CN109180623A - 水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜a和栀子新萜f的制备方法及其应用 - Google Patents

水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜a和栀子新萜f的制备方法及其应用 Download PDF

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张艳丽
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李本科
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齐曼
刘晏灵
王梦娜
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Abstract

本发明涉及水栀子中3,4‑裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制备方法及其应用，有效解决快速从水栀子中制备两个具有肾细胞保护活性的3,4‑裂环环菠萝蜜烷型三萜类化合物的问题，方法是，将水栀子粉碎，丙酮组织破碎提取，减压浓缩，浓缩物用蒸馏水混悬，依次加入石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得水栀子粗提取物；水栀子粗提取物经硅胶柱色谱初步分离，采用体积比为100:1、50:1、30:1的二氯甲烷‑甲醇***进行梯度洗脱，收集二氯甲烷‑甲醇体积比为50:1、30:1洗脱流份；二氯甲烷‑甲醇体积比为50:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，得栀子新萜A；二氯甲烷‑甲醇体积比为30:1洗脱流份经ODS柱色谱进一步分离，得栀子新萜F；本发明方法稳定可靠，效率高。

Description

水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制 备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制备方法及其应用。
背景技术
脓毒症是由感染引起的全身炎症反应，常常引起多组织损伤及功能障碍。目前，脓毒症已成为重症监护病房(ICU)患者死亡的主要原因，是1～7岁患儿的第七大致死原因和65～75岁老人的第八大致死原因。急性肾损伤(AKI)是临床脓毒症发病过程中最严重、最常见的并发症之一。AKI的发病率会随着脓毒症的发展而增加，脓毒症合并AKI后病死率增加1倍，明显高于其它因素导致的急性肾功能衰竭。目前临床上广泛使用的肾细胞保护药物主要包括HMG-COA还原酶抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)等。由于多数合成药基于单靶点的作用，对于肾损伤的复杂的病因，很难取得理想的治疗效果。
水栀子为茜草科(Rubiaceae)栀子属植物水栀子(Gardenia jasminoidesvar.radicans)的干燥成熟果实。历代本草学著作，如《雷公炮制论》，《八闽通志》等均有关于水栀子的相关记载，在我国民间，水栀子根、叶及果实可入药，具有解热凉血、镇静止痛、疏风解湿的功效。水栀子分布广泛，在我国长江以南的多个省区均有分布或人工栽培，主要产区在湖北、湖南、四川、江西、福建、浙江等省。化学成分研究表明水栀子除了含有环烯醚萜类和单萜类化合物以外，近年来的研究发现水栀子还含有大量的三萜类化合物，同样具有多样的生物活性，如抗肿瘤，抑制肿瘤细胞血管生长以及抗炎等活性。本发明采用硅胶柱色谱法富集目标成分，再用硅胶、ODS等柱色谱法结合制备液相分离纯化，建立了水栀子中两个痕量的3,4-裂环环菠萝蜜烷型三萜类化合物栀子新萜A和栀子新萜F的快速制备方法。该方法分离效率高、时间短，溶剂消耗量小，样品回收率高，得到的目标成分纯度高。这两个化合物均为未见文献报道的新化合物。
中草药在细胞保护方面的应用历史悠久，从中草药中寻找具有肾细胞保护的活性物质，研制特异性强、毒副作用小的新型药物具有重要的社会效益和经济效益。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制备方法及其应用，可有效解决快速从水栀子中制备两个具有肾细胞保护活性的3,4-裂环环菠萝蜜烷型三萜类化合物的问题。
本发明解决的技术方案是，一种水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F，所述的三萜类化合物栀子新萜A和栀子新萜F分子结构式(化学结构式)为：
其制备方法包括以下步骤：
(1)制备粗提取物，方法是，将水栀子粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量6-9倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次1-3min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积3-5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；所述的重量体积是指固体物以g计，液体物以ml计，以下同，如浓缩物为1g时，蒸馏水为3-5ml；
(2)硅胶、ODS等柱色谱结合制备液相分离纯化：方法是，乙酸乙酯萃取部位的浸膏经硅胶柱色谱初步分离，采用体积比为100:1、50:1、30:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，分别收集二氯甲烷-甲醇体积比为50:1、30:1洗脱流份；
二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为4:1、2:1的石油醚-丙酮***进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每20ml为1个流份，收集石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份；石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为80:20的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，得到栀子新萜A；
二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ODS柱色谱进一步分离，采用体积比为80:10、90:10的甲醇-水***进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为90:10洗脱流份，甲醇-水体积比为90:10洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为75:25的乙腈-水进行洗脱，得到栀子新萜F。
本发明方法制备的栀子新萜A、栀子新萜F具有抑制肾小管上皮细胞NRK 52e凋亡的保护作用，实现栀子新萜A、栀子新萜F在制备治疗各种原因引起的肾损伤的药物中的应用。
本发明方法稳定可靠，效率高，可快速从水栀子中分离得到两个3,4-裂环环菠萝蜜烷型三萜类化合物栀子新萜A和栀子新萜F，对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞NRK 52e凋亡具有一定的保护作用，有效用于制备治疗各种原因引起的肾损伤的药物，开拓了水栀子的药用价值和商业价值，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明化合物栀子新萜A、栀子新萜F的分子结构图。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，一种水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备粗提取物，方法是，将水栀子4.03kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量9倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次1min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)硅胶、ODS等柱色谱结合制备液相分离纯化：方法是，乙酸乙酯萃取部位的浸膏61.3g，用100～200目硅胶60g拌样后，上含有100～200目硅胶600g的硅胶柱，采用体积比为100:1、50:1、30:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，分别收集二氯甲烷-甲醇体积比为50:1和30:1洗脱流份；
二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为4:1、2:1的石油醚-丙酮***进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每20ml为1个流份，收集石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份；石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为80:20的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜A(化合物1)；
二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ODS柱色谱进一步分离，采用体积比为80:20，90:10的甲醇-水***进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为90:10洗脱流份，甲醇-水体积比为90:10洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为75:25的乙腈-水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜F(化合物2)。
化合物结构鉴定：
上述两个化合物，经过核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、NOESY)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光谱技术鉴定了其化学结构：
化合物1，无色蜡状，易溶于甲醇。+30.459(c 0.8036,CH3OH),经HR ESI MS测定得到其准分子离子峰[M-H]-m/z：487.3421(C30H47O5计算值为487.3418)。
1H NMR(500MHz,CD3OD)中，δ4.81和4.74处出现2个一氢宽单峰，提示这2个氢为末端双键上的两个氢信号；δ4.08(1H,br d,J＝11.5Hz,H-21a)，3.50(1H,d,J＝11.2Hz,H-26a)，3.47(1H,dd,J＝11.5,2.2Hz,H-21b)，3.42(1H,d,J＝11.2Hz,H-26b)和3.35(1H,dd,J＝10.8,2.4Hz,H-24)为连氧碳上的氢信号；δ0.76(1H,d,J＝4.4Hz,H-19a)和0.44(1H,d,J＝4.4Hz,H-19b)为环丙基亚甲基氢信号；在δ1.70(3H,s,H-29)，1.11(3H,s,H-27)，1.05(3H,s,H-30)和0.99(3H,s,H-18)处显示4个甲基氢信号。
13C NMR(125MHz,CD3OD)中共出现30个碳信号，且多数为脂肪碳，提示该化合物可能为一个三萜类化合物，δ177.8为羰基碳信号，δ150.8和112.2为末端双键碳信号，δ82.5，75.3，71.6和68.0为连氧碳信号。通过分析1H-1H COSY谱发现分子结构中存在5个自旋体系，分别为S1：C-1(δ30.4)/C-2(δ32.5)；S2：C-5(δ47.2)/C-6(δ29.0)/C-7(δ26.2)/C-8(δ49.5)；S3：C-11(δ28.1)/C-12(δ33.7)；S4：C-15(δ36.7)/C-16(δ28.3)/C-17(δ43.7)/C-20(δ37.2)/(C-21)/C-22(δ28.3)/C-23(δ21.8)/C-24(δ82.5)；S5:C-28(δ112.2)/C-4(δ150.8)/C-29(δ20.1)。
HMBC谱中，H-19(δ0.76和0.44)与C-1，C-5，C-8和C-11有远程相关，提示S1的C-1和S2的C-5连在C-19所在的环丙烷的C-10环上，S2的C-8和S3的C-9都连在环丙烷的C-9上；由H-18与C-12，C-14(δ50.3)和C-17有远程相关，H-30(δ1.05)与C-8，C-13(δ46.0)和C-15有远程相关，确定S2的C-8，S3的C-12和S4的C-15、C-17都连在C-13上；H-1(δ2.04和1.37)与C-3(δ177.8)有远程相关，提示羧基连在C-2上；H-28(δ4.08和3.51)与C-5有远程相关，提示该异丙烯基连在C-5上；H-21(δ4.81和4.74)与C-20，C-22，C-24有远程相关，说明C-21和C-24通过氧原子连在一起；此外，H-24(δ3.35)与C-25(δ75.3)，C-26(δ68.0)和C-27(δ20.2)有远程相关，提示一个2-丙二醇基连在C-24上。通过以上分析可知，该化合物为3,4-裂环-环菠萝蜜烷型三萜衍生物，C-21和C-24成醚，并且C-25和C-26都连有羟基。
由H-21α(dd,J＝11.5,2.2Hz)，H-21β(d,J＝11.5Hz)和H-24(dd,J＝10.8,2.4Hz)的偶合常数可以推测出H-20和H-24分别处于环的两侧。NOE谱中，H-20与H-21β，H-21α与H-24分别有NOE关系，验证了这一推测。综合以上分析，可得出化合物的结构，为21,24环氧-25,26-二羟基-3,4-裂环环菠萝蜜烷-4(28)-烯-3羧酸，文献检索发现为一新化合物，命名为栀子新萜A(gardenpic A)。
化合物2，白色无定形粉末，易溶于甲醇。+45.571(c 0.1120,CH3OH)，经HR ESIMS测定得到准分子离子峰[M+Na]+m/z：527.3712(C31H52O5Na计算值为527.3707)。
1H NMR(500MHz,CD3OD)中，δ5.28(1H,t,J＝7.0Hz,H-24)为双键上的氢信号；δ4.07(2H,dd,J＝15.4,12.6Hz,H-26)，3.69(1H,dd,J＝11.0,3.3Hz,H-21a)和3.48(1H,dd,J＝11.0,6.3Hz,H-21b)为连氧碳上的氢信号；δ3.62(3H,s)为甲氧基氢信号；δ0.71(1H,d,J＝4.6Hz,H-19a)和0.52(1H,d,J＝4.6Hz,H-19b)为环丙基上亚甲基氢信号；在δ1.75(3H,s,H-27)，1.20(3H,s,H-28)，1.19(3H,s,H-29)，1.01(3H,s,H-18)和0.98(3H,s,H-30)处显示5个甲基氢信号。
13C NMR(125MHz,CD3OD)中共出现31个碳信号，且多数为脂肪碳，提示该化合物可能为一个三萜类化合物，δ176.7为羰基碳信号，δ135.4和129.5为双键碳信号，δ76.8，62.7和61.4为连氧碳信号。该化合物与1的核磁共振数据非常相似，提示二者具有相同的骨架类型，区别在于连在5位的异丙烯基双键被饱和、氧代形成异丙醇基，以及17位侧链开环形成链状结构。分析1H-1H COSY谱，发现结构含有C-21(δ62.7)/C-20(δ43.5)/C-22(δ30.9)/C-23(δ25.1)/C-24(δ129.5)结构片段，其中，C-21为连氧碳，C-24为双键碳。通过与文献对比C-26的化学位移(E构型：δ69.0～70.0；Z构型：δ60.0～62.0)可以确定24(25)双键为Z构型。HMBC谱中，H-26、H-27均与C-24和C-25有远程相关，提示有一个甲基和一个羟甲基连在C-25上；δ3.62(3H,s)与C-3有远程相关，提示3位上的羧基形成甲酯。综合以上分析，可以得出化合物的结构，为(24Z)-4,21,26-三羟基-3,4-裂环环菠萝蜜烷-24(25)-烯-3-羧酸甲酯，经文献检索发现为一新化合物，命名为栀子新萜F。
表1化合物1和2的核磁数据
a NMR spectroscopic data were recorded in CD3OD at 500MHz(1H NMR)and125MHz(13CNMR)
上述两个化合物均属于水栀子中两个具有肾细胞保护活性的两个3,4-裂环环菠萝蜜烷型三萜类化合物栀子新萜A和栀子新萜F。
实施例2
本发明在具体实施中，一种水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备粗提取物：方法是，将水栀子5.11kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量7倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次2min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)硅胶、ODS等柱色谱结合制备液相分离纯化：方法是，乙酸乙酯萃取部位的浸膏77.86g，用100～200目硅胶80g拌样后，上含有100～200目硅胶800g的硅胶柱，采用体积比为100:1，50:1，30:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为50:1和30:1洗脱流份；
二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为4:1，2:1的石油醚-丙酮***进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每20ml为1个流份，收集石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份，石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为80:20的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜A(化合物1)；
二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ODS柱色谱进一步分离，采用体积比为80:20，90:10的甲醇-水***进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为90:10洗脱流份，甲醇-水体积比为90:10洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为75:25的乙腈-水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜F(化合物2)。
化合物的结构鉴定
上述两种粉末经过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、NOESY)及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定(鉴定过程同实施例1中的化合物的结构鉴定)，其分别为属于水栀子中两个具有肾细胞保护活性的两个3,4-裂环环菠萝蜜烷型三萜类化合物栀子新萜A和栀子新萜F。
实施例3
本发明在具体实施中，一种水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备粗提取物：方法是，将水栀子4.11kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量8倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次3min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)硅胶、ODS等柱色谱结合制备液相分离纯化：方法是，乙酸乙酯萃取部位的浸膏57.91g，用100～200目硅胶60g拌样后，上含有100～200目硅胶600g的硅胶柱，采用体积比为100:1，50:1，30:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为50:1和30:1洗脱流份；
二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为4:1，2:1的石油醚-丙酮***进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每20ml为1个流份，收集石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份，石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为80:20的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜A(化合物1)；
二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ODS柱色谱进一步分离，采用体积比为80:20，90:10的甲醇-水***进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为90:10洗脱流份，甲醇-水体积比为90:10洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为75:25的乙腈-水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜F(化合物2)。
化合物的结构鉴定
上述两种粉末经过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、NOESY)及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定(鉴定过程同实施例1中的化合物的结构鉴定)，其分别为属于水栀子中两个具有肾细胞保护活性的两个3,4-裂环环菠萝蜜烷型三萜类化合物栀子新萜A和栀子新萜F。
实施例4
本发明在具体实施中，一种水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备粗提取物：方法是，将水栀子5.14kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量6倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次2min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)硅胶、ODS等柱色谱结合制备液相分离纯化，方法是：乙酸乙酯萃取部位的浸膏78.04g，用100～200目硅胶80g拌样后，上含有100～200目硅胶800g的硅胶柱，采用体积比为100:1，50:1，30:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为50:1和30:1洗脱流份；
二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为4:1，2:1的石油醚-丙酮***进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每20ml为1个流份，收集石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份，石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为80:20的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜A(化合物1)；
二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ODS柱色谱进一步分离，采用体积比为80:20，90:10的甲醇-水***进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为90:10洗脱流份。甲醇-水体积比为90:10洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为75:25的乙腈-水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜F(化合物2)。
化合物的结构鉴定
上述两种粉末经过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、NOESY)及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定(鉴定过程同实施例1中的化合物的结构鉴定)，其分别为属于水栀子中两个具有肾细胞保护活性的两个3,4-裂环环菠萝蜜烷型三萜类化合物栀子新萜A和栀子新萜F。
本发明方法稳定可靠，其提取分离的栀子新萜A和栀子新萜F经试验，可有效抑制脂多糖(LPS)诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK 52e)的凋亡，可有效用于制备治疗各种原因引起的肾损伤的药物，并经实验得到了充分证明，有关实验资料如下：
1.大鼠肾小管上皮细胞NRK 52e培养
NRK 52e细胞培养于37℃、含5％CO2的培养箱中培养，培养基为DMEM高糖培养基(含10％胎牛血清，100 U·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素)，两天换液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。
2.MTT法检测化合物对脂多糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞的保护作用
以培养基将细胞分散，使成为密度为2×104 cell·ml-1的单细胞悬液，并以每孔0.2 ml接种于96孔板中，培养24 h后，将细胞分为对照组、模型组及不同用药组，正常组加入等量溶剂，模型组加入浓度为1mg·ml-1的LPS溶液(终浓度为1μg·ml-1)，不同用药组加入浓度为0.1,1,10,50,100μM的待测化合物和浓度为1μg·ml-1的脂多糖。培养24h后每孔加入MTT溶液(5 mg·ml-1)20μl，37℃继续培养4小时，小心吸净培养液，每孔加入150μl DMSO，震荡10分钟，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在490nm下测定各孔的吸光度值(A)，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过SPSS18.0软件处理得到半数有效浓度(EC50)，重复测试3次，取平均值为最终结果。
3.实验结果
通过MTT法检测栀子新萜A和栀子新萜F对LPS诱导的NRK 52e细胞凋亡的影响，EC50值分别为38.4μM和26.8μM，经反复试验(10次以上)均取得了相同或相近似的结果。
实验表明，本发明制备出的栀子新萜A和栀子新萜F可以有效抑制LPS诱导的NRK52e细胞凋亡，有效用于制备治疗各种原因引起的肾损伤的药物，开辟了水栀子用于肾细胞保护作用药物的新用途，是治疗各种原因引起的肾损伤的药物上的创新，开辟了水栀子的药用新途径和商业价值，有显著的经济和社会效益。

Claims (6)

1.一种水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F，所述的三萜类化合物栀子新萜A和栀子新萜F分子结构式为：
其制备方法包括以下步骤：
(1)制备粗提取物，方法是，将水栀子粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量6-9倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次1-3min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积3-5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；所述的重量体积是指固体物以g计，液体物以ml计，以下同，如浓缩物为1g时，蒸馏水为3-5ml；
(2)硅胶、ODS等柱色谱结合制备液相分离纯化：方法是，乙酸乙酯萃取部位的浸膏经硅胶柱色谱初步分离，采用体积比为100:1、50:1、30:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，分别收集二氯甲烷-甲醇体积比为50:1、30:1洗脱流份；
二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为4:1、2:1的石油醚-丙酮***进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每20ml为1个流份，收集石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份；石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为80:20的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，得到栀子新萜A；
二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ODS柱色谱进一步分离，采用体积比为80:10、90:10的甲醇-水***进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为90:10洗脱流份，甲醇-水体积比为90:10洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为75:25的乙腈-水进行洗脱，得到栀子新萜F。
2.根据权利要求1所述的水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备粗提取物，方法是，将水栀子4.03kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量9倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次1min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)硅胶、ODS等柱色谱结合制备液相分离纯化：方法是，乙酸乙酯萃取部位的浸膏61.3g，用100～200目硅胶60g拌样后，上含有100～200目硅胶600g的硅胶柱，采用体积比为100:1、50:1、30:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，分别收集二氯甲烷-甲醇体积比为50:1和30:1洗脱流份；
二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为4:1、2:1的石油醚-丙酮***进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每20ml为1个流份，收集石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份；石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为80:20的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜A；
二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ODS柱色谱进一步分离，采用体积比为80:20，90:10的甲醇-水***进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为90:10洗脱流份，甲醇-水体积比为90:10洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为75:25的乙腈-水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜F。
3.根据权利要求1所述的水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备粗提取物：方法是，将水栀子5.11kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量7倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次2min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)硅胶、ODS等柱色谱结合制备液相分离纯化：方法是，乙酸乙酯萃取部位的浸膏77.86g，用100～200目硅胶80g拌样后，上含有100～200目硅胶800g的硅胶柱，采用体积比为100:1，50:1，30:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为50:1和30:1洗脱流份；
二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为4:1，2:1的石油醚-丙酮***进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每20ml为1个流份，收集石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份，石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为80:20的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜A；
二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ODS柱色谱进一步分离，采用体积比为80:20，90:10的甲醇-水***进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为90:10洗脱流份，甲醇-水体积比为90:10洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为75:25的乙腈-水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜F。
4.根据权利要求1所述的水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备粗提取物：方法是，将水栀子4.11kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量8倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次3min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)硅胶、ODS等柱色谱结合制备液相分离纯化：方法是，乙酸乙酯萃取部位的浸膏57.91g，用100～200目硅胶60g拌样后，上含有100～200目硅胶600g的硅胶柱，采用体积比为100:1，50:1，30:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为50:1和30:1洗脱流份；
二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为4:1，2:1的石油醚-丙酮***进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每20ml为1个流份，收集石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份，石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为80:20的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜A；
二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ODS柱色谱进一步分离，采用体积比为80:20，90:10的甲醇-水***进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为90:10洗脱流份，甲醇-水体积比为90:10洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为75:25的乙腈-水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜F。
5.根据权利要求1所述的水栀子中3,4-裂环环菠萝蜜烷型栀子新萜A和栀子新萜F的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备粗提取物：方法是，将水栀子5.14kg粉碎，过40目筛，每次用水栀子重量6倍量的体积浓度为50％的丙酮组织破碎提取3次，每次2min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为水栀子粗提取物；
(2)硅胶、ODS等柱色谱结合制备液相分离纯化，方法是：乙酸乙酯萃取部位的浸膏78.04g，用100～200目硅胶80g拌样后，上含有100～200目硅胶800g的硅胶柱，采用体积比为100:1，50:1，30:1的二氯甲烷-甲醇***进行梯度洗脱，流速为15ml·min-1，每200ml为1个流份，收集二氯甲烷-甲醇体积比为50:1和30:1洗脱流份；
二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，采用体积比为4:1，2:1的石油醚-丙酮***进行梯度洗脱，流速为5ml·min-1，每20ml为1个流份，收集石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份，石油醚-丙酮体积比为2:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为80:20的乙腈-水进行洗脱，流速为3ml·min-1，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜A；
二氯甲烷-甲醇体积比为30:1洗脱流份经ODS柱色谱进一步分离，采用体积比为80:20，90:10的甲醇-水***进行梯度洗脱，流速为17ml·min-1，每170ml为1个流份，收集甲醇-水体积比为90:10洗脱流份。甲醇-水体积比为90:10洗脱流份采用半制备液相进行纯化，采用体积比为75:25的乙腈-水进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得栀子新萜F。
6.权利要求1或2-5任一项所述方法制备的栀子新萜A和栀子新萜F在制备治疗肾小管上皮细胞NRK 52e凋亡引起的肾损伤药物中的应用。
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