CN109136300B - 一种玉米赤霉烯酮脱毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，将Lt‑OMT的基因与pRS425载体连接构建重组人工质粒92‑Lt‑OMT‑YEp‑Leu，将人工质粒92‑Lt‑OMT‑YEp‑Leu转入感受态酵母细胞中，将酵母细胞置于Leu营养缺陷型培养基中培养，在Leu营养缺陷型培养基中加入玉米赤霉烯酮ZEN，酵母细胞合成的Lt‑OMT将玉米赤霉烯酮ZEN转化为3‑OCH₃‑ZEN。本发明的ZEN被Lt‑OMT转化为3‑OCH₃‑ZEN，实验证明3‑OCH₃‑ZEN对小鼠无明显毒副作用。在酵母发酵***中Lt‑OMT对ZEN的转化效率达98%以上，HPLC分析几乎无底物残留。

Description

一种玉米赤霉烯酮脱毒方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)脱毒方法，该方法利用一种可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)的氧甲基转移酶(Lasiodiplodia theobromae Oxymethyltransferase,Lt-OMT)将玉米赤霉烯酮ZEN的3位羟基(-OH)转化为氧甲基(-OCH₃)。

背景技术

玉米赤霉烯酮(ZEN)主要是禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、三线镰刀菌(F.tricinctum)、黄色镰孢(F.culmorum)、木贼镰孢(F.equiseti)、半裸镰孢(F.sernitectum)、茄病镰孢(F.solani)等真菌产生的次级代谢产物，广泛存在于谷物及其制品中。玉米赤霉烯酮ZEN具有类***作用，可与动物机体***受体结合，诱发生殖毒性和致畸、致癌作用，严重影响动物繁殖性能，另外，玉米赤霉烯酮ZEN可导致机体免疫抑制、肝肾损伤、消化吸收障碍等危害。

目前我国粮食作物种植、收购、加工规模化程度不高，个人或小型企业在作物或其制品加工、运输或储存过程中霉菌防范意识不强，导致相关产品中玉米赤霉烯酮ZEN检出率较高，且平均含量远超发达国家平均水平。如：2017年，龚阿琼等对我国多地饲料原料或饲料中霉菌毒素检测分析得出，玉米中ZEN检出率为91.9％，超标率为5.4％；麦麸中ZEN检出率为100％，超标率为13％；干酒糟及其可溶物(Distillers Dried Grains withSolubles,DDGS)中ZEN检出率为100％，超标率为43.8；玉米胚芽粕中ZEN检出率为100％，超标率为35％；猪饲料中ZEN检出率为100％，超标率为7.1％；反刍料中ZEN检出率为100％，超标率为22.2％；通过与往年数据对比，ZEN的超标率呈现上升趋势。因此，玉米赤霉烯酮ZEN污染造成资源巨大浪费，严重危害我国畜牧业的发展并对人们生命健康产生严重威胁。

现阶段，ZEN脱毒方法主要有物理法、化学法和生物法三类。物理法采用毒素吸附剂进行脱毒，但多数吸附效果差、脱毒不彻底，成本较高，且饲料营养成分损失较大，大大限制了其在饲料脱毒上的应用。化学法对ZEN脱毒效果优于物理法，但同样因造成营养成分的破坏或造成二次污染未得到广泛应用。生物法主要利用微生物产生的酶对ZEN的高效降解作用，或利用微生物体对ZEN的特异吸附作用而脱除，该法具有反应条件温和、特异性好、无化学试剂残留、不破坏饲料营养等优点，是当前真菌毒素脱毒技术中最有发展前景的处理技术。但该技术也存在不足，如筛选的微生物也是动物致病菌；微生物产生的次级代谢产物对动物体存在毒性作用；生物酶降解ZEN的中间产物对动物体仍有毒性作用；生物酶产量低、分离纯化过程复杂、酶活性不稳定、酶作用条件苛刻等，这些缺点也限制了ZEN生物脱毒领域的发展。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明内容提供一种具有良好脱毒效应，脱毒效率高，无毒副作用的玉米赤霉烯酮脱毒方法，利用Lt-OMT将玉米赤霉烯酮(ZEN)的3位-OH转换为-OCH₃。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，其特征在于：利用可可毛色二孢菌的氧甲基修饰酶Lt-OMT将玉米赤霉烯酮的3位羟基-OH替换为氧甲基基团-OCH₃。

将Lt-OMT的基因与pRS425载体连接构建人工重组质粒92-Lt-OMT-YEp-Leu，将人工重组质粒92-Lt-OMT-YEp-Leu转入感受态酵母细胞中，将酵母细胞置于Leu营养缺陷型培养基中培养，在Leu营养缺陷型培养基中加入玉米赤霉烯酮实现共培养，酵母细胞合成的Lt-OMT将玉米赤霉烯酮转化为3-OCH₃-ZEN，反应式为：

玉米赤霉烯酮脱毒方法，具体步骤为：

(1)基因克隆：

根据Lt-OMT的核苷酸序列设计正链和反链引物，通过PCR的方法，获得目的基因Lt-OMT；

(2)重组质粒的构建：

①利用限制性内切酶NdeI、PmeI酶切Lt-OMT PCR产物和pRS425载体，通过T4DNA连接酶将酶切后Lt-OMT基因片段与酶切后pRS425载体连接构建重组质粒92-Lt-OMT-YEp-Leu；

②将重组质粒92-Lt-OMT-YEp-Leu导入感受态大肠杆菌DH5α细胞中表达，碱裂解法提取质粒，利用NdeI和PmeI酶切质粒后进行琼脂糖电泳验证目的基因是否完整；

(3)酵母转化：

将构建的92-Lt-OMT-YEp-Leu重组质粒导入感受态酵母细胞BJ5464-NpgA中；

(4)玉米赤霉烯酮和酵母转化子共培养：

将10mg玉米赤霉烯酮置于含有酵母转化子的营养缺陷型-Leu培养液中培养48h；所述酵母转化子为1μg的92-Lt-OMT-YEp-Leu重组质粒；

(5)发酵产物提取：

①将发酵液1580g离心5min，分别收集上清液、沉淀物；

②将①中上清液与等体积的乙酸乙酯混合，充分混匀后倒入分液漏斗里，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

③将步骤②的沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

④将步骤③的沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

⑤将步骤②③④上清液混合并转入旋转蒸发仪，浓缩至膏状；

⑥在①沉淀物中加入3倍体积甲醇并超声15min，倒入分液漏斗里，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

⑦将步骤⑥沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，反复抽提三次，合并三次上清液；

⑧将步骤⑦上清液转入旋转蒸发仪，浓缩至膏状；

⑨将步骤⑤⑧获得的浓缩物用色谱甲醇复溶，用0.22μm滤膜过滤后，13400g离心10min，上清液装入棕色液相进样瓶中备用。

(6)纯化转化产物：

通过硅胶柱层析法，用不同比例的流动相分离粗提物的各组分，收集各馏分；将各馏分进行薄层色谱(Thin-layer chromatography,TLC)点板，筛选目标化合物。

(7)转化产物结构分析：

发酵产物经高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析发现，4.790min的ZEN底物峰消失，在4.175min生成一个新峰(见附图3)。

收集转化产物馏分(4.175min处化合物)，旋转蒸法至白色晶体粉末析出并称重，得出新化合物质量为9.8mg。

经质谱分析仪(Mass Spectrometry,MS)分析新化合物的分子量为333.8(见附图4)。

经核磁共振法(Nuclear-magnetic Resonance,NMR)分析得出，新化合物结构为3-OCH₃-ZEN(见附图5、表2)。

分析得出该酶在酵母发酵***(BJ5464-NpgA)内对ZEN的转化效率为98％。

Lt-OMT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1.ZEN被Lt-OMT转化为3-OCH₃-ZEN，试验证明3-OCH₃-ZEN对小鼠无明显毒副作用。

2.在酵母发酵***中Lt-OMT对ZEN的转化效率达98％以上，HPLC分析几乎无底物残留。

本发明采用在酵母发酵***(Saccharomyces cerevisiae BJ5464-NpgA,BJ5464-NpgA)中异源表达Lt-OMT，Lt-OMT可特异性的将ZEN的3位-OH转化为-OCH₃，转化效率达98％以上。将上述转化产物纯化后进行小鼠毒性试验，结果发现转化后化合物按10mg/kg剂量连续给药5天，对小鼠无明显毒副作用，而同剂量的ZEN可明显引起小鼠肝脏、肾脏、生殖***损伤，死亡率达50％，说明所述方法对ZEN具有良好的脱毒效应，脱毒效率高。

附图说明

图1、92-Lt-OMT-YEp-Leu质粒图谱；

图2、92-Lt-OMT-YEp-Leu质粒酶切后目的基因完整性检验图，其中1：目的基因；2/3：酶切产物；

图3、ZEN、转化产物的HPLC分析结果图，注：A：ZEN标准品HPLC图谱；B：转化产物HPLC图谱；

图4、ZEN、转化产物的质谱分析结果图，注：A：ZEN标准品MS图谱；B：转化产物MS图谱；

图5、ZEN转化产物的NMR分析结果图，注：A:3-OCH₃-ZEN ¹H谱图；B:3-OCH₃-ZEN ¹³C谱图；C:3-OCH₃-ZEN HMBC图谱；D:3-OCH₃-ZEN HSQC图谱。

表1、Lt-OMT的核苷酸序列；

表2、ZEN转化产物的NMR图谱解析。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

(一).实验材料：

①菌株与载体：

E.coli DH5α感受态细胞购自康为世纪公司；

BJ5464-NpgA：来源于中国农业科学院生物技术研究所；PRS42载体：由中国农业科学院生物技术研究所生物合成实验室构建。

②酶与试剂盒：

Nde I、Pme I、T4连接酶，购自NEB公司产品；

Taq酶购自全式金公司；

质粒提取、胶回收试剂盒分别购自TIGEN公司、AXYGEN公司。

实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，分子克隆按(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

(二).Lt-OMT对ZEN的甲基化修饰的具体实施方式：

1.目的基因克隆：

根据Lt-OMT的核苷酸序列(表1，SEQ ID NO.1)，设计引物，通过PCR的方法，获得目的基因。Lt-OMT引物序列，正链引物F：5’-GATCTGGGTGGTTATGCAAGATA-3’(SEQ ID NO.3)；反链引物R：5’-ACCATCTGCTGACTTGTACGA-3’(SEQ ID NO.4),Size:1.2kb。

表1 Lt-OMT核苷酸序列信息(SEQ ID NO.1)

注：Lt-OMT的核苷酸序列的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)为：

MRSYSLDIVPKIEAILADAKQLEDEDLSARLGLMTQVDRLYQDLESPIELFFRQWTDVTVYSCVNVAIKLGIFEKMKAKENISAQELADLVGVDLDVIVRVMRVLVAAGIVASPVEETYSHTPKSLIFVRGKGTAVGSFELIALYAKSYLSLPEYLKTRPSADLYDVCKTPYAYEYGIEGKPFYEALSSVPQHLDIFNRAMDEPTTECGIFPWSSLKEEVQAEPDRAFIVDIGGGSGKVLHFARAETGDVFGTSARLILQERPDALAQLDTAQQSGIEMMAYDFHTEQPIKGAHIYHLGHILHNHPDHICRDILKRIAEAMSPKSRLLIFDAVIPARTEPGKYMNGYLIDIVGLATGGKERTEKETAALLDAEGLEFVRVWHGQAGWQGVIEARLKRG

①PCR反应体系(25μL)如下：

模板DNA(0.1μg/mL)：1.00μL；

正链引物(100pmol/L)：2.00μL；

10×Buffer(1.0mmol/L)：2.50μL；

反链引物(100pmol/L)：2.00μL；

dNTP(1.0mmol/L)：8.00μL；

Taq DNA聚合酶(5.0U/μL)：1.00μL；

灭菌双蒸水：8.50μL。

②PCR反应条件为：94℃预变性处理1min；94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸90s，循环次数30次；最后72℃延伸7min，于4℃保存备用。

③将PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并进行PCR产物回收。

2.重组质粒构建：

1)用Nde I和Pme I酶切Lt-OMT(步骤1获得的PCR产物)和PRS425载体。

2)利用T4 DNA连接酶连接1)中酶切产物以构建92-Lt-OMT-YEp-Leu质粒(见附图1)。

3)将92-Lt-OMT-YEp-Leu质粒转化至E.coli DH5α中，并均匀涂布到含50μg/mL氨苄西林(Ampicillin,Amp)的固体溶菌肉汤(Luria-Bertani,LB)培养基中，置于37℃培养箱中培养12-14h。

4)挑取阳性克隆子，转移到含Amp(50μg/mL)的液体LB培养基(4mL)中，37℃恒温摇床(200rpm)培养12-14h。

5)利用碱裂解法提取质粒，用Nde I和Pme I酶切质粒，产生6000bp、1200bp两条片段(附图2)。

6)保存质粒。

3.酵母转化：

将构建的92-Lt-OMT-YEp-Leu质粒(步骤2获得)转化到BJ5464-NpgA中，具体步骤如下：

1)在固体酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(Yeast Extract Peptone DextroseMedium,YPD)培养基上，通过划线法分离BJ5464-NpgA单菌落，置于恒温培养箱(30℃)培养16h。

2)挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，置恒温摇床中(30℃，220rpm)培养，每隔2h检测OD值，当OD₆₀₀处于0.8-1.0之间时停止培养。

3)离心(500g，4min)收集酵母菌，弃上清。

4)使用酵母转化试剂盒(ZYMO,No.T2001)进行转化，具体操作如下：

a.用10mL EZ1溶液重悬细胞，离心(500g,4min)后弃上清。

b.用1mL EZ2溶液重悬细胞，分装(50μL)后进行转化或-80℃保存。

c.将1μg的92-Lt-OMT-YEp-Leu质粒与50μL的酵母感受态细胞混合后加入500μLEZ3溶液，混合均匀，置于恒温培养箱(30℃)中孵育45min，孵育过程中重悬2-3次。

5)吸取100μL转化液涂到固体亮氨酸缺乏培养基(-Leu)中，30℃恒温培养72h。

6)生长的菌落即为酵母转化子。

4.酵母转化子与ZEN共培养：

1)通过划线法将酵母转化子(步骤3酵母转化获得)涂布到新的固体SC-Leu培养基(Clontech,3013C204)上，30℃恒温培养48h。

2)收集酵母细胞并接种到250mL液体-Leu培养基中，置于恒温摇床(30℃,220rpm)中扩大培养24h。

3)在锥形瓶中加入250mL YPD培养基、1mL ZEN标准品溶液(10mg/mL)后继续培养48h。

5.发酵产物提取：

①将发酵液(步骤4：酵母转化子与ZEN共培养获得)1580g离心5min，分别收集上清液、沉淀物。

②将①中上清液与等体积的乙酸乙酯混合，充分混匀后倒入分液漏斗里，静置分层，分别收集上清液、沉淀物。

③将步骤②的沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，静置分层，分别收集上清液、沉淀物。

④将步骤③的沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，静置分层，分别收集上清液、沉淀物。

⑤将步骤②③④上清液混合并转入旋转蒸发仪，浓缩至膏状(水浴锅恒温37℃，冷凝池恒温0℃，真空压力恒压100mbar，旋转蒸发转速为60rpm)。

⑥在①沉淀物中加入3倍体积甲醇并超声(频率为39900Hz)15min，倒入分液漏斗里，静置分层，分别收集上清液、沉淀物。

⑦将步骤⑥沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，反复抽提三次(同步骤②-④)，合并三次上清液。

⑧将步骤⑦上清液转入旋转蒸发仪，浓缩至膏状(同步骤⑤)。

⑨将步骤⑤⑧获得的浓缩物用色谱甲醇(2mL)复溶，用0.22μm滤膜过滤后，13400g离心10min，上清液装入棕色液相进样瓶中备用。

6.纯化转化产物

①实验材料：200目硅胶柱；薄层色谱(Thin-layer chromatography,TLC)硅胶板；手提式紫外灯。

②方法：通过硅胶柱层析法，用不同比例的流动相(二氯甲烷、甲醇)分离粗提物的各组分，收集各馏分；将各馏分进行TLC点板，筛选目标化合物(流动相是二氯甲烷：甲醇体积比为99:1)。

7.转化产物的HPLC分析、制备：

1)分析条件如下：

HPLC仪(Agilent 1290Infinity UHPLC,GER)；色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18Narrow Bore,5μm×2.1mm×150mm。

流动相：乙腈：水(90：10)，进行梯度洗脱；

梯度洗脱条件：0～1min，乙腈10％；1～3min，乙腈从10％→95％；3～5min，乙腈为95％；5～8min，乙腈从95％→10％；8～10min，乙腈为10％。

流速：0.5mL/min，检测波长：300nm。

2)结果分析：

①保留时间4.790min的ZEN底物峰消失，保留时间4.175min生成一个新峰(见附图3)。

②收集转化产物馏分(4.175min处化合物)，旋转蒸发(水浴锅恒温37℃，冷凝池恒温0℃，真空压力恒压100mbar，旋转蒸发转速为60rpm)至白色晶体粉末析出并称重，得出新化合物质量为9.8mg。

8.转化产物的MS分析：

1)分析条件如下：

a)仪器设备：

MS仪(Agilent 6100Single quadrupole mass spectrometry,GER)；UHPLC仪(Agilent 1290Infinity UHPLC,GER)；色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 Narrow Bore,5μm×2.1mm×150mm。

b)电喷雾电离(Electrospray ionization,ESI)条件：

毛细管电压：3.0kV；源温度：20℃；去溶剂温度：350℃；锥孔气流：氮气，流速100L/h；去溶剂气流：氮气，流速600L/h；碰撞气：氩气，碰撞气压2.60×10^-4Pa。

c)扫描方式：

负离子扫描。

d)多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM)条件：

扫描范围(m/z)：0-1000。

2)结果分析：

ZEN标准品：驻留时间：0.2s；锥孔电压：30V；碰撞能量：28eV、32eV；保留时间：4.790min。母离子(m/z)：317.8，子离子(m/z)：300.8(见附图4A)。

转化产物：驻留时间：0.2s；锥孔电压：30V；碰撞能量：25eV、30eV；保留时间：4.175min。母离子(m/z)：332.8，子离子(m/z)：314.8(见附图4B)。

转化产物的分子量为333.8，ZEN分子量为318.8，转化产物的分子量较ZEN的增加了15。

9.转化产物的NMR(Bruker,AVANCE 600MHz,GER)分析：

1)分析条件如下：

a)仪器设备：

NMR仪(Bruker,AVANCE 600MHz,GER)。

b)分析参数：

循环等待时间为2s，混合时间为100ms，脉冲延迟时间(t1)4μs，谱宽为10000Hz，采样时间为1.64s，采样点数为32k，累加次数为64。

质子共振频率为600.13MHz.¹H-¹H J-RES的F₂(¹H)维的谱宽为600.13Hz，采样数据点阵t₂×t₁＝4096×64；¹H-¹³C HSQC的F₂(¹H)和F₁(¹³C)维的谱宽分别6313.13Hz和26409.97Hz，采样数据点阵t₂×t₁＝2048×90；¹H-¹³C HMBC的F₂(¹H)和F₁(¹³C)维的谱宽分别6313.13Hz和33201.94Hz，采样数据点阵t₂×t₁＝2048×100。

2)结果分析：

结构解析后证实ZEN 3位C上的-OH被转化为-OCH₃(见附图5、表2)。

证明Lt-OMT对ZEN 3位-OH进行氧甲基修饰。

表2、ZEN转化产物NMR图谱解析

注：s＝single，m＝multiple，t＝triple，CD3OD为氘代甲醇，δ为化学位移，J为耦合常数，ppm为化学位移单位。

本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明的范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种玉米赤霉烯酮脱毒方法

<130> xhx2018072601

<141> 2018-07-26

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1197

<212> DNA

<213> Lasiodiplodia theobromae

<400> 1

atgagatcct actcattgga tatcgtccca aagattgaag ctattttggc tgatgctaag 60

caattggaag atgaagattt gtctgctaga ttgggtttga tgacccaagt tgacagatta 120

taccaagact tggaatcccc aatcgaatta ttcttcagac aatggactga tgtcaccgtt 180

tactcttgtg ttaatgttgc cattaagttg ggtatcttcg aaaagatgaa ggccaaagaa 240

aacatctccg ctcaagaatt ggctgatttg gttggtgttg atttggatgt tatcgtcaga 300

gttatgagag ttttggttgc tgctggtata gttgcttctc cagttgaaga aacttactct 360

catactccaa agtccttgat cttcgttaga ggtaaaggta ctgctgttgg ttcctttgaa 420

ttgattgcct tgtacgctaa gtcctacttg tctttgccag aatacttgaa aactagacca 480

tctgctgact tgtacgatgt ctgtaaaact ccatacgctt acgaatacgg tattgaaggt 540

aagccattct acgaagcttt atcctctgtt ccacaacact tggatatttt caacagagct 600

atggatgaac ctactaccga atgtggtatt tttccatggt cctcattgaa agaagaagtt 660

caagctgaac cagatagagc cttcatagtt gatattggtg gtggttctgg taaggtcttg 720

cattttgcta gagctgaaac tggtgatgtt tttggtactt cagctagatt gatattgcaa 780

gaaagaccag atgctttggc tcaattggat actgctcaac aatctggtat tgaaatgatg 840

gcctacgatt tccatactga acaacctatt aagggtgccc atatctatca tttgggtcat 900

atcttgcata accacccaga tcatatctgc agagatatct tgaagagaat tgctgaagct 960

atgtccccaa agtccagatt attgattttc gatgctgtta ttccagccag aactgaacca 1020

ggtaagtata tgaatggtta cttgatcgat atcgttggtt tggctactgg tggtaaagaa 1080

agaactgaaa aagaaaccgc tgctttgttg gatgctgaag gtttggaatt tgttagagtt 1140

tggcatggtc aagctggttg gcaaggtgtt attgaagcaa gattgaaaag aggttaa 1197

<210> 2

<211> 398

<212> PRT

<213> Lasiodiplodia theobromae

<400> 2

Met Arg Ser Tyr Ser Leu Asp Ile Val Pro Lys Ile Glu Ala Ile Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Lys Gln Leu Glu Asp Glu Asp Leu Ser Ala Arg Leu Gly

20 25 30

Leu Met Thr Gln Val Asp Arg Leu Tyr Gln Asp Leu Glu Ser Pro Ile

35 40 45

Glu Leu Phe Phe Arg Gln Trp Thr Asp Val Thr Val Tyr Ser Cys Val

50 55 60

Asn Val Ala Ile Lys Leu Gly Ile Phe Glu Lys Met Lys Ala Lys Glu

65 70 75 80

Asn Ile Ser Ala Gln Glu Leu Ala Asp Leu Val Gly Val Asp Leu Asp

85 90 95

Val Ile Val Arg Val Met Arg Val Leu Val Ala Ala Gly Ile Val Ala

100 105 110

Ser Pro Val Glu Glu Thr Tyr Ser His Thr Pro Lys Ser Leu Ile Phe

115 120 125

Val Arg Gly Lys Gly Thr Ala Val Gly Ser Phe Glu Leu Ile Ala Leu

130 135 140

Tyr Ala Lys Ser Tyr Leu Ser Leu Pro Glu Tyr Leu Lys Thr Arg Pro

145 150 155 160

Ser Ala Asp Leu Tyr Asp Val Cys Lys Thr Pro Tyr Ala Tyr Glu Tyr

165 170 175

Gly Ile Glu Gly Lys Pro Phe Tyr Glu Ala Leu Ser Ser Val Pro Gln

180 185 190

His Leu Asp Ile Phe Asn Arg Ala Met Asp Glu Pro Thr Thr Glu Cys

195 200 205

Gly Ile Phe Pro Trp Ser Ser Leu Lys Glu Glu Val Gln Ala Glu Pro

210 215 220

Asp Arg Ala Phe Ile Val Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Lys Val Leu

225 230 235 240

His Phe Ala Arg Ala Glu Thr Gly Asp Val Phe Gly Thr Ser Ala Arg

245 250 255

Leu Ile Leu Gln Glu Arg Pro Asp Ala Leu Ala Gln Leu Asp Thr Ala

260 265 270

Gln Gln Ser Gly Ile Glu Met Met Ala Tyr Asp Phe His Thr Glu Gln

275 280 285

Pro Ile Lys Gly Ala His Ile Tyr His Leu Gly His Ile Leu His Asn

290 295 300

His Pro Asp His Ile Cys Arg Asp Ile Leu Lys Arg Ile Ala Glu Ala

305 310 315 320

Met Ser Pro Lys Ser Arg Leu Leu Ile Phe Asp Ala Val Ile Pro Ala

325 330 335

Arg Thr Glu Pro Gly Lys Tyr Met Asn Gly Tyr Leu Ile Asp Ile Val

340 345 350

Gly Leu Ala Thr Gly Gly Lys Glu Arg Thr Glu Lys Glu Thr Ala Ala

355 360 365

Leu Leu Asp Ala Glu Gly Leu Glu Phe Val Arg Val Trp His Gly Gln

370 375 380

Ala Gly Trp Gln Gly Val Ile Glu Ala Arg Leu Lys Arg Gly

385 390 395

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Lasiodiplodia theobromae

<400> 3

gatctgggtg gttatgcaag ata 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Lasiodiplodia theobromae

<400> 4

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Claims (5)

1.一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，其特征在于：利用可可毛色二孢菌的氧甲基修饰酶Lt-OMT将玉米赤霉烯酮的3位羟基(-OH)替换为氧甲基基团(-OCH₃)；Lt-OMT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Lt-OMT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述方法的反应式为：

2.根据权利要求1所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，其特征在于：将Lt-OMT的基因与pRS425载体连接构建人工重组质粒92-Lt-OMT-YEp-Leu，将人工重组质粒92-Lt-OMT-YEp-Leu转入感受态酵母细胞中，将酵母细胞置于Leu营养缺陷型培养基中培养，在Leu营养缺陷型培养基中加入玉米赤霉烯酮实现共培养，酵母细胞合成的Lt-OMT将玉米赤霉烯酮转化为3-OCH₃-ZEN。

3.根据权利要求2所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，其特征在于：具体步骤为：

(1)基因克隆：

根据Lt-OMT的核苷酸序列设计正链和反链引物，通过PCR的方法，获得目的基因Lt-OMT；

(2)重组质粒的构建：

①利用限制性内切酶NdeI、PmeI酶切Lt-OMT PCR产物和pRS425载体，通过T4DNA连接酶将酶切后Lt-OMT基因片段与酶切后pRS425载体连接构建重组质粒92-Lt-OMT-Yep-Leu；

②将重组质粒92-Lt-OMT-Yep-Leu导入感受态大肠杆菌DH5α细胞中表达，碱裂解法提取质粒，利用NdeI和PmeI酶切质粒后进行琼脂糖电泳验证目的基因是否完整；

(3)酵母转化：

将构建的92-Lt-OMT-Yep-Leu重组质粒导入感受态酵母细胞BJ5464-NpgA中；

(4)玉米赤霉烯酮和酵母转化子共培养：

将10mg玉米赤霉烯酮置于含有酵母转化子的营养缺陷型-Leu培养液中培养48h；所述酵母转化子为含有1μg 92-Lt-OMT-Yep-Leu重组质粒的酵母细胞；

(5)发酵产物提取；

(6)纯化转化产物：

通过硅胶柱层析法，用不同比例的流动相分离粗提物的各组分，收集各馏分；将各馏分进行薄层色谱点板，筛选目标化合物；

(7)转化产物结构分析。

4.根据权利要求3所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，其特征在于：步骤(5)的具体步骤为：

①将发酵液1580g离心5min，分别收集上清液、沉淀物；

②将①中上清液与等体积的乙酸乙酯混合，充分混匀后倒入分液漏斗里，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

③将步骤②的沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

④将步骤③的沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

⑤将步骤②③④上清液混合并转入旋转蒸发仪，浓缩至膏状；

⑥在①沉淀物中加入3倍体积甲醇并超声15min，倒入分液漏斗里，静置分层，分别收集上清液、沉淀物；

⑦将步骤⑥沉淀物与等体积乙酸乙酯混合均匀，反复抽提三次，合并三次上清液；

⑧将步骤⑦上清液转入旋转蒸发仪，浓缩至膏状；

⑨将步骤⑤⑧获得的浓缩物用色谱甲醇复溶，用0.22μm滤膜过滤后，13400g离心10min，上清液装入棕色液相进样瓶中备用。

5.根据权利要求3所述的一种玉米赤霉烯酮脱毒方法，其特征在于：步骤(7)的具体步骤为：

①发酵产物经高效液相色谱法分析，4.790min的玉米赤霉烯酮底物峰消失，在4.175min生成一个新峰；

②收集转化产物馏分，即4.175min处化合物，旋转蒸法至白色晶体粉末析出并称重；

③经质谱分析仪分析新化合物的分子量为333.8；

④经核磁共振法分析得出，新化合物结构为3-OCH₃-ZEN；

⑤分析得出该酶在酵母发酵***BJ5464-NpgA内对玉米赤霉烯酮的转化效率为98％。

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