CN115521877B - 青霉菌株及其在制备布雷菲德菌素a中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种青霉菌株及其在制备布雷菲德菌素A中的应用。一株青霉菌株（Penicillium glaucoroseum），2020年08月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.20244，名称为青霉BT‑38。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明的应用具体是以虫蛀或发霉大米为底物，在20～35℃的温度下对青霉BT‑38进行发酵培养，培养时间为3～11天，所得发酵产物经分离纯化得到高纯度的布雷菲德菌素A。

Description

青霉菌株及其在制备布雷菲德菌素A中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种青霉菌株及其在制备布雷菲德菌素A中的应用。

背景技术

大米在为人民提供食物方面发挥着主导作用。农民通常使用传统的储存容器储存大米，但是储藏容器中的一部分大米受到各种生物因素的损害或腐烂。生物因素包括真菌、螨虫、霉菌、昆虫、害虫、啮齿动物、蜥蜴、鸟类等。在常见的生物制剂中，甲虫和蛾子是热带国家发现的导致储藏大米损失和变质的主要大米储藏害虫。霉菌毒素污染是大米损失的另一个巨大的因素，大量谷物被全球储藏真菌产生的真菌毒素污染。霉菌和霉菌毒素会导致大米损失，是食品价值链中的一个危险因素。其中高浓度的黄曲霉毒素会导致黄曲霉毒素中毒，从而导致严重的疾病甚至死亡。因此当人们遇到大米生虫或发霉后，会将大米丢弃照成巨大浪费。因此利用虫蛀和发霉大米生产微生物次级代谢产物，使生虫和发霉大米的到再次利用，更绿色、生态和环保。

微生物发酵包括固体发酵(SSF)和液体发酵(SmF)。其中，固体发酵已经有一千年的历史，并在很长的时间里是微生物发酵唯一的手段。但在20世纪40年代，随着科学家们通过液体发酵方法生产出了青霉素后，越来越多的抗生素通过液体发酵分离得到，使得液体发酵在抗生素的生产中占据绝对地位。近些年来，固体发酵越来越受到重视，但是基本上集中在农业生产上。据我所知本专利为第一个可以使用固体发酵工业生产抗生素的案例，为后续固体发酵生产抗生素的提供参考。固体发酵相对于液体发酵最显著的区别在于培养基质中没有加入大量的水，因此具有发酵时间长并且发酵流动性差，难以精确控制发酵过程的缺点。与此同时固体发酵存在的优势有很多，因为在发酵罐中水分含量低，固体发酵使用发酵罐体积更小，灭菌过程水分吸热耗能低，提取和浓缩成本低。通常情况下，产品是浓缩的浸在基质中，发酵的固体可以通过直接添加溶剂来立即提取，且减少或消除了污水处理的资本和运营成本。

一些研究表明，在SSF下生长的真菌能够满足全球对次生代谢物日益增长的需求。还有其他几个例子表明，SSF在短时间内产生大量次级代谢产物，产生比液体发酵更稳定的抗生素。SSF为培养的微生物提供了一个尽可能接近其自然环境的环境，这是微生物在SSF中表现良好并获得较高产品产量的主要原因。但是，由于提取了大量的固体，人们还提取了更多的浓缩杂质，提纯的成本与惰性化合物的浓度成正比。这实际上可能导致回收成本的增加，特别是在提取次生代谢物方面。因此，最终产品的分离和纯化通常被认为是这项技术的一个挑战，常占整个发酵过程的70％-80％。

布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)是一种天然存在的具有13元环大环内酯类抗生素，BFA具有抑制蛋白质由内质网向高尔基体复合物转运过程的功效。研究发现BFA具有抗细菌、抗真菌和抗肿瘤的活性。BFA作为一种蛋白转运抑制剂，能够影响蛋白质转运、加工过程，已成为细胞生物学家研究哺乳动物细胞信号转导途径的重要分子工具，且BFA对人类部分肿瘤细胞具有很好的抑制效果，可进一步开发为抗肿瘤药物或者作为抗肿瘤药物的先导化合物进行开发，具有一定的市场需求。关于发酵生产BFA的报道均为液体发酵，其工艺复杂、效率低、提取分离过程繁琐，经济性差、产生废水量大，环境污染严重。公开号为CN101445784A的中国发明专利公开了使用液体发酵生产BFA的技术，其原料均为纯度高的化工产品，价格高，环保性差，而且液体发酵过程使用水分多，占地面积大，产生废水多。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株青霉菌株，该菌株可用于以虫蛀或发霉大米为底物进行发酵生产高纯度布雷菲德菌素A。

本发明的另一目的在于提供一种所述的青霉菌株在制备布雷菲德菌素A中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一株青霉菌株(Penicillium glaucoroseum)，2020年08月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.20244，名称为青霉BT-38。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。青霉BT-38是由采集于浙江的药用植物白术的根基土壤菌中分离得到。

一种所述的青霉菌株在制备布雷菲德菌素A中的应用。

作为优选，以虫蛀或发霉大米为底物，在20～35℃的温度下对青霉BT-38进行发酵培养，培养时间为3～11天，所得发酵产物经分离纯化得到布雷菲德菌素A。

作为优选，所述虫蛀或发霉大米与水混合制成固体培养基进行发酵培养。

作为优选，发酵培养的步骤是：

青霉BT-38接种至PDA培养基，25～35℃培养2～7天，挑取菌种接种至真菌液体培养基，25～35℃培养2～9天，得到种子液；

种子液以体积比1～50％接种至虫蛀或发霉大米培养基。

作为优选，所述虫蛀或发霉大米培养基主要组成是水和虫蛀或发霉大米，其中虫蛀或发霉大米的初始含水量为46％-61％，121℃灭菌20min。

作为优选，所述真菌液体培养基的组成：蛋白胨5.0g，葡萄糖：20.0g，酵母粉：2.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，pH值6.4±0.2加入到1000ml蒸馏水中。

作为优选，分离纯化包括以下步骤：

发酵产物经体积百分含量为60％-100％的乙醇提取、浓缩后，得到提取液和固体残渣，提取液用乙酸乙酯萃取所得萃取相经减压蒸馏后，向得到的含布雷菲德菌素A的粗提物中加入石油醚，离心后取沉淀，得到布雷菲德菌素A粗品，加入甲醇或乙醇后配制成布雷菲德菌素A饱和溶液，趁热过滤，冷却结晶，得到布雷菲德菌素A。分离纯化后可得到纯度≥99％布雷菲德菌素A。

作为优选，乙醇提取控制温度为20～100℃，乙醇提取步骤中的发酵产物与乙醇的质量体积比为1：0.5～32(g：ml)，提取的时间为5～60min。

作为优选，分离得到的布雷菲德菌素A纯度≥99％。

作为优选，发酵产物中的布雷菲德菌素A，

在虫蛀大米培养基中产量≥2.88mg/g(虫蛀大米量)；

在发霉大米培养基中产量≥2.37mg/g(发霉大米量)；

大米培养基中分离纯化后纯度＞99％的BFA的产量为1.58mg/g(大米量)。

本发明所述的应用消除了污水处理的资本和运营成本，且产生的固体残渣营养含量高。并采用加入黄曲霉素，模拟发霉含黄曲霉素大米，对大米中黄曲霉素提取工艺进行考察。实验结果证明98％的黄曲霉素均被提取，剩余固体残渣黄曲霉素含量显著性降低，因此可进一步应用于饲料或生物菌肥，提供了发霉大米再次利用的潜在收益。

本发明所述的应用对目标产物的分离纯化成本非常低，低至发酵成本的10％。与常见固体发酵分离纯化的成本相比降低50％-60％。且该固体发酵工艺发酵时间短，只需8天，为常见固体发酵时间的1/4。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

1、本发明利用该菌株发酵制备布雷菲德菌素A，产量不少于2.88mg/g(虫蛀大米量)，大于99％的BFA的产量为1.58mg/g(大米量)。工艺简单，该菌株为野生菌种活力强，产布雷菲德菌素A类类似物量少，产生的废渣营养含量高，可利用度高；

2、本发明采用固体发酵生产BFA，以虫蛀和发霉大米为培养基，相当于直接使用农产品来发酵，价格低廉，更经济环保；而且，每升虫蛀和发霉大米培养基所含碳源和氮源约为同等体积的液体培养基的十倍，且生产过程中几乎不产生废水，产生的固体废渣含蛋白质，脂肪，碳水化合物分别约为10.0％,1.1％和80.8％，可进一步应用于动物饲料或农肥，无污染，更环保；

3、本发明应用对目标产物的分离纯化成本非常低，低至发酵成本的10％。与常见固体发酵分离纯化的成本相比降低50％-60％；

4、本发明中，采用的固体发酵工艺提取分离纯化溶剂仅需乙醇，乙酸乙酯，石油醚，即可完成，低毒环保。本发明的固体发酵工艺发酵时间短，最大产量只需8天，为常见固体发酵时间的1/4，大大缩短了发酵周期。本发明的固体发酵工艺对大米的质量要求低，即使含低含量的黄曲霉素的大米也可用作原料，黄曲霉素将被提取浓缩入石油醚上清液，可用于该类大米产品的处理。本发明的固体发酵工艺放大发酵类似于红曲发酵工艺，红曲发酵工艺在我国发展成熟，但是我国天然色素行业,某些天然色素产品由于重复建设、产能过剩该工艺可以给予充分利用。

附图说明

图1示出实施例1的青霉属青霉BT-38的菌落形态图；

图2示出实施例1的青霉属青霉BT-38的种子液图；

图3示出实施例2中大米培养基发酵示意图；

图4示出实施例2中发酵产物的HPLC图；

图5示出实施例2中含布雷菲德菌素A的发酵产物乙酸乙酯萃取液HPLC图；

图6示出实施例2中含布雷菲德菌素A的粗提物加入石油醚离心后的上清液的HPLC图；

图7示出实施例2中含布雷菲德菌素A的粗提物加入石油醚离心后的沉淀的HPLC图；

图8示出实施例2中提取后固体残渣含量检测结果；

图9示出实施例2中含量大于99％的布雷菲德菌素A的HPLC图；

图10示出实施例2中含量大于99％的布雷菲德菌素A结晶图；

图11示出实施例2中布雷菲德菌素A氢谱图；

图12示出实施例2中布雷菲德菌素A碳谱图；

图13示出实施例2中基本流程图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1：青霉BT-38的鉴定

一株青霉，名称为青霉BT-38，2020年08月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.20244。

该青霉是通过以下的程序获得的：

在采集于浙江的药用植物白术的根基土壤样本中加入无菌水，取上清液接种到PDA培养基中，28℃培养6天；分离单菌落，单一菌株逐一接种至PDA培养基，28℃培养6天，得到青霉BT-38；4℃保藏，备用。

其中，PDA培养基组分是：马铃薯淀粉：11.0g，葡萄糖：20.0g，琼脂15.0g，pH5.6±0.2加入到1000ml蒸馏水中。

青霉BT-38菌株的特征如下：菌落形态：菌株BT-38在固体PDA培养基上生产良好，菌落生长初期呈白色绒毛状，有绒毛边缘；之后菌落中间逐渐变为中间青黄色；菌落有皱褶，菌落不透明，背面棕黄色。菌落形态具体如图1所示。

ITS-DNA序列为

CTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATCATACCTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTCATGGCCGCCGGGGGGCACCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCCCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGATTGCTGTCTGAGCGATTAGCTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCGCCCCCCGGCTCCCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGACCCCCCTCAATCTTTCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA(核苷酸序列为SEQ ID No.1)，通过MEGA4软件在NCBI网站中GENBANK比对，得出与青霉属(Penicillium)同源性100.00％，鉴定BT-38菌株为青霉属。

实施例2：青霉BT-38发酵生产布雷菲德菌素A的应用

采用青霉BT-38发酵生产布雷菲德菌素A的具体步骤如下：

1、将青霉属青霉BT-38接种至PDA培养基，28℃培养5天，挑取菌种接种至200ml真菌液体培养基，28℃培养5天，得到种子液，照片见图2；种子液接种至200g大米培养基；28℃发酵8天后，得到发酵产物，实物照片如图3所示。发酵产物的HPLC图见图4。

其中，PDA培养基的组分：马铃薯淀粉：11.0g，葡萄糖：20.0g，琼脂15.0g，pH5.6±0.2加入到1000ml蒸馏水中。

真菌液体培养基的组分：蛋白胨5.0g，葡萄糖：20.0g，酵母粉：2.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，pH值6.4±0.2加入到1000ml蒸馏水中。

大米培养基由水和大米组成，其中大米的初始含水量为45％，121℃灭菌20min。

2、所得发酵产物经分离纯化得到布雷菲德菌素A。

分离纯化步骤为：青霉BT-38发酵后得到的发酵产物经3.2L的95％(体积)乙醇回流提取、浓缩后至150ml，然后加入150ml乙酸乙酯萃取两次(乙酸乙酯萃取液HPLC图见图5)；所得萃取相经减压蒸馏后，得到的含布雷菲德菌素A的粗提物约2.9克，加入5ml石油醚，离心后取沉淀，加入甲醇配制成布雷菲德菌素A饱和溶液，过滤，室温下过夜结晶，得到布雷菲德菌素A约312mg。

本实施例中，95％乙醇提取的温度为100℃，发酵产物与95％乙醇的质量体积比为1：8(g：ml)，提取时间为60min。

石油醚离心后得到的上清液、沉淀的HPLC图分别见图6和图7。

乙醇提取后得到固体残渣，对该固体残渣含量检测结果见图8，图8说明：本法产生的固体废渣含蛋白质，脂肪，碳水化合物分别约为10.0％,1.1％和80.8％；

最终得到的产品布雷菲德菌素A的HPLC图见图9，图9说明：本法得到的布雷菲德菌素A达到纯度＞99％。

布雷菲德菌素A氢谱图见图11，A碳谱见图12。所得布雷菲德菌素A碳谱(DMSO-d₆)揭示该化合物含有16个碳信号：C16(δ20.7)，C13(δ26.4)，C12(δ31.4)，C14(δ33.4)，C6(δ40.9)，C8(δ43.0)，C9(δ43.3)，C5(δ51.7)，C7(δ70.5)，C15(δ70.8)，C4(δ74.3)，C2(δ116.2)，C11(δ129.2)，C10(δ137.1)，C3(δ154.4)，C1(δ165.6),与已知化合物相比较确定为布雷菲德菌素A。

经检测，大米固体培养基中布雷菲德菌素A的产量为2.88mg/g(大米量)；分离纯化所得的布雷菲德菌素A纯度大于99％的BFA的产量为1.58mg/g(大米量)。

本实施例的BFA不需要使用大孔树脂进行纯化，将该菌株经95％乙醇提取后，利用乙酸乙酯萃取得到的萃取液中BFA含量高，其他杂质较少，仅乙酸乙酯萃取物溶剂挥发过程中即有BFA的析出，再经简单的石油醚洗晶的过程，即可分离得到纯度不低于73.4％的BFA，该工艺十分简单易行，如图13，使用的有机试剂均可回收利用，产生的固体残渣营养丰富，可作为饲料或者农肥进一步利用，绿色环保，经济效益高。

实施例3：5L锥形瓶放大发酵青霉属青霉BT-38菌种在制备布雷菲德菌素A中的应用

(1)将青霉BT-38接种至PDA斜面培养基，28℃培养2天，挑取菌种接种至真菌液体培养基，28℃培养9天，得到种子液；种子液以体积比50％接种至大米培养基；28℃发酵5天后，得到发酵产物。

其中，PDA培养基的组分：马铃薯淀粉：11.0g，葡萄糖：20.0g，琼脂15.0g，pH5.6±0.2加入到1000ml蒸馏水中。

真菌液体培养基的组分：蛋白胨5.0g，葡萄糖：20.0g，酵母粉：2.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，pH值6.4±0.2加入到1000ml蒸馏水中。

虫蛀大米培养基的组分：水和虫蛀大米，其中虫蛀大米与水的比例为20：22.5g/ml，121℃灭菌20min。

(2)所得发酵产物经分离纯化得到布雷菲德菌素A。

分离纯化包括以下步骤：发酵产物经95％乙醇提取、浓缩后，利用乙酸乙酯萃取；所得萃取相经减压蒸馏后，得到的含布雷菲德菌素A的粗提物中加入石油醚，离心后取沉淀，加入乙醇加热配制成布雷菲德菌素A饱和溶液，过滤，冷却结晶，重结晶，得到布雷菲德菌素A。

95％乙醇提取的温度为60℃，发酵产物与95％乙醇的体积比为1：16，95％乙醇提取的时间为30min。

(3)布雷菲德菌素A的浓度采用高效液相色谱分析：发酵后的培养基捣碎，取出5g加入40ml 95％乙醇100℃加热回流提取20min后，取上清液1ml挥干后加入1.0ml甲醇溶解样品，0.45μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析；HPLC分析条件：色谱柱为250mm×4.6mmRascil C18反相柱；流动相为甲醇:水(65:35，v/v流速1.0mL/min，进样量为2.0μL，柱后流出物依次经UV检测；UV检测波长为230nm。

大米固体培养基中布雷菲德菌素A的产量为3.16mg/g(虫蛀大米量)。

实施例4：青霉BT-38菌株使用发霉大米制备布雷菲德菌素A中的应用

(1)将青霉BT-38接种至PDA斜面培养基，28℃培养4天，挑取菌种接种至真菌液体培养基，28℃培养5天，得到种子液；种子液以体积比25％接种至发霉大米培养基；28℃发酵10天后，得到发酵产物；

其中PDA培养基的组分：马铃薯淀粉：11.0g，葡萄糖：20.0g，琼脂15.0g，pH5.6±0.2加入到1000ml蒸馏水中；

真菌液体培养基的组分：蛋白胨5.0g，葡萄糖：20.0g，酵母粉：2.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，pH值6.4±0.2加入到1000ml蒸馏水中。

发霉大米的制备：使用虫蛀大米浸泡水后，放入37℃培养箱中培养基，保持微生物生长需要的温度和湿度，使大米发霉。5天后，取出大米，烘干至恒重后进行实验。

发霉大米培养基的组分是水和发霉大米，其中发霉大米的浓度为20:22.5g/L，121℃灭菌20min。

(2)布雷菲德菌素A的浓度采用高效液相色谱分析：发酵后的培养基捣碎，取出5g加入40ml 95％乙醇70℃加热回流提取20min后，取上清液1ml挥发干燥后加入1.0ml甲醇溶解样品，0.45μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析；HPLC分析条件：色谱柱为250mm×4.6mm Rascil C18反相柱；流动相为甲醇:水(65:35，v/v流速1.0mL/min，进样量为2.0μL，柱后流出物经UV检测；UV检测波长为230nm；

发霉大米培养基中布雷菲德菌素A的产量为2.37mg/g(发霉大米量)。

实施例5：加入黄曲霉素模拟含黄曲霉素大米生产BFA时黄曲霉素的分布

(1)取实验案例一中青霉属青霉BT-38发酵后的虫蛀大米培养基1g加入0.5mg黄曲霉素，模拟含黄曲霉素大米生产BFA，考察黄曲霉素的分布；

(2)所得固体发酵培养基经分离纯化黄曲霉素的分布；

分离纯化包括以下步骤：发酵产物经95％乙醇提取、浓缩后，利用乙酸乙酯萃取；所得萃取相经减压蒸馏后，得到的含布雷菲德菌素A的粗提物中加入石油醚，离心后取沉淀，加入甲醇配制成布雷菲德菌素A饱和溶液，过滤，室温下过夜结晶，重结晶，得到布雷菲德菌素A。

(3)黄曲霉素的浓度采用高效液相色谱分析：发酵后的培养基捣碎，取出1g加入0.5g黄曲霉素后加入8ml 95％乙醇70℃加热回流提取20min三次后，各取上清液1ml挥发干燥后加入1.0ml甲醇溶解样品，使用0.45μm微滤膜过滤，滤液采用岛津HPLC分析；HPLC分析条件：色谱柱为250mm×4.6mm Rascil C18反相柱；流动相为甲醇:水(65:35，v/v流速1.0mL/min，进样量为2.0μL，柱后流出物经UV检测；UV检测波长为230nm；

大米固体发酵物中黄曲霉素第一次提取为三次提取总量的96％。

以上结合了优选的实施方式对本发明进行了说明，不过这些实施方式仅是范例性的，仅起到说明性的作用。在此基础上，可以对本发明进行多种替换和改进，这些均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 浙江中医药大学

<120> 布雷正青霉菌株及其在制备布雷菲德菌素A中的应用

<130> WHLY22-025

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 565

<212> DNA

<213> 布雷正青霉BT-38菌株ITS(Penicillium glaucoroseum)

<400> 1

ctgcggaagg atcattaccg agtgagggcc ctctgggtcc aacctcccac ccgtgtttat 60

catacctagt tgcttcggcg ggcccgccgt catggccgcc ggggggcacc cgcccccggg 120

cccgcgcccg ccgaagcccc ccctgaacgc tgtctgaaga ttgctgtctg agcgattagc 180

taaatcagtt aaaactttca acaacggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag 240

cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc tttgaacgca 300

cattgcgccc cctggtattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcattgc tgccctcaag 360

cacggcttgt gtgttgggcc cccgcccccc ggctcccggg gggcgggccc gaaaggcagc 420

ggcggcaccg cgtccggtcc tcgagcgtat ggggcttcgt cacccgctct gtaggcccgg 480

ccggcgcccg ccggcgaccc ccctcaatct ttctcaggtt gacctcggat caggtaggga 540

tacccgctga acttaagcat atcaa 565

Claims (10)

1.一株青霉菌株，2020年08月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.20244，名称为青霉BT-38，其分类命名为Penicillium glaucoroseum。

2.一种权利要求1所述的青霉菌株在制备布雷菲德菌素A中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：以虫蛀或发霉大米为底物，在20～35℃的温度下对青霉BT-38进行发酵培养，培养时间为3～11天，所得发酵产物经分离纯化得到布雷菲德菌素A。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述虫蛀或发霉大米与水混合制成固体培养基进行发酵培养。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养的步骤是：

青霉BT-38接种至PDA培养基，25～35℃培养2～7天，挑取菌种接种至真菌液体培养基，25～35℃培养2～9天，得到种子液；

种子液以体积比1～50％接种至虫蛀或发霉大米培养基。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述虫蛀或发霉大米培养基主要组成是水和虫蛀或发霉大米，其中虫蛀或发霉大米的初始含水量为46%-61%，121℃灭菌20min；

所述真菌液体培养基的组成：蛋白胨 5.0 g，葡萄糖：20.0 g，酵母粉：2.0 g，磷酸氢二钾1.0 g，硫酸镁0.5 g，pH值6.4 ± 0.2加入到1000ml蒸馏水中。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，分离纯化包括以下步骤：

发酵产物经体积百分含量为60%-100%的乙醇提取、浓缩后，得到提取液和固体残渣，提取液用乙酸乙酯萃取；所得萃取相经减压蒸馏后，向得到的含布雷菲德菌素A的粗提物中加入石油醚，离心后取沉淀，得到布雷菲德菌素A粗品，加入甲醇或乙醇后配制成布雷菲德菌素A饱和溶液，趁热过滤，冷却结晶，得到布雷菲德菌素A。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：乙醇提取控制温度为20~100℃，乙醇提取步骤中的发酵产物与乙醇的质量体积比为1：0.5～32（g：ml），提取的时间为5～60min。

9.根据权利要求2-8中任一项所述的应用，其特征在于：分离得到的布雷菲德菌素A纯度≥99%。

10.根据权利要求3-7任一项所述的应用，其特征在于：发酵产物中的布雷菲德菌素A，

在虫蛀大米培养基中产量≥2.88 mg/g（虫蛀大米量）；

在发霉大米培养基中产量≥2.37 mg/g（发霉大米量）。