CN109096386A - 一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法和应用 - Google Patents

一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109096386A
CN109096386A CN201811009702.0A CN201811009702A CN109096386A CN 109096386 A CN109096386 A CN 109096386A CN 201811009702 A CN201811009702 A CN 201811009702A CN 109096386 A CN109096386 A CN 109096386A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
breast carcinoma
cell
carcinoma stem
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811009702.0A
Other languages
English (en)
Inventor
李新峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Laifu Life Science And Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Laifu Life Science And Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Laifu Life Science And Biotechnology Co Ltd filed Critical Shanghai Laifu Life Science And Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201811009702.0A priority Critical patent/CN109096386A/zh
Publication of CN109096386A publication Critical patent/CN109096386A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0695—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法和应用，该方法包含培养乳腺癌干细胞，将次氯酸加入到培养乳腺癌干细胞的溶液中，混合均匀，诱导乳腺癌干细胞凋亡，裂解次氯酸处理后的乳腺癌干细胞，并收集细胞裂解物获得抗原的步骤，其中，次氯酸加入到培养乳腺癌干细胞的溶液中，浓度为20～80μM，次氯酸处理时间为30～60分钟。本发明方法制备的抗原可用于肿瘤DC疫苗的制备。用次氯酸处理乳腺癌干细胞后再收集抗原的方法，不仅经济、简单，还能够更强烈地激活抗原特异性T细胞的免疫应答，提高T细胞的肿瘤杀伤能力。

Description

一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程和生物医药领域，具体涉及一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，乳腺癌中99％发生在女性，男性仅占1％。从上个世纪90年代以来，中国的乳腺癌发病增长速度是全球平均速度的两倍，城市地区尤为显著。目前，乳腺癌是中国女性发病率最高的癌症病种，位居女性恶性肿瘤死亡的第五位。对于乳腺癌而言，5年生存期率大于85％的国家和地区大约有25个，其中，亚洲国家包括以色列、韩国和日本3个。我国的乳腺癌5年生存期率在亚洲国家和地区处于中游位置，小于以色列、韩国和日本，也略微小于我国台湾省和香港。
在临床上，Her-2阳性型与三阴性的乳腺癌预后都要差于鲁米那(luminal)型，但是Her-2阳性型的乳腺癌在应用靶向治疗后，可以得到显著的改善。对三阴性乳腺癌，传统治疗几乎无效，化疗3年后的复发率为40％—50％，而一旦发生远处转移，治愈率就几乎为零。而三阴性乳腺癌恰恰又在亚洲的年轻女性群体中多发，占所有乳腺癌的15％—20％，因此寻找一种更有效的临床方式是十分迫切的。
DC细胞全称树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)，是近年来倍受人们关注的专职抗原呈递细胞(Antigen Presenting Cells，APCs)，能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应，DC是美国学者斯坦曼(Steinman)于1973年首次在小鼠***中发现的。DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。DC是免疫***的关键启动者，DC分布在全身的组织和器官，具有对周围环境和抗原快速反应和引发免疫应答的能力。DC可以通过吞噬作用、巨胞饮作用和受体介导的内吞作用等方式摄取周围的抗原。抗原的摄取会导致DC成熟，DC会增加抗原递呈分子(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)、共刺激分子(例如CD80和CD86)、细胞黏附分子(例如CD83和CD54)以及趋化因子受体(例如CCR7)的表达水平，迁移至附近的***，通过抗原递呈分子把抗原递呈给T细胞。通过大量体外诱导和培养DC细胞，当细胞达到一定数量后负载肿瘤抗原回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。临床研究证明，DC疫苗可以用于治疗黑色素瘤、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌和白血病等多种癌症。DC疫苗的抗原可以是来自于合成的多肽、重组DNA、肿瘤组织RNA或者肿瘤细胞裂解物，甚至是让DC细胞直接吞噬肿瘤细胞。如果是用合成的多肽或者重组DNA作为抗原，因为抗原种类的不足可能会导致免疫逃逸的发生；如果使用肿瘤组织RNA或者肿瘤组织裂解物作为抗原，会存在抗原数量不足的问题；如果使用培养过的肿瘤原代细胞制备抗原，理论上能获得大量的肿瘤抗原，但是肿瘤原代细胞很难培养而且在培养过程中不易去除成纤维细胞。
癌症干细胞(cancer stem cells，CSCs)，是指具有干细胞性质的癌细胞，即具有自我复制和分化能力的癌细胞。CSC对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用，当今的研究也把CSC等同于癌症起始细胞，认为癌症是来自于CSC。CSC在肿瘤组织中所占的比例非常低，但是他们主要处于静止期，对化疗药物不敏感，因此CSC可能是导致肿瘤治疗后复发的根源。而且肿瘤干细胞高表达免疫抑制、DNA修复和耐药性相关的基因；相对于非肿瘤干细胞，用肿瘤干细胞抗原能引起更为强烈的抗肿瘤免疫反应。如果能有效的杀伤CSC，那么必将有助于提高恶性肿瘤的临床治愈率。
体外培养的肿瘤干细胞是纯化过的肿瘤细胞，不用考虑有成纤维细胞污染；肿瘤干细胞在无血清条件下能大量的扩增，并且保持未分化的状态，肿瘤干细胞抗原裂解物能够提供所有与肿瘤发生相关的抗原并且是个性化的抗原，所以是很理想的DC疫苗的抗原来源。放疗和化疗能杀伤肿瘤细胞，肿瘤细胞在凋亡(apoptosis)或者坏死(necrosis)的过程中会产生“危险信号”分子，这些“危险信号”分子可以是热休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)、钙网蛋白(calreticulin)或者染色质相关高迁移率族蛋白B1(Chromatin-Associated Protein High-Mobility Group Box 1，HMGB1)，这些分子能促进抗原交叉递呈和增强免疫应答反应。选择合适的抗原和抗原制备方法是提高治疗性肿瘤疫苗疗效的关键。利用肿瘤细胞制备抗原的常规方法是用紫外线照射肿瘤细胞或者直接反复冻融肿瘤细胞诱导肿瘤细胞凋亡(apoptosis)或者坏死(necrosis)来制备全肿瘤细胞抗原。
HSP70是分子量约70kD的热休克蛋白(Heat Shock Protein 70，HSP70)，是热休克蛋白家族中重要的一员。HSP70家族在抗原呈递中扮演重要的角色。在肿瘤细胞表面的HSP70可以引发针对该肿瘤细胞的特异性免疫，并与DC抗肿瘤作用有关。HSP70能促进肿瘤细胞的生长，与肿瘤的发生、发展、肿瘤免疫、肿瘤治疗中耐药性和肿瘤的预后等有密切关系。
IL-12为白细胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)，主要由DC等细胞产生，具有诱导NK细胞和T细胞产生IFN-γ，促进细胞毒性T细胞形成等作用，已被证实参与细胞免疫，能与NK细胞、T淋巴细胞等协同发挥抗肿瘤效应，也能够通过自身或者诱导其他细胞因子，如IFN-γ，发挥抗肿瘤作用，对多种肿瘤(结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌等)的生长和转移具有明显的抑制作用。利用IL-12家族细胞因子提高宿主免疫能力，破坏肿瘤细胞的免疫逃逸功能是肿瘤生物治疗的重要策略。
IFN-γ为干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)，是II型干扰素的唯一成员，只由活化T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)产生。IFN-γ在体内能抑制肿瘤细胞生长，防治肿瘤的转移和复发。既可通过诱导肿瘤细胞凋亡和干扰肿瘤细胞的生长周期等方式直接杀死肿瘤细胞，也可通过抗肿瘤组织的血管生长从而抑制肿瘤细胞生长，还可通过调节人体免疫***增强人体自身对肿瘤细胞的清除能力。
次氯酸是一种强杀菌氧化剂，在急性炎症中由活化的中性粒细胞产生。用次氯酸处理肿瘤细胞能引起肿瘤细胞的快速凋亡和坏死，刺激DC对肿瘤抗原的摄取，增加抗原特异性T细胞的免疫活性。次氯酸还能给抗原打上醛基标签增加抗原的免疫原性，让抗原更好的暴露给T细胞。用次氯酸诱导乳腺癌干细胞凋亡，裂解凋亡的肿瘤干细胞制备成DC抗原，相对传统的抗原制备方法，用次氯酸氧化法制备得到的肿瘤抗原能够更强烈地激活抗原特异性T细胞的免疫应答，提高T细胞的肿瘤杀伤能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用次氯酸氧化法制备乳腺癌干细胞抗原的方法，不仅经济、简单，相对传统的抗原制备方法，还能够更强烈地激活抗原特异性T细胞的免疫应答，提高T细胞的肿瘤杀伤能力。
为了达到上述目的，本发明提供了一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法，包含以下步骤：
(1)培养乳腺癌干细胞；
(2)将次氯酸加入到培养乳腺癌干细胞的溶液中，混合均匀，诱导乳腺癌干细胞凋亡；
(3)裂解次氯酸处理后的乳腺癌干细胞，并收集细胞裂解物获得抗原。
较佳地，步骤(1)所述的乳腺癌干细胞包含从新鲜的乳腺癌肿瘤组织中分离并培养获得的乳腺癌干细胞。
较佳地，所述的次氯酸在所述的培养乳腺癌干细胞的溶液中的浓度为20～80μM。
较佳地，所述的次氯酸诱导所述的乳腺癌干细胞凋亡的时间为30～60分钟。
较佳地，步骤(3)中的裂解是指采用反复冻融法裂解所述的次氯酸处理后的乳腺癌干细胞。
较佳地，反复冻融法是把细胞放在-80℃和38℃条件下反复冻融4～6次。
较佳地，所述的细胞裂解物是细胞被裂解后，离心获得的上清液。
本发明还提供了一种乳腺癌干细胞抗原的应用，其是上述的方法制备得到，所述的乳腺癌干细胞抗原用于肿瘤疫苗的制备。
较佳地，所述的肿瘤疫苗是所述的乳腺癌干细胞抗原致敏DC后获得的DC疫苗。
与现有技术相比，本发明提供的采用次氯酸氧化法制备乳腺癌干细胞抗原的方法，在裂解乳腺癌干细胞收集抗原前，用次氯酸处理乳腺癌干细胞，可快速诱导乳腺癌干细胞凋亡，使获得的抗原具有更多增强免疫应答的分子；制备的抗原可用于肿瘤DC疫苗的制备，不仅经济、简单，还能够更强烈地激活抗原特异性T细胞的免疫应答，提高T细胞的肿瘤杀伤能力。
附图说明
图1为显微镜下看到的悬浮的球形乳腺癌干细胞克隆的形态图。
图2为未做处理(直接冻融)、紫外线照射处理和次氯酸氧化处理后细胞的凋亡比例。
图3为蛋白质免疫印迹实验检测的直接冻融法、紫外线照射法和次氯酸氧化法制备的乳腺癌干细胞抗原中HSP70的表达丰度结果。
图4为DC细胞被直接冻融法、紫外线照射法和次氯酸氧化法制备的乳腺癌干细胞抗原负载后上清中IL-12的表达水平。
图5直接冻融法、紫外线照射法和次氯酸氧化法制备的抗原负载DC细胞后与T细胞共培养，ELISPOT技术检测的能分泌IFN-γ的T细胞数目。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
本发明公开了一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法，包含以下步骤：
(1)培养乳腺癌干细胞；
(2)将次氯酸加入到培养乳腺癌干细胞的溶液中，混合均匀，诱导乳腺癌干细胞凋亡；
(3)裂解次氯酸处理后的乳腺癌干细胞，并收集细胞裂解物获得抗原。
实施例1
乳腺癌干细胞培养基为DMEM/F12培养基，并加入：20ng/mL EGF，20ng/mL bFGF，20ng/mL PDGF-AA和1×B27。DMEM/F12培养基购自赛默飞世尔公司；EGF为表皮生长因子，购自PeproTech公司；bFGF是碱性成纤维细胞生长因子，购自PeproTech公司；PDGF-AA是一种血小板衍生因子；B27是一种干细胞生长因子，购自赛默飞世尔公司。
步骤如下：
1.解离新鲜的乳腺癌肿瘤组织，并分离单个的肿瘤细胞
1.1把新鲜的乳腺癌组织块用无菌的镊子转移到培养皿中，用生理盐水清洗组织块2次，丢掉废弃液体。在组织块上滴加少量的无血清1640培养基，用剪刀把组织块剪碎。把剪碎的组织块转移到一个50mL的离心管中，1500rpm离心10分钟；吸走废液，以每5克组织中加入20mL消化液的比例在组织中加入消化液(5mg/ml胶原酶Ⅰ、5mg/ml胶原酶Ⅱ、50U/mlDNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)和稀释1倍的Accutase消化液(购自赛默飞世尔公司))，在37℃的条件下消化组织1个小时。
1.2当组织被消化成单个的细胞以后，往细胞悬液里面加入1/10体积的胎牛血清中和消化酶。吹打细胞悬液若干次，让细胞悬液通过直径为70μm的过滤网。以1500rpm的速度离心10分钟，去除上清；然后用30～40mL生理盐水重悬细胞沉淀，离心，再次清洗细胞一次，丢弃上清，用20～30mL生理盐水重悬细胞沉淀。
1.3在一个50mL的离心管中，加入10～20mL淋巴细胞分离液，然后把等体积细胞悬液缓慢的加入到淋巴分离液上面；把离心管放入离心机里面，关掉离心机的减速阀，以850g的转速离心20分钟。离心结束后，把离心管中间有肿瘤细胞的白色细胞层转移到另外一个干净的离心管中，用2～3倍体积的生理盐水重悬细胞，离心，去除上清。再次用生理盐水重悬细胞，细胞计数，离心。
1.4离心结束后，丢弃上清，用乳腺癌干细胞培养基把肿瘤细胞调成1×106/mL，在一个T75培养瓶中加入10～15mL细胞，然后把细胞放入培养箱中培养。
2.乳腺癌干细胞培养
2.1乳腺癌细胞培养到第五天时半换液处理细胞，以后每4天给细胞半换液处理一次。大概2周以后，在显微镜下能看到悬浮的球形干细胞克隆。如图1所示，为显微镜下看到的悬浮的球形乳腺癌干细胞克隆的形态图。
2.2当需要细胞传代的时候，在37℃的条件下用Accutase消化液(购自赛默飞世尔公司)消化球形干细胞克隆8分钟，直至肿瘤干细胞克隆被消化成单个的细胞，乳腺癌干细胞的传代比例是1：3。
3.将次氯酸加入到培养乳腺癌干细胞的溶液中，混合均匀，诱导乳腺癌干细胞凋亡
3.1用Accutase消化液把乳腺癌干细胞克隆消化成单个的细胞，以800rpm的速度离心细胞7分钟，去除上清；用培养基把肿瘤干细胞调成1×106个/mL，在细胞里面加入50μM次氯酸，然后把细胞放回培养箱中继续培养40分钟。
3.2以800rpm的速度离心细胞7分钟，去除上清；再用生理盐水洗细胞两次；用生理盐水把乳腺癌干细胞的浓度调整为2×107/mL。
4.裂解乳腺癌干细胞，收集抗原并检测浓度
4.1用反复冻融法裂解乳腺癌干细胞：把细胞放在-80℃下10分钟，然后把细胞放在38℃水浴锅中2分钟让细胞解冻，如此反复五次，乳腺癌干细胞会完全裂解。
4.2在4℃条件下，以12000rpm的速度离心裂解后的乳腺癌干细胞20分钟，收集上清，用直径为0.22μM的过滤网过滤上清，获得抗原。
4.3用BCA蛋白质浓度检测试剂盒检测乳腺癌干细胞抗原的浓度，分装抗原，把抗原保存在-80℃。
比较例1(直接冻融法)
直接冻融法是指参照实施例1，但是在步骤3中对乳腺癌不作任何处理，收集指定数量细胞直接进入步骤4，即步骤3修改为：
1.用Accutase消化液把乳腺癌干细胞克隆消化成单个的细胞，以800rpm的速度离心细胞7分钟，去除上清；
2.再用生理盐水洗细胞两次；用生理盐水把乳腺癌干细胞的浓度调整为2×107/mL。
比较例2(紫外线照射法)
紫外线照射法是指参照实施例1，但是在步骤3中，对细胞进行紫外线照射处理，即步骤3修改为：
1.用Accutase消化液把乳腺癌干细胞克隆消化成单个的细胞，以800rpm的速度离心细胞7分钟，去除上清；用培养基把肿瘤干细胞调成1×106个/mL，加入到直径为10厘米的培养皿中；让乳腺癌干细胞在302nm的紫外线下照射10分钟，然后把细胞放回培养箱中培养过夜。
2.以800rpm的速度离心细胞7分钟，去除上清；再用生理盐水洗细胞两次；用生理盐水把乳腺癌干细胞的浓度调整为2×107/mL。
实施例1(次氯酸氧化法)与比较例1(直接冻融法)和比较例2(紫外线照射法)的结果对比
一、乳腺癌干细胞被裂解前的细胞凋亡比例
裂解乳腺癌干细胞前，收集用次氯酸处理过的乳腺癌干细胞(次氯酸氧化法)和用紫外线照射过的乳腺癌干细胞(紫外线照射法)，并收集未做处理的乳腺癌干细胞(直接冻融法)作为对照。使用eBioscience公司的细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡比例。
实验结果如图2所示，为未做处理(直接冻融)、紫外线照射处理和次氯酸氧化处理后细胞的凋亡比例。
图2的A是未做处理的乳腺癌干细胞(直接冻融法)的凋亡比例，凋亡比例是4.32％，图2的B用紫外线照射过的乳腺癌干细胞(紫外线照射法)，凋亡比例是36.63％，图2的C是次氯酸处理过的乳腺癌干细胞(次氯酸氧化法)，凋亡比例是51.87％。结果显示，次氯酸氧化法可快速诱导细胞凋亡，次氯酸氧化组的乳腺癌干细胞的凋亡比例高于紫外线照射组。
二、乳腺癌干细胞抗原中HSP70的表达丰度
以蛋白质免疫印迹实验比较次氯酸氧化法、直接冻融法和紫外线照射法3种方法制备的乳腺癌干细胞抗原中HSP70的表达丰度。
步骤如下：
1.蛋白质抗原经过变性处理后，取50μg抗原上样电泳；
2.电泳结束后，抗原转移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜上；
3.PVDF膜与HSP70和GAPDH一抗在4℃条件下孵育过夜；
4.洗去一抗，PVDF膜与二抗孵育；
5.洗去二抗，用超灵敏发光液检测抗原表达水平。
实验结果如图3所示，为蛋白质免疫印迹实验检测直接冻融法、紫外线照射法和次氯酸氧化法制备的乳腺癌干细胞抗原中HSP70的表达丰度结果。
由图3可知，相对于直接冻融法和紫外线照射法，次氯酸氧化法能诱导乳腺癌干细胞表达更多的HSP70分子。
三、乳腺癌干细胞抗原致敏DC细胞，获得的DC疫苗的IL-12表达水平
步骤如下：
1.抽取患者的50mL外周血，在每个50mL离心管中加入20～25mL淋巴细胞分离液，然后在淋巴细胞分离液上方缓慢加入等体积的血液。把离心管放入离心机中，离心速度是500g，离心时间是20分钟，并且关掉降速阀。从离心管中吸取中间层白色的外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)，加入到新的50mL离心管中。吹打均匀，用生理盐水定容至40～50mL，600g离心10分钟。离心后弃上清，用生理盐水定容至40～50mL，吹打细胞至混匀，再次以500g离心10分钟，弃上清得到PBMCs。用德国美天旎公司的DendriMACS GMP级别培养基重悬细胞，同时细胞计数；以500g离心10分钟，弃上清。
2.每5×107个PBMC加500μL预冷的分选缓冲液、100μL Fc受体阻断剂和100μL生物素化抗体混合液，混匀后，放置在4℃冰箱内，20分钟后取出。
3.加入4mL分选缓冲液，混合细胞几次，在4℃下以350g的速度离心8分钟，去除上清。用500μL分选缓冲液重悬细胞，加入500μL磁珠，放置在4℃冰箱内，15分钟后取出。再加入4mL分选缓冲液，轻轻吹打细胞十次以上。
4.把装有细胞的管子置于磁架上静置2分钟，把上清转移到另外一个干净的管子里面；然后在原离心管里加入4mL分选缓冲液，轻轻吹打细胞十次以上，静置在磁架上2分钟，转移上清；把两份上清合并在一起，单核细胞包含在上清里面。在含有单核细胞的上清里面加入2倍体积的无血清基础培养基，350g的速度离心8分钟，丢掉上清。
5.用无血清基础培养基调节单核细胞，使其浓度为1×106个/mL，加到6孔板中，每孔2.5～3mL培养基；然后往基础培养基里面加入1000U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor,GM-CSF)和500U/mL白细胞介素4(IL-4)，把6孔板放入37℃的培养箱。单核细胞会在GM-CSF和白细胞介素4的作用下分化成不成熟的DC细胞。
6.第4天的时候，在DC细胞中加入100μg/mL的乳腺癌干细胞抗原。
7.第5天的时候，在DC细胞中加入1000U/mL IFN-γ、1000U/mL肿瘤坏死因子-α(TNF-a)、100U/mL干扰素-a(IFN-a)和100ng/mL脂多糖。
8.第6天的时候，收集悬浮的成熟的DC细胞和DC细胞的培养上清。
9.用IL-12的ELISA试剂盒检测DC上清中的IL-12表达水平。
实验结果如图4所示，为DC细胞被直接冻融法、紫外线照射法和次氯酸氧化法制备的乳腺癌干细胞抗原负载后上清中的IL-12的表达水平。
由图4可知，相对于直接裂解法和紫外线照射法，次氯酸氧化法制备的乳腺癌干细胞抗原致敏的DC细胞能分泌更多的IL-12，其中，与直接裂解法和紫外线照射法相比，p<0.01。
四、乳腺癌干细胞抗原致敏的DC细胞激活初始T细胞(T cell)，比较IFN-γ的表达水平
步骤如下：
(1)制备乳腺癌干细胞抗原特异性的细胞毒性T细胞
1.在制备DC的同时制备初始T细胞。每107个PBMC中加入40μL缓冲液(buffer)、10μL初始T细胞生物素-抗体混合液(Pan T Cell Biotin-Antibody Cocktail)和10μL抗Anti-TCRγ/δ生物素(Anti-TCRγ/δ-Biotin)，混合PBMCs和抗体，4℃放置5分钟。
2.每107个PBMC中加入30μL缓冲液和20μL初始T细胞磁珠混合液(Pan TCell MicroBead Cocktail)，混合PBMCs和磁珠，4℃放置10分钟。
3.将LS柱子(德国美天旎)放在磁架上面，加入3mL缓冲液，等缓冲液完全流干后，把细胞加到柱子里面，收集流下来的细胞；然后再用3mL缓冲液洗柱子一次，收集洗脱下来的细胞。
4.计数所有收集到的T细胞，然后T细胞在350g的速度下离心8分钟；丢弃上清，用XVIVO-15培养基重悬T细胞，把T细胞的密度调整为1×106/mL。
5.在一个T25的培养瓶中，加入5mL T细胞，补加20U/mL IL-2和20U/mL IL-7，把T细胞放回培养箱中培养。第三天的时候补加1/2体积的培养基，并补加20U/mL IL-2和20U/mL IL-7。
6.第五天的时候，收集DC的同时收集T细胞。分别用X VIVO-15培养基调整DC和T细胞的密度，T细胞的密度是2×106/mL，DC的密度是1×105/mL。把T细胞和DC细胞等体积混合接种到培养瓶中，用于制备抗原特异性毒性T细胞，培养基中加入5％灭活的人AB血清、20U/mL IL-2和20U/mL IL-7。经过抗原致敏过的DC和T细胞共培养，作为实验组，没有经过抗原致敏过的DC和T细胞共培养，作为对照组。
(2)酶联免疫斑点检测(ELISPOT)实验：
1.在ELISPOT预包被PVDF板的每个孔里面加入200μL无血清的X VIVO-15培养基，室温静置5分钟后把培养基吸出。
2.把制备好的抗原特异性毒性T细胞用培养基稀释成1×106/mL，每个孔中加入100μL T细胞悬液；用抗CD3/CD28磁珠激活的初始T细胞作为阳性对照。
3.把T细胞放回培养箱中培养20个小时。
4.第二天，倾倒孔内的细胞和培养基，用冰冷的生理盐水低渗裂解细胞；倒掉孔内的液体，用清洗缓冲液清洗板子5～6次。
5.在板子里面加入抗体，最后显色和终止显色。
6.用酶联免疫斑点图像自动分析仪读取斑点并做统计分析。
实验结果如图5所示，为直接冻融法、紫外线照射法和次氯酸氧化法制备的抗原负载DC细胞后与T细胞共培养，ELISPOT技术检测的能分泌IFN-γ的T细胞数目。
由图5可知，相对于直接裂解法和紫外线照射法，次氯酸氧化法制备的初始T细胞能分泌更多的IFN-γ，其中，与直接裂解法和紫外线照射法相比，p<0.01。
综上所述，次氯酸氧化法与直接冻融法和紫外线照射法相比：
(1)乳腺癌干细胞被次氯酸诱导凋亡后的细胞凋亡比例更高；
(2)次氯酸氧化法制备的乳腺癌干细胞抗原中HSP70的表达丰度更高；
(3)次氯酸氧化法制备的乳腺癌干细胞抗原致敏DC细胞，获得的DC疫苗的IL-12表达水平更高；
(4)次氯酸氧化法制备的乳腺癌干细胞抗原致敏DC细胞，激活的初始T细胞分泌的IFN-γ表达水平更高。
因此，本发明提供的次氯酸氧化法制备乳腺癌干细胞抗原的方法，不仅经济、简单，还能够更强烈地激活抗原特异性T细胞的免疫应答，提高T细胞的肿瘤杀伤能力。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (9)

1.一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)培养乳腺癌干细胞；
(2)将次氯酸加入到培养乳腺癌干细胞的溶液中，混合均匀，诱导乳腺癌干细胞凋亡；
(3)裂解次氯酸处理后的乳腺癌干细胞，并收集细胞裂解物获得抗原。
2.如权利要求1所述的乳腺癌干细胞抗原的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的乳腺癌干细胞包含从新鲜的乳腺癌肿瘤组织中分离并培养获得的乳腺癌干细胞。
3.如权利要求1所述的乳腺癌干细胞抗原的制备方法，其特征在于，所述的次氯酸在所述的培养乳腺癌干细胞的溶液中的浓度为20～80μM。
4.如权利要求1所述的乳腺癌干细胞抗原的制备方法，其特征在于，所述的次氯酸诱导所述的乳腺癌干细胞凋亡的时间为30～60分钟。
5.如权利要求1所述的乳腺癌干细胞抗原的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的裂解是指采用反复冻融法裂解所述的次氯酸处理后的乳腺癌干细胞。
6.如权利要求5所述的乳腺癌干细胞抗原的制备方法，其特征在于，反复冻融法是把细胞放在-80℃和38℃条件下反复冻融4～6次。
7.如权利要求1所述的乳腺癌干细胞抗原的制备方法，其特征在于，所述的细胞裂解物是细胞被裂解后，离心获得的上清液。
8.一种乳腺癌干细胞抗原的应用，其特征在于，该乳腺癌干细胞抗原由权利要求1-7中任一项所述的方法制备得到，该乳腺癌干细胞抗原用于肿瘤疫苗的制备。
9.如权利要求8所述的乳腺癌干细胞抗原的应用，其特征在于，所述的肿瘤疫苗是所述的乳腺癌干细胞抗原致敏DC后获得的DC疫苗。
CN201811009702.0A 2018-08-31 2018-08-31 一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法和应用 Pending CN109096386A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811009702.0A CN109096386A (zh) 2018-08-31 2018-08-31 一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811009702.0A CN109096386A (zh) 2018-08-31 2018-08-31 一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109096386A true CN109096386A (zh) 2018-12-28

Family

ID=64864487

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811009702.0A Pending CN109096386A (zh) 2018-08-31 2018-08-31 一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109096386A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110124021A (zh) * 2019-05-15 2019-08-16 迪亚思生命科技(武汉)有限公司 一种新型肿瘤疫苗的制备方法
CN115607661A (zh) * 2022-10-31 2023-01-17 徐州医科大学 全肿瘤裂解液制备的dc疫苗在肿瘤治疗中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108291205A (zh) * 2015-09-26 2018-07-17 普莱瓦克斯免疫肿瘤学公司 用于产生树突细胞的组合物和方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108291205A (zh) * 2015-09-26 2018-07-17 普莱瓦克斯免疫肿瘤学公司 用于产生树突细胞的组合物和方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIANG CLL等: "Adjuvants for Enhancing the Immunogenicity of Whole Tumor Cell Vaccines", 《INTERNATIONAL REVIEWS OF IMMUNOLOGY》 *
CHIANG CLL等: "Hypochlorous acid enhances immunogenicity and uptake of allogeneic ovarian tumor cells by dendritic cells to cross-prime tumor-specific T cells", 《CANCER IMMUNOLOGY IMMUNOTHERAPY》 *
CHIANG CL等: "A dendritic cell vaccine pulsed with autologous hypochlorous acid-oxidized ovarian cancer lysate primes effective broad antitumor immunity: from bench to bedside", 《CLIN CANCER RES》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110124021A (zh) * 2019-05-15 2019-08-16 迪亚思生命科技(武汉)有限公司 一种新型肿瘤疫苗的制备方法
CN115607661A (zh) * 2022-10-31 2023-01-17 徐州医科大学 全肿瘤裂解液制备的dc疫苗在肿瘤治疗中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102618498B (zh) Hla-a0201限制性抗原特异性ctl制备方法
TW201934748A (zh) Hpv專一性t細胞之產生技術
CN105176927A (zh) 一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤nk/cik细胞的制备方法
WO2022062687A1 (zh) 肿瘤复合抗原、树突状细胞多价疫苗及其应用
CN104491853A (zh) 一种人树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法
CN102719402B (zh) Hla-a0201限制性抗hpv抗原特异性ctl的制备方法
CN108300692B (zh) 一种制备hpv抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞的方法
CN109096386A (zh) 一种乳腺癌干细胞抗原的制备方法和应用
CN104491857B (zh) 一种用于免疫治疗ebv相关疾病的抗原组合物、生物制剂及其制备方法
CN112662625B (zh) 一种t细胞培养基及其用于t细胞的扩增培养方法
Delirezh et al. Generation of mature monocyte-derived dendritic cells in the presence of heparin and monocyte conditioned medium: phenotypic and functional comparison
CN109957543A (zh) 利用脐带血大量扩增脐血nk细胞的方法
CN105018427A (zh) 一种增强ctl免疫反应的dc细胞培养方法
CN1201817C (zh) 一种治疗肝癌的肿瘤ct抗原免疫诱导剂及其制备方法
Kacani et al. Immunosuppressive effects of soluble factors secreted by head and neck squamous cell carcinoma on dendritic cells and T lymphocytes
CN109535241B (zh) Dc-cik共培养细胞及其制备方法、致敏抗原和应用
CN106084008A (zh) 用于对hpv感染进行细胞治疗的树状多肽及其筛选方法、制备方法和应用
Sjaastad et al. Reduced T Cell Priming in Microbially Experienced “Dirty” Mice Results from Limited IL-27 Production by XCR1+ Dendritic Cells
WO2022061811A1 (zh) 药物组合物及其制备方法和应用
CN106008692A (zh) 一种肿瘤抗原gpc3的ctl识别表位肽及其应用
JPWO2002100889A1 (ja) ヒトパピローマウイルスｅ７抗原の新規エピトープおよびそのエピトープにより活性化されたｃｄ４陽性ｔ細胞
US20230405111A1 (en) Ebv-targeted allogeneic b cell vaccine and preparation method therefor
CN111303268B (zh) 子宫肌瘤新抗原、其应用和子宫肌瘤疫苗
CN111763246B (zh) 一种用于预防和/或治疗***的药物组合物及其制备方法和其应用
CN105535952A (zh) 制备高效的新型自体dc疫苗的试剂盒、方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181228