CN109504619B - 一种植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌及其应用，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌株为PA01，保藏号为CGMCC No.15660。所述植物乳杆菌安全性高、耐受性强、可以在肠道定植、生长繁殖，调节肠道菌群平衡，发挥益生作用，可以用于制备食品或饲料添加剂、调节动物肠道疾病的调节剂、动物抗生素替代剂、免疫调节剂、病原菌抑菌剂，还可用于提高肉鸡生产性能，效果好，安全无副作用。

Description

一种植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌及其应用。
背景技术
沙门氏菌病是重要的人畜(禽)共患性传染病，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，为革兰氏阴性肠道杆菌。沙门氏菌感染畜禽后表现的临床症状有加重畜禽病态或死亡率、或降低畜禽的繁殖生产力；也可能呈无症状带菌状态，人食用这些被污染的畜产品后，可能会引起严重的细菌性食物中毒。家禽养殖过程中，降低其消化道中的沙门氏菌量，将会减少沙门氏菌进入肉品加工厂的风险。
由于抗生素生长促进剂在动物生产中添加受到限制，为了能够有效地控制沙门氏菌的危害，人们一直探索抗生素的替代物，益生菌能促进宿主有益微生物区系发育、竞争性排斥有害致病菌定植、增强黏膜免疫力、提高消化道消化率和降低pH、增强肠道组织成熟和完整性。乳酸菌是最早发现的益生菌，其作为微生态饲料添加剂在畜牧行业中的应用越来越广泛，乳酸菌通过粘附于宿主肠道上皮细胞表面竞争性排斥病原菌在宿主肠道内的定植，加强宿主的免疫调节应答从而有效地控制沙门氏菌对家禽的感染。因此，在家禽养殖业中，乳酸菌是一个控制沙门氏菌的有效替代方法。虽然乳酸菌是动物肠道自身具有的一种十分重要的益生菌，其种群数量常常受到外界因素影响而减少。因此可以通过外源补充乳酸菌，维持动物肠道内乳酸菌占优势的菌群结构，而筛选益生菌特性较好的乳酸菌显得更为重要。
发明内容
为此，本发明的目的是提供一株耐酸和耐胆盐性能优异、抑菌谱广、能够有效促进禽类生长的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PA01，于2018年4月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC No.15660。
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PA01，从陕西杨凌地区的传统泡菜浸泡液中分离得到的乳酸菌中发现的。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PA01具有如下生物学特性：
菌体特征：革兰氏阳性菌，圆端中短杆状，单个、成对或成链排列，无鞭毛，不产芽孢。0.6～1.0μm×2.0～5.0μm。
菌落特征：乳白色的圆形菌落，边缘整齐，表面光滑湿润，有凸起，1.2～3.0mm。
生长特征：延滞期约为4h，培养16h后进入稳定期。最适生长温度为28～35℃，该菌株最低生长温度为15℃，最高生长温度为40℃。最适生长初始pH值为6.5，能耐受最高和最低初始生长pH值为8.5和2.0。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)PA01还具有下述有益特性：
抑菌谱广：能够较强的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长，尤其是对于沙门氏菌具有很强的抑菌性能。
具有耐酸性：在pH 2.5的酸性环境下能够很好的存活，和正常环境下活性几乎一致。
具有较强的耐胆盐性：在含0.1％、0.3％、0.5％和1.0％胆盐的MRS培养基中37℃厌氧无菌培养4h后，与初始浓度基本一致。
粘附能力的适中：对Caco-2细胞的粘附率为3.6％。
具有较强的抑制肠炎沙门氏菌对上皮细胞粘附能力：采用竞争性黏附方法检测植物乳杆菌PA01抑制肠炎沙门氏菌对上皮细胞的黏附性。在排斥试验和竞争试验中肠炎沙门氏菌的黏附分别为不加植物乳杆菌PA01时黏附率的1.67％和3.5％。
具有产胞外多糖的能力：植物乳杆菌PA01分泌胞外多糖含量可以达到520mg/L。
所述植物乳杆菌PA01的培养方法，包括：MRS固体培养基，厌氧环境，37℃培养15～48h。
本发明还提供了所述植物乳杆菌PA01的应用，包括用于制备食品或饲料添加剂、调节动物肠道疾病的调节剂、动物抗生素替代剂、免疫调节剂、病原菌抑菌剂，还包括用于提高肉鸡生产性能。
所述病原菌为动物源性致病病原菌，包括，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。
本发明有益效果为：
1、本发明的植物乳杆菌分离自传统泡菜浸泡液中，具有可食用植物源性，充分保证了其在畜牧养殖和动物饲料中应用的安全性；耐受性强、能够耐受胃肠道低pH和高胆盐浓度，可以在肠道定植、生长繁殖，调节肠道菌群平衡，发挥益生作用。
2、本发明所述植物乳杆菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌均有明显的抑菌作用，尤其肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，抑菌效果更好，并且对肠炎沙门氏菌黏附的作用较好，降低了有害菌与肠上皮细胞接触的可能性，提高宿主免疫及非免疫防御体系。
3、本发明所述植物乳杆菌显著提高了肉鸡生产性能，可替代或部分替代抗生素，以期减少抗生素作为预防动物疾病作用在饲料中的长期亚治疗剂量添加，无副作用。
生物材料保藏说明
分类命名：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；菌株编号：PA01。
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年4月28日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15660。
附图说明
图1为植物乳杆菌PA01 16SrDNA凝胶鉴定的电泳图；其中，泳道M为DNA分子量标准，泳道1-6为植物乳杆菌PA01 16SrDNA。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或成分比例上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围内。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。
实施例1菌株分离纯化
植物乳杆菌PA01是从陕西杨凌地区的传统泡菜浸泡液中分离得到的乳酸菌中发现的。
将购买得到的发酵泡菜在无菌条件下取50g，用pH为7.4的PBS溶液进行10倍梯度稀释，稀释梯度为102～106，稀释完成后，各取200μL涂布到MRS固体培养基上(含2.0％CaCO3)，在37℃的厌氧环境中倒置培养48h。随后挑取溶钙圈大小及形态不同的单菌落接种到MRS液体培养基上，37℃过夜培养。混匀液体培养基，在超净工作台中用接种环蘸取少量菌液划线到MRS固体培养基上，在37℃厌氧环境中倒置培养36～48h，完成一次纯化，一般纯化3-4次使得平板上的菌落形态一致即可。将纯化后的菌液与无菌的50％的甘油等比例混匀后，置于超低温冰箱备用。
提取菌株的基因组，然后使用通用引物27F和1492R，扩增菌株16SrDNA基因。引物27F为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，引物1492R为：GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR反应条件为：95℃10min；95℃30s；55℃30s；72℃90s；30个循环，72℃延伸10min。图1为植物乳杆菌PA0116SrDNA凝胶鉴定的电泳图。将菌株的1500bp 16SrDNA序列(如序列表中SEQ ID NO.1所示)与GenBank数据库中获得的植物乳杆菌16S rDNA序列作比较，相似度97％。
实施例2植物乳杆菌PA01的抑菌能力的检测
将病原菌震荡培养10h后，以0.1％的接种量接种于45℃左右的LB固体培养基中；将灭菌并烘干的牛津杯放置于培养皿中；向每个培养皿中加入约25mL的含有病原菌的LB固体培养基；室温静置1h后，在不破坏培养孔结构的前提下用灭菌的镊子夹取牛津杯，然后室温条件下置于超净工作台中1h；在培养孔中加入200μL培养20h的乳杆菌菌液，室温情况下菌液被全部吸收后，37℃条件下培养过夜，测量抑菌圈直径的大小，并通过抑菌圈直径的大小表示乳杆菌的抑菌效果。
当选用大肠杆菌E.coli(S.aureus ATCC 29213)、沙门氏菌Salmonella(肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis ATCC 13076)和鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium ATCC 14082))和金黄色葡萄球菌S.aureus(S.aureus ATCC 29213)作为指示菌时，植物乳杆菌PA01能够抑制这些致病菌的生长。如表1所示，MRS培养基对各种肠道致病菌均没有抑菌效果，而植物乳杆菌PA01能够较强的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长。
表1植物乳杆菌PA01抑菌圈直径(mm)
Figure BDA0001848535080000061
Figure BDA0001848535080000071
实施例3植物乳杆菌PA01抵抗胃肠道环境的检测
耐酸性能检测
将浓度约为108～109CFU/mL的150μL植物乳杆菌悬液加入4.85mL pH 2.5的酸性MRS液体培养基中；混匀培养基后，于37℃无菌厌氧的环境中静置培养3h；将植物乳杆菌PA01悬液10倍比稀释至105～106CFU/mL，分别向培养皿中加入500μL的植物乳杆菌悬液；将冷却至45℃左右的MRS固体培养基倒入培养皿中混匀，自然冷却30min后置于37℃厌氧无菌环境中培养48h，检测植物乳杆菌浓度为108.41CFU/mL，与保持正常培养108.65CFU/mL几乎活性一致。
耐胆盐性能检测
将浓度约为108～109CFU/mL的150μL植物乳杆菌悬液分别加入到4.85mL含0.1％、0.3％、0.5％和1.0％胆盐的MRS液体培养基中；混匀后于37℃厌氧无菌环境中静止培养4h；将植物乳杆菌PA01悬液10倍比稀释至105～106CFU/mL，分别向培养皿中加入500μL的植物乳杆菌悬液；将冷却至45℃左右的MRS固体培养基倒入培养皿中混匀自然冷却30min后于37℃的厌氧无菌环境中培养48h。检测植物乳杆菌PA01的浓度分别为108.39，108.11，107.85和107.62CFU/mL，该菌株具有较强的胆盐耐受性。
粘附能力的检测
采用荧光素Fluorescein Isothiocyanate(FITC,Sigma,USA)标记植物乳杆菌的方法检测植物乳杆菌PA01对人体肠道Caco-2上皮细胞的粘附能力的大小。
室温条件下离心收集植物乳杆菌PA01，用PBS洗涤3次菌体后使菌体重悬浮，并按1:50加入FITC(Sigma,USA)，37℃避光条件下静止孵育2h；离心后弃上清，用PBS清洗3次后重悬浮菌体，稀释菌体浓度至5×108CFU/mL得到荧光标记的植物乳杆菌PA01菌液。
将已经长有单层细胞的24孔细胞培养板用PBS洗涤2次，然后向每孔中加入600μL无抗生素的细胞培养基，并培养2h；向24孔板细胞培养板中加入100μL标记的植物乳杆菌PA01菌液，培养2h；用PBS洗涤3次培养基和荧光标记的植物乳杆菌的混合液；然后向每孔中加入200μL胰酶，消化5min后，再加入600μL PBS；用移液枪将24孔板中的细胞吹打混匀，转移到96孔板中，每孔200μL，测定荧光值为A1；再取100μL荧光标记的植物乳杆菌PA01菌液，加入200μL胰酶和500μL PBS，混匀后分装到96孔板，每孔200μL，测定荧光值为A2；取200μL的胰酶和600μL的PBS，混匀后加入96孔板，每孔200μL，测定荧光值为A0；植物乳杆菌粘附率的计算公式为：粘附率＝(A1-A0)/(A2-A0)×100％。
所有的操作需在暗处进行，以减少光照对荧光素产生的影响。植物乳杆菌PA01对Caco-2细胞的粘附率为3.6％，具有适中的粘附能力。
实施例4抑制肠炎沙门氏菌对上皮细胞粘附的检测
采用竞争性黏附方法检测植物乳杆菌PA01抑制肠炎沙门氏菌对上皮细胞的黏附性。
向24孔细胞培养板中接种Caco-2细胞，并向24孔中加入无双抗DMEM培养基(10％胎牛血清)，置于37℃，CO2含量为5％的细胞培养箱中培养直至细胞培养板中形成单层细胞。将植物乳杆菌PA01和沙门氏菌混匀过夜培养后，用高速离心机8000×g室温离心5min后收集细菌，用PBS冲洗细菌2次。再次离心菌液后，用无双抗DMEM培养基重悬浮(约1×107cfu/250μL)。移除Caco-2细胞培养液后，重新用无抗PBS冲洗2次。
排斥试验：向24孔细胞培养板中各加入250μL DMEM培养基悬浮的植物乳杆菌PA01，细菌培养箱37℃条件下孵育1h，用无抗PBS冲洗2次，移除未黏附的植物乳杆菌PA01，加入0.25％的胰酶消化，待细胞基本脱落后，向培养板中加入含血清的DMEM终止消化，收集液体后用PBS梯度稀释，然后用沙门氏菌选择性亮绿琼脂涂板，在37℃细菌培养箱培养18～24h，计数。
竞争试验：同时加入植物乳杆菌和肠炎沙门氏菌，37℃细菌培养箱条件下共孵育1h，后续操作同排斥试验。置换试验：先加入肠炎沙门氏菌，37℃细菌培养箱中孵育1h，然后加入250μL DMEM培养基悬浮的植物乳杆菌PA01，共孵育1h，后续操作同排斥试验。
肠炎沙门氏菌黏附百分比公式：粘附率＝A1/A0×100％。
其中，A1为添加植物乳杆菌PA01后肠炎沙门氏菌黏附到细胞上的细菌数；A0为无植物乳杆菌PA01添加，肠炎沙门氏菌黏附到细胞上的细菌数。
在排斥试验中，植物乳杆菌PA01显著降低肠炎沙门氏菌的黏附，仅为不加植物乳杆菌PA01时黏附率的1.67％；在竞争试验中，肠炎沙门氏菌的黏附为不加植物乳杆菌PA01时黏附率的3.5％，同样显著降低了肠炎沙门氏菌的粘附；在置换试验中，肠炎沙门氏菌的黏附为不加植物乳杆菌PA01时黏附率的92.9％，虽然降低肠炎沙门氏菌的粘附但差异不显著。
实施例5：植物乳杆菌PA01产胞外多糖的能力
将活化的植物乳杆菌PA01按1.0％的接种量接种于100ml的MRS培养基中，在厌氧环境中37℃静止培养24h，10000×g室温离心10min，收集上清液，向上清液中加入等体积的4℃放置的无水乙醇，充分混匀后放置于4℃冰箱，静置过夜，14000×g室温离心5min，弃去上清液，收集沉淀，称取收集的胞外多糖的重量，记录结果，最终换算成mg/L。
乳酸菌的胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到环境中，对乳酸菌的生存和生长具有重要意义。乳酸菌分泌的胞外多糖能够增强宿主的免疫调节功能，其分泌量与乳酸菌免疫调节能力呈正相关。分析表明，植物乳杆菌PA01分泌胞外多糖含量可以达到520mg/L。
实施例6植物乳杆菌PA01对肉雏鸡感染肠炎沙门氏菌的保护作用
将72只1日龄的AA肉仔鸡随机分为3组(陕西省咸阳市大成禽业有限公司，每组6个重复，每个重复4只)，第1组为阴性对照组(CON)，24只肉鸡每天以灌胃的方式饲喂一次PBS缓冲液(0.2mL/只)；第二组为阳性对照组(SE)，24只肉鸡只在第4天时用肠炎沙门氏菌(108～109CFU/0.2mL/只)感染；第三组为试验组(SE+PA01)，每天饲喂一次植物乳杆菌PA01(109CFU/0.2mL/只)，第4天用沙门氏菌(108～109CFU/0.2mL/只)感染。在感染沙门氏菌后的第1天、第3天和第5天三组采集肉鸡肝脏、脾脏和盲肠(含内容物)，用于沙门氏菌计数检测。
与阳性对照组相比，实验组在感染后的肉鸡盲肠沙门氏菌第1d、第3d和第5d数量显著降低(见表2)，植物乳杆菌PA01均能够显著减少沙门氏菌在盲肠中的定植(P<0.05)。
感染后1、3和5天肉鸡肝脏和脾脏中检测到沙门氏菌，说明沙门氏菌能迅速侵入这些组织。而感染沙门氏菌同时饲喂乳杆菌后的肉鸡肝脏、脾脏中均未检出到沙门氏菌，说明植物乳杆菌PA01可以有效抑制沙门氏菌对这些组织的侵染。
表2沙门氏菌在肉鸡盲肠、肝脏和脾脏中的数量
Figure BDA0001848535080000111
注：同列标有不同小写字母差异显著(P<0.05)，——表示未检出，下表同。
实施例7植物乳杆菌PA01对感染沙门氏菌肉鸡血清细胞因子水平的影响
在肉雏鸡感染沙门氏菌后的第1天、第3天和第5天，由翅动脉抽取肉鸡血液，转移至灭菌的离心管中，室温放置30min后低速离心10min，收集血清，然后放于-20℃冰箱保存。采用ELISA的方法检测样品中抗体的效价。
检测结果如表3，与阳性对照组相比，植物乳杆菌PA01试验组能显著降低雏鸡血液中促炎细胞因子LITAF、IL-1β、IL-6和IL-12的表达水平。与阳性对照组相比，提前用植物乳杆菌PA01处理的雏鸡血清中IL-10具有较高的表达水平(P<0.05)。植物乳杆菌PA01试验组的抗炎性因子IL-10较阳性对照组和阴性对照组有提高(P<0.05)，表示植物乳杆菌PA01可能促进抗炎性因子IL-10的表达，激活炎症与免疫抑制因子，从而调节炎性反应和免疫反应。
表3植物乳杆菌PA01对感染沙门氏菌肉鸡血清细胞因子水平的影响
Figure BDA0001848535080000121
实施例8植物乳杆菌PA01对肉鸡生产性能的影响
将288只健康1日龄的AA肉仔鸡随机分成3组，每组6个重复，每个重复16只肉仔鸡。第1组为对照组，日粮选用不添加抗生素的基础日粮；第2组为抗生素组，在对照组基础上添加50mg/kg的金霉素；第3组为植物乳杆菌PA01添加组(日粮)，在对照组基础上添加109CFU/kg的植物乳杆菌PA01。基础日粮在0～21天为育雏期日粮，22～42天为育成期日粮。
42日龄时统计平均日增重、平均日采食量和饲料转化率，结果如表4所示，日粮添加植物乳杆菌PA01显著地提高了平均日增重(P<0.05)，并且与抗生素组差异不显著(P>0.05)。植物乳杆菌PA01对平均日采食量无显著影响(P>0.05)。植物乳杆菌PA01组的42日龄体重显著高于对照组(P<0.05)，并且与抗生素组差异不显著(P>0.05)。
试验结果表明在肉鸡饲料中添加植物乳杆菌PA01与添加抗生素有相同的效果，因此植物乳杆菌PA01可以完全代替抗生素，从而减少饲粮中长期低剂量添加抗生素导致的耐药性和抗生素残留的问题。
表4植物乳杆菌PA01对肉鸡生产性能的影响
Figure BDA0001848535080000131
同行标有相同小写字母差异不显著(P>0.05)，标有不同小写字母差异显著(P<0.05)。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种植物乳杆菌及其应用
<130> seqlist
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1171
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
agacccttag gcggctggtt cctaaaaggt taccccaccg actttgggtg ttacaaactc 60
tcatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat 120
ccgcgattac tagcgattcc gacttcatgt aggcgagttg cagcctacaa tccgaactga 180
gaatggcttt aagagattag cttactctcg cgagttcgca actcgttgta ccatccattg 240
tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc 300
tccggtttgt caccggcagt ctcaccagag tgcccaactt aatgctggca actgataata 360
agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca 420
tgcaccacct gtatccatgt ccccgaaggg aacgtctaat ctcttagatt tgcatagtat 480
gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgtagc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 540
tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc agccttgcgg ccgtactccc caggcggaat 600
gcttaatgcg ttagctgcag cactgaaggg cggaaaccct ccaacactta gcattcatcg 660
tttacggtat ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct acccatactt tcgagcctca 720
gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata tatctacgca 780
tttcaccgct acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc ccagtttccg 840
atgcacttct tcggttgagc cgaaaggctt tcacatcaga cttaaaaaac cgcctgcgct 900
cgctttacgc ccaataaatc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg 960
cacgtagtta gccgtgcttt ctgttaaata ccgtcaatac tgaacagtac tctcagaata 1020
ttgtttcttc tttaacaaca gagtttttac gagcgaaccg tcttccctca cgcgcgtggc 1080
ttcatcagac ttcgtccatt gtgagatccc ctactgctgc tcggtagagt tcggcggatt 1140
ccagttccaa ttgtgacgga tttaccttac t 1171

Claims (7)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其特征在于，所述植物乳杆菌菌株名称为PA01，保藏号为CGMCC No.15660。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备食品和饲料添加剂中的应用。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备调节动物肠道疾病的调节剂中的应用。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备动物抗生素替代剂中的应用。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备免疫调节剂中的应用。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备病原菌抑菌剂中的应用，所述病原菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。
7.权利要求1所述的植物乳杆菌在提高肉鸡生产性能方面的应用。
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