。
26.权利要求23的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:287的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列的第三多肽链。
27.权利要求7的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT017a相同的DLL-4表位和相同的VEGF表位，其中双特异性结合蛋白FIT017b包含:包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:306的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第三多肽链。
28.权利要求27的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:299的VLACDR1，SEQ ID NO:300的VLA CDR2和SEQ ID NO:301的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:303的VHB CDR1、SEQ ID NO:304的VHB CDR2和SEQ ID NO:305的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:308的VHA CDR1、SEQ ID NO:309的VHA CDR2和SEQ ID NO:310的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:313的VLB CDR1、SEQ ID NO:314的VLB CDR2和SEQ ID NO:315的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:299的VLA CDR1，SEQ ID NO:300的VLA CDR2和SEQID NO:301的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:303的VHB CDR1、SEQ ID NO:304的VHB CDR2和SEQ ID NO:305的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:308的VHACDR1、SEQ ID NO:309的VHA CDR2和SEQ ID NO:310的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:313的VLB CDR1、SEQ ID NO:314的VLB CDR2和SEQ ID NO:315的VLB CDR3。
29.权利要求27的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:298的序列的VLA和具有SEQ ID NO:302的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:307的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:312的序列的VLB。
30.权利要求27的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:306的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列的第三多肽链。
31.权利要求8的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT019a相同的Her3表位和相同的EGFR表位，其中双特异性结合蛋白FIT019a包含：包含SEQID NO:335的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:344的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:349的氨基酸序列的第三多肽链。
32.权利要求31的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:337的VLACDR1，SEQ ID NO:338的VLA CDR2和SEQ ID NO:339的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:341的VHB CDR1、SEQ ID NO:342的VHB CDR2和SEQ ID NO:343的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:346的VHA CDR1、SEQ ID NO:347的VHA CDR2和SEQ ID NO:348的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:351的VLB CDR1、SEQ ID NO:352的VLB CDR2和SEQ ID NO:353的VLB CDR3；
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:337的VLA CDR1，SEQ ID NO:338的VLA CDR2和SEQID NO:339的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:341的VHB CDR1、SEQ ID NO:342的VHB CDR2和SEQ ID NO:343的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:346的VHACDR1、SEQ ID NO:347的VHA CDR2和SEQ ID NO:348的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:351的VLB CDR1、SEQ ID NO:352的VLB CDR2和SEQ ID NO:353的VLB CDR3。
33.权利要求31的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:336的序列的VLA和具有SEQ ID NO:340的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:345的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:350的序列的VLB。
34.权利要求31的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:335的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:344的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:349的氨基酸序列的第三多肽链。
35.权利要求8的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT019b相同的Her3表位和相同的EGFR表位，其中双特异性结合蛋白FIT019b包含：包含SEQID NO:354的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:363的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:368的氨基酸序列的第三多肽链。
36.权利要求35的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:356的VLACDR1，SEQ ID NO:357的VLA CDR2和SEQ ID NO:358的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:360的VHB CDR1、SEQ ID NO:361的VHB CDR2和SEQ ID NO:362的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:365的VHA CDR1、SEQ ID NO:366的VHA CDR2和SEQ ID NO:367的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:370的VLB CDR1、SEQ ID NO:371的VLB CDR2和SEQ ID NO:372的VLB CDR3；
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:356的VLA CDR1，SEQ ID NO:357的VLA CDR2和SEQID NO:358的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:360的VHB CDR1、SEQ ID NO:361的VHB CDR2和SEQ ID NO:362的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:365的VHACDR1、SEQ ID NO:366的VHA CDR2和SEQ ID NO:367的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:370的VLB CDR1、SEQ ID NO:371的VLB CDR2和SEQ ID NO:372的VLB CDR3。
37.权利要求35的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:355的序列的VLA和具有SEQ ID NO:359的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:364的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:369的序列的VLB。
38.权利要求35的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:354的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:363的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:368的氨基酸序列的第三多肽链。
39.权利要求9的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT020a或FIT020b相同的PD-1表位和相同的PD-L1表位，其中双特异性结合蛋白FIT020a包含：包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的第三多肽链，以及其中双特异性结合蛋白FIT020b包含：包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:382的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:387的氨基酸序列的第三多肽链。
40.权利要求39的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含(a)SEQ ID NO:389的VLA CDR1，SEQ ID NO:390的VLA CDR2和SEQ ID NO:391的VLA CDR3；或(b)SEQ ID NO:375的VLA CDR1，SEQ ID NO:376的VLA CDR2和SEQ ID NO:377的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含(a)SEQ ID NO:384的VHB CDR1、SEQ ID NO:385的VHB CDR2和SEQ ID NO:386的VHB CDR3；或(b)SEQ ID NO:379的VHB CDR1、SEQ ID NO:380的VHB CDR2和SEQ ID NO:381的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含(a)SEQ ID NO:379的VHA CDR1、SEQ ID NO:380的VHA CDR2和SEQ ID NO:381的VHA CDR3，或(b)SEQ ID NO:384的VHA CDR1、SEQ ID NO:385的VHA CDR2和SEQ ID NO:386的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含(a)SEQ ID NO:375的VLB CDR1、SEQ ID NO:376的VLB CDR2和SEQ ID NO:377的VLB CDR3，或(b)SEQ ID NO:389的VLB CDR1、SEQ ID NO:390的VLB CDR2和SEQ ID NO:391的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中(a)第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:389的VLA CDR1，SEQ ID NO:390的VLA CDR2和SEQ ID NO:391的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:384的VHB CDR1、SEQ IDNO:385的VHB CDR2和SEQ ID NO:386的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:379的VHA CDR1、SEQ ID NO:380的VHA CDR2和SEQ ID NO:381的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:375的VLB CDR1、SEQ ID NO:376的VLB CDR2和SEQ ID NO:377的VLBCDR3；或(b)第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:375的VLA CDR1，SEQ ID NO:376的VLA CDR2和SEQ ID NO:377的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:379的VHB CDR1、SEQ IDNO:380的VHB CDR2和SEQ ID NO:381的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:384的VHA CDR1、SEQ ID NO:385的VHA CDR2和SEQ ID NO:386的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:389的VLB CDR1、SEQ ID NO:390的VLB CDR2和SEQ ID NO:391的VLBCDR3。
41.权利要求39的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含(a)第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:388的序列的VLA和具有SEQ ID NO:383的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:378的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:374的序列的VLB；或(b)第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:374的序列的VLA和具有SEQ ID NO:378的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:383的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:388的序列的VLB。
42.权利要求39的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含(a)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ IDNO:122的氨基酸序列的第三多肽链；或(b)包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:382的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:387的氨基酸序列的第三多肽链。
43.权利要求10的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT022a相同的Her3表位和相同的PD-1表位，其中双特异性结合蛋白FIT022a包含：包含SEQID NO:411的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:420的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:425的氨基酸序列的第三多肽链。
44.权利要求43的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:413的VLACDR1，SEQ ID NO:414的VLA CDR2和SEQ ID NO:415的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:417的VHB CDR1、SEQ ID NO:418的VHB CDR2和SEQ ID NO:419的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:422的VHA CDR1、SEQ ID NO:423的VHA CDR2和SEQ ID NO:424的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:427的VLB CDR1、SEQ ID NO:428的VLB CDR2和SEQ ID NO:429的VLB CDR3；
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:413的VLA CDR1，SEQ ID NO:414的VLA CDR2和SEQID NO:415的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:417的VHB CDR1、SEQ ID NO:418的VHB CDR2和SEQ ID NO:419的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:422的VHACDR1、SEQ ID NO:423的VHA CDR2和SEQ ID NO:424的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:427的VLB CDR1、SEQ ID NO:428的VLB CDR2和SEQ ID NO:429的VLB CDR3。
45.权利要求43的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:412的序列的VLA和具有SEQ ID NO:416的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:421的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:426的序列的VLB。
46.权利要求43的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:420的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:425的氨基酸序列的第三多肽链。
47.权利要求11的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT023a相同的cMet表位和相同的PD-L1表位，其中双特异性结合蛋白FIT023a包含:包含SEQ ID NO:430的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:444的氨基酸序列的第三多肽链。
48.权利要求47的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:432的VLACDR1，SEQ ID NO:433的VLA CDR2和SEQ ID NO:434的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:436的VHB CDR1、SEQ ID NO:437的VHB CDR2和SEQ ID NO:438的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:441的VHA CDR1、SEQ ID NO:442的VHA CDR2和SEQ ID NO:443的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:446的VLB CDR1、SEQ ID NO:447的VLB CDR2和SEQ ID NO:448的VLB CDR3；
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:432的VLA CDR1，SEQ ID NO:433的VLA CDR2和SEQID NO:434的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:436的VHB CDR1、SEQ ID NO:437的VHB CDR2和SEQ ID NO:438的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:441的VHACDR1、SEQ ID NO:442的VHA CDR2和SEQ ID NO:443的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:446的VLB CDR1、SEQ ID NO:447的VLB CDR2和SEQ ID NO:448的VLB CDR3。
49.权利要求47的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:431的序列的VLA和具有SEQ ID NO:435的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:440的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:445的序列的VLB。
50.权利要求47的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:430的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:444的氨基酸序列的第三多肽链。
51.权利要求12的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT024a相同的BTLA表位和相同的PD-1表位，其中双特异性结合蛋白FIT024a包含：包含SEQID NO:449的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:458的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:463的氨基酸序列的第三多肽链。
52.权利要求51的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:451的VLACDR1，SEQ ID NO:452的VLA CDR2和SEQ ID NO:453的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:455的VHB CDR1、SEQ ID NO:456的VHB CDR2和SEQ ID NO:457的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:460的VHA CDR1、SEQ ID NO:461的VHA CDR2和SEQ ID NO:462的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:465的VLB CDR1、SEQ ID NO:466的VLB CDR2和SEQ ID NO:467的VLB CDR3；
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:451的VLA CDR1，SEQ ID NO:452的VLA CDR2和SEQID NO:453的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:455的VHB CDR1、SEQ ID NO:456的VHB CDR2和SEQ ID NO:457的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:460的VHACDR1、SEQ ID NO:461的VHA CDR2和SEQ ID NO:462的VHA CDR3；其中第三多肽的VLB包含SEQID NO:465的VLB CDR1、SEQ ID NO:466的VLB CDR2和SEQ ID NO:467的VLB CDR3。
53.权利要求51的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:450的序列的VLA和具有SEQ ID NO:454的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:459的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:464的序列的VLB。
54.权利要求51的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:449的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:458的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:463的氨基酸序列的第三多肽链。
55.权利要求12的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT024b相同的BTLA表位和相同的PD-1表位，其中双特异性结合蛋白FIT024b包含：包含SEQID NO:468的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:477的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:482的氨基酸序列的第三多肽链。
56.权利要求55的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:470的VLACDR1，SEQ ID NO:471的VLA CDR2和SEQ ID NO:472的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:474的VHB CDR1、SEQ ID NO:475的VHB CDR2和SEQ ID NO:476的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:479的VHA CDR1、SEQ ID NO:480的VHA CDR2和SEQ ID NO:481的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:484的VLB CDR1、SEQ ID NO:485的VLB CDR2和SEQ ID NO:486的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:470的VLA CDR1，SEQ ID NO:471的VLA CDR2和SEQID NO:472的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:474的VHB CDR1、SEQ ID NO:475的VHB CDR2和SEQ ID NO:476的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:479的VHACDR1、SEQ ID NO:480的VHA CDR2和SEQ ID NO:481的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:484的VLB CDR1、SEQ ID NO:485的VLB CDR2和SEQ ID NO:486的VLB CDR3。
57.权利要求55的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:469的序列的VLA和具有SEQ ID NO:473的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:478的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:483的序列的VLB。
58.权利要求55的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:468的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:477的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:482的氨基酸序列的第三多肽链。
59.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT014a相同的因子IXa表位和相同的因子X表位，其中双特异性结合蛋白FIT014a包含：包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:273的氨基酸序列的第三多肽链。
60.权利要求59的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:261的VLACDR1，SEQ ID NO:262的VLA CDR2和SEQ ID NO:263的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:265的VHB CDR1、SEQ ID NO:266的VHB CDR2和SEQ ID NO:267的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:270的VHA CDR1、SEQ ID NO:271的VHA CDR2和SEQ ID NO:272的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:275的VLB CDR1、SEQ ID NO:276的VLB CDR2和SEQ ID NO:277的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:261的VLA CDR1，SEQ ID NO:262的VLA CDR2和SEQID NO:263的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:265的VHB CDR1、SEQ ID NO:266的VHB CDR2和SEQ ID NO:267的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:270的VHACDR1、SEQ ID NO:271的VHA CDR2和SEQ ID NO:272的VHA CDR3；其中第三多肽的VLB包含SEQID NO:275的VLB CDR1、SEQ ID NO:276的VLB CDR2和SEQ ID NO:277的VLB CDR3。
61.权利要求59的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:260的序列的VLA和具有SEQ ID NO:264的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:269的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:274的序列的VLB。
62.权利要求59的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:273的氨基酸序列的第三多肽链。
63.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT018a相同的CD20表位和相同的CD3表位，其中双特异性结合蛋白FIT018a包含：包含SEQID NO:316的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列的第三多肽链。
64.权利要求63的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:318的VLACDR1，SEQ ID NO:319的VLA CDR2和SEQ ID NO:320的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:322的VHB CDR1、SEQ ID NO:323的VHB CDR2和SEQ ID NO:324的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:327的VHA CDR1、SEQ ID NO:328的VHA CDR2和SEQ ID NO:329的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:332的VLB CDR1、SEQ ID NO:333的VLB CDR2和SEQ ID NO:334的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:318的VLA CDR1，SEQ ID NO:319的VLA CDR2和SEQID NO:320的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:322的VHB CDR1、SEQ ID NO:323的VHB CDR2和SEQ ID NO:324的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:327的VHACDR1、SEQ ID NO:328的VHA CDR2和SEQ ID NO:329的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:332的VLB CDR1、SEQ ID NO:333的VLB CDR2和SEQ ID NO:334的VLB CDR3。
65.权利要求63的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:317的序列的VLA和具有SEQ ID NO:321的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:326的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:331的序列的VLB。
66.权利要求63的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：第一多肽链，其包含SEQ IDNO:316的氨基酸序列；第二多肽链，其包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列；和第三多肽链，其包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列。
67.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一条多肽链包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白NBS3相同的CTLA4表位和相同的PD-1表位，其中双特异性结合蛋白NBS3包含：包含SEQ IDNO:126的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的第三多肽链。
68.权利要求67的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:128的VLACDR1，SEQ ID NO:129的VLA CDR2和SEQ ID NO:130的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:132的VHB CDR1、SEQ ID NO:133的VHB CDR2和SEQ ID NO:134的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:137的VHA CDR1、SEQ ID NO:138的VHA CDR2和SEQ ID NO:139的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:142的VLB CDR1、SEQ ID NO:143的VLB CDR2和SEQ ID NO:144的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:128的VLA CDR1，SEQ ID NO:129的VLA CDR2和SEQID NO:130的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:132的VHB CDR1、SEQ ID NO:133的VHB CDR2和SEQ ID NO:134的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:137的VHACDR1、SEQ ID NO:138的VHA CDR2和SEQ ID NO:139的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:142的VLB CDR1、SEQ ID NO:143的VLB CDR2和SEQ ID NO:144的VLB CDR3。
69.权利要求67的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:127的序列的VLA和具有SEQ ID NO:131序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:136的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:141的序列的VLB。
70.权利要求67的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的第三多肽链。
71.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白NBS3R相同的CTLA4表位和相同的PD-1表位，其中双特异性结合蛋白NBS3R包含：包含SEQ IDNO:145的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第三多肽链。
72.权利要求71的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:147的VLACDR1，SEQ ID NO:148的VLA CDR2和SEQ ID NO:149的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:151的VHB CDR1、SEQ ID NO:152的VHB CDR2和SEQ ID NO:153的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:156的VHA CDR1、SEQ ID NO:157的VHA CDR2和SEQ ID NO:158的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:161的VLB CDR1、SEQ ID NO:162的VLB CDR2和SEQ ID NO:163的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:147的VLA CDR1，SEQ ID NO:148的VLA CDR2和SEQID NO:149的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:151的VHB CDR1、SEQ ID NO:152的VHB CDR2和SEQ ID NO:153的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:156的VHACDR1、SEQ ID NO:157的VHA CDR2和SEQ ID NO:158的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:161的VLB CDR1、SEQ ID NO:162的VLB CDR2和SEQ ID NO:163的VLB CDR3。
73.权利要求71的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:146的序列的VLA和具有SEQ ID NO:150序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:155的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:160的序列的VLB。
74.权利要求71的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的第三多肽链。
75.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白NBS3-C相同的CTLA4表位和相同的PD-1表位，其中双特异性结合蛋白NBS3-C包含：包含SEQID NO:164的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第三多肽链。
76.权利要求75的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:166的VLACDR1，SEQ ID NO:167的VLA CDR2和SEQ ID NO:168的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:170的VHB CDR1、SEQ ID NO:171的VHB CDR2和SEQ ID NO:172的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:175的VHA CDR1、SEQ ID NO:176的VHA CDR2和SEQ ID NO:177的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:180的VLB CDR1、SEQ ID NO:181的VLB CDR2和SEQ ID NO:182的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:166的VLA CDR1，SEQ ID NO:167的VLA CDR2和SEQID NO:168的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:170的VHB CDR1、SEQ ID NO:171的VHB CDR2和SEQ ID NO:172的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:175的VHACDR1、SEQ ID NO:176的VHA CDR2和SEQ ID NO:177的VHA CDR3；其中第三多肽的VLB包含SEQID NO:180的VLB CDR1、SEQ ID NO:181的VLB CDR2和SEQ ID NO:182的VLB CDR3。
77.权利要求75的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:165的序列的VLA和具有SEQ ID NO:169序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:174的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:179的序列的VLB。
78.权利要求71的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的第三多肽链。
79.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白NBS3R-C相同的CTLA4表位和相同的PD-1表位，其中双特异性结合蛋白NBS3R-C包含：包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的第三多肽链。
80.权利要求79的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:185的VLACDR1，SEQ ID NO:186的VLA CDR2和SEQ ID NO:187的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:189的VHB CDR1、SEQ ID NO:190的VHB CDR2和SEQ ID NO:191的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:194的VHA CDR1、SEQ ID NO:195的VHA CDR2和SEQ ID NO:196的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:199的VLB CDR1、SEQ ID NO:200的VLB CDR2和SEQ ID NO:201的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:185的VLA CDR1，SEQ ID NO:186的VLA CDR2和SEQID NO:187的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:189的VHB CDR1、SEQ ID NO:190的VHB CDR2和SEQ ID NO:191的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:194的VHACDR1、SEQ ID NO:195的VHA CDR2和SEQ ID NO:196的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:199的VLB CDR1、SEQ ID NO:200的VLB CDR2和SEQ ID NO:201的VLB CDR3。
81.权利要求75的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:184的序列的VLA和具有SEQ ID NO:188序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:193的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:198的序列的VLB。
82.权利要求71的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的第三多肽链。
83.一种包含至少两条多肽链的双特异性结合蛋白，其中多肽链配对形成能够结合两个抗原的IgG-样分子，其中第一多肽链包含(1)VLA、CL、VHB和CH1或(2)VHB、CH1、VLA和CL，其中VL是轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，VH是重链可变结构域，CH1是重链的第一恒定结构域，A是第一抗原，并且B是第二抗原，其中结合蛋白能够结合与双特异性结合蛋白FIT021b相同的CD20表位和相同的CD22表位，其中双特异性结合蛋白FIT021b包含：包含SEQID NO:392的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:401的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的第三多肽链。
84.权利要求83的双特异性结合蛋白，选自：
(i)包含在第一多肽上的VLA的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:394的VLACDR1，SEQ ID NO:395的VLA CDR2和SEQ ID NO:396的VLA CDR3；
(ii)包含在第一多肽上的VHB的结合蛋白，其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:398的VHB CDR1、SEQ ID NO:399的VHB CDR2和SEQ ID NO:400的VHB CDR3；
(iii)包含在第二多肽上的VHA的结合蛋白，其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:403的VHA CDR1、SEQ ID NO:404的VHA CDR2和SEQ ID NO:405的VHA CDR3；
(iv)包含在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:408的VLB CDR1、SEQ ID NO:409的VLB CDR2和SEQ ID NO:410的VLB CDR3；和
(v)包含在第一多肽上的VLA和VHB、在第二多肽上的VHA和在第三多肽上的VLB的结合蛋白，其中第一多肽的VLA包含SEQ ID NO:394的VLA CDR1，SEQ ID NO:395的VLA CDR2和SEQID NO:396的VLA CDR3；其中第一多肽的VHB包含SEQ ID NO:398的VHB CDR1、SEQ ID NO:399的VHB CDR2和SEQ ID NO:400的VHB CDR3；其中第二多肽的VHA包含SEQ ID NO:403的VHACDR1、SEQ ID NO:404的VHA CDR2和SEQ ID NO:405的VHA CDR3；以及其中第三多肽的VLB包含SEQ ID NO:408的VLB CDR1、SEQ ID NO:409的VLB CDR2和SEQ ID NO:410的VLB CDR3。
85.权利要求83的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含具有SEQ ID NO:393的序列的VLA和具有SEQ ID NO:397的序列的VHB，其中结合蛋白包含第二多肽链，所述第二多肽链包含具有SEQ ID NO:402的序列的VHA，和其中结合蛋白包含第三多肽链，所述第三多肽链包含具有SEQ ID NO:407的序列的VLB。
86.权利要求87的双特异性结合蛋白，其中结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:392的氨基酸序列的第一多肽链；包含SEQ ID NO:401的氨基酸序列的第二多肽链；和包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的第三多肽链。
87.权利要求1至权利要求86任一项的结合蛋白，其中结合蛋白还包含Fc。
88.权利要求87的结合蛋白，其中Fc是人IgG1的Fc。
89.权利要求87的结合蛋白，其中Fc是根据SEQ ID NO:20的序列。
90.权利要求1至权利要求86任一项的结合蛋白，还包含至少一个多肽接头。
91.权利要求1至权利要求86任一项的结合蛋白，其中第一多肽链包含，从氨基端到羧基端，VLA-CL-VHB-CH1-Fc；第二多肽链包含，从氨基端到羧基端，VHA-CH1；和第三多肽链包含，从氨基端到羧基端，VLB-CL。
92.权利要求1至权利要求86任一项的结合蛋白，其中第一多肽链包含，从氨基端到羧基端，VHB-CH1-VLA-CL-Fc；和第二多肽链包含，从氨基端到羧基端，VHA-CH1；和第三多肽链包含，从氨基端到羧基端，VLB-CL。
93.权利要求1至权利要求86任一项的结合蛋白，其中第一多肽链的CL与VHB直接融合，或经由氨基酸或寡肽接头与VHB融合。
94.权利要求1至权利要求86任一项的结合蛋白，其中第一多肽链的CH1与VLA直接融合，或经由氨基酸或寡肽接头与VLA融合。
95.在权利要求1至权利要求86任一项的结合蛋白中具有一个或多个氨基酸保守性置换的结合蛋白，所述结合蛋白具有与权利要求1至权利要求86中没有氨基酸保守性置换的相应结合蛋白等价的活性。
96.一种药物组合物，其包含之前任一项权利要求的结合蛋白和一种或多种药学可接受载体。
97.一种在有需要的受试者中治疗或预防病症的方法，所述方法包括将有效量的权利要求96的药物组合物施用于受试者。
98.根据权利要求1至86任一项的结合蛋白在制备用于治疗或预防病症的药物中的用途。
99.权利要求98的用途，其中所述病症是炎性疾病、自体免疫性疾病、神经退行性疾病、癌症或脊髓损伤。
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