CN105092724A - 石柑子hplc指纹图谱的构建方法及其hplc指纹图谱 - Google Patents

Abstract

本发明公开了石柑子HPLC指纹图谱的构建方法及其HPLC指纹图谱，基于高效液相色谱技术构建的指纹图谱。该指纹图谱具有16个共有峰，其相对保留时间tg分别为：0.178min、0.268min、0.309min、0.354min、0.411min、0.488min、0.507min、0.633min、0.730min、0.922min、1.000min、1.318min、1.326min、1.525min、1.544min、1.579min。通过指纹图谱中共有峰的有无，可全面地对石柑子的质量进行评价，保证药材质量的稳定性及临床用药的有效性与安全性。

Description

石柑子HPLC指纹图谱的构建方法及其HPLC指纹图谱

技术领域

本发明涉及中药质量检测技术领域，特别是涉及一种石柑子HPLC指纹图谱的构建方法及其HPLC指纹图谱。

背景技术

柑子是天南星科石柑属植物石柑子Pothoschinensis(Raf.)Merr.的干燥全草，是瑶医老班药“五虎、九牛、十八钻、七十二风”之一的葫芦钻。石柑子性平，味淡，具有祛风除湿、活血散瘀、消积止咳的功效，在瑶族地区常用于治疗跌打损伤、风湿骨痛，疗效显著。由于中药成分复杂，仅凭单一指标难以准确评价中药的质量。中药指纹图谱是指某种(某产地)中药所共有的具有特征性的某类或某几类成分的色谱或者光谱图谱。中药指纹图谱因其具有整体性、模糊性和可量化的特点，能够全面地反应中药的内在质量，目前已成为中药质量控制最有效的方法之一。

但目前尚无石柑子药材的质量标准，对石柑子药材质量的控制就显得非常薄弱，只包括显微鉴别等常规性检查，缺乏完善的质量评价体系，难以达到对石柑子质量的有效控制。

发明内容

本发明的目的在于提供石柑子HPLC指纹图谱的构建方法，该方法采用高效液相色谱(HPLC)建立其指纹图谱，并用相似度软件进行评价，可全面地对石柑子的质量进行评价，保证药材质量的稳定性及临床用药的有效性与安全性。

其具体的技术方案如下：

一种石柑子HPLC指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的配制：取石柑子粉末(过四号筛)2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再次称重，用50％甲醇补足减失的重量，过滤，精密吸取续滤液10ml，蒸干，残渣加50％甲醇溶解并定容至2ml，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：精密称定阿魏酰酪胺、丁香酸、香草酸对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含阿魏酰酪胺60.42μg、丁香酸120.14μg和香草酸71.25μg的混合溶液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；

(3)高效液相色谱分析：

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，

色谱条件如下：色谱柱：ThermoODS-2Hypersil色谱柱，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；

流动相：以甲醇为流动相A，体积百分含量为0.4％的磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：从0-15mim，流动相A的体积百分含量由10％提高至20％，流动相B的体积百分含量由90％降低至80％；从15-25mim，流动相A的体积百分含量为20％，流动相B的体积百分含量为80％；从25-35mim，流动相A的体积百分含量由20％提高至25％，流动相B的体积百分含量由80％降低至75％；从35-45mim，流动相A的体积百分含量由25％提高至28％，流动相B的体积百分含量由75％降低至72％；从45-50mim，流动相A的体积百分含量为28％，流动相B的体积百分含量为72％；从50-60mim，流动相A的体积百分含量由28％提高至32％，流动相B的体积百分含量由72％降低至68％；从60-70mim，流动相A的体积百分含量由32％提高至40％，流动相B的体积百分含量由68％降低至60％；从70-90mim，流动相A的体积百分含量由40％提高至70％，流动相B的体积百分含量由60％降低至30％；从90-120mim，流动相A的体积百分含量为70％，流动相B的体积百分含量为30％；检测波长：300nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；

(4)测定24批石柑子药材并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的石柑子HPLC的标准指纹图谱。

所述的石柑子HPLC指纹图谱的构建方法，其还包括以下步骤：

(5)所述标准指纹图谱的精密度、重现性及稳定性试验，

(51)精密度试验：

取同一供试品溶液，连续进样6次，以11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.990，表明仪器稳定，精密度良好；

(52)重现性试验：

取同一批石柑子粉末，精密称取6份，按步骤(51)下供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，以11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，表明所述石柑子HPLC指纹图谱的构建方法重现性良好；

(53)稳定性试验：

取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24h进样检测，以11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，表明供试品溶液在24小时内稳定。

本发明的另一目的是提供上述方法构建得到的石柑子HPLC的标准指纹图谱，所述石柑子HPLC的标准指纹图谱具有的16个共有峰的相对保留时间tg分别为：0.178min、0.268min、0.309min、0.354min、0.411min、0.488min、0.507min、0.633min、0.730min、0.922min、1.000min、1.318min、1.326min、1.525min、1.544min、1.579min。

本发明具有如下优点和用途：通过高效液相色谱(HPLC)建立石柑子HPLC的标准指纹图谱，并通过试验确定标准指纹图谱的精密度、重现性及稳定性；通过指纹图谱中共有峰的有无，可全面地对石柑子的质量进行评价，保证药材质量的稳定性及临床用药有有效性与安全性。

下面结合附图与具体实施方式，对本发明进一步详细说明。

附图说明

图1为石柑子HPLC标准指纹图谱；

图2为24批石柑子的HPLC指纹图谱叠加图；

图3为不同流动相***的HPLC色谱图；

图4为不同浓度磷酸水溶液的HPLC色谱图；

图5为不同提取溶剂的HPLC色谱图；

图6为精密度试验叠加图；

图7为重复性试验叠加图；

图8为稳定性试验叠加图。

具体实施方式

参见图1～图2，以下通过具体实施例对本发明做进一步的阐述。

选用Waterse2695-2489型高效液相色谱仪(美国)：PAD检测器，四元梯度泵，Empower2数据处理软件***；MilliporeAdvantageA10超纯水***(美国)；MettlerToledoXS205DU型电子分析天平(瑞士)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-8型数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)。

选用阿魏酰酪胺(自制，纯度≥99.5％)，丁香酸(自制：纯度≥99.0％)，香草酸(批号：X-030-140801，购自成都瑞芬思生物科技有限公司)；液相用甲醇为色谱纯(Merck)；液相用水为超纯水；提取用水为广东省第二中医院制剂室自制纯化水；其余试剂均为分析纯。

色谱条件：色谱柱：ThermoODS-2Hypersil色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.4％磷酸水溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长：300nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。

表1梯度洗脱程序

供试品溶液的配制：取石柑子粉末(过四号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再次称重，用50％甲醇补足减失的重量，过滤，精密吸取续滤液10ml，蒸干，残渣加50％甲醇溶解并定容至2ml，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：精密称定阿魏酰酪胺、丁香酸、香草酸对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含阿魏酰酪胺60.42μg、丁香酸120.14μg和香草酸71.25μg的混合溶液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

指纹图谱的建立：测定24批石柑子药材HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的石柑子HPLC的标准指纹图谱(如图1、2所示)，其中2号峰为香草酸，3号峰为丁香酸，11号峰为阿魏酰酪胺.

选定该24批样品，将其导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2004A版)”，选取时间窗宽度为0.1min，以中位数生成对照谱图，经过多点校正后自动匹配，生成石柑子指纹图谱共有模式，并计算24批样品的指纹图谱与该共有模式的相似度。以11号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的16个共有峰的相对保留时间tg分别为：0.178min、0.268min、0.309min、0.354min、0.411min、0.488min、0.507min、0.633min、0.730min、0.922min、1.000min、1.318min、1.326min、1.525min、1.544min、1.579min。

将其导入药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价***(A版)，进行色谱峰匹配，以11号峰为参照确定16个共有峰为构成石柑子指纹图谱的特征峰，样品共有峰的相对保留时间及相对峰面积分别列于表2、表3，24批石柑子与标准指纹图谱相似度计算结果分别为：0.958、0.952、0.916、0.954、0.971、0.919、0.908、0.941、0.926、0.968、0.993、0.952、0.911、0.975、0.998、0.952、0.969、0.948、0.956、0.915、0.992、0.979、0.975、0.907。

表224批石柑子指纹图谱共有峰相对保留时间

表324批石柑子指纹图谱共有峰相对峰面积

本实施例中，参见图3(图中A为乙腈-水；B为甲醇-水；C为甲醇-甲酸水溶液；D为甲醇-磷酸水溶液)，图4(图中A为0.05％磷酸水溶液；B为0.1％磷酸水溶液；C为0.4％磷酸水溶液)，对流动相条件的进行优化，分别试验了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液4种流动相***，并考察了不同浓度的磷酸水溶液对石柑子色谱行为的影响。结果表明，以乙腈-水为流动相时，大部分成分过早地被洗脱下来，色谱峰堆积在前30分钟，分离度较差；以甲醇-水为流动相时，谱图信息较少，无法全面反映石柑子的内在质量；以甲醇-甲酸水溶液为流动相时，色谱峰峰形较差。以甲醇-磷酸为流动相时，色谱信息较丰富且峰形较好，见图3。流动相中以0.4％磷酸水溶液为佳，若采用0.05％或0.1％的磷酸水溶液，则部分色谱峰分离度较差，见图4。确定以甲醇-0.4％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。

提取溶剂的选用，参见图5(A为水；B为乙醇；C为甲醇；D为50％甲醇)分别以水、乙醇、甲醇、50％甲醇作为提取溶剂对样品进行提取，并对所得图谱进行比较。结果表明，采用水作为提取溶剂时，样品中极性较小的成分没有被充分提取出来，色谱峰主要集中在前50分钟；而采用乙醇和甲醇作为提取溶剂时，样品中极性较大的成分难以提取出来，大部分色谱峰的保留时间都在60分钟以后，且提取液中叶绿素等杂质较多，对色谱柱污染严重；而采用50％甲醇作为提取溶剂时，样品中成分提取完全，图谱信息丰富，能最大限度的反映药材的成分特征，且降低了叶绿素等杂质的干扰和污染，因而采用50％甲醇作为样品的提取溶剂。

精密度试验：取同一供试品溶液(S20)，连续进样6次，所得指纹图谱叠加图见图6。采用中药色谱指纹图谱评价分析***2004A版对其指纹图谱进行分析，与生成的对照指纹图谱相比，各图谱的相似度均大于0.990。以11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.990，表明仪器稳定，精密度良好。结果见表4、5、6。

表4精密度试验指纹图谱相似度分析结果

表5精密度试验共有峰相对保留时间

表6精密度试验共有峰相对峰面积

重现性试验：取同一批石柑子粉末(S20)，精密称取6份，按供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，同法进行检测，所得指纹图谱叠加图见图7。采用相似度评价软件对其指纹图谱进行分析，与生成的对照指纹图谱相比，6份样品的相似度均大于0.990。以11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，表明该方法重现性良好。结果见表7、8、9。

表7重复性试验指纹图谱相似度分析结果

表8重复性试验共有峰相对保留时间

表9重复性试验共有峰相对峰面积

稳定性试验：取同一份供试品溶液(S20)，分别于0，2，4，8，16，24h进样检测，所得指纹图谱叠加图见图8。采用相似度评价软件对其指纹图谱进行分析，与生成的对照指纹图谱相比，各图谱的相似度均大于0.990。以11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，表明供试品溶液在24小时内稳定，符合指纹图谱技术要求。结果见表10、11、12。

表10稳定性试验指纹图谱相似度分析结果

表11稳定性试验共有峰相对保留时间

表12稳定性试验共有峰相对峰面积

相似度评价分析：24批石柑子样品指纹图谱的相似度计算结果见表13，由结果可知，24批样品中，12批样品的相似度在0.9以上，8批样品的相似度在0.8～0.9之间，其余4批样品的相似度在0.7～0.8之间。

对相似度在0.8以下的4批样品进行分析，11号样品中茎的部分较多而叶的部分较少，从而导致化学成分有所不同，共有峰较少；12号样品生长年限较短，叶片较幼嫩，叶绿素较多，成分富集不够；而22号样品在贮存过程中有少量霉变，可能导致部分成分发生变化。表明石柑子药材的质量受到生长年限、采收加工和储存条件等诸多因素的影响。

表1324批石柑子HPLC指纹图谱相似度

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变动和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.石柑子HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤和条件：

(1)供试品溶液的配制：

取石柑子粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再次称重，用50％甲醇补足减失的重量，过滤，精密吸取续滤液10ml，蒸干，残渣加50％甲醇溶解并定容至2ml，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：

精密称定阿魏酰酪胺、丁香酸、香草酸对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含阿魏酰酪胺60.42μg、丁香酸120.14μg和香草酸71.25μg的混合溶液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；

(3)高效液相色谱分析：

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中；

色谱条件为色谱柱：ThermoODS-2Hypersil色谱柱，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；

流动相：以甲醇为流动相A，体积百分含量为0.4％的磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：从0-15mim，流动相A的体积百分含量由10％提高至20％，流动相B的体积百分含量由90％降低至80％；从15-25mim，流动相A的体积百分含量为20％，流动相B的体积百分含量为80％；从25-35mim，流动相A的体积百分含量由20％提高至25％，流动相B的体积百分含量由80％降低至75％；从35-45mim，流动相A的体积百分含量由25％提高至28％，流动相B的体积百分含量由75％降低至72％；从45-50mim，流动相A的体积百分含量为28％，流动相B的体积百分含量为72％；从50-60mim，流动相A的体积百分含量由28％提高至32％，流动相B的体积百分含量由72％降低至68％；从60-70mim，流动相A的体积百分含量由32％提高至40％，流动相B的体积百分含量由68％降低至60％；从70-90mim，流动相A的体积百分含量由40％提高至70％，流动相B的体积百分含量由60％降低至30％；从90-120mim，流动相A的体积百分含量为70％，流动相B的体积百分含量为30％；检测波长：300nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；

(4)测定24批石柑子药材并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的石柑子HPLC的标准指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的石柑子HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，其还包括以下步骤：(5)所述标准指纹图谱的精密度、重现性及稳定性试验，

(51)精密度试验：

取同一供试品溶液，连续进样6次，以11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.990，仪器稳定，精密度良好；

(52)重现性试验：

取同一批石柑子粉末，精密称取6份，按步骤(51)下供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，以11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，所述石柑子HPLC指纹图谱的构建方法重现性良好；

(53)稳定性试验：

取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24h进样检测，以11号峰为参照峰，计算出1-16号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，供试品溶液在24小时内稳定。

3.石柑子HPLC指纹图谱，其特征在于，石柑子HPLC的标准指纹图谱是由16个共有指纹峰构成，该石柑子HPLC的标准指纹图谱具有的16个共有峰的相对保留时间tg分别为：0.178min、0.268min、0.309min、0.354min、0.411min、0.488min、0.507min、0.633min、0.730min、0.922min、1.000min、1.318min、1.326min、1.525min、1.544min、1.579min。