CN112725235B - 一种梭状芽孢杆菌属新菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于酿酒微生物技术领域，具体涉及一种梭状芽孢杆菌属新菌株及其应用。针对现有能够在白酒发酵过程中提升香气的功能微生物种类较少的问题，本发明提供了一种梭状芽孢杆菌属新菌株，保藏编号为CGMCC NO.19455。本发明的新菌株能够同时高产丁酸、戊酸乙酯、乙酸乙酯和2‑戊酮，为白酒酿造中产香提供了新的菌株，丰富了酿酒微生物的资源，具有很好的应用价值。

Description

一种梭状芽孢杆菌属新菌株及其应用

技术领域

本发明属于酿酒微生物技术领域，具体涉及一种梭状芽孢杆菌属新菌株及其应用。

背景技术

中国白酒因其独特的口感与香气被誉为世界六大蒸馏酒之一，浓香型白酒是占有举足轻重的地位。自古以来就有“老窖出好酒”的说法，窖泥对浓香型白酒的品质和风味有重要影响。窖泥细菌代谢产生的酸是浓香型白酒中的重要物质，在酒中起到呈香、助香、减少酒体刺激以及缓冲平衡的作用。其中的梭状芽孢杆菌就能产生己酸，是合成浓香型白酒的主体呈香物质己酸乙酯的重要前体物质。在白酒生产中常通过人工窖泥的方法强化于窖泥中。

众所周知，酒中的基本组分一致，主要是乙醇和水，约占总量的98％，剩余2％的组分才是形成白酒独特风格的色谱骨架成分和微量香气物质。目前白酒中香气组分已检出470多种，主要包含酯类、有机酸、醇类、醛酮化合物、芳香族化合物等物质。它们的含量虽然极少，但却决定着白酒的风格特征。

目前发现的能够产香的功能微生物还较少，利用微生物发酵来对白酒增香的技术还有待进一步开发。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有能够在白酒发酵过程中提升香气的功能微生物种类较少，需要开发。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种梭状芽孢杆菌属新菌株。本发明所述的梭状芽孢杆菌新菌株，保藏编号为CGMCC NO.19455。保藏时间为2020年3月6日，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

其中，上述梭状芽孢杆菌属新菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO:1梭状芽孢杆菌属新菌株的16S rDNA核苷酸序列

TCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGGGCGAAGAAGCTCCTTCGGGAGAATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCAAAGAGGGGGATAGCCTCCCGAAAGGGAGATTAATACCGCATGACAAATATAATCCGCATGGATTATATTTTAAAGGAGAAATCCGCTTTGAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGCAGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGAACGGCCACATTGGAACTGAGAGACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATTGTAAAGCTCTGTCATCTGGGACGATAATGACGGTACCAGATGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGCAGGCGGACATTTAAGTGAGATGTGAAATACCCGGGCTTAACCCGGGCAGTGCATTTCAAACTGGGTGTCTGGAGTGCAGGAGAGGAGAACGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGACTGTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAGGTGTAGGAGGTATCGACCCCTTCTGTGCCGCAGTAAACACAATAAGTACTCCGCCTGGGAAGTACGATCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGACTTGACATCCCCTGCATATCTCAGAGATGAGAGAAGCCCTTCGGGGCAGGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTTGTTAGTTGCTAACAGTAAGATGAGCACTCTAACGAGACTGCCGCGGTTAACGCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCAACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAGAGAGAAGCAAGGCCGCGAGGTGGAGCGAACCTCAAAAACTGTTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGAAACCCGCCTGCATGAAGCTGGAGTTGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGCCGGCAACACCCGAAGTCCGTAGTCTAACGAAAGAGGACGCGGCCGAAGGTGGGGTTGGTGATTGGGGTG。

其中，上述梭状芽孢杆菌属新菌株的细胞学特征为：菌体为杆状，菌落呈浅黄色，圆形，表明光滑湿润、边缘整齐。

其中，上述梭状芽孢杆菌属新菌株的生物学特征为：能利用水杨苷、D-木糖、L-***糖、明胶、D-松三糖、D-棉子糖、D-山梨醇、L-鼠李糖或D-海藻糖；不能利用色氨酸、尿素、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-乳糖、D-蔗糖、D-麦芽糖、七叶灵柠檬酸铁、丙三醇、D-纤维二糖或D-甘露糖；过氧化氢试验呈阴性。

其中，上述梭状芽孢杆菌属新菌株同时产戊酸乙酯和2-戊酮。

其中，上述梭状芽孢杆菌属新菌株同时产丁酸、戊酸乙酯、乙酸乙酯和2-戊酮。

其中，上述梭状芽孢杆菌属新菌株的产戊酸乙酯的能力达到6.37ppm。

其中，上述梭状芽孢杆菌属新菌株的产2-戊酮的能力达到3.16ppm。

其中，上述梭状芽孢杆菌属新菌株的产丁酸的能力达到588ppm。

其中，上述梭状芽孢杆菌属新菌株的产乙酸乙酯的能力达到2.62ppm。

本发明还提供了一种上述梭状芽孢杆菌属新菌株在白酒酿造中的用途。

本发明的有益效果为：

本发明从浓香型白酒窖泥中筛选得到了一种新的梭状芽孢杆菌属新菌株，保藏编号为CGMCC NO.19455，本发明首次筛选得到能够产戊酸乙酯和2-戊酮的梭状芽孢杆菌菌株，同时，该菌株还能在产戊酸乙酯和2-戊酮的同时产丁酸和乙酸乙酯，丰富了白酒中的风味物质，能够在浓香型白酒酿造中提升白酒的酒体品质。本发明为浓香型白酒产香的提供了一种新的微生物，具有很广阔的应用空间。

本发明的梭状芽孢杆菌新菌株于2020年3月6日中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC NO.19455。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。分类命名为梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)WLY-B-L2。

附图说明

图1所示为本发明新菌株梭状芽孢杆菌形态图；

图2所示为新菌株梭状芽孢杆菌的16S rDNA***发育树图；

图3所示为新菌株梭状芽孢杆菌发酵液的HS-SPME峰图；

图4所示为DSM29923发酵液的HS-SPME峰图；

图5所示为空白发酵液的HS-SPME峰图。

具体实施方式

本发明提供了一株菌株梭状芽孢杆菌新菌株，其是在宜宾五粮液股份有限公司浓香型白酒窖泥中筛选得到的，命名为WLY-B-L2。本发明的新菌株已于2020年3月6日进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.19455，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

本发明所述的新菌株梭状芽孢杆菌WLY-B-L2产丁酸能力为≤588ppm，产戊酸乙酯的能力为≤6.37ppm，产乙酸乙酯的能力为≤2.62ppm，产2-戊酮的能力为≤3.16ppm。

本发明梭状芽孢杆菌WLY-B-L2为新菌株，补充了新的宝贵的菌种资源，具有很高的应用价值。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中使用的分离培养基组成包括：葡萄糖20份、酵母膏1份、碳酸钙20份，溶于1000份蒸馏水中，再混合后用NaOH调节pH至6.5-7.0。

实施例中使用的培养基RCM组成包括：蛋白胨10份、牛肉膏10份、酵母粉3份、葡萄糖5份、可溶性淀粉1份、氯化钠5份、乙酸钠3份、L-半胱氨酸盐酸盐0.5份、1000ml蒸馏水，NaOH调节pH至6.5-7.0。

实施例中使用的斜面和平板为相应培养基中加入2％的琼脂粉。

实施例1新菌株梭状芽孢杆菌WLY-B-L2的分离、筛选和鉴定

(一)分离、筛选

将取自宜宾五粮液股份有限公司酿酒车间的窖泥样品，以10％的量放于含玻璃珠和无菌生理盐水的三角瓶中，震荡一定时间后，80℃水浴20min后静置备用。然后取上清液进行梯度稀释，取10^-2-10^-6稀释液涂布于分离培养基平板上，放入厌氧盒中，37℃静置培养15天，挑选平板上的菌落进行划线后培养，重复三次，直至分离获得纯化的菌株，斜面保存。菌株命名为WLY-B-L2。

(二)分类、鉴定

1、菌株的形态学特征

分离得到的WLY-B-L2菌株为革兰氏阴性菌，杆状，在RCM培养基上菌落为米色、表面湿润光滑、边缘整齐。

2、生理生化特性

分离得到的WLY-B-L2菌株能利用能利用水杨苷、D-木糖、L-***糖、明胶、D-松三糖、D-棉子糖、D-山梨醇、L-鼠李糖、D-海藻糖的至少一种。不能利用色氨酸、尿素、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-乳糖、D-蔗糖、D-麦芽糖、七叶灵柠檬酸铁、丙三醇、D-纤维二糖、D-甘露糖。过氧化氢试验呈阴性。

3、16S rDNA鉴定

将菌株WLY-B-L2接种于RCM培养基中，37℃静置培养7天，取1mL菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，-20℃保藏备用。

利用引物27F和1492R对细菌基因组16S rDNA进行扩增，27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG(SEQ ID NO:2)，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO:3)。

扩增体系(共25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP(2.5mmol/L each)1μL，DNA10ng，引物F(10μmol/L)0.5μL，引物R(10μmol/L)0.5μL，加双蒸水至25μL。扩增程序：94℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃60s，共30个循环；72℃10min，4℃终止反应。

16S rDNA序列测定：利用胶回收试剂盒进行PCR扩增产物的纯化；纯化产物的测序工作由上海生工生物有限公司完成，测定结果得到菌株WLY-B-L2的16S rDNA序列如SEQ IDNO:1所示。

***发育树构建：将所测定的细菌16S rDNA基因序列分别与GenBank数据库进行BLASTn相似性分析，与实验菌株亲缘关系最近的Clostridium luticellarii FW431(NR145907)相似度为97.42％，小于98.65％。选取与实验菌株亲缘关系相对较近的标准菌株用Clustalw软件进行序列比对，采用MEGA7软件进行***发育分析，构建***发育树，如图2所示。

4、全基因组dDDH分析

将梭状芽孢杆菌WLY-B-L2及其模式菌株DSM29923(购自德国微生物菌种保藏中心)送至中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)进行全基因组dDDH分析。结果显示其与模式菌株DSM29923的dDDH值为28.1％，小于70％。

综合菌体形态、生理生化特性、16S rDNA基因序列和全基因dDDH分析，将菌株WLY-B-L2鉴定为梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)新菌株。该菌株WLY-B-L2于2020年3月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNO.19455。

实施例2新菌株梭状芽孢杆菌WLY-B-L2产风味物质测定

将上述菌株按照5％接种量接种于RCM培养基中，在37℃厌氧盒中培养30天。

(一)风味成分

1、检测方法：发酵液经5000r/min离心10min后，利用0.22μm滤膜过滤上清液2ml，经顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC-MS)测定其可挥发性风味成分。

(1)HS-SPME条件：取2mL过滤发酵液于20mL顶空瓶中，加入10μL内标(4-辛醇)。60℃平衡15min，***针头距离液面1cm处，吸附40min，进样口解析3min。

(2)GC条件：TG-WAXMS(30.0m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度250℃，载气(He)流速1mL/min，不分流模式进样；气相色谱升温程序：起始柱温40℃，保持5min，以4℃/min升至230℃，保持15min。

(3)MS条件：质谱EI源，电子轰击能量70eV；离子源温度200℃，四级杆温度150℃，质量数扫描范围35～350amu。

以4-辛醇(0.5ppm)为内标，采用峰面积归一化法进行半定量分析。采用选择离子(SIM)计算各化合物的峰面积，并与内标物质的峰面积之比计算各化合物的浓度。

2、结果：在RCM培养基中，Clostridium sp.WLY-B-L2产的主要风味物质为戊酸乙酯、乙酸乙酯和2-戊酮。

(1)HS-SPME峰图

WLY-B-L2发酵液峰见图3，DSM29923发酵液峰见图4，空白发酵液峰见图5。

(2)风味物质信息见表1。

表1新菌株梭状芽孢杆菌及模式菌株风味物质信息表(ppm)

注：“-”表示没有检测出。

由表1可知，梭状芽孢杆菌新菌株WLY-B-L2主要产生的风味物质为戊酸乙酯、乙酸乙酯和2-戊酮，分别为6.37、2.62和3.16ppm，均为白酒中的重要风味物质。而模式菌株DSM29923产的风味物质极少。由此可知两种菌有较大差别。

(二)主要有机酸

1、检测方法

取上述发酵液0.1mL，以0.1％的磷酸水溶液稀释至1mL，于2mL离心管中，振荡均匀，0.2μm滤膜过滤后作为待测样品。

利用HPLC测定发酵液中主要有机酸含量。色谱程序为：柱温30℃；流动相：A为甲醇；B为0.1％磷酸水溶液。梯度洗脱：0min：100％B；8min：100％B；25min：10％B；28.5min：10％B；29min：100％B；35min：100％B；停止：35min；流速：1.0mL/min。检测波长：214.8nm。

2、结果

HPLC测定新菌株梭状芽孢杆菌WLY-B-L2及模式菌株DSM29923发酵液主要有机酸含量如表2。

表2新菌株梭状芽孢杆菌及模式菌株主要有机酸信息表(ppm)

名称	空白	WLY-B-L2	DSM29923
				乳酸	733±3	-	494±2
乙酸	1598±6	1555±5	3032±9
				丁酸	505±2	1093±1	338±1
己酸	-	-	-

注：“-”表示没有检测出。

由表2可知，新菌株梭状芽孢杆菌WLY-B-L2产的有机酸主要为丁酸，达到588ppm，而模式菌株DSM29923产的有机酸主要为乙酸，达到1432ppm。由此可知两种菌有较大差别。由上述实施例可看出，本发明筛选得到的菌株WLY-B-L2与模式菌株主要产的香味物质和有机酸不同，两者属于不同的种，本发明筛选得到的菌株能够同时高产丁酸、戊酸乙酯、乙酸乙酯和2-戊酮，可以将其应用于白酒酿造过程中，用来提升酒的品质，具有很广阔的应用前景。

序列表

<110> 宜宾五粮液股份有限公司

<120> 一种梭状芽孢杆菌属新菌种及其应用

<130> A210024K（序）

<141> 2021-01-20

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaaca catgcaagtc gggcgaagaa gctccttcgg 60

gagaatctta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctcaa agagggggat 120

agcctcccga aagggagatt aataccgcat gacaaatata atccgcatgg attatatttt 180

aaaggagaaa tccgctttga gatggacccg cggcgcatta gctagttggc agggtaacgg 240

cctaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga acggccacat tggaactgag 300

agacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc 360

tgatgcagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat tgtaaagctc tgtcatctgg 420

gacgataatg acggtaccag atgaggaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480

aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tactgggcgt aaagggtgcg caggcggaca 540

tttaagtgag atgtgaaata cccgggctta acccgggcag tgcatttcaa actgggtgtc 600

tggagtgcag gagaggagaa cggaattcct agtgtagcgg tgaaatgcgt agagattagg 660

aagaacacca gtggcgaagg cggttctctg gactgtaact gacgctgagg cacgaaagcg 720

tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtactaggt 780

gtaggaggta tcgacccctt ctgtgccgca gtaaacacaa taagtactcc gcctgggaag 840

tacgatcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc agcggagcat 900

gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttacctggac ttgacatccc ctgcatatct 960

cagagatgag agaagccctt cggggcaggg agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1020

gtgtcgtgag atgttaggtt aagtcctgca acgagcgcaa cccctgttgt tagttgctaa 1080

cagtaagatg agcactctaa cgagactgcc gcggttaacg cggaggaagg tggggatgac 1140

gtcaaatcat catgcccctt atgtccaggg caacacacgt gctacaatgg gcagaacaga 1200

gagaagcaag gccgcgaggt ggagcgaacc tcaaaaactg ttcccagttc ggattgcagg 1260

ctgaaacccg cctgcatgaa gctggagttg ctagtaatcg cgaatcagca tgtcgcggtg 1320

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagccgg caacacccga 1380

agtccgtagt ctaacgaaag aggacgcggc cgaaggtggg gttggtgatt ggggtg 1436

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtttgatcm tggctcag 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (9)

1.梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)WLY-B-L2新菌株，其特征在于：所述新菌株的保藏编号为CGMCC NO.19455。

2.根据权利要求1所述的梭状芽孢杆菌属新菌株，其特征在于：所述新菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的梭状芽孢杆菌属新菌株，其特征在于：所述的梭状芽孢杆菌属新菌株同时产戊酸乙酯和2-戊酮。

4.根据权利要求1所述的梭状芽孢杆菌属新菌株，其特征在于：所述的梭状芽孢杆菌属新菌株同时产丁酸、戊酸乙酯、乙酸乙酯和2-戊酮。

5.根据权利要求1所述的梭状芽孢杆菌属新菌株，其特征在于：所述的梭状芽孢杆菌属新菌株的产戊酸乙酯的能力达到6.37ppm。

6.根据权利要求1所述的梭状芽孢杆菌属新菌株，其特征在于：所述的梭状芽孢杆菌属新菌株的产2-戊酮的能力达到3.16ppm。

7.根据权利要求1所述的梭状芽孢杆菌属新菌株，其特征在于：所述新菌株的产丁酸能力达到588ppm。

8.根据权利要求1所述的梭状芽孢杆菌属新菌株，其特征在于：所述新菌株的产乙酸乙酯能力达到2.62ppm。

9.权利要求1～8任一项所述的梭状芽孢杆菌属新菌株在白酒酿造中的用途。

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