CN109097400B

CN109097400B - 基于染色质重塑激活内源性Pdx1基因表达的方法

Info

Publication number: CN109097400B
Application number: CN201810947480.0A
Authority: CN
Inventors: 王启伟; 叶华虎
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2018-08-20
Filing date: 2018-08-20
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2038-08-20
Also published as: CN109097400A

Abstract

本发明公开了基于染色质重塑激活内源性Pdx1基因表达的方法。本发明提供了一种激活靶细胞中内源性Pdx1基因表达的方法，是基于CRISPR‑on的SAM***建立激活靶细胞中内源性Pdx1基因表达的方法。所述SAM***包括靶向Pdx1基因转录起始点上游‑400至+1bp位置的sgRNA，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4。本发明应用CRISPR‑on技术，通过染色质重塑，能够高效地激活293T细胞的Pdx1表达。本研究将对基因诱导PSCs定向分化为β细胞以及胰腺的胚胎发育研究具有重要作用。

Description

基于染色质重塑激活内源性Pdx1基因表达的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于染色质重塑激活内源性Pdx1基因表达的方法。

背景技术

糖尿病的发病率正在逐年显著增加。2017年WHO报告显示，目前全球糖尿病的发病率约为8.5％，大约有4.22亿糖尿病患者。1型糖尿病是由于胰岛β细胞受到自身免疫反应攻击所导致的。当残存的胰岛β细胞数量少于胰岛细胞总数的10-20％就会表现出临床症状[Gillespie,K.M.Type 1diabetes:pathogenesis and prevention.CMAJ 175,165-170,doi:10.1503/cmaj.060244(2006).]。2型糖尿病是由于细胞增殖能力下降和细胞凋亡增加而导致β细胞功能异常和进行性细胞数量减少[Joost,H.G.Pathogenesis,riskassessment and prevention of type 2diabetes mellitus.Obes Facts 1,128-137,doi:10.1159/000137673(2008).]。目前，胰岛β细胞移植被认为是治疗糖尿病最有效的办法之一。然而，大规模胰岛β细胞移植的应用却受到细胞来源短缺和终生使用免疫抑制剂等限制[Atkinson,M.A.&Eisenbarth,G.S.Type 1diabetes:new perspectives on diseasepathogenesis and treatment.Lancet 358,221-229,doi:10.1016/S0140-6736(01)05415-0(2001).]。多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)，具有自我更新和多向分化潜能。因此，PSCs成为糖尿病的细胞治疗的理想细胞来源。近年来，PSCs定向分化为胰岛β细胞和非胰岛β细胞转分化的研究取得了较大的进展[Miyazaki,S.,Yamato,E.&Miyazaki,J.Regulated expression of pdx-1promotes invitro differentiation of insulin-producing cells from embryonic stemcells.Diabetes 53,1030-1037(2004).]。目前诱导细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法主要包括两类：一是采用调控胰岛β细胞发生特异性转录因子法；另一是生长因子和小分子化合物组合法。基因诱导方法主要是采用胰岛细胞发生过程中的关键性转录因子诱导细胞分化与转分化。Miyazaki等采用Tet off***构建了诱导表达Pdx1的ES细胞系，结果显示Pdx1能够提高生长因子和小分子化合物法诱导ESCs向β细胞分化的效率，增强分化细胞相关基因的表达，如insulin 2、somatostatin、Kir6.2、glucokinase、neurogenin3、p48、Pax6、PC2和HNF6[Miyazaki,S.,Yamato,E.&Miyazaki,J.Regulated expression of pdx-1promotesin vitro differentiation of insulin-producing cells from embryonic stemcells.Diabetes 53,1030-1037(2004).]。Kubo等的研究结果表明，过表达Pdx1和Ngn3能够显著上调内胚层细胞表达insulin和胰岛相关基因[Kubo,A.et al.Pdx1and Ngn3overexpression enhances pancreatic differentiation of mouse ES cell-derivedendoderm population.PLoS One 6,e24058,doi:10.1371/journal.pone.0024058(2011).]。表达Pdx1的腺病毒感染人皮肤角质细胞，能迅速激活胰腺发生相关的特异性转录因子，将细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。这些转分化细胞在葡萄糖刺激下具有合成和分泌胰岛素的功能[Mauda-Havakuk,M.et al.Ectopic PDX-1expression directlyreprograms human keratinocytes along pancreatic insulin-producing cellsfate.PLoS One 6,e26298,doi:10.1371/journal.pone.0026298(2011).]。Zhou等发现Pdx1，Ngn3和MafA在小鼠体内可将胰腺外分泌部细胞转化为胰岛β细胞。这些转化的细胞与内源性的胰岛β细胞非常相似，表达胰岛β细胞功能相关基因，能够分泌胰岛素，降低小鼠的血糖[Zhou,Q.,Brown,J.,Kanarek,A.,Rajagopal,J.&Melton,D.A.In vivoreprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.Nature 455,627-632,doi:10.1038/nature07314(2008).]。Akinci等采用了同样的方法，观察了体外Pdx1，Ngn3和MafA对大鼠胰腺外分泌细胞系AR42j-B13的转分化作用。尽管转分化所获得的细胞表达胰岛素，降低糖尿病小鼠的血糖水平；但细胞内源性的Pdx1，Ngn3和MafA没有被激活，且不表达胰岛β细胞功能相关的一些基因。因此，这些细胞的转分化是不完全的[Akinci,E.,Banga,A.,Greder,L.V.,Dutton,J.R.&Slack,J.M.Reprogramming ofpancreatic exocrine cells towards a beta(beta)cell character using Pdx1,Ngn3and MafA.Biochem J442,539-550,doi:10.1042/BJ20111678(2012).]。基因诱导分化的方法具有特异性强，操作相对容易，成本较低。然而，目前外源基因过表达的方法很难激活内源性相关基因的表达，因此，分化的细胞不具有成熟的生理功能。胚胎发育中各谱系的细胞分化是受谱系特异性转录因子精确调控，最终分化为各胚层的终末分化细胞。与此同时，细胞分化过程中各种转录因子的活化是受表观遗传学各种调控机制控制的。表观遗传学因素与各种转录因子相互协调作用，形成适合于特定谱系分化的微环境，才能有效保证机体各种细胞的正常分化。表观遗传学在细胞功能中的重要作用可从细胞重编程过程中得到佐证。由成纤维细胞重编程至iPSCs的过程，影响重编程效率的一个重要因素就是表观遗传学障碍。Huangfu等的研究显示，DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够显著提高细胞重编程的效率。尤其是组蛋白去乙酰化酶抑制剂valproic acid(VPA)能够将重编程效率提高100倍[Huangfu,D.et al.Induction of pluripotent stem cells by definedfactors is greatly improved by small-molecule compounds.Nat Biotechnol26,795-797,doi:10.1038/nbt1418(2008).]。近期，Ding小组通过CRISPR(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)技术重置染色质Oct4和Sox2位点的表观遗传状态，激活内源性Oct4和Sox2的表达，成功地重编程成纤维细胞至iPSCs[Liu,P.,Chen,M.,Liu,Y.,Qi,L.S.&Ding,S.CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the EndogenousOct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency.Cell Stem Cell 22,252-261e254,doi:10.1016/j.stem.2017.12.001(2018).]，这进一步显示了表观遗传在细胞功能中的重要作用。

Pdx1是一种同源结构域转录因子，在早期胚胎胰腺发育，内分泌细胞的形成及后期β细胞成熟中具有重要作用[Pan,F.C.&Wright,C.Pancreas organogenesis:from budto plexus to gland.Dev Dyn 240,530-565,doi:10.1002/dvdy.22584(2011).]。小鼠Pdx1最早表达在胚胎8.5天(E8.5)[Miki,R.et al.Fate maps of ventral and dorsalpancreatic progenitor cells in early somite stage mouse embryos.Mech Dev 128,597-609,doi:10.1016/j.mod.2011.12.004(2012).]，人Pdx1最早表达在孕4周(G4w)[Jennings,R.E.et al.Development of the human pancreas from foregut toendocrine commitment.Diabetes62,3514-3522,doi:10.2337/db12-1479(2013).]。啮齿类的早期胚胎胰腺发育需要Pdx1的表达，Pdx1缺陷小鼠不能形成胰腺，出生后几天内就会死亡[Jonsson,J.,Carlsson,L.,Edlund,T.&Edlund,H.Insulin-promoter-factor 1isrequired for pancreas development in mice.Nature 371,606-609,doi:10.1038/371606a0(1994).]。随后的胰腺各谱系的发育仍需要Pdx1的持续表达。在内分泌细胞的形成中，高表达Pdx1在细胞的定向分化中具有重要作用[Pan,F.C.&Wright,C.Pancreasorganogenesis:from bud to plexus to gland.Dev Dyn 240,530-565,doi:10.1002/dvdy.22584(2011).]。成年时，Pdx1只表达在胰岛的β和δ细胞中，通过调节葡萄糖稳态相关的基因维持β细胞的特征和功能[Gao,T.et al.Pdx1maintains beta cell identity andfunction by repressing an alpha cell program.Cell Metab 19,259-271,doi:10.1016/j.cmet.2013.12.002(2014).]。综上所述，Pdx1在胚胎胰腺发育和体外诱导细胞定向分化为β细胞中具有重要作用。因此，建立体外高效的内源性Pdx1激活方法，对基因诱导PSCs定向分化为β细胞以及胰腺的胚胎发育研究具有重要作用。

CRISPR技术是继锌指核酸酶(ZFN，zinc finger nulceases)和TALENs(transcription activator-like effector nucleases)之后又一种功能强大的基因组编辑技术。工程化的CRISPR/Cas9是由sgRNA(tracrRNA:crRNA)和Cas9组成。Cas9具有两个功能结构域HNH和RuvC，具有核酸内切酶活性。同时突变两个结构域(H840A和D10A突变)，Cas9失去内切酶活性(deactivated Cas9，dCas9)，转变成sgRNA导向的DNA结合蛋白[Doudna,J.A.&Charpentier,E.Genome editing.The new frontier of genome engineering withCRISPR-Cas9.Science 346,1258096,doi:10.1126/science.1258096(2014).]。将dCas9与转录激活因子融合，在sgRNA指导下结合在基因的启动子区域，就可强力激活内源性基因的表达，有效地克服了基因诱导表达中内源性基因难以活化的不足[Konermann,S.etal.Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9complex.Nature 517,583-588,doi:10.1038/nature14136(2015).]。

发明内容

为了有效的解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于染色质重塑激活内源性Pdx1基因表达的方法。本发明应用基于CRISPR-on的SAM(synergistic activationmediator)***建立高效的内源性Pdx1激活方法。SAM***由三个部分组成，sgRNA、NLS-dCas9-VP64和MS2-P65-HSF1。当SAM***在细胞内表达时，三个组份形成转录激活复合体，结合在sgRNA靶向的特定启动子区域，激活基因的表达。

第一方面，本发明要求保护一种激活靶细胞中内源性Pdx1基因表达的方法。

本发明所提供的激活靶细胞中内源性Pdx1基因表达的方法，是基于CRISPR-on(CRISPR激活)的SAM***建立激活靶细胞中内源性Pdx1基因表达的方法。

进一步地，所述SAM***包括靶向Pdx1基因转录起始点(transcription startsite,TSS)上游-400至+1bp位置的sgRNA，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.3(对应本发明实施例中的sgRNA3)和/或SEQ ID No.4(对应本发明实施例中的sgRNA4)。

更进一步地，所述方法可包括如下步骤：使所述靶细胞表达dCAS-VP64融合蛋白、MS2-P65-HSF1融合蛋白和所述sgRNA(dCAS-VP64融合蛋白、MS2-P65-HSF1融合蛋白和所述sgRNA形成SAM复合体)，从而激活所述靶细胞中内源性Pdx1基因表达。

更加具体的，所述方法可包括如下步骤：

(1)包装能够表达所述dCAS-VP64融合蛋白的重组慢病毒A；包装能够表达所述MS2-P65-HSF1融合蛋白的重组慢病毒B；然后将所述重组慢病毒A和所述重组慢病毒B一起感染所述靶细胞，得到阳性细胞系；

(2)向步骤(1)所得阳性细胞系中导入能够表达所述sgRNA的载体，进而实现激活所述靶细胞中内源性Pdx1基因表达。

步骤(1)中，包装所述重组慢病毒A时，采用的目的质粒可为lenti dCAS-VP64_Blast载体；包装所述重组慢病毒B时，采用的目的质粒可为MS2-P65-HSF1_Hygro载体。包装所述重组慢病毒A和所述重组慢病毒B时，采用的辅助质粒均可为PMD2.G质粒和PsPax2质粒；采用的包装细胞均可为293T细胞。

步骤(2)中，能够表达所述sgRNA的载体为载体A和/或载体B。所述载体A具体为将通过BsmB I酶切位点向lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone中***SEQ ID No.3所示DNA片段后得到的重组载体。所述载体B具体为将通过BsmB I酶切位点向lenti sgRNA(MS2)_zeobackbone中***SEQ ID No.4所示DNA片段后得到的重组载体。

在本发明的具体实施例方式中，能够表达所述sgRNA的载体为所述载体A和所述载体B，所述载体A和所述载体B的质量配比为1:1(如两种载体各向所述靶细胞中导入0.8μg，所述靶细胞于前一天接种，接种量为3×10⁵)。

在本发明的具体实施例方式中，所述方法包括如下步骤：(1)将lenti dCAS-VP64_Blast载体、PMD2.G质粒和PsPax2质粒(三者的质量配比具体可为1：0.25：0.75)导入293T细胞，包装得到所述重组慢病毒A；将MS2-P65-HSF1_Hygro载体、PMD2.G质粒和PsPax2质粒(三者的质量配比具体可为1：0.25：0.75)导入293T细胞，包装得到所述重组慢病毒B；然后将所述重组慢病毒A和所述重组慢病毒B一起感染所述靶细胞，得到阳性细胞系。(2)向步骤(1)所得阳性细胞系中导入所述载体A和所述载体B(质量配比为1:1，进一步，如两种载体各导入0.8μg，所述靶细胞于前一天接种，接种量为3×10⁵)，进而实现激活所述靶细胞中内源性Pdx1基因表达。

在本发明的具体实施例方式中，所述靶细胞具体为293T细胞。当然根据需要，所述靶细胞也可为多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)，如胚胎干细胞(embryonicstem cells,ESCs)或诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。

第二方面，本发明要求保护一种制备内源性Pdx1基因表达被激活的细胞的方法。

本发明所提供的制备内源性Pdx1基因表达被激活的细胞的方法，可包括如下步骤：利用前文第一方面中所述的方法制备得到内源性Pdx1基因表达被激活的细胞。

第三方面，本发明要求保护下述任一种生物材料：

(I)利用前文第二方面中所述方法制备得到的内源性Pdx1基因表达被激活的细胞。

(II)sgRNA，为前文第一方面中所述的sgRNA。

(III)载体或成套载体；

所述载体为前文第一方面中所述的“能够表达所述sgRNA的载体”(所述载体A和/或所述载体B)。

所述成套载体由前文第一方面中所述的“能够表达所述sgRNA的载体”、lentidCAS-VP64_Blast载体、MS2-P65-HSF1_Hygro载体组成。当然也可包括PMD2.G质粒和PsPax2质粒。

在前文第二方面和第三方面中，所述细胞可为293T细胞，也可为多能干细胞(如胚胎干细胞或者诱导多能干细胞)。

第四方面，本发明还要求保护如下任一中的应用：

(A1)前文第一方面中所述的方法在诱导多能干细胞定向分化为胰岛β细胞中的应用；

(A2)前文第一方面中所述的方法或前文第二方面中所述的细胞在促进胰腺胚胎发育中的应用。

其中，所述多能干细胞可为胚胎干细胞或者诱导多能干细胞。

本发明应用CRISPR-on技术，通过染色质重塑，能够高效地激活293T细胞的Pdx1表达。本发明将对基因诱导PSCs定向分化为β细胞以及胰腺的胚胎发育研究具有重要作用。

附图说明

图1为Pdx1启动子及sgRNA设计。TSS为转录起始点。黑色箭头为sgRNA在启动子区域的相对位置，数字代表sgRNA相对于TSS的位置。sgRNA1、sgRNA4和sgRNA5靶向Pdx1基因的正义链，sgRNA2和sgRNA3靶向Pdx1基因的反义链。

图2为Pdx1表达分析。A为RT-PCR检测Pdx1基因表达。sgRNA转染293T细胞后3天，提取总RNA，并进行分析。B为qPCR检测Pdx1基因表达。分析sgRNA转染293T细胞后3天Pdx1表达水平变化。基因表达数据以GAPDH转录水平为基准进行标准化。实验结果经三次独立生物学重复确认，*p<0.05；**p<0.01；***P<0.001。

图3为sgRNA协同作用分析。A为RT-PCR检测Pdx1基因表达。sgRNA转染293T细胞后3天，提取总RNA，并进行分析。B为qPCR检测Pdx1基因表达。分析sgRNA转染293T细胞后3天Pdx1表达水平变化。基因表达数据以GAPDH转录水平为基准进行标准化。实验结果经三次独立生物学重复确认，*p<0.05；**p<0.01；***P<0.001。

图4为免疫荧光分析。收集sgRNAM(sgRNA3+4)转染后3天的细胞，制备细胞甩片，进行anti-Pdx1(1:100)染色，INS-1细胞作为阳性对照组。细胞核以DAPI复染。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、基于染色质重塑激活内源性Pdx1基因表达

一、材料与方法

(一)CRISPR载体

从Addgene购买lenti dCAS-VP64_Blast(下文简称dCAS-VP64)、lenti MS2-P65-HSF1_Hygro(下文简称MPH)和lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone。三个载体的Addgene ID分别为61425、61426和61427。

(二)慢病毒包装质粒PMD2.G和PsPax2(Addgene)以及293T细胞(Invitrogen)、大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞(AddexBio)。

(三)启动子特异性结合的sgRNA的设计及载体构建

1、sgRNA设计

在Pdx1基因转录起始点(transcription start site,TSS)上游-400至+1bp位置，采用Lei Qi实验室提供的在线软件CRISPR-ERA(crispr-era.stanford.edu)设计5条sgRNA(图1)。sgRNA的靶序列见表1。sgRNA的靶序列寡核苷酸由华大基因合成。

表1 sgRNA在Pdx1启动子上的靶向序列及位置

sgRNA	靶序列(5’-3’)	PAM	所在链	距离TSS的位置
					1	GCGGAGCTGTCAAAGCGAGC(SEQ ID No.1)	AGG	+	-22/-3
2	GTTCAGCCGGGGGCCGTGAT(SEQ ID No.2)	TGG	-	-103/-122
					3	GCCTGGCTGGCCGCACTAAG(SEQ ID No.3)	AGG	-	-125/-144
4	GCAGGTGCTCGCGGGTACCT(SEQ ID No.4)	GGG	+	-175/-156
					5	GTTTTCGTGAGCGCCCATTT(SEQ ID No.5)	TGG	+	-266/-247

2、sgRNA载体构建

(1)sgRNA寡核苷酸链退火处理

将合成的两条互补sgRNA寡核苷酸单链用ddH₂O稀释到100μM。然后，按如下反应条件进行退火处理以合成双链sgRNA(双链部分的序列即为表1中的靶序列，另外，两端为与BsmB I切口相符的粘性末端)。

反应体系：sgRNA-Forward(100μM)1μl；sgRNA-Reverse(100μM)1μl；10×T4DNAligase buffer(NEB)1μl；ddH₂O 7μl。

反应条件：37℃，30min；95℃，5min；90℃，1min；此后，梯度退火5℃/min，直至4℃。

反应结束后，将产物用ddH₂O稀释200倍，用于随后的载体连接反应。

(2)载体连接反应

lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone载体经酶切、胶回收纯化后，进行连接反应。

酶切反应体系：lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone载体2μl；10×Buffer 3.1(NEB)5μl；BsmB I(NEB)2μl；ddH₂O 41μl。反应条件：55℃，2hrs。

连接反应：双链sgRNA 1μl；lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone载体酶切产物1μl；ddH₂O 3μl；2×solution I(Takara)5μl。反应条件：22℃，2hrs。

(3)转化

连接产物经转化、涂板，挑取阳性克隆，进行测序鉴定。

(四)dCAS-VP64/MPH细胞系构建及筛选

1、慢病毒制备

dCAS-VP64和MPH慢病毒包装过程简述如下：病毒制备的前一天，按照4-5×10⁶/10cm培养皿的密度接种293T细胞。制备病毒当日，将目的基因载体dCAS-VP64或MPH和慢病毒包装质粒PMD2.G和PsPax2按照1：0.25：0.75的比例(质量比)，用脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen)共转染293T细胞。转染后48-72hrs收集含有病毒颗粒的培养基上清，1500rpm离心去除上清中悬浮的细胞及碎片。然后再以20000rpm，4℃离心2hrs浓缩病毒。离心后弃掉上清，用4ml培养基重悬病毒颗粒备用。经此步骤得到两种重组慢病毒。

2、构建表达dCAS-VP64/MPH的293T细胞系

293T细胞生长到60-70％融合时，以表达dCAS-VP64/MPH载体的两种慢病毒(即步骤1得到的两种重组慢病毒)同时感染293T细胞。病毒感染后2天，细胞首先在含有10μg/mlBlasticidin S(Selleck)的培养基中加压筛选7天。而后，细胞在含有300μg/mlHygromycin B(Selleck)的培养基中继续加压筛选7天。所获阳性细胞克隆在含有5μg/mlBlasticidin S和150μg/ml Hygromycin B的培养基中培养，以维持转基因的表达。

(五)sgRNA激活内源性Pdx1基因表达

表达dCAS-VP64/MPH的293T细胞以3×10⁵/ml的密度接种于12孔板中，每孔接种1ml细胞。第二天，用脂质体将步骤(三)构建并测序验证正确的sgRNA载体转入细胞。细胞转染共分6组，分别为sgRNA 1-5以及sgRNA M(5条sgRNA等质量比混合组)，每组载体的用量为0.8μg(sgRNA M组中5种sgRNA载体等质量，分别为0.16μg)。以293T细胞为转染对照组。

检测sgRNA协同作用时，细胞转染共分5组，分别为sgRNA3载体0.8μg和1.6μg、sgRNA 4载体0.8μg和1.6μg以及sgRNA M 1.6μg(sgRNA 3载体0.8μg+sgRNA 4载体0.8μg)组。细胞转染后3天，采用RT-PCR和qRCR检测Pdx1基因表达水平的变化，并经免疫荧光分析确认Pdx1蛋白的表达。

(六)RT-PCR和qPCR

采用TRIzol试剂由细胞中分离总RNA，DNase处理总RNA以去除基因组DNA污染。采用Superscript IV first-strand synthesis system(Invitrogen)以1μg总RNA为模板进行反转录。采用Taq DNA polymerase(Invitrogen)进行PCR扩增，反应条件如下：预变性94℃，3min；变性94℃，30s，退火56℃，30s，延伸72℃，1min，共30个循环；终延伸72℃，10min。qPCR反应采用SYBR Green PCR Master Mix(AB)进行，每个反应重复三次。基因表达数据以GAPDH转录水平为基准进行标准化。基因表达变化采用2^-ΔΔCt计算方法。实验结果经三次独立生物学重复确认。qPCR反应条件如下：预变性95℃，1min；变性95℃，5s，退火60℃，10s，延伸72℃，15s，共40个循环。

Pdx1引物：

5’-ATGAAGTCTACCAAAGCTCACGC-3’；

5’-TCTCTCGGTCAAGTTCAACATGA-3’。

GAPDH引物：

5’-CGAGATCCCTCCAAAATCAAGT-3’；

5’-TGAGGCTGTTGTCATACT TCTCAT-3’。

(七)免疫荧光分析

细胞首先在多聚甲醛中固定30min，4℃。而后在含0.1％Triton X-100和10％牛血清的PBS中进行破膜及封闭处理。随后一抗4℃过夜孵育，最后以荧光标记的二抗室温孵育1hr。所用一抗是anti-Pdx1(R&D Systems)；二抗是donkey anti-goat AF594(Invitrogen)。大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞作为阳性对照组。细胞核以DAPI复染。

(八)统计学分析

所有实验至少重复3次。结果为均数±标准差。统计学分析采用非配对的Student’s t test，p<0.05为具有显著性差异。

二、结果

1、sgRNA载体构建

sgRNA寡核苷酸单链经退火处理后形成互补的寡核苷酸双链。随后经连接反应，将双链sgRNA***lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone载体的BsmB I的酶切位点。连接产物经细菌转化后，挑取阳性克隆，进行测序鉴定，最终获得了正确***5种sgRNA的质粒载体。

2、dCAS-VP64/MPH细胞系

为高效便捷地研究sgRNA对内源性Pdx1的激活作用，本发明构建了表达dCAS-VP64/MPH的293T细胞系。dCAS-VP64和MPH载体分别具有Blasticidin和Hygromycin抗性基因。以表达dCAS-VP64/MPH载体的慢病毒感染细胞后2天，细胞首先在含有10μg/mlBlasticidin S的培养基中加压筛选。经3-4天筛选，对照组细胞(未感染病毒的293T细胞)全部死亡。5-7天后，病毒感染组细胞出现Blasticidin抗性克隆。随后，细胞在含有Hygromycin的培养基中继续加压筛选。经3-4天筛选，对照组细胞全部死亡。病毒感染组细胞在筛选的初期亦可见部分细胞死亡，这些死亡的细胞主要为dCAS-VP64^-细胞。5-7天后所形成的阳性细胞克隆为dCAS-VP64⁺/MPH⁺细胞。筛选所获细胞用于下一步的内源性基因激活表达研究。

3、sgRNA激活Pdx1的表达

sgRNA转染细胞3天后，收取各组细胞的总RNA，RT-PCR检测Pdx1基因表达情况。结果显示，对照组293T细胞本身固有表达一定量的Pdx1；与293T细胞对照组相比，sgRNA 1-5以及sgRNA M组Pdx1表达明显上调，但各组之间Pdx1的表达差异无法区分(图2中A)。为进一步分析各组之间Pdx1的表达差异，采用qPCR检测Pdx1的差异表达。结果表明，与对照组相比，各组Pdx1的表达明显上调，其中以sgRNA 3和4组上调最显著。sgRNA 1-5之间的协同作用(sgRNA M)不明显(图2中B)。

为进一步优化sgRNA激活Pdx1的表达，选取sgRNA 3和sgRNA4观察其对基因激活的作用。sgRNA转染细胞3天后，RT-PCR结果显示，与对照组相比各组Pdx1表达明显上调(图3中A)。qPCR结果显示，sgRNA 1.6μg组激活效果优于sgRNA 0.8μg组，具有一定的剂量依赖性；sgRNA M 1.6μg组激活效果优于sgRNA 4 1.6μg，提示sgRNA 3和sgRNA 4之间在激活Pdx1的表达时具有协同作用(图3中B)。

为进一步在蛋白质水平上确认细胞表达Pdx1，收集了转染后3天sgRNA M组细胞，制备细胞甩片进行免疫荧光分析。结果显示，293T细胞组Pdx1呈弱阳性反应(图4)，与PCR结果一致(图3中A和B)。INS-1细胞阳性对照组Pdx1呈强阳性反应；sgRNA M组细胞亦呈强阳性反应(图4)。上述结果表明，sgRNA能够高效地激活293T细胞的Pdx1表达。

本发明结果表明，应用CRISPR-on技术，通过染色质重塑，能够高效地激活293T细胞的Pdx1表达。本发明将对基因诱导PSCs定向分化为β细胞以及胰腺的胚胎发育研究具有重要作用。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 基于染色质重塑激活内源性Pdx1基因表达的方法

<130> GNCLN181726

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gcggagctgt caaagcgagc 20

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<213> Artificial sequence

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gttcagccgg gggccgtgat 20

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gcctggctgg ccgcactaag 20

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<213> Artificial sequence

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gcaggtgctc gcgggtacct 20

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gttttcgtga gcgcccattt 20

Claims

1.一种激活靶细胞中内源性Pdx1基因表达的方法，是基于CRISPR-on的SAM***建立激活靶细胞中内源性Pdx1基因表达的方法；

所述SAM***包括靶向Pdx1基因转录起始点上游-400至+1 bp位置的sgRNA；所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：使所述靶细胞表达dCAS-VP64融合蛋白、MS2-P65-HSF1融合蛋白和所述sgRNA，从而激活所述靶细胞中内源性Pdx1基因表达。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）包装能够表达所述dCAS-VP64融合蛋白的重组慢病毒A；包装能够表达所述MS2-P65-HSF1融合蛋白的重组慢病毒B；然后将所述重组慢病毒A和所述重组慢病毒B一起感染所述靶细胞，得到阳性细胞系；

（2）向步骤（1）所得阳性细胞系中导入能够表达所述sgRNA的载体，进而实现激活所述靶细胞中内源性Pdx1基因表达。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，包装所述重组慢病毒A时，采用的目的质粒是lenti dCAS-VP64_Blast载体；包装所述重组慢病毒B时，采用的目的质粒是MS2-P65-HSF1_Hygro 载体。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，包装所述重组慢病毒A和所述重组慢病毒B时，采用的包装细胞均为293T细胞。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，能够表达所述sgRNA的载体为载体A和载体B；

所述载体A为将通过BsmB I酶切位点向lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone中***SEQID No.3所示DNA片段后得到的重组载体；所述载体B为将通过BsmB I酶切位点向lentisgRNA(MS2)_zeo backbone中***SEQ ID No.4所示DNA片段后得到的重组载体。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述靶细胞为293T细胞或多能干细胞。

8.一种制备内源性Pdx1基因表达被激活的细胞的方法，包括如下步骤：利用权利要求1-7中任一所述的方法制备得到内源性Pdx1基因表达被激活的细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述细胞为293T细胞或多能干细胞。

10.sgRNA，为靶向Pdx1基因转录起始点上游-400至+1 bp位置的sgRNA；所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

11.能够表达权利要求10所述sgRNA的载体。

12.根据权利要求11所述的载体，其特征在于：所述载体由载体A和载体B组成；

13.成套载体，由权利要求11或12所述的载体、lenti dCAS-VP64_Blast载体、MS2-P65-HSF1_Hygro 载体组成。

14.权利要求1-7中任一所述的方法在诱导多能干细胞定向分化为胰岛β细胞中的应用。

15.权利要求1-7中任一所述的方法在促进胰腺胚胎发育中的应用。