CN109385377A

CN109385377A - 用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN109385377A
Application number: CN201710659583.2A
Authority: CN
Inventors: 张学礼; 宋云飞; 孙媛霞; 戴住波; 李元元; 戴隆海; 王冬; 刘怡; 林庭庭; 唐金磊; 李守连; 李宇钰
Original assignee: Guilin Layn Natural Ingredients Corp; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Guilin Layn Natural Ingredients Corp; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2019-02-26

Abstract

本发明公开了一种用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用。本发明提供了制备用于生产葫芦二烯醇的工程菌的方法，包括如下步骤：向能够产生2,3‑环氧鲨烯的受体菌株中导入葫芦二烯醇合成酶的编码基因，得到重组菌；从所述重组菌中获得所述用于生产葫芦二烯醇的工程菌；所述葫芦二烯醇合成酶的氨基酸序列为序列表中序列5或序列6或序列7。本发明成功运用生物工程技术实现了葫芦二烯醇生物合成途径的异源重建及产物的生产，摇瓶发酵法葫芦二烯醇产量高达82.89mg·L^‑1；同时并通过重组菌株的高密度发酵技术，再提高葫芦二烯醇产量20.48倍。

Description

用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

葫芦二烯醇(Cucurbitadienol)是从罗汉果、栝楼、西瓜、冬瓜和苦瓜等多种葫芦科植物中分离获得的葫芦烷型四环三萜类化合物的基本前体，其在生物体内能被进一步被酶修饰形成罗汉果甜苷和葫芦素等化合物。其中罗汉果甜苷Ⅴ是罗汉果果实甜味的主要成分，甜度是蔗糖的250倍，是糖尿病患者和肥胖者食品的良好添加剂；另外，葫芦素等苦味成分具有广泛的生物活性，如护肝，抗炎，抗菌，驱虫以及对中枢神经***和心血管具有保护作用；一些葫芦素还可以作为蜕皮类固醇受体激动剂和拮抗剂。

运用合成生物学策略实现中药有效成分生物合成途径的异源重建及产物的生产，能够积极促进生物合成途径解析和利用，如丹参酮，***和人参皂苷等成分的生物合成途径的研究。在生产方面，Keasling团队耗时10年，将黄花蒿中青蒿酸的合成途径完全解析，并在酿酒酵母中完成了抗疟药物前体—青蒿酸的异源合成工作，青蒿酸的产量达25g·L^-1。

在生物体内2,3-环氧鲨烯能被不同三萜环合酶环合为齐墩果烷型，乌苏烷型，羽扇豆烷型，达玛烷型和葫芦烷型等多种类型三萜母核。其中葫芦二烯醇合成酶(Cucurbitadienol synthase,CBS)能催化2,3-环氧鲨烯生成葫芦二烯醇。目前来源于罗汉果、南瓜、黄瓜和药西瓜等葫芦二烯醇合酶已经被成功克隆。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用。

本发明所提供的制备用于生产葫芦二烯醇的工程菌的方法，包括如下步骤：使能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株表达葫芦二烯醇合成酶，从而获得所述用于生产葫芦二烯醇的工程菌；所述葫芦二烯醇合成酶的氨基酸序列为序列表中序列5或序列6或序列7。

进一步，所述方法包括如下步骤：向能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株中导入所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因，得到表达所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因的重组菌，即为所述用于生产葫芦二烯醇的工程菌。

更进一步，所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因具体可为如下任一所示DNA分子：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(3)序列表中序列3所示的DNA分子；

(4)序列表中序列4所示的DNA分子；

(5)在严格条件下与(1)-(4)中任一限定的DNA分子杂交且编码序列表中序列5或序列6或序列7所示葫芦二烯醇合成酶的DNA分子；

(6)与(1)-(5)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码序列表中序列5或序列6或序列7所示葫芦二烯醇合成酶的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在所述方法中，所述能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株为能够表达MVA途径相关酶、法呢基焦磷酸合成酶(FPS)、角鲨烯合成酶(SQS)和角鲨烯环氧酶(SE)的重组酵母。

其中，所述MVA途径相关酶为MVA途径中的ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、ERG19和IDI1。

进一步，发明人所在团队前期研究已经获得过表达如上所述MVA途径相关酶的工程菌株——酿酒酵母NK2-SQ(参见“林庭庭,王冬,戴住波,张学礼,黄璐琦.创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇.中国中药杂志,2016,41(6):1008-1015”)。相应的，所述能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株为向酿酒酵母NK2-SQ中导入法呢基焦磷酸合成酶(FPS)的编码基因、角鲨烯合成酶(SQS)的编码基因和角鲨烯环氧酶(SE)的编码基因后得到的重组酵母。

在本发明中，所述法呢基焦磷酸合成酶(FPS)的编码基因具体为以丹参cDNA为模板，用引物5’-GCGGCGCGCCTTATTTCTGCCTCTTGTATATCTTGCC-3’和5’-GCGACCWGGTATGGCGAATCTGAACGGAGAGTCGGC-3’扩增得到的DNA片段。所述角鲨烯合成酶(SQS)的编码基因具体为以拟南芥cDNA为模板，用引物5’-GCGACCWGGTATGGGGAGCTTGGGGACGATGCTGAG-3’和5’-GCGGCGCGCCTCAGTTTGCTCTGAGATATGCAAAGAC-3’扩增得到的DNA片段。所述角鲨烯环氧酶(SE)的编码基因具体为以拟南芥cDNA为模板，用引物5’-GCGTTAATTAAATGGCTCCGACGATATTCGTTGATCAC-3’和5’-GCGGCGCGCCTCATTGAGGAGAAG AAGAAGAAGGAG-3’扩增得到的DNA片段。

更加具体的，向所述酿酒酵母NK2-SQ中导入法呢基焦磷酸合成酶(FPS)的编码基因、角鲨烯合成酶(SQS)的编码基因和角鲨烯环氧酶(SE)的编码基因具体为：向所述酿酒酵母NK2-SQ中导入(如电转)M1、M2、M3、M4和M5共五个DNA片段，这五个DNA片段可采用表3中给出的模板及对应引物序列通过PCR扩增获得。导入时，所述五个DNA片段的摩尔用量配比为(1-2):(1-2):(1-2):(1-2):(1-2)，具体如1:1:1:1:1:1或者1:1.5:1:1.5:1或者2:1:2:1:1.5。完成导入后还包括20-45℃(如20℃、30℃、35℃、45℃)培养30h以上(如36h、38h、45h)的步骤。

在所述方法中，所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因是通过重组表达载体导入所述能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株中的；在所述重组表达载体中，含有由来源于酵母细胞的TEF1启动子、所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因终止子和来源于酵母细胞的CYC1t终止子组成的表达盒。

在本发明中，所述来源于酵母细胞的TEF1启动子具体是以酵母基因组为模板，用引物5’-GCGCCGCGGAGTGATCCCCCACACACCATAG-3’和5’-GCGGCGCGCCTGTTATAATATCTGTGCGATTGTAC-3’扩增得到的DNA片段。所述来源于酵母细胞的CYC1t终止子具体是以酵母基因组为模板，用引物5’-GCGGCGCGCCAGCCTTAATTAAACGCACAGATATT-3’和5’-GCGCCGCGGGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCA-3’扩增得到的DNA片段。

进一步，所述重组表达载体为将所述表达盒克隆入pRS313质粒或pRS425质粒后得到的重组质粒。

更加具体的，所述重组表达载体为如下(a)或(b)：

(a)pRS425-LEU2-P_TEF1-CBS-T_CYC1：将所述表达盒克隆入pRS425质粒的酶切位点SacII处后得到的重组质粒。

(b)pRS313-LEU2-P_TEF1-CBS-T_CYC1：将所述表达盒克隆入pRS313质粒的酶切位点SacII处后得到中间质粒，命名为pRS313-HIS3-P_TEF1-CBS-T_CYC1质粒；以pRS313-HIS3-P_TEF1-CBS-T_CYC1质粒为模板，用引物5’-CTTTGCCTTCGTTTATCTTGC-3’和5’-TATATGTATACCTATGAATGTCAG-3’，扩增质粒骨架pRS313-TEF1-CBS-CYC1t片段；以pRS425质粒为模板，用引物5’-TGGCGTCCGGATTAAGCAAG GATTTTCTTAACTTCTTC-3’和5’-TGGCGTCCGGAGATGCGGTATTTTCTCCTTACG CA-3’，扩增LEU2片段；将所述质粒骨架pRS313-TEF1-CBS-CYC1t片段和所述LEU2片段连接后得到重组质粒，即为pRS313-LEU2-P_TEF1-CBS-T_CYC1。

在所述方法中，将含有所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因的重组表达载体导入所述能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株中后还包括于30℃培养36h的步骤。

采用所述方法制备得到的用于生产葫芦二烯醇的工程菌也属于本发明的保护范围。

将其中一株所述工程菌于2017年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)313-SL-CB，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.14173。

所述工程菌在生产葫芦二烯醇中的应用也属于本发明的保护范围。

相应的，本发明提供了一种生产葫芦二烯醇的方法。

本发明所提供的生产葫芦二烯醇的方法，具体可包括如下步骤：将所述工程菌转接到生物反应器中后进行发酵培养；所述发酵培养为高密度发酵培养；所述高密度发酵培养的条件为：温度20-38℃(如20℃、30℃、36℃、38℃)，pH4-7(如4、5、7)，溶氧15-45％(如15％、30％、35％、45％)，空气流量3-20L/min(如3L/min、12L/min、20L/min)，搅拌转速300-1000rpm(如300rpm、800rpm、1000rpm)，溶氧与搅拌转速、通气相偶联。所述高密度发酵的补料条件为：溶氧值大于等于40(如40、60、70、80)时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵液中葡萄糖浓度为5-20g/L(如5g/L、10g/L、15g/L、20g/L)。

本发明的有益效果是：

1、运用合成生物学策略实现中药有效成分生物合成途径的异源重建及产物的生产，能够积极促进生物合成途径解析和利用，进一步推动了葫芦烷型四环三萜生物合成途径解析及高效细胞工厂创建。

2、从罗汉果中克隆到葫芦二烯醇合成酶(CBS)基因，并将基因转入酵母中实现葫芦二烯醇生物合成途径的异源表达和发酵生产，摇瓶发酵葫芦二烯醇产量高达82.89mg·L^-1。

3、将高密度发酵技术应用于葫芦二烯醇高产菌株，葫芦二烯醇产量与摇瓶发酵法相比提高20.48倍。

附图说明

图1为质粒的验证。M：Trans 2K plus marker；泳道1-2：质粒pRS425-LEU-P_TEF1-CBS-T_CYC1和pRS313-LEU2-P_TEF1-CBS-T_CYC1酶切验证(SexAI和AscI双酶切)。

图2为工程菌425-SL-CB的发酵产物分析结果。A为色谱图；Cucurbitadienol代表葫芦二烯醇标准品，WD-2091代表工程菌WD-2091发酵产物，425-SL-CB代表工程菌425-SL-CB发酵产物；B为葫芦二烯醇标准品质谱图；C为工程菌425-SL-CB发酵产物中葫芦二烯醇质谱图。

图3为高密度发酵工程菌株313-SL-CB葫芦二烯醇产量。

图4为工程菌425-SL-CB和313-SL-CB中葫芦二烯醇的产量比较。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用到的质粒和菌株见表1，所用到的引物序列见表2。

表1本发明涉及的质粒和菌株

表2本发明所用到的引物

实施例1

1、目的核苷酸序列(基因)的获得

Trizol法提取罗汉果RNA，RNA经反转录试剂盒转化为cDNA模板，再用SexAI-CBS-F和CBS-AscI-R的引物组合扩增得到SgCBS基因，经测序后，SgCbS基因片段序列如序列表中序列1所示(编码序列表中序列5所示蛋白质)，其与罗汉果转录组数据库葫芦二烯醇合成酶的基因SgCbQ(GeneBank ID NO:HQ128567)同源性为99％。PCR产物经纯化后用SexAI和AscI双酶切，切胶回收备用。以酵母基因组为模板，用引物SacⅡ-TEF1和TEF1-SexAI扩增得到启动子TEF1，PCR产物经纯化后用SexAI酶切，切胶回收备用；以酵母基因组为模板，用引物Asc1-CYC1t和CYC1t-SacⅡ扩增得到终止子CYC1t，PCR产物经纯化后用AscI酶切，切胶回收备用；将酶切产物TEF1、CYC1t和CBS三片段连接，室温反应2小时后取1μL连接产物用引物SacⅡ-TEF1和CYC1t-SacⅡ进行PCR得到含SacⅡ位点的目的片段。将扩增产物纯化，然后用SacⅡ酶切，割胶回收目的片段SacII-TEF1-CBS-CYC1t-SacII备用。

2、重组表达载体的构建

用SacⅡ分别酶切质粒pRS313和pRS425并去磷酸化，进一步将所得载体片段pRS313-SacII、pRS425-SacII分别和步骤1中得到的SacII-TEF1-CBS-CYC1t-SacII连接后转入Trans1-T1感受态细胞中和测序验证，得到pRS313-HIS3-P_TEF1-CBS-T_CYC1和pRS425-LEU2-P_TEF1-CBS-T_CYC1质粒。

pRS313-LEU2-P_TEF1-CBS-T_CYC1质粒获得：以pRS313-HIS3-P_TEF1-CBS-T_CYC1质粒为模板，用引物V313-to-R和V313-to-F，扩增质粒骨架pRS313-TEF1-CBS-CYC1t；用pRS425为模板，用引物Bsp-Leu-F和Bsp-Leu-R，扩增LEU2，切胶纯化目的片段。将产物LEU2片段磷酸化后切胶回收同pRS313-TEF1-CBS-CYC1t用Quick Ligase连接酶连接，转化，测序验证后得到质粒pRS313-LEU2-P_TEF1-CBS-T_CYC1。

pRS313-LEU2-P_TEF1-CBS-T_CYC1质粒和pRS425-LEU2-P_TEF1-CBS-T_CYC1质粒的酶切验证(SexAI和AscI双酶切)图谱如图1所示。

3、宿主菌的构建

Trizol法提取拟南芥RNA，RNA经反转录试剂盒转化为cDNA模板，再用SexAI-AtERG9和AtERG9-AscI、Pac1-AtERG1和AtERG1-AscI两对引物组合分别扩增得到AtERG9(角鲨烯合成酶)和AtERG1(角鲨烯环氧酶)的基因。Trizol法提取丹参RNA，RNA经反转录试剂盒转化为cDNA模板，再用SexAI-SmERG20和SmERG20-AscI的引物组合扩增得到SmERG20(法呢基焦磷酸合成酶)的基因。

(1)pM3-AtERG9质粒

用SexA1和Asc1分别对上述扩增得到的AtERG9以及质粒pM3-MtOAS(记载在中国专利ZL201310399947.X中，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得)进行双酶切，得到AtERG9酶切产物和pM3-MtOAS酶切后骨架，再将AtERG9酶切产物与质粒pM3-MtOAS酶切后骨架连接，经测序验证正确后得到重组质粒pM3-AtERG9。

(2)pM11-AtERG1质粒

用Pac1和Asc1分别对上述一中扩增得到的AtERG1以及质粒pM11-AtCPR1(记载在中国专利ZL201310399947.X中，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得)进行双酶切；得到AtERG1酶切产物和质粒pM11-AtCPR1酶切后骨架；再将AtERG1酶切产物与质粒pM11-AtCPR1酶切后骨架连接，经测序验证正确后得到重组质粒pM11-AtERG1。

(3)pM2-SmERG20质粒

用SexA1和Asc1分别上述一中扩增得到的SmERG20以及质粒pM2-GgbAS(记载在中国专利ZL201310399947.X中，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得)进行双酶切；得到SmERG20酶切产物和pM2-GgbAS酶切后骨架；再将SmERG20酶切产物与质粒pM2-GgbAS酶切后骨架连接，得到重组质粒pM2-SmERG20。

分别用表3引物描述的PCR模板pHis-TRP(具体构建方法见下文)、pM2-SmERG20、pM11-AtERG1和pM3-AtERG9和引物进行PCR获得功能模块：M1(His-TRP-up)，M2(PPGK1-SmERG20-TADH1)，M3(PTDH3-AtERG1-TTPI1)，M4(PTEF1-AtERG9-TCYC1)，M5(His-TRP-down)。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5×buffer 10μl、dNTP(10mM eachdNTP)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各1μl、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、补加蒸馏水至总体积50μl。扩增条件为98℃预变性1.5分钟(1个循环)；98℃变性10秒、退火10秒(退火温度58℃)、72℃延伸均用2分钟(32个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存。

出发菌酿酒酵母NK2-SQ(记载于“林庭庭,王冬,戴住波,张学礼,黄璐琦.创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇.中国中药杂志,2016,41(6):1008-1015”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用)于SD-Ura液体培养基【配方：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％His，0.01％Trp，％表示质量百分比浓度】中过夜培养后制备感受态。然后向NK2-SQ感受态细胞中加入转化用片段：M1，M2，M3，M4和M5基因模块共5μg(摩尔比＝1:1:1:1:1)，电击转化后涂布在固体选择培养基SD-Ura-Trp中。固体选择培养基SD-Ura-Trp成分为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％(质量百分比浓度)葡萄糖，0.005％(质量百分比浓度)His，0.01％(质量百分比浓度)Leu。筛选培养的条件为：30℃，培养36h。PCR鉴定出序列正确的阳性克隆，命名为菌株WD-2091。

表3转基因重组菌的构建所需引物

前文表3中出现的pHis-TRP的质粒构建，分两步：

第一步：p-Trp1质粒的构建

以pRS314质粒为模板，用表4中的引物扩增Trp1。将约865bp Trp1扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体，得到含有Trp1的重组载体p-Trp1。

表4构建p-Trp1质粒所用引物

第二步：pHis-TRP质粒的构建

PmeI酶切p-Trp1，割胶纯化目的片段。

以酿酒酵母BY4742(记载在中国专利申请ZL201310399947.X中基因组为模板，用表5中引物扩增His片段。将该His片段与上述p-Trp1的PmeI酶切片段(约4794bp)用T4连接酶连接，得到重组质粒pHis-TRP。

表5构建pHis-TRP质粒所用引物

4、转基因重组菌的构建

用SD-Ura-Trp液体培养基活化菌株WD-2091，并用醋酸锂法制备感受态细胞。将pRS313-LEU2-P_TEF1-CBS-T_CYC1质粒和pRS425-LEU2-P_TEF1-CBS-T_CYC1质粒各3μL分别转入WD-2091感受态细胞中，电击转化后涂布在固体选择培养基SD-Ura-Trp-Leu中。固体选择培养基SD-Ura-Trp-Leu成分为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His-Leu(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％(质量百分比浓度)葡萄糖，0.005％(质量百分比浓度)His。筛选培养的条件为：30℃，培养36h。活化单克隆，提取酵母质粒，用引物SacⅡ-TEF和CBS-AscI-R进行PCR验证，正确的菌株分别命名为313-SL-CB、425-SL-CB。其中313-SL-CB于2017年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)313-SL-CB，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.14173。

5、葫芦二烯醇工程菌株的高密度发酵

将上述获得的菌株313-SL-CB和425-SL-CB分别经逐级活化转接到5L生物反应器中进行高密度发酵，发酵过程中参数设定值分别为：温度30℃，pH 5.0，溶氧30％，空气流量3-20L/min，搅拌转速300-1000rpm，溶氧与搅拌转速、通气相偶联。补料策略为：溶氧值达到60时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵液中葡萄糖浓度为10g/L。

6、葫芦二烯醇工程菌株的产物提取

取上述1.5mL的发酵液于破碎管中，13000rpm离心2min，弃上清，重复4次；沉淀用无菌水吹打混匀，同样条件下离心，弃上清；加入与沉淀体积等量的玻璃珠(直径0.5mm)后加入500μL萃取液(甲醇：丙酮＝1:1，体积比)，震荡破碎5min，超声破碎30min，12000rpm离心5min，取上清液，重复一次；上清用有机尼龙滤膜(直径0.22μm)过滤至液相小瓶，备用。

7、葫芦二烯醇检测分析

将上述得到的提取物，用溶剂(甲醇：丙酮＝1:1，体积比)配制麦角固醇、鲨烯和葫芦二烯醇标准品溶液，使用GC-MS进行样品的定性和定量分析。GC-MS测定条件：进样口温度300℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时12min；色谱柱：HP-5ms(30m×0.25mm)；色谱条件：80℃，保持1min；20℃/min升温至300℃，保持15min；MS条件：SIM：69、218、363和411。

结果显示：工程菌425-SL-CB的发酵产物分析如图2所示。工程菌313-SL-CB(CGMCCNo.14173)发酵96小时后生物量OD600与摇瓶发酵法相比提高超30倍，达到152.2；葫芦二烯醇和麦角固醇产量分别达到最高1697.30mg·L^-1和317.80mg·L^-1，其中葫芦二烯醇产量与摇瓶发酵法相比提高了20.48倍。另外，中间体鲨烯在48小时时达到最高值887.80mg·L^-1，在96小时下降到668.83mg·L^-1，见图3。

实施例2

1、目的核苷酸序列(基因)的获得

从罗汉果转录组数据库中挖掘到一个注释为葫芦二烯醇合成酶的基因SgCbQ(GeneBank ID NO:HQ128567)，SgCbQ基因片段序列如序列表中序列2所示(编码序列表中序列5所示蛋白质)，该基因与SgCbS同源性为99％。Trizol法提取罗汉果RNA，RNA经反转录试剂盒转化为cDNA模板，再用SexAI-CBS-F和CBS-AscI-R的引物组合扩增得到SgCBQ基因，PCR产物经纯化后用SexAI和AscI双酶切，切胶回收备用。以酵母基因组为模板，用引物SacⅡ-TEF1和TEF1-SexAI扩增得到启动子TEF1，PCR产物经纯化后用SexAI酶切，切胶回收备用；以酵母基因组为模板，用引物Asc1-CYC1t和CYC1t-SacⅡ扩增得到终止子CYC1t，PCR产物经纯化后用AscI酶切，切胶回收备用；将酶切产物TEF1、CYC1t和CBQ三片段连接，室温反应2小时后取1μL连接产物用引物SacⅡ-TEF1和CYC1t-SacⅡ进行PCR得到含SacⅡ位点的目的片段。将扩增产物纯化，然后用SacⅡ酶切，割胶回收目的片段SacII-TEF1-CBQ-CYC1t-SacII备用。

2、重组表达载体的构建

具体方法参见实施例1步骤2。最终得到pRS313-LEU2-P_TEF1-CBQ-T_CYC1质粒和pRS425-LEU2-P_TEF1-CBQ-T_CYC1质粒。

3、宿主菌的构建

pM3-AtERG9质粒、pM11-AtERG1质粒、pM2-SmERG20质粒的构建同实施例1步骤3。

出发菌酿酒酵母NK2-SQ(记载于“林庭庭,王冬,戴住波,张学礼,黄璐琦.创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇.中国中药杂志,2016,41(6):1008-1015”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用)于SD-Ura液体培养基【配方：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％His，0.01％Trp，％表示质量百分比浓度】中过夜培养后制备感受态。然后向NK2-SQ感受态细胞中加入转化用片段：M1，M2，M3，M4和M5基因模块共5μg(摩尔比＝1:1:1:1:1)。电击转化后涂布在固体选择培养基SD-Ura-Trp中。固体选择培养基SD-Ura-Trp成分为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％(质量百分比浓度)葡萄糖，0.005％(质量百分比浓度)His，0.01％(质量百分比浓度)Leu。筛选培养的条件为：45℃，培养45h。PCR鉴定出序列正确的阳性克隆，命名为菌株WD2-2091。

4、转基因重组菌的构建

用SD-Ura-Trp液体培养基活化菌株WD2-2091，并用醋酸锂法制备感受态细胞。将pRS313-LEU2-P_TEF1-CBQ-T_CYC1质粒和pRS425-LEU2-P_TEF1-CBQ-T_CYC1质粒各3μL分别转入WD2-2091感受态细胞中，电击转化后涂布在固体选择培养基SD-Ura-Trp-Leu中。固体选择培养基SD-Ura-Trp-Leu成分为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His-Leu(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％(质量百分比浓度)葡萄糖，0.005％(质量百分比浓度)His。筛选培养的条件为：30℃，培养36h。活化单克隆，提取酵母质粒，用引物SacⅡ-TEF和CBS-AscI-R进行PCR验证，正确的菌株分别命名为313-SL-CB1、425-SL-CB1。

5、葫芦二烯醇工程菌株的高密度发酵

将上述获得的葫芦二烯醇高产菌株313-SL-CB1经逐级活化转接到5L生物反应器中进行高密度发酵，发酵过程中参数设定值分别为：温度38℃，pH 7，溶氧45％，空气流量20L/min，搅拌转速1000rpm，溶氧与搅拌转速、通气相偶联。补料策略为：溶氧值达到80时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵液中葡萄糖浓度为20g/L。

6、葫芦二烯醇工程菌株的产物提取

具体方法同实施例1步骤6。

7、葫芦二烯醇检测分析

具体方法同实施例1步骤7。

结果显示：工程菌发酵96小时后生物量OD600与摇瓶发酵法相比提高超20倍，达到132.1；葫芦二烯醇和麦角固醇产量分别达到最高1327.50mg·L^-1和257.80mg·L^-1，其中葫芦二烯醇产量与摇瓶发酵法相比提高了12.38倍。另外，中间体鲨烯在48小时时达到最高值556.3mg·L^-1，在96小时下降到458.73mg·L^-1。

实施例3

1、目的核苷酸序列(基因)的获得

从转录组数据库中挖掘到一个具有葫芦二烯醇合成酶功能的基因CDS1(GeneBankID NO:KM821404)，CDS1基因序列如序列表中序列3所示(编码序列表中序列6所示蛋白质)，人工合成两端带有酶切位点SexAI和AscI识别序列的该基因，用SexAI和AscI双酶切，切胶回收备用。以酵母基因组为模板，用引物SacⅡ-TEF1和TEF1-SexAI扩增得到启动子TEF1，PCR产物经纯化后用SexAI酶切，切胶回收备用；以酵母基因组为模板，用引物Asc1-CYC1t和CYC1t-SacⅡ扩增得到终止子CYC1t，PCR产物经纯化后用AscI酶切，切胶回收备用；将酶切产物TEF1、CYC1t和CDS1三片段连接，室温反应2小时后取1μL连接产物用引物SacⅡ-TEF1和CYC1t-SacⅡ进行PCR得到含SacⅡ位点的目的片段。将扩增产物纯化，然后用SacⅡ酶切，割胶回收目的片段SacII-TEF1-CDS1-CYC1t-SacII备用。

2、重组表达载体的构建

具体方法参见实施例1步骤2。具体方法参见实施例1步骤2。最终得到pRS313-LEU2-P_TEF1-CDS1-T_CYC1质粒和pRS425-LEU2-P_TEF1-CDS1-T_CYC1质粒。

3、宿主菌的构建

pM2-AtERG9质粒、pM11-AtERG1质粒、pM3-SmERG20质粒的构建同实施例1步骤3。

出发菌酿酒酵母NK2-SQ(记载于“林庭庭,王冬,戴住波,张学礼,黄璐琦.创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇.中国中药杂志,2016,41(6):1008-1015”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用)于SD-Ura液体培养基【配方：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％His，0.01％Trp，％表示质量百分比浓度】中过夜培养后制备感受态。然后向NK2-SQ感受态细胞中加入转化用片段：M1，M2，M3，M4和M5基因模块共5μg(摩尔比＝1:1.5:1:1.5:1)。电击转化后涂布在固体选择培养基SD-Ura-Trp中。固体选择培养基SD-Ura-Trp成分为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％(质量百分比浓度)葡萄糖，0.005％(质量百分比浓度)His，0.01％(质量百分比浓度)Leu。筛选培养的条件为：20℃，培养30h。PCR鉴定出序列正确的阳性克隆，命名为菌株WD3-2091。

4、转基因重组菌的构建

用SD-Ura-Trp液体培养基活化菌株WD3-2091，并用醋酸锂法制备感受态细胞。将pRS313-LEU2-P_TEF1-CDS1-T_CYC1质粒和pRS425-LEU2-P_TEF1-CDS1-T_CYC1质粒各3μL分别转入WD3-2091感受态细胞中，电击转化后涂布在固体选择培养基SD-Ura-Trp-Leu中。固体选择培养基SD-Ura-Trp-Leu成分为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His-Leu(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％(质量百分比浓度)葡萄糖，0.005％(质量百分比浓度)His。筛选培养的条件为：30℃，培养36h。活化单克隆，提取酵母质粒，用引物SacⅡ-TEF/CBS-AscI-R进行PCR验证，正确的菌株分别命名为313-SL-CDS1、425-SL-CDS1。

5、葫芦二烯醇工程菌株的高密度发酵

将上述获得的葫芦二烯醇高产菌株313-SL-CDS1经逐级活化转接到5L生物反应器中进行高密度发酵，发酵过程中参数设定值分别为：温度20℃，pH 4，溶氧15％，空气流量3L/min，搅拌转速300rpm，溶氧与搅拌转速、通气相偶联。补料条件为：溶氧值达到40时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵液中葡萄糖浓度为5g/L。

6、葫芦二烯醇工程菌株的产物提取

具体方法同实施例1步骤6。

7、葫芦二烯醇检测分析

具体方法同实施例1步骤7。

结果显示：工程菌发酵96小时后生物量OD600与摇瓶发酵法相比提高超21倍，达到138.3；葫芦二烯醇和麦角固醇产量分别达到最高1267.55mg·L^-1和268.88mg·L^-1，其中葫芦二烯醇产量与摇瓶发酵法相比提高了11.28倍。另外，中间体鲨烯在48小时时达到最高值516.2mg·L^-1，在96小时下降到468.83mg·L^-1。

实施例4

1、目的核苷酸序列(基因)的获得

从转录组数据库中挖掘到一个具有葫芦二烯醇合成酶功能的基因CDS(GeneBankID NO:KM821403)，CDS基因序列如序列表中序列4所示(编码序列表中序列7所示蛋白质)，人工合成两端带有酶切位点SexAI和AscI识别序列的该基因，用SexAI和AscI双酶切，切胶回收备用。以酵母基因组为模板，用引物SacⅡ-TEF1和TEF1-SexAI扩增得到启动子TEF1，PCR产物经纯化后用SexAI酶切，切胶回收备用；以酵母基因组为模板，用引物Asc1-CYC1t和CYC1t-SacⅡ扩增得到终止子CYC1t，PCR产物经纯化后用AscI酶切，切胶回收备用；将酶切产物TEF1、CYC1t和CDS三片段连接，室温反应2小时后取1μL连接产物用引物SacⅡ-TEF1和CYC1t-SacⅡ进行PCR得到含SacⅡ位点的目的片段。将扩增产物纯化，然后用SacⅡ酶切，割胶回收目的片段SacII-TEF1-CDS-CYC1t-SacII备用。

2、重组表达载体的构建

具体方法参见实施例1步骤2。最终得到pRS313-LEU2-P_TEF1-CDS-T_CYC1质粒和pRS425-LEU2-P_TEF1-CDS-T_CYC1质粒。

3、宿主菌的构建

pM2-AtERG9质粒、pM11-AtERG1质粒、pM3-SmERG20质粒的构建同实施例1。

出发菌酿酒酵母NK2-SQ(记载于“林庭庭,王冬,戴住波,张学礼,黄璐琦.创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇.中国中药杂志,2016,41(6):1008-1015”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用)于SD-Ura液体培养基【配方：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％His，0.01％Trp，％表示质量百分比浓度】中过夜培养后制备感受态。然后向NK2-SQ感受态细胞中加入转化用片段：M1，M2，M3，M4和M5基因模块共5μg(摩尔比＝2:1:2:1:1.5)。电击转化后涂布在固体选择培养基SD-Ura-Trp中。固体选择培养基SD-Ura-Trp成分为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％(质量百分比浓度)葡萄糖，0.005％(质量百分比浓度)His，0.01％(质量百分比浓度)Leu。筛选培养的条件为：35℃，培养38h。PCR鉴定出序列正确的阳性克隆，命名为菌株WD4-2091。

4、转基因重组菌的构建

用SD-Ura-Trp液体培养基活化菌株WD4-2091，并用醋酸锂法制备感受态细胞。将pRS313-LEU2-P_TEF1-CDS-T_CYC1质粒和pRS425-LEU2-P_TEF1-CDS-T_CYC1质粒各3μL分别转入WD4-2091感受态细胞中，电击转化后涂布在固体选择培养基SD-Ura-Trp-Leu中。固体选择培养基SD-Ura-Trp-Leu成分为：0.8％(质量百分比浓度)酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His-Leu(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％(质量百分比浓度)葡萄糖，0.005％(质量百分比浓度)His。筛选培养的条件为：30℃，培养36h。活化单克隆，提取酵母质粒，用引物SacⅡ-TEF和CBS-AscI-R进行PCR验证，正确的菌株分别命名为313-SL-CDS、425-SL-CDS。

5.葫芦二烯醇工程菌株的高密度发酵

将上述获得的葫芦二烯醇高产菌株313-SL-CDS经逐级活化转接到5L生物反应器中进行高密度发酵，发酵过程中参数设定值分别为：温度36℃，pH 5，溶氧35％，空气流量12L/min，搅拌转速800rpm，溶氧与搅拌转速、通气相偶联。补料条件为：溶氧值达到70时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵液中葡萄糖浓度为15g/L。

6、葫芦二烯醇工程菌株的产物提取

具体方法同实施例1步骤6。

7、葫芦二烯醇检测分析

具体方法同实施例1步骤7。

结果显示：工程菌发酵96小时后生物量OD600与摇瓶发酵法相比提高超18倍，达到118.3；葫芦二烯醇和麦角固醇产量分别达到最高1157.54mg·L^-1和228.78mg·L^-1，其中葫芦二烯醇产量与摇瓶发酵法相比提高了10.3倍。另外，中间体鲨烯在48小时时达到最高值466.2mg·L^-1，在96小时下降到488.35mg·L^-1。

实施例5、通过调控葫芦二烯醇基因表达调控葫芦二烯醇产量

首先将实施例1得到CBS基因从含高拷贝复制元件2micron的pRS425质粒中换到含有低拷贝复制元件CEN6/ARSH4的pRS313质粒中，得到pRS313-LEU2-P_TEF1-CBS1-T_CYC1。功能质粒被电击转入底盘菌WD-2091中获得工程菌313-SL-CB(CGMCC No.14173)。313-SL-CB与425-SL-CB采用摇瓶发酵方法及GC-MS检测发现，低拷贝质粒菌株313-SL-CB的葫芦二烯醇的产量(82.89mg·L^-1)显著高于菌株425-SL-CB(高拷贝，产量27.44mg·L^-1)，提高了202.07％，见图4。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所、桂林莱茵生物科技股份有限公司

<120> 用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用

<130> GNCLN171500

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2280

<212> DNA

<213> 罗汉果

<400> 1

atgtggaggt taaaggtcgg agcagaaagc gttggggaga atgatgagaa atggttgaag 60

agcataagca atcacttggg acgccaggtg tgggagttct gtccggatgc cggcacccaa 120

caacagctct tgcaagtcca caaagctcgt aaagctttcc acgatgaccg tttccaccga 180

aagcaatctt ccgatctctt tatcactatt cagtatggaa aggaagtaga aaatggtgga 240

aagacagcgg gagtgaaatt gaaagaaggg gaagaggtga ggaaagaggc agtagagagt 300

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ggcgtcttga attctgtttt atccaagcac caccggcaag agatgtgcag atatgtttac 480

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ggcaaattgt ggctttctgt acttggagtc tacgaatgga gtggcaataa tcctcttcca 720

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tgtcgaatgg tttatctacc aatgtcatac ttatatggaa agagatttgt tgggccaatc 840

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caagatattc tgtggggatc tctccaccac gtgtatgagc ccttgtttac tcgttggcct 1020

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gagaataccc gatatatatg ccttggccct gtcaacaagg tactcaatct gctttgttgt 1140

tgggttgaag atccctactc cgacgccttc aaacttcatc ttcaacgagt ccatgactat 1200

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ttaagaaagg cacacgactt cgttaaaagt tctcagattc agcaggactg tcctggggat 1380

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<211> 2280

<212> DNA

<213> 罗汉果

<400> 2

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tcggatcttg gggggcccat gtttttactt ccgggtctgg tgattgccct ctacgttaca 420

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gccaaacgcc tgagagaaaa ggctttgcag actgcaatgc aacatattca ctatgaagat 1080

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ccccaacagg agatcatggg agtctttaat aaaaattgca tgatcacata tgctgcatac 2220

cgaaacattt ttcccatttg ggctcttgga gagtattgcc atcgggtttt gactgaataa 2280

<210> 3

<211> 2295

<212> DNA

<213> 罗汉果

<400> 3

atgtggaggc ttaaggttgg ggccgagagc gttggggaga aagaagagaa atggttgaag 60

agtataagca atcacttggg acgccaagtg tgggagtttt gtgcccacca acccactgct 120

tctccaaatc acttacaaca aatcgataat gcgcggaacc actttcgtaa taatcgcttc 180

caccggaagc aatcttccga tctctttctt gctattcaga atgaaaagga gatagcaaat 240

gttacaaaag gtggaggaat caaagtgaaa gaagaggaag atgtaaggaa agagacagtg 300

aagaatacag tagaaagggc attaagtttc tattcagcca ttcagacaaa cgatgggaat 360

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ggtggatggg gagagagtta cctttcatgt cagaataagg tctataccaa tcttgaagga 2040

aacagaccgc atttggttaa cactgcttgg gttttgatgg ctctcattga agccggccag 2100

gctgagagag acccagcacc attgcaccgt gcagcaaggt tgttaatcaa ttcccaattg 2160

gagaatggtg atttccccca agaggaaatc atgggagtgt ttaataaaaa ttgcatgatc 2220

acatatgctg catatcgaaa tatctttccc atttgggctc ttggagagta tttccatcgg 2280

gttcttactg aatga 2295

<210> 4

<211> 1945

<212> DNA

<213> 罗汉果

<400> 4

cgatgggaat tgggcttcgg atcttggagg gcccatgttt ttacttccgg gtctagtgat 60

tgctctctat gtcactggcg tcttgaattc ggttctatcc aagcaccatc ggcaagaaat 120

gtgtagatat ctttataatc accagaatga agatggggga tggggtctcc acatcgaagg 180

tacgagcacg atgtttggtt cggcactgaa ttatgttgca ctgaggttgc ttggagaaga 240

cgctgatggc ggagagggcg gcgcaatgac aaaagcacgc agttggatct tggaccgcgg 300

cggtgccacc gcaattactt cttggggaaa attgtggctc tctgtacttg gagtctatga 360

atggagtggc aataatcctc ttccacctga gttttggtta ctcccttatt gcctaccctt 420

tcatccagga agaatgtggt gccattgtcg aatggtttat ctaccaatgt catatttata 480

tggaaagaga tttgttgggc caatcacacc catagttcta tctctaagaa aagagctcta 540

cacaattcca tatcatgaaa tagattggaa tagatctcgc aatacatgtg caaaggagga 600

tctgtactat ccacatccga agatgcaaga tattctgtgg ggatcaatat accatttgta 660

tgagccttta tttactcgtt ggcctggaaa acggctgagg gaaaaggctt tgcaaatggc 720

aatgaaacat attcactatg aagatgaaaa cagtagatat atatgtcttg gacctgtcaa 780

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aaggacatat aatagttgtg ttgccattcg caaggcttgt gattttttgc tatctaaaga 1620

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tttccatcgg gttcttactg aatga 1945

<210> 5

<211> 759

<212> PRT

<213> 罗汉果

<400> 5

Met Trp Arg Leu Lys Val Gly Ala Glu Ser Val Gly Glu Asn Asp Glu

1 5 10 15

Lys Trp Leu Lys Ser Ile Ser Asn His Leu Gly Arg Gln Val Trp Glu

20 25 30

Phe Cys Pro Asp Ala Gly Thr Gln Gln Gln Leu Leu Gln Val His Lys

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Ala Arg Lys Ala Phe His Asp Asp Arg Phe His Arg Lys Gln Ser Ser

50 55 60

Asp Leu Phe Ile Thr Ile Gln Tyr Gly Lys Glu Val Glu Asn Gly Gly

65 70 75 80

Lys Thr Ala Gly Val Lys Leu Lys Glu Gly Glu Glu Val Arg Lys Glu

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Ala Val Glu Ser Ser Leu Glu Arg Ala Leu Ser Phe Tyr Ser Ser Ile

100 105 110

Gln Thr Ser Asp Gly Asn Trp Ala Ser Asp Leu Gly Gly Pro Met Phe

115 120 125

Leu Leu Pro Gly Leu Val Ile Ala Leu Tyr Val Thr Gly Val Leu Asn

130 135 140

Ser Val Leu Ser Lys His His Arg Gln Glu Met Cys Arg Tyr Val Tyr

145 150 155 160

Asn His Gln Asn Glu Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile Glu Gly Pro

165 170 175

Ser Thr Met Phe Gly Ser Ala Leu Asn Tyr Val Ala Leu Arg Leu Leu

180 185 190

Gly Glu Asp Ala Asn Ala Gly Ala Met Pro Lys Ala Arg Ala Trp Ile

195 200 205

Leu Asp His Gly Gly Ala Thr Gly Ile Thr Ser Trp Gly Lys Leu Trp

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Leu Ser Val Leu Gly Val Tyr Glu Trp Ser Gly Asn Asn Pro Leu Pro

225 230 235 240

Pro Glu Phe Trp Leu Phe Pro Tyr Phe Leu Pro Phe His Pro Gly Arg

245 250 255

Met Trp Cys His Cys Arg Met Val Tyr Leu Pro Met Ser Tyr Leu Tyr

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Gly Lys Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Ile Val Leu Ser Leu Arg

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Lys Glu Leu Tyr Ala Val Pro Tyr His Glu Ile Asp Trp Asn Lys Ser

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Gln Asp Ile Leu Trp Gly Ser Leu His His Val Tyr Glu Pro Leu Phe

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Thr Arg Trp Pro Ala Lys Arg Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gln Thr Ala

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Met Gln His Ile His Tyr Glu Asp Glu Asn Thr Arg Tyr Ile Cys Leu

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Gly Pro Val Asn Lys Val Leu Asn Leu Leu Cys Cys Trp Val Glu Asp

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Pro Tyr Ser Asp Ala Phe Lys Leu His Leu Gln Arg Val His Asp Tyr

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Leu Trp Val Ala Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Gly Tyr Asn Gly Ser

405 410 415

Gln Leu Trp Asp Thr Ala Phe Ser Ile Gln Ala Ile Val Ser Thr Lys

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Leu Val Asp Asn Tyr Gly Pro Thr Leu Arg Lys Ala His Asp Phe Val

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Lys Ser Ser Gln Ile Gln Gln Asp Cys Pro Gly Asp Pro Asn Val Trp

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Tyr Arg His Ile His Lys Gly Ala Trp Pro Phe Ser Thr Arg Asp His

465 470 475 480

Gly Trp Leu Ile Ser Asp Cys Thr Ala Glu Gly Leu Lys Ala Ala Leu

485 490 495

Met Leu Ser Lys Leu Pro Ser Glu Thr Val Gly Glu Ser Leu Glu Arg

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Asn Arg Leu Cys Asp Ala Val Asn Val Leu Leu Ser Leu Gln Asn Asp

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Asn Gly Gly Phe Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Arg Ser Tyr Pro Trp Leu

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Glu Leu Ile Asn Pro Ala Glu Thr Phe Gly Asp Ile Val Ile Asp Tyr

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Lys Lys Leu His Pro Gly His Arg Thr Lys Glu Ile Asp Thr Ala Ile

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Val Arg Ala Ala Asn Phe Leu Glu Asn Met Gln Arg Thr Asp Gly Ser

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Ile Lys Gly Leu Val Ala Ala Gly Arg Thr Tyr Asn Asn Cys Leu Ala

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Ile Arg Lys Ala Cys Asp Phe Leu Leu Ser Lys Glu Leu Pro Gly Gly

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675 680 685

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Arg Ala Ala Arg Leu Leu Ile Asn Ser Gln Leu Glu Asn Gly Asp Phe

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Cys His Arg Val Leu Thr Glu

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<210> 6

<211> 764

<212> PRT

<213> 罗汉果

<400> 6

Met Trp Arg Leu Lys Val Gly Ala Glu Ser Val Gly Glu Lys Glu Glu

1 5 10 15

Lys Trp Leu Lys Ser Ile Ser Asn His Leu Gly Arg Gln Val Trp Glu

20 25 30

Phe Cys Ala His Gln Pro Thr Ala Ser Pro Asn His Leu Gln Gln Ile

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Asp Asn Ala Arg Asn His Phe Arg Asn Asn Arg Phe His Arg Lys Gln

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Ser Ser Asp Leu Phe Leu Ala Ile Gln Asn Glu Lys Glu Ile Ala Asn

65 70 75 80

Val Thr Lys Gly Gly Gly Ile Lys Val Lys Glu Glu Glu Asp Val Arg

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Lys Glu Thr Val Lys Asn Thr Val Glu Arg Ala Leu Ser Phe Tyr Ser

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Ala Ile Gln Thr Asn Asp Gly Asn Trp Ala Ser Asp Leu Gly Gly Pro

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Met Phe Leu Leu Pro Gly Leu Val Ile Ala Leu Tyr Val Thr Gly Val

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Leu Asn Ser Val Leu Ser Lys His His Arg Gln Glu Met Cys Arg Tyr

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Leu Tyr Asn His Gln Asn Glu Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile Glu

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Gly Thr Ser Thr Met Phe Gly Ser Ala Leu Asn Tyr Val Ala Leu Arg

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Leu Leu Gly Glu Asp Ala Asp Gly Gly Glu Gly Gly Ala Met Thr Lys

195 200 205

Ala Arg Ser Trp Ile Leu Asp Arg Gly Gly Ala Thr Ala Ile Thr Ser

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Trp Gly Lys Leu Trp Leu Ser Val Leu Gly Val Tyr Glu Trp Ser Gly

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Asn Asn Pro Leu Pro Pro Glu Phe Trp Leu Leu Pro Tyr Cys Leu Pro

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Met Ser Tyr Leu Tyr Gly Lys Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Ile

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Asp Trp Asn Arg Ser Arg Asn Thr Cys Ala Lys Glu Asp Leu Tyr Tyr

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Pro His Pro Lys Met Gln Asp Ile Leu Trp Gly Ser Ile Tyr His Leu

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Tyr Glu Pro Leu Phe Thr Arg Trp Pro Gly Lys Arg Leu Arg Glu Lys

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Ile Ile Ser Thr Lys Leu Ile Asp Ser Phe Gly Thr Thr Leu Lys Lys

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Ser Thr Arg Asp His Gly Trp Leu Ile Ser Asp Cys Thr Ala Glu Gly

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<210> 7

<211> 647

<212> PRT

<213> 罗汉果

<400> 7

Asp Gly Asn Trp Ala Ser Asp Leu Gly Gly Pro Met Phe Leu Leu Pro

1 5 10 15

Gly Leu Val Ile Ala Leu Tyr Val Thr Gly Val Leu Asn Ser Val Leu

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Ser Lys His His Arg Gln Glu Met Cys Arg Tyr Leu Tyr Asn His Gln

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Asn Glu Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile Glu Gly Thr Ser Thr Met

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Phe Gly Ser Ala Leu Asn Tyr Val Ala Leu Arg Leu Leu Gly Glu Asp

65 70 75 80

Ala Asp Gly Gly Glu Gly Gly Ala Met Thr Lys Ala Arg Ser Trp Ile

85 90 95

Leu Asp Arg Gly Gly Ala Thr Ala Ile Thr Ser Trp Gly Lys Leu Trp

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Leu Ser Val Leu Gly Val Tyr Glu Trp Ser Gly Asn Asn Pro Leu Pro

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Gly Lys Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Ile Val Leu Ser Leu Arg

165 170 175

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Thr Arg Trp Pro Gly Lys Arg Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gln Met Ala

225 230 235 240

Met Lys His Ile His Tyr Glu Asp Glu Asn Ser Arg Tyr Ile Cys Leu

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Pro Tyr Ser Asp Ala Phe Lys Phe His Leu Gln Arg Val Pro Asp Tyr

275 280 285

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Leu Ile Asp Ser Phe Gly Thr Thr Leu Lys Lys Ala His Asp Phe Val

325 330 335

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Gly Trp Leu Ile Ser Asp Cys Thr Ala Glu Gly Leu Lys Ala Ser Leu

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Asn Gly Gly Phe Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Arg Ser Tyr Pro Trp Leu

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Lys Lys Leu His Pro Gly Arg Arg Thr Lys Glu Ile Asp Ile Ala Val

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Trp Tyr Gly Cys Trp Gly Val Cys Phe Thr Tyr Ala Gly Trp Phe Gly

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Ile Arg Lys Ala Cys Asp Phe Leu Leu Ser Lys Glu Leu Pro Gly Gly

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Gly Trp Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Cys Gln Asn Lys Val Tyr Thr Asn

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Leu Glu Gly Asn Arg Pro His Leu Val Asn Thr Ala Trp Val Leu Met

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580 585 590

Arg Ala Ala Arg Leu Leu Ile Asn Ser Gln Leu Glu Asn Gly Asp Phe

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Pro Gln Glu Glu Ile Met Gly Val Phe Asn Lys Asn Cys Met Ile Thr

610 615 620

Tyr Ala Ala Tyr Arg Asn Ile Phe Pro Ile Trp Ala Leu Gly Glu Tyr

625 630 635 640

Phe His Arg Val Leu Thr Glu

645

Claims

1.制备用于生产葫芦二烯醇的工程菌的方法，包括如下步骤：使能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株表达葫芦二烯醇合成酶，从而获得所述用于生产葫芦二烯醇的工程菌；所述葫芦二烯醇合成酶的氨基酸序列为序列表中序列5或序列6或序列7。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：向能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株中导入所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因，得到表达所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因的重组菌，即为所述用于生产葫芦二烯醇的工程菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因为如下任一所示DNA分子：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(3)序列表中序列3所示的DNA分子；

(4)序列表中序列4所示的DNA分子；

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株为能够表达MVA途径相关酶、法呢基焦磷酸合成酶、角鲨烯合成酶和角鲨烯环氧酶的重组酵母。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株为向酿酒酵母NK2-SQ中导入法呢基焦磷酸合成酶的编码基因、角鲨烯合成酶的编码基因和角鲨烯环氧酶的编码基因后得到的重组酵母。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因是通过重组表达载体导入所述能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株中的；

在所述重组表达载体中，含有由来源于酵母细胞的TEF1启动子、所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因终止子和来源于酵母细胞的CYC1t终止子组成的表达盒；

具体的，所述重组表达载体为将所述表达盒克隆入pRS313质粒或pRS425质粒后得到的重组质粒。

7.采用权利要求1-6中任一所述方法制备得到的用于生产葫芦二烯醇的工程菌。

8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)313-SL-CB，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14173。

9.权利要求7或8所述的工程菌在生产葫芦二烯醇中的应用。

10.一种生产葫芦二烯醇的方法，包括如下步骤：将权利要求7或8所述的工程菌转接到生物反应器中后进行发酵培养；

所述发酵培养的条件为：温度20-38℃，pH4-7，溶氧15-45％，空气流量3-20L/min，搅拌转速300-1000rpm。