CN109115927A - 一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测及鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测及鉴别方法。本发明的一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测方法，运用HPLC指纹图谱，明确其化学成分在色谱图谱中的特征，利用烫骨碎补成分中具有5‑羟甲基糠醛，骨碎补成分中无此成分，有效区别骨碎补与烫骨碎补制剂，该方法准确度高，稳定性强，便于实际运用，具有良好的应用前景。

Description

一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测及鉴别方法

技术领域

本发明具体涉及一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测及鉴别方法。

背景技术

骨碎补为常用中药，是水龙骨科(polypodiaceae)多年生蕨类植物。又名：破故纸，婆固脂，胡韭子。产于云南(西双版纳)、四川金沙江河谷。种子入药，有补肾壮阳、补脾健胃之功能。骨碎补主要含有黄酮类、三萜类、苯丙素类、酚酸、木脂素等，现代药理及临床研究表明，促增殖分化作用、抗骨质疏松作用、抗炎作用、促进骨折愈合、牙骨细胞保护作用、肾保护作用、防治药物中毒性耳聋、降血脂等作用。骨碎补化学类型多样，药理作用显著，具有广阔的研发前景。

烫骨碎补由骨碎补进一步加工制作而成，是取干燥后的净骨碎补，用砂石炒烫至鼓起，颜色呈深褐色，再撞去表面的鳞毛。其与普通骨碎补在功效上没有太大差异，只不过经过烫炙之后，去除了其寒气，更加适合寒凉体质者服用。

目前对骨碎补、烫骨碎补的研究多集中于其成分和炮制工艺，对两者的鉴定及区分还未有相关报道。而其中成分差异，使之适用人群不同，如果混淆两者会对用药者产生不利影响，因此对两者的鉴定及区分是有必要的。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种骨碎补与烫骨碎补制剂的质量检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：

1)参照物溶液的制备：取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品加甲醇制成参照物溶液；

2)供试品溶液的制备：取待检样品，加50％甲醇提取，过滤，取滤液，即得供试品溶液；

3)吸取参照物溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相A，以0.08％甲酸溶液为流动相B梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：

进一步地，步骤1)所述5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷溶液浓度为每1ml含30μg、30μg、60μg的溶液。

进一步地，步骤2)所述待测样品为药材粉末、饮片粉末、提取物或颗粒剂中的一种或几种。

更进一步地，所述药材粉末、饮片粉末与50％甲醇的质量体积比为1g:100mL；所述提取物或颗粒剂与50％甲醇的质量体积比为1g:250mL。

进一步地，步骤2)所述提取为超声提取，提取功率600W，频率40kHz，时间30min。

进一步地，步骤3)所述参照物溶液和供试品溶液吸取量为10μl。

进一步地，步骤3)所述色谱条件为波长260nm，流速1.0ml/min，柱温40℃，理论板数按柚皮苷峰计算不低于3000；和/或，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18 250×4.6mm、phenomenex Luna 5μm C18(2)100A 4.6×250mm、AgilentZORAX Eclipse Plus C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron。

本发明还提供了一种骨碎补与烫骨碎补制剂的鉴别方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)取待检骨碎补或烫骨碎补制剂；

(2)按前述高效液相色谱法检测；

(3)分析指纹图谱。

进一步地，所述指纹图谱为烫骨碎补应呈现8个特征峰，其中3个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与原儿茶酸参照物相应的峰为S1峰，与5-羟甲基糠醛参照物相应的峰为峰1，计算峰1-4与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内，相对保留时间分别为：0.793(峰1)、1.000(峰2,S1)、1.463(峰3)、1.514(峰4)；与柚皮苷参照物相应的峰为S2峰，计算峰5-8与S2峰的相对保留时间，其相对保留之间规定值在±5％之内，相对保留时间分别为：0.577(峰5)、0.699(峰6)、0.876(峰7)、1.000(峰8,S2)。

更进一步地，所述指纹图谱缺5-羟甲基糠醛参照物相应峰，其余峰与烫骨碎补相同则为骨碎补。

本发明的一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测及鉴别方法，利用烫骨碎补成分中具有5-羟甲基糠醛，骨碎补成分中无此成分，有效区别骨碎补与烫骨碎补饮制剂。本发明适用于骨碎补与烫骨碎补不同制剂的鉴别，方法简单，便于实际运用，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1烫骨碎补配方颗粒特征图谱

图2骨碎补饮片、烫骨碎补饮片、骨碎补提取物、烫骨碎补提取物特征图谱对比图(S1(7):骨碎补饮片对照特征图谱，S2(7):骨碎补提取物对照特征图谱，S3(8):烫骨碎补饮片对照特征图谱，S4(8):烫骨碎补提取物对照特征图谱，S1(7)、S2(7)：峰1,S1：原儿茶酸；峰7,S2：柚皮苷，S3(8)、S4(8)：峰1：5-羟甲基糠醛；峰2,S1：原儿茶酸；峰8,S2：柚皮苷)

图3原儿茶酸紫外吸收光谱图

图4 5-羟甲基糠醛紫外吸收光谱图

图5柚皮苷紫外吸收光谱图

图6烫骨碎补配方颗粒3D色谱图

图7烫骨碎补配方颗粒不同波长色谱图

图8柱温考察色谱图

图9流速考察

图10提取溶剂考察

图11溶剂加入量考察

图12提取方法考察

图13提取时间考察

图14骨碎补对照药材、烫骨碎补饮片、烫骨碎补配方颗粒特征图谱对比图

图15不同仪器考察

图16不同色谱柱考察

图17烫骨碎补配方颗粒对照特征图谱

具体实施方式

实验仪器及材料

高效液相色谱仪：安捷伦1200型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪；

电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；

超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 250×4.6mm、phenomenex Luna 5um C18(2)100A 4.6×250mm、Agilent ZORAX Eclipse Plus C18 Analytical 4.6*250mm 5-Micron。

柚皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：110722-201714，含量以93.4％计)，5-羟甲基糠醛(中国食品药品检定研究院，批号：111626-201509，含量以97.8％计)，原儿茶酸(中国食品药品检定研究院，批号：110809-201205，含量以99.9％计)。

乙腈(SIGMA公司，色谱纯)；甲酸(优级纯)；水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

烫骨碎补配方颗粒SY1806001、SY1806002、SY1806003。

骨碎补配方颗粒GSB180601、GSB180602、GSB180603

骨碎补饮片(XLS201805420、XLS201805421、XLS201805422、XLS201805423、XLS201805424、XLS201805425、XLS201805426、XLS201805427、XLS201805428、XLS201805429、XLS201806499、XLS201806500、XLS201806501、XLS201806551、XLS201806552、XLS201806553、XLS201806554、010172-1612001)

烫骨碎补饮片(TGSB180601、TGSB180602、TGSB180603、TGSB180604、TGSB180605、TGSB180606、TGSB180607、TGSB180608、TGSB180609、TGSB180610、TGSB180611、TGSB180612、TGSB180613、TGSB180616、TGSB180617、TGSB180618、TGSB180619、TGSB180620)

实施例1烫骨碎补配方颗粒鉴定

1)、参照物溶液的制备：取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml各含30μg、30μg、60μg的参照物溶液。

2)、供试品溶液的制备：取烫骨碎补配方颗粒，研细，各精密称定0.2g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

3)、特征图谱的测定：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；

色谱条件如下：

检测波长：260nm；

色谱柱：C18色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；

流动相:乙腈(A)和0.08％甲酸溶液(B)，梯度洗脱(0～7min，6％～6％A；7～12min，6％～11％A；12～14min，11％～11％A；14～45min，11％～27％A)；

流速1.0ml/min；

柱温40℃；

4)分析指纹图谱：

烫骨碎补配方颗粒特征图谱见图1。图中呈现8个特征峰，其中3个峰分别与相应的参照物峰保留时间相同，与原儿茶酸参照物相应的峰为S1峰，与5-羟甲基糠醛参照物相应的峰为峰1，计算峰1-4与S1峰的相对保留时间(见表1)，其相对保留时间在规定值的±5％之内，规定值为0.793(峰1)、1.000(峰2,S1)、1.463(峰3)、1.514(峰4)；与柚皮苷参照物相应的峰为S2峰，计算峰5-8与S2峰的相对保留时间(见表1)，其相对保留时间规定值在±5％之内，规定值为0.577(峰5)、0.699(峰6)、0.876(峰7)、1.000(峰8,S2)。

表1烫骨碎补配方颗粒相对保留时间

实施例2骨碎补与烫骨碎补鉴别

1)参照物溶液的制备：取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含30μg、30μg、60μg的溶液，即得。

2)供试品溶液的制备：取骨碎补饮片粗粉、烫骨碎补饮片粗粉各0.5g，骨碎补提取物、烫骨碎补提取物各0.2g，精密称定，置不同具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3)特征图谱的测定：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；

色谱条件如下：

检测波长：260nm；

色谱柱：C18色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；

流动相:乙腈(A)和0.08％甲酸溶液(B)，梯度洗脱(0～7min，6％～6％A；7～12min，6％～11％A；12～14min，11％～11％A；14～45min，11％～27％A)；

流速1.0ml/min；

柱温40℃；

4)分析指纹图谱：

骨碎补饮片、烫骨碎补饮片、骨碎补提取物、烫骨碎补提取物特征图谱对比图见图2。从图中可见：骨碎补饮片及骨碎补提取物特征图谱具有一致性，烫骨碎补饮片及烫骨碎补提取物特征图谱具有一致性。烫骨碎补特征图谱中具有5-羟甲基糠醛相应峰，骨碎补特征图谱中无此成分相应峰，因此从中能有效区别骨碎补与烫骨碎补饮片及提取物。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1液相特征图谱方法学

1、色谱条件

色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以乙腈为流动相A，以0.08％甲酸溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长：260nm。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于3000。

表2流动相梯度洗脱比例

1.1波长选择

在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器分别对5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷、供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm波长下的色谱图。见图3-7。

结果表明，在检测波长为260nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为260nm。

1.2柱温考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、30℃、40℃时进行考察。见图8。

柱温考察结果表明，当柱温为20℃和30℃时，峰3和峰4不能分离，当柱温为40℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，故最终确定40℃作为烫骨碎补配方颗粒特征图谱方法的柱温。

1.3流速考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min时进行了考察。见图9，表3。

表3流速考察—特征峰相对保留时间

结果表明，流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时，各特征峰的相对保留时间RSD为0.57％～21.99％，在流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0ml/min。

2参照物溶液的制备

取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含30μg、30μg、60μg的溶液，即得。

3供试品溶液的制备

3.1提取溶剂考察

取烫骨碎补配方颗粒(批号1710008)研细，精密称定0.2g，置具塞锥形瓶中，分别以甲醇、50％甲醇、80％甲醇、水、50％乙醇、乙醇50ml作为供试品溶剂进行考察，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图10。

结果表明，提取溶剂中50％甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量大，故供试品提取溶剂确定为50％甲醇。

3.2溶剂加入量考察

取烫骨碎补配方颗粒(批号1710008)研细，精密称定0.2g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇25ml、50ml、100ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图11。

结果表明，在溶剂加入量为50ml时，特征图谱色谱峰面积适中。故供试品溶剂加入量确定为50ml。

3.3提取方式考察

取烫骨碎补配方颗粒(批号：1710008)研细，精密称定0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，分别对供试品采用回流、超声的提取方式进行考察，提取时间20min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图12。

结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。

3.4提取时间考察

取烫骨碎补配方颗粒(批号1710008)研细，精密称定0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为10分钟、20分钟、30分钟时进行考察，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图13。

结果表明，在提取时间为20分钟时，即可充分提取。故供试品提取时间确定为20分钟。

3.5最终确定供试品制备方法：取本品颗粒约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声20分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

试验例2液相特征图谱方法学考察

1色谱峰指认

参照物溶液的制备：取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml各含30μg、30μg、60μg的溶液，即得。

骨碎补对照药材溶液的制备：取骨碎补对照药材粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

烫骨碎补饮片溶液的制备：取烫骨碎补饮片粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

烫骨碎补配方颗粒溶液的制备：取烫骨碎补配方颗粒精密称定0.2g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照溶液的制备：精密量取50％甲醇50ml，置于具塞锥形瓶中，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按拟定实验方法进行测定，对烫骨碎补配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图14。由专属性结果可知，骨碎补对照药材与烫骨碎补配方颗粒特征图谱之间存在差异。骨碎补对照药材色谱图显示缺少5-羟甲基糠醛参照物相应峰，故选择烫骨碎补饮片作为烫骨碎补配方颗粒的对照饮片。

2、精密度试验

取烫骨碎补配方颗粒(批号：1710008)供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。见表4-5。

表4精密度考察-保留时间

表5精密度考察-峰面积

结果表明，该仪器精密度良好。

3、重复性考察

精密称取烫骨碎补配方颗粒(批号：1710008)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表6-7。

表6重复性考察-相对保留时间比值

表7重复性考察-相对峰面积比值

结果表明，该方法重复性好。

4、中间精密度考察

4.1不同仪器考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取烫骨碎补配方颗粒(批号：1710008)两份，制备供试品溶液，分别在安捷伦1200、岛津LC-20AD、安捷伦1260型高效液相色谱仪上进行测定。见图15、表8-9。

表8仪器耐用性考察-相对保留时间比值

表9仪器耐用性考察-相对峰面积比值

结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD范围为0.37％-6.98％。

4.2不同人员和时间考察

在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取烫骨碎补配方颗粒(批号：1801032)各两份，制备供试品，进行测定。见表10-11。

表10人员和时间考察-相对保留时间比值

表11人员和时间考察-相对峰面积比值

结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。

5耐用性考察

5.1色谱柱耐用性考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18、phenomenex Luna 5um C18(2)100A、Agilent ZORAX Eclipse Plus C18 Analytical。进行考察。见图16，表12、13。

表12色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值

表13色谱柱耐用性考察-相对峰面积比值

结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.13％～11.35％，特征峰相对峰面积的RSD在0.51％～6.53％。

5.2稳定性

在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，3h，6h，9h，12h，24h时测定。见表14-15。

表14稳定性考察-保留时间

表15稳定性考察-峰面积

结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.09％～1.28％，样品溶液在24小时内较稳定。

6方法学小结

选择峰8为S峰时，各阶段的RSD见表16。选择峰2为S峰时，各阶段的RSD见表17。

表16峰8为S峰时，RSD值

表17峰2为S峰时，RSD值

综上所述，峰1-4选择峰2作为S峰时，耐用性均满足±5％的要求；峰5-8选择峰8作为S峰时，耐用性均满足±5％的要求，因此选择峰2作为S1，峰8作为S2峰。

试验例3特征峰的确定及对照图谱的建立

1、烫骨碎补配方颗粒特征图谱验证

采用拟定的方法对3批烫骨碎补配方颗粒进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。特征图谱及相对保留时间结果同实验例1中图1及表1，相对峰面积见表18。

表18 3批烫骨碎补配方颗粒相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰4作为S峰时，3批次烫骨碎补配方颗粒特征峰相对保留时间RSD在0.01％～0.08％，3批次烫骨碎补配方颗粒8个特征峰相对保留时间RSD均小于3％。

2相对保留时间规定值限度的制定

汇总方法学各考察项目及验证结果，见表19。

表19方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间

根据汇总结果，将各峰的相对保留时间规定值暂定为5％。

最终规定：烫骨碎补供试品特征图谱中应呈现8个特征峰，其中3个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与原儿茶酸参照物相应的峰为S1峰，计算峰1-4与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内，规定值为0.793(峰1)、1.000(峰2,S1)、1.463(峰3)、1.514(峰4)；与柚皮苷参照物相应的峰为S2峰，计算峰5-8与S2峰的相对保留时间，其相对保留之间规定值在±5％之内，规定值为0.577(峰5)、0.699(峰6)、0.876(峰7)、1.000(峰8,S2)。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)对3批烫骨碎补配方颗粒进行合成，建立了烫骨碎补配方颗粒特征图谱的对照图谱。见图17。

通过高效液相色谱条件的筛选及方法学的验证，确定了骨碎补饮片及骨碎补提取物具有相同物质基础；烫骨碎补饮片及烫骨碎补提取物具有相同物质基础。骨碎补饮片、提取物与烫骨碎补饮片及提取物具有差异，烫骨碎补成分中具有5-羟甲基糠醛，骨碎补成分中无此成分，该检测方法能有效区别骨碎补饮片与烫骨碎补饮片，骨碎补提取物及烫骨碎补提取物。

Claims (10)

1.一种骨碎补与烫骨碎补制剂的质量检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法检测，其操作步骤如下：

1)参照物溶液的制备：取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品加甲醇制成参照物溶液；

2)供试品溶液的制备：取待检样品，加50％甲醇提取，过滤，取滤液，即得供试品溶液；

3)吸取参照物溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相A，以0.08％甲酸溶液为流动相B梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷溶液浓度为每1ml含30μg、30μg、60μg的溶液。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述待测样品为药材粉末、饮片粉末、提取物或颗粒剂中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述药材粉末、饮片粉末与50％甲醇的质量体积比为1g:100mL；所述提取物或颗粒剂与50％甲醇的质量体积比为1g:250mL。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述提取为超声提取，提取功率600W，频率40kHz，时间30min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)所述参照物溶液和供试品溶液吸取量为10μl。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)所述色谱条件为波长260nm，流速1.0ml/min，柱温40℃，理论板数按柚皮苷峰计算不低于3000；和/或，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 250×4.6mm、phenomenex Luna 5μm C18(2)100A 4.6×250mm、Agilent ZORAX Eclipse Plus C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron。

8.一种骨碎补与烫骨碎补制剂的鉴别方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)取待检骨碎补或烫骨碎补制剂；

(2)按权利要求1-7项所述的高效液相色谱法检测；

(3)分析指纹图谱。

9.根据权利要求8所述的鉴别方法，其特征在于：所述指纹图谱为烫骨碎补应呈现8个特征峰，其中3个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与原儿茶酸参照物相应的峰为S1峰，与5-羟甲基糠醛参照物相应的峰为峰1，计算峰1-4与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内，相对保留时间分别为：0.793(峰1)、1.000(峰2,S1)、1.463(峰3)、1.514(峰4)；与柚皮苷参照物相应的峰为S2峰，计算峰5-8与S2峰的相对保留时间，其相对保留之间规定值在±5％之内，相对保留时间分别为：0.577(峰5)、0.699(峰6)、0.876(峰7)、1.000(峰8,S2)。

10.根据权利要求9所述的鉴别方法，其特征在于，所述指纹图谱缺5-羟甲基糠醛参照物相应峰，其余峰与烫骨碎补相同则为骨碎补。