CN102203099B - 一种具有手性螺环碳架结构的新化合物及其制备方法以及包含该化合物的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有手性螺环碳架结构的新化合物、其立体异构体、对映异构体、以及在生物体内可水解的所述新化合物或药学上可接受的盐。所述具有手性螺环碳架结构的新化合物由于成骨细胞分化性能优异，且具有肥大细胞分化抑制性能及肝脏的脂肪酸合成抑制性能，所以对于骨质疏松症、脂肪肝及肥胖症的治疗非常有效。

Description

一种具有手性螺环碳架结构的新化合物及其制备方法以及包含该化合物的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种具有手性螺环碳架结构的新化合物及其制备方法、以及包含该化合物的药物组合物。
背景技术
近年经济的高速增长及医学的快速发展带来营养过剩以及老年人口增多的问题。这导致肥胖及因肥胖引发的脂肪肝患者急剧增多，同时老龄化导致骨质疏松症患者人数增加。
长期以来，脂肪组织仅被认为具有保护身体组织、维持体温的功能，并作为身体运动所需能量的储藏所。但是最近许多研究结果证明，脂肪组织对人体的生理或繁殖也起到重要的作用。特别是陆续发现了脂肪细胞中分泌如脂肪酶(adipsin)、甲型肿瘤坏死因子(TNFa)、瘦索(leptin)等能够调节各种生理活性(均衡能量、调节血糖、调节胰岛素敏感性、生成血管等)的物质。因此脂肪细胞被认为是调节身体新陈代谢的中轴。
另一方面，由于肥胖导致深刻的社会问题，因此也在大力开发抑制脂肪细胞形成的药物。但是，尽管因肥胖导致的非酒精性脂肪肝患者的急剧增加对现代人的健康已构成严重威胁，但治疗该病的有效药物还没有被开发。
骨质疏松症是因均衡的骨骼形成、即成骨细胞的骨骼形成性能及破骨细胞的骨骼吸收性能遭到破坏导致的结果。调节成骨细胞及破骨细胞的生成是由荷尔蒙、外部营养、以及遗传方面决定，但并没有发现多少成为骨病直接原因的遗传基因。
当前用于治疗的方法大都是通过抑制骨细胞的吸收性能来保持骨细胞平衡的方法。但是，由于这些药物副作用大或临床效果不明显，所以要求开发新概念的药物。因此，很多科研人员试图开发可直接促进骨细胞的形成，即促进成骨细胞活性的药物，但还没有开发出显现优良效果的新药物。
发明内容
(一)要解决的技术问题
第一、本发明的目的在于提供一种具有优良的成骨细胞的分化性能的新化合物。
第二、提供一种具有出色的抑制脂肪细胞分化性能的新化合物。
第三、提供一种对肝X受体(LXR)具有选择性且具有优良的拮抗活性的新化合物。
第四、提供一种抑制肝的脂肪生物合成及脂肪吸收的新化合物。
第五、提供一种作为有效成分包含所述新化合物的骨质疏松症、脂肪肝或肥胖症治疗用药物组合物。
(二)技术方案
本发明提供一种下述化学式(1)所示的新化合物、其立体异构体、对映异构体、以及在生物体内可水解的所述新化合物前体或药学上可接受的盐。
【化学式(1)】
Figure BPA00001358187700021
上式中，W为CO或CHOR1，X为N3、NHR2、OR2、SR2、SeR2或TeR2；所述R1及R2分别独立地选自氢、C1～C8直链或支链烷基、C2～C8烯基、C2～C8环炔基、C3～C8环烷基、C6～C20芳基或C4～C20杂芳基或所述Y为O、S或NR4；Z为单键、NH、O、S、Se或Te；R3和R4分别独立地选自氢、C1～C8直链或支链烷基、C2～C8烯基、C2～C8炔基、C3～C8环烷基、C6～C20芳基或C4～C20杂芳基；M和N分别为氢、OH或不存在，在此与M或N连接的碳原子与其他碳原子形成单键或双键，每个碳原子形成一个以下的双键。
另外，本发明提供一种所述化学式(1)的化合物的制备方法，该方法包括，
步骤a、将海绵动物Phorbas sp.切断并进行干燥之后，用C1～C4醇提取；
步骤b、使用水和二氯甲烷对所述步骤a得到的提取物进行溶质分布后，去除有机层溶剂，再使用正己烷、及甲醇与水的混合液进行溶质分布；
步骤c、去除所述步骤b得到的甲醇分液层的溶剂之后，进行色谱分析，使用二氧化硅作为固定相，使用含水20重量％以下、或无水甲醇溶液作为洗提液，从而获得分离液。
另外，本发明提供一种用于治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于，作为药学上可接受的载体及活性成分包含权利要求1的化学式(1)的化合物、所述化合物的立体异构体、对映异构体、以及在生物体内可水解的所述化合物的前体或药学上可接受的盐。
另外，本发明提供一种用于治疗脂肪肝的药物组合物，其特征在于，作为药学上可接受的载体及活性成分包含权利要求1的化学式(1)的化合物、其立体异构体、对映异构体、以及在生物体内可水解的所述化学式(1)的化合物前体或药学上可接受的盐。
另外，本发明提供一种用于治疗肥胖症的药物组合物，其特征在于，作为药学上可接受的载体及活性成分包含权利要求1的化学式(1)的化合物、其立体异构体、对映异构体、以及在生物体内可水解的所述化合物前体或药学上可接受的盐。
另外，本发明提供一种肝X受体(LXR)拮抗用药物组合物，其特征在于，作为药学上可接受的载体及活性成分包含权利要求1的化学式(1)的化合物、其立体异构体、对映异构体、以及在生物体内可水解的所述化合物前体或药学上可接受的盐。
(三)有益效果
27本发明的化学式(1)的化合物由于具有非常优异的成骨细胞的分化性能，所以有望对骨质疏松症的治疗具有突破性的作用。另外，所述化学式(1)的化合物对于肝X受体(LXR)具有很强的拮抗作用，从而抑制肝的脂肪生物合成及脂肪吸收，因此有望有效应用于脂肪肝的治疗中。
另外，所述化学式(1)的化合物由于具有出色的脂肪细胞分化抑制性能，所以有望有效应用于肥胖症治疗中。
附图说明
图1(a)是从COSY实验得到的氢相关性(粗线)和HMBC相关性(箭头表示氢核中与碳核的相关结合)示意图，(b)是本发明的化合物1～4的结构示意图。
图2为本发明化合物1及2的圆二色谱示意图。
图3表示本发明的提取出的分离液116V和化合物1至4的成骨细胞分化性能测定结果的照片(实验例1)。
图4表示用本发明的化合物1至4对C3H/10T1/2细胞株进行6天处理之后，通过实时荧光定量PCR(RTPCR)确定成骨细胞分化标记因子(Runx2、Osteocalcin、Msx2等)的转录结果的RTPCR数据(实验例1)。
图5表示用本发明的化合物1至4对C3H/10T1/2细胞株进行6天处理之后，通过免疫印迹(Western Blot)法确定成骨细胞分化标记因子TAZ的蛋白质表达的免疫印迹数据(实验例1)。
图6表示用本发明的化合物1至4对C3H/10T1/2细胞株进行6天处理之后，通过免疫印迹(Western Blot)法确定成骨细胞分化标记因子TAZ及Runx2的蛋白质表达的免疫印迹数据(实验例1)。
图7是表示所述实验例1实施的本发明的化合物5的成骨细胞分化性能测定结果的照片。
图8是表示所述实验例2实施的本发明的提取出的提取液116V和化合物1至4的脂肪细胞(C3H/10T1/2)分化性能测定结果的照片。
图9是表示所述实验例2实施的本发明的化合物1的脂肪细胞(3T2-L1)分化抑制性能测定结果的照片。
图10是表示所述实验例3实施的本发明的化合物1的LXR核受体的拮抗活性测定结果图。
图11是表示在所述实验例3实施的对本发明的化合物1的各种核受体的选择活性测定结果图。
图12是表示在所述实验例3中对本发明的化合物1与LXR核受体蛋白质直接结合进行的测定的结果图。
图13是表示在所述实验例中本发明的化合物1对小鼠脾细胞产生的细胞毒性的测定结果图。
图14是表示在所述实验例5实施中本发明的化合物1对肝细胞(AML12及HepG2细胞)的基因表达的调节功能的测定结果图。
图15是表示在所述实验例6中给小鼠投用本发明的化合物1的实验中给药期间的处理群与对照群间的体重变化图。
图16是表示所述实验例6实施的对本发明的化合物1的疾病动物模型的脂肪肝抑制效果结果的图表及照片。
图17是表示在所述实验例6实施的验证完本发明的化合物1对疾病动物模型的效果之后，该动物模型的化合物1表现的基因表达调节效果测定结果的图表。
具体实施方式
本发明涉及一种具有以下化学式(1)结构的新化合物、其立体异构体、对映异构体、以及在生物体内可水解的新化合物前体或药学上可接受的盐。
(化学式1)
Figure BPA00001358187700061
上式中，W为CO或CHOR1；X为N3、NHR2、OR2、SR2、SeR2或TeR2；所述R1及R2分别独立地选自氢、C1～C8直链或支链烷基、C2～C8烯基、C2～C8炔基、C3～C8环烷基、C6～C20芳基、C4～C20杂芳基或
Figure BPA00001358187700062
所述Y为O、S或NR4；Z为单键、NH、O、S、Se或Te；R3和R4分别独立地选自氢、C1～C8直链或支链烷基、C2～C8烯基、C2～C8炔基、C3～C8环烷基、C6～C20芳基或C4～C20杂芳基；M和N分别为氢、OH或不存在，在此与M或N连接的碳原子和其他碳原子形成单键或双键，各碳原子的双键为一个以下。
所述化学式(1)的化合物可以从国内栖息的海绵动物Phorbas sp.的提取物(KNUE116)中分离出，或以所述分离出的化合物为原材料进行合成而制得，其为具有手性螺环(spiro chiral)碳架结构的新化合物。所述化学式(1)的化合物促进成骨细胞分化，明显抑制脂肪细胞分化性能，并抑制肝生成及吸收脂肪，因此有望在治疗骨质疏松症、脂肪肝及肥胖症中发挥突出作用。
所述化学式(1)的化合物具体例示如下。
所述化学式中，X1为N3、NH2、OH、SH、SeH或TeH；X2为NH、O、S、Se或Te；Z为单键、NH、O、S、Se或Te；R1为氢、C1～C8直链或支链烷基、C2～C8烯基、C2～C8炔基、C3～C8环烷基、C6～C20芳基、C4～C20杂芳基或
Figure BPA00001358187700082
R2、R3及R4各自独立为氢、C1～C8直链或支链烷基、C2～C8烯基、C2～C8炔基、C3～C8环烷基、C6～C20芳基、C4～C20杂芳基。
所述化学式(1)的化合物中，优选的化合物是W为CO或CHOR1；X为N3、NHR2、OR2、SR2、SeR2或TeR2；所述R1及R2分别独立地选自氢、C1～C8直链或支链烷基、C2～C8烯基、C2～C8炔基或所述Y为O、S或NR4；Z为单键、NH、O或S；R3和R4分别独立地选自氢、C1～C8直链或支链烷基、C2～C8烯基、C2～C8炔基；M和N分别为氢、OH或不存在，在此与M或N连接的碳原子和其他碳原子形成单键或双键，各碳原子的双键为一个以下。
所述化学式(1)的化合物中，更优选的化合物是W为CO或CHOR1；X为N3、OR2或SR2；所述R1及R2分别独立地选自氢、C1～C8直链或支链烷基、C2～C8烯基、C2～C8炔基或
Figure BPA00001358187700084
所述Y为O或S；Z为单键；R3选自氢、C1～C8直链或支链烷基、C2～C8烯基、C2～C8炔基M和N分别为氢、OH或不存在，在此与M或N相连的碳原子和其他碳原子形成单键或双键，各碳原子的双键为一个以下。
所述化学式(1)的化合物进一步具体例示如下。
Figure BPA00001358187700091
另外，本发明提供一种所述化学式(1)的化合物的制备方法。
本发明的制备方法包括以下步骤：
步骤(a)将海绵动物Phorbas sp.切断并进行干燥之后，用C1～C4醇提取；
步骤(b)使用水和二氯甲烷对所述步骤a得到的提取物进行溶质分布后，去除有机层溶剂，再使用正己烷、及甲醇与水的混合液进行溶质分布；
步骤(c)去除所述步骤(b)得到的甲醇分液层的溶剂之后，进行色谱分析，使用二氧化硅作为固定相，使用含水20重量％以下或无水甲醇溶液作为洗提液，得到一定量的分离液。
另外，所述制备方法在所述步骤(c)之后还可以包括步骤(d)，即对所述步骤(c)中获得的一定量的分离液进行精制的步骤，
所述步骤(a)中，干燥方式优选使用冷冻干燥方式，所述C1～C4醇优选使用甲醇。优选在室温下提取2小时以上。
在所述步骤(b)中，所述甲醇和水的混合溶液优选甲醇含量为60～90重量％，水的含量为10～40重量％。
所述步骤(c)中，优选进行反相柱色谱分析，使用含水20重量％以下或无水甲醇溶液作为洗提液之前，优选使用极性比甲醇溶液更高的水和甲醇的混合液作为洗提液，并按照洗提液极性的高低顺序进行一次以上的色谱分析。特别是，所述洗提液优选使用水与甲醇的混合液。
所述步骤(d)中，优选利用高效液相色谱(HPLC)进行精制，使用乙腈(ACN)含量为50～80重量％、水含量为20～50重量％的混合液作为洗提液。
另一方面，本发明的化学式(1)的化合物可以是以所述方法分离出的化合物为原材料，通过酯化反应、叠氮取代反应、醚化反应等方法合成而得。
本发明还涉及用于治疗骨质疏松症、脂肪肝及肥胖症的药物组合物，其特征在于，作为药学上可接受的载体及活性成分包含化学式(1)的化合物、其立体异构体、对映异构体、以及在生物体内可水解的所述化合物前体或药学上可接受的盐。
本发明还提供一种用于拮抗肝X受体(LXR)的药物组合物，其特征在于，作为药学上可接受的载体及活性成分包含化学式(1)的化合物、其立体异构体、对映异构体、以及在生物体内可水解的所述化合物前体或药学上可接受的盐。
所述药物组合物中药学上可接受的载体是指指药物载体或介质，只要是在本领域通常使用的盐，没有限制均可使用。例如溶剂、溶质分布剂、填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。
本发明的药物组合物可以利用通常方法成型，即制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、悬浮液、乳胶、糖浆、喷雾剂等口服型、外用剂、栓剂、无菌注射液等形态。
本发明的化学式(1)的化合物、其立体异构体、对映异构体、以及在生物体内可水解的所述化合物前体或药学上可接受的盐的优选给药量虽然根据患者的状况及体重、疾病程度、药物形态、给药途径及给药期限而不同，但本领域人员可以适当选择。例如，一天给药0.01mg/kg至200mg/kg。给药也可以一天一次，也可以分成多次。因此，所述给药量从任何方面都不能限定本发明范围。
本发明的药物组合物可以利用多种途径对大鼠、小鼠、家畜、人等哺乳动物给药。可以适用已知的所有给药方式，例如口服、直肠、静脉、肌肉注射、皮下、子宫内硬膜或侧脑室(intracerebroventricular)注射。
下面，利用实施例更具体说明本发明。但是，下面实施例只是用于例示本发明，本发明不限于下面实施例，可以进行多种修改和变形。
实施例1：新化合物的分离及精制
使用水下呼吸器(skin scubas)采集栖息在国内的海绵动物Phorbas sp.，切成约10cm以下的大小冷冻干燥3日。准备好干燥后重量约1kg的干燥生物，向其加入3.0L的甲醇，在室温下2天内进行2次提取。利用水与二氯甲烷溶剂对所述提取物进行溶质分布，通过减压浓缩从有机层去除溶剂之后，再使用正乙烷、及甲醇85重量％与水15重量％的混合溶液进行溶质分布。其中，从85重量％甲醇分液层去除溶剂之后，得到约5g的提取液。对这些提取液进行反相二氧化硅柱色谱分析。在此，使用二氧化硅C18作为固定相，按照如下极性从高到低的顺序使用洗提液：50％水/50％甲醇、40％水/60％甲醇、30％水/70％甲醇、20％水/80％甲醇、10％水/90％甲醇、100％甲醇、100％丙酮。测定各层物质的成骨细胞分化性能的结果为：分别得到1g左右的10％水/90％甲醇分离液(116V)和100％甲醇分离液(116VI)并在如上两种分离液中能够确定成骨细胞分化性能。
为了对具有活性的2种分离液精制出化合物，实施了半制备反相高效液相色谱(reversephased semiprep HPLC)法。首先在以下条件下对提取液116V进行色谱提纯制得化合物1、9和10。
【色谱柱：YMC ODSC18，粒子直径：5μm，色谱柱尺寸：250×10mm(长度×直径)，洗脱率：2.0ml/min，检测器：折光检测器，洗提液：65重量％的乙腈(ACN)和35重量％的水的混合液】
注入50mg该提取液，当停留时间为33分钟时分离出25mg的橙色油状成分(化合物1)；停留时间为40分钟时分离出1.5mg的橙色油状成分(化合物9)；停留时间为15分钟时分离出1.0mg的橙色油状成分(化合物10)。之后，对提取液116VI也使用了同样的HPLC，但为了分离出后添加的成分，需要在不同的展开剂条件下进行。在此情况下，使用含有70重量％的乙腈和30重量％的水的混合液，1次总展开时间需要约1小时30分钟。其中一次注入5mg提取液时，展开时间为1小时10分钟左右可分离精制出0.5mg橙色油状的化合物2，展开时间为1小时40分钟左右可分离精制出0.08mg化合物3，最后展开时间为1小时57分钟可分离精制出0.004mg化合物4。
实施例2：新化合物的化学结构分析
首先对从所述提取液116V和116VI中得到的化合物1～4、9及10进行核磁共振氢谱测定，检测其纯度，之后使用以下仪器获得光谱数据。首先，利用了质量分析仪(Jeol公司JMS700 spectrometer)测定各化合物的分子量，而精密的化学结构分析是通过核磁共振波谱仪(Varian公司的VNMRS 500 spectrometer)进行的。此外，分别利用Varian公司的Cary50和JACSO公司的FT_IR 4100分光仪测定分子的紫外线吸收带及红外线吸收带，而偏振角的测定则使用JASCO公司的P1010偏光镜。
化合物1被分离成浅橙色的油状，从高性能波谱FAB质量分析数据([M+H]+ m/z 399.2533)能够确定所述化学式(1)的分子式为C25H34O4。根据红外光谱分析，由于特定吸收带出现在3433cm-1 and1680cm-1，所以推定所述化合物1含有羟基和羰基团。另外，通过C13NMR and HNMR探明了化合物的结构。
下面表1整理出了所述化合物1的化学位移值。
表1
Figure BPA00001358187700141
另一方面，为了确定该化合物的相对立体结构，进行了ROESY实验。特别是从位于4.49ppm和2.59ppm处的两氢之间的NOE信息可以确定环A和B顺式(cis)连接；根据5.28ppm中的氢与位于5.54ppm和2.43ppm的两氢之间的NOE信息可以确定环C的立体取向。最后，C-16上的氢的空间取向可以从邻近氢之间的耦合常数(11.3，7.8，3.4Hz)来推定，而且，H-19甲基氢与H-5和H-6氢具有NOE关系，因此可以间接证明。
化合物1的绝对立体化学结构通过圆二色谱(CD)分析确定。环己酮手性中心的绝对立体取向由Snatzke扇区规则(sector rule)确定。在环己酮中环A的C-7手性中心为S型的绝对立体取向情况下，化合物1在圆二色谱的nπ*过渡区(330nm～350nm)显示正吸收。化合物1在330nm～350nm显示正吸收，从而确定化合物1的C-7周边的绝对立体取向为S型(图2)。
对另外5个化合物也采用同上方法分析了化学结构。对3个化合物的各自的碳NMR数据和氢NMR数据在表2至表4分别示出，此外表5整理出了物理及波谱数据。
表2
Figure BPA00001358187700161
表3
Figure BPA00001358187700171
表4
Figure BPA00001358187700181
表5
Figure BPA00001358187700191
实施例3：通过酯化反应合成化合物1的衍生物
Figure BPA00001358187700192
将本发明的化合物1在四氢呋喃中进行溶解。将温度降低0～5℃之后，依次添加了二异丙基乙胺和丁酰氯。在0～5℃条件下搅拌1个小时之后，添加乙酸乙酯和水之后并提取，分离有机溶剂层并进行蒸馏。用快速柱色谱(flash column chromatography)进行精制并得到了化合物5。
化合物5(C29H41O5)的[M+H]+＝469.29
实施例4：通过叠氮取代反应合成化合物1的衍生物
Figure BPA00001358187700201
将本发明的化合物1在二氯甲烷中进行溶解之后，将温度降低至0～5℃。依次添加二叔丁基甲基吡啶、三氟甲磺酸酐，搅拌30分钟。添加二氯甲烷和水并提取之后，分离有机溶剂层并进行蒸馏。将溶剂全部去除之后，重新在二甲基甲酰胺中进行溶解。添加叠氮钠之后，在常温下搅拌3个小时，添加二氯甲烷稀释之后，用水清洗多次。将有机溶剂层分离并蒸馏之后，用快速柱色谱(flash columnchromatography)进行精制并得到了化合物6。
化合物6(C25H34N3O3)：[M+H]+＝424.26
实施例5：化合物1的醚衍生物的合成
Figure BPA00001358187700202
将本发明的化合物1和二叔丁基甲基吡啶在二氯甲烷中进行溶解。添加甲烷三氟磺酸甲酯之后，在常温下搅拌3个小时。将溶剂全部去除之后，用快速柱色谱(flash column chromatography)进行精制并得到了化合物7。
化合物7(C26H37O4)：[M+H]+＝413.27
实施例6：化合物1的碳酸衍生物的合成
Figure BPA00001358187700211
将本发明的化合物1在二氯甲烷中进行溶解之后，将温度降低至0～5℃。依次添加吡啶和乙烯基氯之后，在常温下搅拌1个小时。用二氯甲烷稀释之后用水清洗。将有机溶剂层分离并蒸馏之后，用快速柱色谱(flash column chromatography)进行精制并得到了化合物8。
化合物8(C28H37O6)：[M+H]+＝469.26
实验例1：对新化合物的成骨细胞形成性能测定(CalciumDeposition Assa)
将从ATTC购买的鼠间叶祖细胞C3H/10T1/2在含有5.958g/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、3.7g/L碳酸氢钠、10％胎牛血清(FBS：fetal bovine serum)的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)培养基中进行稀释，在24孔培养板上以浓度4x104 cells/well、37℃、5％CO2情况下培养了2天。培养的细胞在培养板上长出90～100％后，在包含10％FBS的DMEM培养基添加10mM的β甘油磷酸(βglycerophosphate)和50μ/ml的抗坏血酸(ascorbic acid)，在37℃、5％CO2情况下培养了6天，诱导分化成成骨细胞。在分化期间，每两天换一次培养基。将诱导分化成成骨细胞的C3H/10T1/2细胞株用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Phosphate Buffered Saline)清洗1次，用70％的乙醇在20℃固定1小时。将固定完的细胞用冷PBS清洗3次，再用40mM的茜素红S染色溶液在常温下染色20分钟。为了仅选择性观察分化成成骨细胞的细胞，去除染色液并用蒸馏水清洗3次。
将从海绵动物提取并进行溶质分布的一定量液体(116V)和一定量液体(116VI)在DMSO溶剂中进行溶解之后，用1、2.5、5、10和20ug/ml的浓度对间叶祖细胞C3H/10T1/2细胞株进行处理的结果，显现出基于浓度而明显增加的成骨细胞分化性能，在20ug/ml的浓度下观察到较小的细胞毒性。之后，对从一定量液体116V和116IV中简单分离出的化合物1(1163)、化合物2(1162)、化合物3(1161)以及化合物4(1164)进行相同实验，的结果可以确定在化合物1、3以及4中成骨细胞分化性能增加。显现最大活性的浓度略有不同。化合物3(116-1)在2.5ug/ml显示出最大活性，在之后的浓度能够观察到细胞毒性。化合物1(116-3)与没有进行简单分离的一定量液体(116V)的活性类似，随浓度明显增加，到10ug/ml浓度显示最大活性，在20ug/ml浓度下显示出细胞毒性。化合物4在5ug/ml显示出最大活性之后，大于该浓度则观察到细胞毒性(图3)。为了对表现出的成骨细胞分化性能的作用机理进行研究，用化合物1和化合物4对C3H/10T1/2细胞株分别进行6天处理之后，通过实时荧光定量PCR(RTPCR)确认成骨细胞的分化标记因子(Runx2、Osteocalcin、Msx2等)转录明显增加(图4)。另外，用化合物1和化合物4对C3H/10T1/2细胞株分别进行6天处理之后，通过免疫印迹(Western Blot)确认Runx2和TAZ的蛋白质表达增加(图5和图6)。由此可知，本发明的化合物在Runx2和TAZ的蛋白质转录之后，通过调控步骤增加Runx2和TAZ的蛋白质的表达量，从而促进成骨细胞的分化。另外，与此同时，通过化合物的处理，TAZ和Runx2的结合增加，从而可以确认Runx2为介质的转录活性增加。为了制备生物体活性更好的物质，合成了化合物1(1163)的酯衍生物、即化合物5，这样制得的化合物5的结构是确定的。通过钙沉积法(calcium deposition assay)对进一步制得的衍生物的生理活性(成骨细胞的分化性能)进行确认的结果，确认出化合物1的衍生物的化合物5仍然类似程度地促进成骨细胞的分化(图7)。因此，通过本发明的化合物及其衍生物促进成骨细胞的分化，有望在骨质疏松症的治疗中发挥突出作用。
实验例2：对新化合物的脂肪细胞分化抑制性能测定
将从ATTC购买的鼠间叶祖细胞C3H/10T1/2在5.958g/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、3.7g/L碳酸氢钠、10％胎牛血清(FBS：fetalbovine serum)的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)培养基中进行稀释，在24孔培养板上以浓度4x104cells/well、37℃、5％CO2情况下培养2天。在培养板上长出90～100％后的培养细胞后，向含有10％FBS的DMEM培养基中添加5μ/ml胰岛素、1μM***(dexamethason)和5μM曲格列酮(troglitazone)，在37℃、5％CO2情况下培养了8天，诱导分化脂肪细胞。在分化期间，每两天换一次培养基。将诱导分化成脂肪细胞的C3H/10T1/2细胞株用3.7％甲醛在常温下固定了30分钟。将油红O溶解在异丙醇中制得0.5％的油红O溶液，油红O溶液和蒸馏水以6∶4比例对油红O溶液进行稀释，并用0.2μm过滤器过滤之后分注到被固定的细胞株中，在常温下染色1个小时。为了仅观察分化成脂肪细胞的细胞，去除染色液并用蒸馏水清洗2次。
将从海绵动物提取的116V样本在DMSO溶剂中进行溶解之后，分别用浓度为1、2.5、5、10和20ug/ml的溶液处理间叶祖细胞C3H/10T1/2细胞株，结果显示脂肪细胞分化性能随浓度增加而明显减少，之后，对一定量溶液116V和116VI样本进行简单分离得到化合物1(1163)、化合物2(1162)、化合物3(1161)以及化合物4(1164)样本，并进行相同实验。结果确定：脂肪细胞的分化性能同样在10ug/ml的浓度下明显减少。特别是，化合物1(116-3)样本在低浓度(1ug/ml)下与其他样本相比表现出明显的抑制脂肪细胞分化的性能。在脂肪细胞分化过程中，没有观察到各样本具有明显的细胞毒性(图8)。从化合物1对3T3-L1细胞的作用效果的检测结果可知，该细胞也显示出非常优异的脂肪细胞分化性能(图9)。
实验例3：对新化合物的肝X受体(LXR)拮抗效果及选择性测定
使用动物细胞株CV-1进行转染实验。在二氧化碳含量为5％的37℃的细胞培养装置中在DMEM培养基上培养细胞。培养基包含10％胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。实验第一天，将CV-1细胞在96孔(well)板(plate)以5,000cells/well进行了接种。第二天，在被接种的细胞中，应用脂质体(Superfect)(QIAGEN)对GAL-hLXR表达质粒(plasmid)、荧光素酶基因表达质粒以及β-半乳糖苷酶表达质粒进行了转染。16小时后，使用不同浓度的溶解于二甲基亚砜(DMSO)中的化合物1与激动剂TO901317(2.5μM)一起对转染的细胞分别进行处理。阴性对照组的二甲基亚砜的最终处理浓度为1％，阳性对照组的TO901317的最终处理浓度为500nM。培养24小时后，利用裂解缓冲液(lysis buffer)裂解细胞，在光度计(luminometer)添加荧光素(luciferin)测定荧光素酶活性。β-半乳糖苷酶活性是添加ONPG试剂后，利用酶联免疫吸附试验器(ELISA reader)测定。将测定的荧光素酶数值修改为β-半乳糖苷酶活性数值。该实验结果中，化合物1对LXRα及LXRβ分别显示出的IC50值为18.7及20.4nM(图10)。另外，为了对多种核受体的选择性进行测定，利用相同方法测定了对各种核受体的活性。但是，化合物1对其他核受体完全没有显示出活性(图11)。另外，通过Biacore实验证明，化合物1直接与LXR蛋白质(图12)结合。
实验例4：对新化合物的细胞毒性测定
利用鼠的脾细胞进行正常细胞的毒性测定。鼠的脾细胞准备如下。从5～6星期大小的鼠取出脾并切好，通过100μm网眼的网，只过滤出浮动的脾细胞。去除与脾细胞混合在一起的红细胞具体如下：利用红细胞裂解试剂进行裂解之后，离心分离、沉积并清洗细胞。将准备好的脾细胞以5×105cells/well的浓度在96孔(well)板(plate)上接种。在此，在按不同浓度分离出的脾细胞中处理要测定毒性的化学式(1)的化合物。第二天，对培养了16～18小时的细胞利用Cell Titer-Glo发光法细胞活力检测(Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay)试剂(Promega)处理10分钟后，在光度计(luminometer)中测定细胞的生存率。化合物1对鼠脾细胞的细胞毒性IC50值为63μM，这比LXR的拮抗浓度高1000倍以上，从而表明对正常细胞基本没有细胞毒性(图13)。
实验例5：确定新化合物的肝细胞的基因表达功能
为了确定开发的肝X受体拮抗剂的效果，确定了鼠与人类的肝细胞的基因表达调控功能。本实验使用了鼠的肝细胞AML12细胞和人类细胞HepG2细胞。AML12细胞是在二氧化碳含量为5％的37℃的细胞培养装置中在DMEM培养基上培养的。培养基包含10％胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。实验第一天，将AML12细胞在6孔(well)板(plate)进行了接种。第二天，用不包含血清的DMEM培养基替换长出80％左右的细胞的培养基之后，用TO901317与开发的肝X受体拮抗剂进行处理，每组处理3孔(well)。阴性对照组的二甲基亚砜的最终处理浓度为0.2％，阳性对照组的TO901317的最终处理浓度为500nM。为了解拮抗剂的作用，可以单独使用1μM浓度的化合物1进行处理或与500nM的TO901317一起进行处理。培养18小时之后，利用RNeasy总RNA提取试剂盒(QIAGEN，RNeasy total RNA extraction kit)提取了肝细胞的所有RNA。在cDNA合成的各样品中分别定量使用1μg的提取出的RNA。在cDNA合成中利用了反转录cDNA合成试剂盒(Roche，TranscriptorFirst Strand cDNA)。通过实时聚合酶链反应对合成的肝细胞的cDNA进行了基因分析。为了进行实时聚合酶链反应，向合成的cDNA、混合ACC1或肌动蛋白Actin基因选择性引物(primer)和QuantiTechMaster Mix(QIAGEN)。聚合酶链反应是在95℃10秒、60℃15秒、72℃20秒的反应周期下重复45次进行的。所有cDNA样品的聚合酶链反应采用三周期(triplicate)反应方式。为了比较各基因的每个处理组的表达量，利用实时聚合酶链反应软件得到了各样品的Ct值。各处理组的Ct值与阴性对照组的Ct值相比较，计算出基因表达量的差。用GADPH基因表达量的的差修改了各处理组的目标基因的表达量的差。实验结果表明，化合物1可以有效抑制成为脂肪肝发病原因的脂肪酸生物合成基因SREBP1c、ACC及FAS的表达(图14)。
实验例6：对新化合物的实验动物模型的脂肪肝抑制效果测定
为了验证本发明开发的化合物1的脂肪肝抑制效果，对C57BL/6背景的鼠进行了实验。对10星期大小的C57BL/6鼠喂食普通饲料的同时，投用引发脂肪肝的T0901317物质，喂养脂肪肝模型。化合物1的脂肪肝抑制效果是通过口服该化合物进行观察。阴性对造组使用只喂食0.75％羧甲基纤维素的作为给药***的鼠，阳性对照组使用只喂食T0901317物质的鼠。另外，利用吸收光谱仪(Nanodrop)对获得的RNA进行定量，通过RT-PCR方法从各组间的相同量的RNA得到cDNA，所述RT-PCR方法利用核苷酸(oligo dT)和逆转录酶(reversetranscriptase)。将获得的cDNA作为模板(templates)分析组间的mRNA变化，利用与脂肪合成和脂肪的肝流入相关联的基因(transporter)引物(primer)进行实时聚合酶链反应。该实验结果显示，对诱导了脂肪肝的鼠投用化合物1时，处理组和对照组之间的体重没有差异，实验动物模型也显示出非常优异的脂肪肝抑制效果(图15及图16)。另外，分析脂肪肝表达的结果显示能够有效抑制成为脂肪肝发病原因的脂肪酸的合成基因和向肝转移脂肪的转达基因的表达(图17)。因此，本发明的化合物及其衍生物有望对酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、细菌感染引起的脂肪肝的治疗发挥突出的作用。

Claims (10)

1.一种化合物以及其药学上可接受的盐，其特征在于，
所述化合物选自如下化合物
Figure FDA0000387307220000011
2.一种权利要求1的化合物的制备方法，其特征在于，包括：
步骤a、将海绵动物Phorbas sp.切断并进行干燥之后，用C1～C4醇提取；
步骤b、使用水和二氯甲烷对所述步骤a得到的提取物进行溶质分布后，去除有机层溶剂，再使用正己烷、及甲醇与水的混合液进行溶质分布；
步骤c、去除所述步骤b得到的甲醇分液层的溶剂之后，进行色谱分析，使用二氧化硅作为固定相，使用含水20重量％以下或无水甲醇溶液作为洗提液，从而获得分离液。
3.如权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：
所述步骤a中，干燥方式使用冷冻干燥方式，所述C1～C4醇使用甲醇。
4.如权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：
所述步骤b中，所述甲醇与水的混合液中，含有60～90重量％的甲醇和10～40重量％的水。
5.如权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：
所述步骤c中，使用含水20重量％以下或无水甲醇溶液作为洗提液之前，使用极性高于甲醇溶液的水和甲醇的混合液作为洗提液，并按照洗提液极性的高低顺序进行一次以上色谱分析。
6.如权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：
所述制备方法还包括
步骤d对所述c步骤得到的分离液进行精制；
所述精制是通过高效液相色谱来进行，使用含有50～80重量％的乙腈和20～50重量％的水的混合液作为洗提液。
7.一种用于治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于，作为药学上可接受的载体及活性成分包含权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐。
8.一种用于治疗脂肪肝的药物组合物，其特征在于，作为药学上可接受的载体及活性成分包含权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐。
9.一种肥胖症的药物组合物，其特征在于，作为药学上可接受的载体及活性成分包含权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐。
10.一种肝X受体拮抗用药物组合物，其特征在于，作为药学上可接受的载体及活性成分包含权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐。
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