CN109136126A - 一株用于预防断奶仔猪腹泻的戊糖片球菌 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,提供了一株戊糖片球菌及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用。该戊糖片球菌菌株L1已在2017年5月4日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,保藏号为CGMCC No.14092,分类命名为戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus。应用戊糖片球菌L1预防断奶仔猪腹泻,具体方法为将含有戊糖片球菌L1的无菌生理盐水灌服给断奶仔猪,每天10mL,连续7天。本发明的有益效果是能显著降低断奶仔猪腹泻率,提高仔猪成活率、生长性能及生猪养殖企业经济效益,应用前景十分广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其是动物科学中的生猪养殖领域,具体涉及 一株用于预防断奶仔猪腹泻的戊糖片球菌。
背景技术
我国是世界上第一生猪养殖和猪肉消费大国,猪业在农业产业经济中占据 主导地位。但我国还不是养猪强国,与养猪发达国家的养猪水平相比还有一段 差距,仍存在一些空间有待提高。仔猪是现代化养猪生产的核心,其健康状况 对后期的生长发育产生极其重要的影响。近年来,仔猪腹泻是当前集约化养猪 条件下出现的高发病症,是导致仔猪生长受阻和死亡率高的主要原因。大肠杆 菌性腹泻是仔猪腹泻的常见病症,主要由产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhage Escherichia coli, EHEC)和肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichia coli,EPEC)等致病 菌引起。据统计,每年死亡的仔猪约有50%与大肠杆菌感染有关,临床表现为 仔猪黄痢、仔猪白痢、败血症等,影响仔猪生长发育、降低饲料报酬,甚至引 起仔猪死亡而造成较大的经济损失。
在现代生猪生产过程中,仔猪普遍实行早期断奶。断奶后,食物由母乳变 为饲料,又因环境的改变,加剧断奶应激,导致仔猪免疫力下降,腹泻率及死 亡率升高,给养殖业带来巨大的损失。为提高养殖经济效益,抗生素作为生长 促进剂被广泛应用于畜禽养殖业。但抗生素的长期大量使用,破坏了机体的微 生态平衡,导致细菌的变异和耐药菌的产生,并在肉制品中的残留,威胁人类 的健康。2006年1月欧盟已全面禁止在饲料中添加任何抗生素,日本、美国和 我国都出台了相关法律法规限制或禁止抗生素在饲料中的使用,抗生素作为畜 禽促生长添加剂的全面限制使用是畜牧业发展的必然趋势。因此,研发能够预防仔猪腹泻的安全、高效、绿色的饲用抗生素替代品,具有显著的经济、社会 和生态效益。
微生物饲料添加剂是指通过改善动物肠道菌群生态平衡、促进营养物质消 化吸收、增强畜禽免疫功能,以提高动物健康水平的微生物制剂产品。与抗生 素相比,微生物饲料添加剂具有安全、无毒性、无残留、无耐药性以及环境友 好等优点,是饲用抗生素最具发展潜力的替代品。菌种即益生菌的种类,是微 生物饲料添加剂发挥功能的基础,也是产品安全的首要保证,世界各国对此都 有明确规定和严格管理。美国食品药品管理局和美国饲料管理协会1989年公布 了42种益生菌可以直接饲喂,我国农业部也于2000年公布了16种安全微生物 可以应用于饲料工业中。目前应用于畜牧生产中的益生菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌等菌株。
戊糖片球菌属链球菌科、片球菌属,为革兰氏阳性菌,因能发酵葡萄糖产 生乳酸而属于乳酸菌的一种。2006年我国农业部658号公告《饲料添加剂品种 目录》将戊糖片球菌列入了可允许使用的微生物名录。因此,分离得到具有抑 制产肠毒素大肠杆菌等致病菌增殖,耐胃酸、肠液环境,抗生素敏感,有效粘 附在肠粘膜上皮细胞等益生功能,以及显著降低断奶仔猪腹泻率,提高成活率 和生长性能的戊糖片球菌,在生猪养殖领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供了一株戊糖片球菌菌株,命名为戊糖片球菌L1。该戊糖片球菌 L1具有抑制仔猪腹泻主要致病菌增殖,耐胃酸、肠液环境,抗生素敏感,有效 粘附在猪肠粘膜上皮细胞等益生功能,经灌服后,能显著降低断奶仔猪腹泻率, 提高仔猪的成活率和生长性能。
技术方案
本发明的技术方案:
一株用于预防断奶仔猪腹泻的戊糖片球菌L1,该戊糖片球菌菌株已于2017 年5月4日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,保藏号为 CGMCCNo.14092,分类命名为戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus。中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3 号,邮编:100101。该戊糖片球菌具有抑制产肠毒素大肠杆菌等致病菌增殖, 耐胃、肠环境,抗生素敏感,有效粘附在肠粘膜上皮细胞等益生功能,经灌服 饲喂断奶仔猪,可显著降低断奶仔猪腹泻率,提高成活率和生长性能。
本发明的积极效果有:
(1)降低断奶仔猪腹泻率。
(2)提高成活率和生长性能。
(3)降低抗生素依赖。
附图说明
图1是戊糖片球菌L1仔猪胃肠道环境耐受性检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案,进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1戊糖片球菌L1的分离、鉴定
采用MRS选择培养基从泡菜中分离疑似乳酸菌单菌落,应用16SrDNA序 列分析法进行分子生物学鉴定。将扩增的16S rDNA片段序列在NCBI上使用 BLAST程序比对结果显示,与戊糖片球菌同源性大于99%。基于凡是16S rDNA 可变区序列的同源性大于97.5%便可认为是同一个种的标准,该菌株鉴定为戊 糖片球菌,命名为戊糖片球菌L1。其16S rDNA序列已经提交GenBank,序列 号为KP792278。
实施例2戊糖片球菌L1对致仔猪腹泻主要肠道致病菌抑菌作用
采用琼脂打孔扩散法,研究戊糖片球菌L1对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhageEscherichia coli,EHEC)和肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)生长繁殖的抑制作用。ETEC K88ac+和EHEC O157:H7购自中国兽医药 品监察所,EPEC1、ETEC1、ETEC3和ETEC4均为申请人从腹泻仔猪粪便中自 主分离得到。将戊糖片球菌L1接种于MRS肉汤培养基中,37℃厌氧培养24h, 用MRS肉汤培养基调节菌体数到108CFU/mL;4℃,5000rpm,离心10min, 收集上清液;上清液经0.22μm微孔滤膜过滤,用氢氧化钠调pH至6.2;将20μL 浓度为1×108CFU/mL的指示菌菌液(EHEC O157:H7、EPEC1、ETEC K88ac+、ETEC1、ETEC3和ETEC4)加入到经高温高压灭菌并冷却到45℃左右的LB固 体培养基中,剧烈混合后迅速倒入平皿中,待培养基凝固后用牛津杯在培养基 上打孔(直径8mm),吸取90μL戊糖片球菌L1培养液上清注入小孔中,鼠李 糖乳杆菌LGG为参照,灭菌的MRS液体培养基为空白对照,室温下扩散4h 后,置于37℃恒温箱中培养24h后,测量抑菌圈直径。戊糖片球菌L1对仔猪 腹泻主要肠道致病菌的抗菌活性结果如表1所示,结果表明,戊糖片球菌L1能 显著抑制ETEC、EHEC和EPEC的生长,且抗菌活性均优于参考益生菌菌株鼠 李糖乳杆菌LGG。
表1 戊糖片球菌L1对仔猪腹泻主要肠道致病菌的抑菌活性
注:“-”表示无抑菌作用;“+”表示抑菌圈半径<3mm;“++”表示抑菌圈半径3-6mm;“+++”表示抑 菌圈半径>6mm。
实施例3戊糖片球菌L1的胃液、肠液耐受性
将戊糖片球菌L1接种到pH 3.0的MRS液体培养基中,37℃培养4h,在 0、1、2、3、4小时,平板计数法计算活菌数目;随后将戊糖片球菌L1分别接 种到含有0.3%猪胆盐的MRS液体培养基中,37℃继续培养4h,在5、6、7、 8小时,平板计数法计算活菌数目,检测戊糖片球菌L1的胃液、肠液耐受性。 结果如图1所示,与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG比较,戊糖片球菌L1胃肠道 环境耐受性更强,且戊糖片球菌L1数量在整个检测时间范围内(8h)均未降低,胃肠道环境耐受性优势突出。
实施例4戊糖片球菌L1的抗生素敏感性
在益生菌使用过程中,如果益生菌携带有抗性基因,就有可能将抗性基因转 移给致病菌,使致病菌的耐药性增强。因此,评价抗生素敏感性是研究乳酸菌 益生特性的重要指标。采用纸片扩散法检测了戊糖片球菌L1对7种常用抗生素 的药敏性,结果如表2所示,戊糖片球菌L1对氨苄青霉素、链霉素、红霉素、 四环素和氯霉素敏感,对卡那霉素中度敏感,对万古霉素具有耐药性。研究显 示,戊糖片球菌L1对万古霉素的耐药性是先天固有的,一般不会转移给其他菌 株。因此,上述研究结果显示戊糖片球菌L1对常用抗生素敏感。
表2 戊糖片球菌L1对抗生素的敏感性
实施例5戊糖片球菌L1的猪肠上皮细胞粘附能力
将戊糖片球菌L1接种于MRS肉汤培养基中,37℃厌氧培养18h,4℃, 5000rpm,离心10min,除去上清液,收集菌体,用DMEM高糖培养基将菌体 重新悬起,使菌体浓度达到5×107CFU/mL备用。在培养至汇合的IPEC-J2猪肠 上皮细胞(细胞密度9×105细胞/mL)中,加入2mL5×107CFU/mL的戊糖片球菌L1-DMEM高糖培养基混合液,CO2培养箱中37℃培养1h,移除培养基,PBS 清洗三次除去未黏附的乳酸菌后,加入1mL含有0.1%Triton X-100的PBS,37℃ 作用30min裂解IPEC-J2细胞,裂解液经PBS梯度稀释后涂布在MRS琼脂平板 中,37℃培养48h,计算黏附在IPEC-J2细胞上的乳酸菌数量。与参考菌株LGG 比较,按下列公式计算黏附指数:黏附指数(%)=(黏附的细菌数/细胞数)×100。 戊糖片球菌L1对猪肠上皮细胞的黏附能力结果如表3所示,戊糖片球菌L1在 IPEC-J2细胞表面的黏附指数为14.4%,与参考菌株LGG比较差异不显著,表 明戊糖片球菌L1可有效粘附在猪肠上皮细胞,发挥益生功能。
表3 戊糖片球菌L1对猪肠上皮细胞黏附能力
注:同行数据肩标相同小写字母表示差异不显著(P<0.05)
实例6戊糖片球菌L1对ETEC感染断奶仔猪生长性能和腹泻的影响
试验采用30头杜×长×大三元杂交断奶仔猪(断奶日龄21d),饲喂仔猪日粮 过度7d后,随机分配到空白对照组、ETEC组、戊糖片球菌+ETEC组。各组处 理如下:
a.空白对照组:第1-8天连续灌服10mL无菌生理盐水。
b.ETEC组:第1-7天连续灌服10mL无菌生理盐水,第8天灌服10mL浓 度为109CFU/mL的ETEC K88ac+菌。
c.戊糖片球菌+ETEC组:第1-7天连续灌服10mL含戊糖片球菌L1(109 CFU/mL)的无菌生理盐水,第8天灌服10mL浓度为109CFU/mL的ETEC K88ac+菌。
实验周期为14天,自由采食、自由饮水,称量仔猪初始重、末重,记录每 天的采食量和仔猪腹泻情况,计算日增重、日采食量、料肉比和腹泻率。
腹泻率(%)=[(每组仔猪总腹泻天数)/(仔猪头数×试验天数)]×100
戊糖片球菌L1对ETEC感染断奶仔猪生长性能和腹泻的影响如表4所示, 与空白对照组、ETEC组相比,戊糖片球菌+ETEC组仔猪的日增重分别增加了 2.72%(P>0.05)和6.32%(P>0.05),料肉比分别降低了0.65%(P>0.05)和 4.94%(P>0.05),腹泻率分别降低了30.75%(P<0.05)和61.70%(P<0.05)。 结果表明,戊糖片球菌L1可显著降低ETEC感染断奶仔猪的腹泻率,且有提高 仔猪生长性能的趋势。
表4 戊糖片球菌L1对ETEC感染断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响
注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Claims (1)
1.一株用于预防断奶仔猪腹泻的戊糖片球菌,其特征在于,该戊糖片球菌菌株已在2017年5月4日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,保藏号为CGMCCNo.14092,分类命名为戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus。
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