CN109535241B - Dc-cik共培养细胞及其制备方法、致敏抗原和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DC‑CIK共培养细胞及其制备方法、致敏抗原和应用。该DC‑CIK共培养细胞通过将分离的单个核细胞分别诱导培养成DC细胞和CIK细胞，其中DC细胞在培养过程中添加自行构建的经过验证在多种肿瘤细胞中都广泛表达的多肽致敏抗原来进行诱导刺激，可以提高对肿瘤杀伤效果。通过该方法培养得到的DC‑CIK共培养细胞可以对多种肿瘤细胞均有非常好的杀伤效果，而且培养的DC‑CIK细胞活性高，扩增能力强，释放的IFN‑γ等细胞因子多，杀伤力强。该共培养细胞可以广泛用于多种癌症的治疗，包括肾癌、***癌、乳腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、结肠癌、卵巢癌、骨癌、肺癌、神经母细胞瘤等，适应面广泛。

Description

DC-CIK共培养细胞及其制备方法、致敏抗原和应用
技术领域
本发明涉及免疫细胞领域，尤其是涉及一种DC-CIK共培养细胞及其制备方法、致敏抗原和应用。
背景技术
DC-CIK细胞疗法是一种细胞因子激活的杀伤细胞-树突状细胞混合疗法，它同时含有杀伤性免疫细胞与树突状细胞两种细胞。在肿瘤治疗过程中，DC细胞先识别抗原，继而激活获得性免疫***；活化后的CIK细胞通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子高效杀伤肿瘤细胞。
树突状细胞(dendritic cells，DC)因其成熟时细胞表面伸出树突样或伪足样的膜性突起而得名，是功能最强的专职抗原提呈细胞。DC起源于骨髓CD34+HSC前体细胞，正常情况下少量但广泛分布脑以外的全身多种脏器，如脐血、人骨髓和外周血。在体外可通过添加一系列细胞因子GM-CSF、IL-4、TNF-α及IL-1β等将前体细胞诱导为成熟DC。成熟DC细胞呈递抗原，可激活初始T细胞，引发机体产生抗肿瘤反应。
CIK细胞是将人体外周血单个核细胞在体外用细胞因子诱导培养的一群以CD3+CD56为主的异质细胞群，又称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具T淋巴细胞的抗肿瘤活性和NK细胞非MIH限制性杀瘤优点。CIK细胞可通过释放胞浆毒性颗粒(颗粒酶或穿孔素)直接杀伤肿瘤细胞和被病毒感染的细胞，同时CIK细胞产生大量炎性细胞因子(如IFN-γ、TNF-α、IL-6等)，提高免疫效应细胞的细胞毒作用或调节肿瘤细胞对CIK的敏感性，以抑制肿瘤生长、病毒复制。
DC作为功能强大的专职抗原提呈细胞，在T细胞的活化、分化中发挥着重要作用。将CIK细胞与DC联合起来***，不仅有助于避免T细胞对部分肿瘤细胞的免疫无能现象，还能发挥协同抗肿瘤作用。DC与CIK联合后，CIK在细胞增殖活性、肿瘤杀伤活性以及细胞因子的释放量均得到显著的提升和增加。而抗原负载的DC能够刺激CIK细胞进一步活化，释放更多细胞因子，具有更高的杀瘤活性。目前体外致敏DC所使用的抗原主要是已知的特定肿瘤相关抗原、肿瘤细胞株裂解物或者病人肿瘤标本裂解物。肿瘤细胞株裂解物或者病人肿瘤标本裂解物风险性较高，里面抗原成分不明确；已知的特定肿瘤相关抗原致敏的DC-CIK细胞针对的是特定的肿瘤，无法对多种肿瘤起较强的杀伤作用，限制了肿瘤抗原致敏的DC-CIK细胞的体内抗肿瘤效果。
发明内容
基于此，有必要提供一种DC-CIK共培养细胞及其制备方法、致敏抗原和应用，以解决传统的DC-CIK共培养细胞抗肿瘤杀伤效果差、局限性大的问题。
一种DC-CIK共培养细胞的致敏抗原，含有多肽1和多肽2中的至少一种多肽，所述多肽1和所述多肽2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
在其中一个实施例中，所述致敏抗原同时含有所述多肽1和所述多肽2，所述多肽1与所述多肽2的摩尔比为(0.2～5):1。
在其中一个实施例中，所述致敏抗原的使用浓度是2μM～20μM。
在其中一个实施例中，所述多肽1和所述多肽2上偶联有血蓝蛋白KLH，偶联率不小于90％。
一种DC-CIK共培养细胞的制备方法，包括如下步骤：
收集单个核细胞，分别诱导培养DC细胞和CIK细胞，在DC细胞的诱导培养过程中添加上述任一实施例所述的致敏抗原进行刺激诱导；
将致敏抗原刺激诱导后的DC细胞与CIK细胞共培养。
在其中一个实施例中，共培养时，所述致敏抗原刺激诱导后的DC细胞与所述CIK细胞的数量比例是1:(5～20)。
在其中一个实施例中，所述收集单个核细胞是从新鲜的外周血或脐血中收集。
在其中一个实施例中，所述分别诱导培养DC和CIK细胞、所述致敏抗原进行刺激诱导以及所述共培养包括如下步骤：
按照2～4×106细胞/ml的密度将所述单个核细胞接种在贴壁培养容器中，静置一段时间后，轻轻摇晃培养容器，收集未贴壁的细胞，将贴壁细胞加入DC培养基继续培养，所述DC培养基为AIM-V培养基中添加终体积百分比为2～5％的自体血清、终浓度为20～200ng/ml的GM-CSF以及终浓度为20～200ng/ml的IL-4，未贴壁细胞使用CIK培养基培养进行诱导培养，所述CIK培养基是AIM-V培养基中添加终体积百分比为2～5％的自体血清、终浓度为500～2000ng/ml的IFN-γ以及终浓度为500～2000ng/ml的IL-2；
第2天向CIK细胞培养液中分别添加终浓度为200～1000ng/ml的CD3抗体和CD28抗体，进行培养；
第4天向DC细胞培养液中加入所述致敏抗原，继续培养；
第6天向DC细胞培养液中加入促成熟细胞因子：终浓度为20～200ng/ml的TNF-α、终浓度为5～50ng/ml的IL-1β及终浓度为1～5μg/ml的PEG2，继续诱导培养；
第8天收获成熟的DC细胞和CIK细胞，将DC细胞与CIK细胞共培养。
一种DC-CIK共培养细胞，采用上述任一实施例所述的制备方法制备。
上述DC-CIK共培养细胞可应用在制备用于***的细胞类药物中。
上述DC-CIK共培养细胞通过将分离的单个核细胞分别诱导培养成DC细胞和CIK细胞，其中DC细胞在培养过程中添加自行构建的经过验证在多种肿瘤细胞中都广泛表达的多肽致敏抗原来进行诱导刺激，可以提高对肿瘤杀伤效果。通过该方法培养得到的DC-CIK共培养细胞可以对多种肿瘤细胞均有非常好的杀伤效果，而且培养的DC-CIK细胞活性高，扩增能力强，释放的IFN-γ等细胞因子多，杀伤力强。
进一步，在培养过程中，通过在体外利用多种细胞因子诱导单个核细胞分化成DC与CIK细胞，并添加在多种癌细胞中都高表达的抗原多肽混合物刺激使其杀伤肿瘤细胞效率大大提高；而且此种制备方法制备的DC-CIK共培养细胞可以广泛用于多种癌症的治疗，包括肾癌、***癌、乳腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、结肠癌、卵巢癌、骨癌、肺癌、神经母细胞瘤等，适应面广泛。
在单个核细胞来源上，可以使用新鲜的外周血或脐血，而使用脐血进行培养抗原激活的DC-CIK共培养细胞时，脐血的细胞免疫原性较低，故而可以进行异体回输治疗，这样可以解决部分患者难以制备合格的免疫细胞的难题，便于临床应用。
更进一步，本发明使用自体血清进行细胞诱导和扩增，降低了异体血清可能存在的免疫原性风险，提高了DC-CIK共培养细胞的适用性。
附图说明
图1为收获的DC成熟细胞的镜下形态图(10×10)，可见DC细胞伸出较多伪足，具有毛刺样的树突，如黑色箭头所示。
图2为DC细胞的表型CD80/CD86/CD83/HLA-DR流式柱状图。
图3为CIK细胞的表型。
图4为致敏抗原激活的DC-CIK共培养细胞对HepG2肝癌细胞杀伤效率图；其中横坐标为CIK细胞与HepG2细胞的比例，纵坐标表示杀伤效率。
图5为杀伤HepG2肝癌细胞时的IFN-γ释放图；其中横坐标为CIK细胞与HepG2细胞的比例，纵坐标表示浓度(单位pg/mL)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种DC-CIK共培养细胞的致敏抗原，其含有多肽1和多肽2中的至少一种多肽。多肽1和多肽2都是在多种肿瘤细胞中，如在肾癌、***癌、乳腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、结肠癌、卵巢癌、骨癌、肺癌、神经母细胞瘤等癌细胞中广泛表达的广谱性多肽。多肽1的氨基酸序列为VLFIAKITPNNNGTYACFVSNLAT(SEQ ID NO.1)，多肽2的氨基酸序列为SAENFTVLIKNNIDFPGHNYTTRNILP(SEQ ID NO.2)。
多肽1和多肽2可以采用SPSS(固相多肽合成方法)进行合成，也可以采用基因工程，进行转基因表达。合成或表达纯化的多肽1和多肽2的纯度要求不低于98％。合成后的多肽可以采用SMCC方法偶联血蓝蛋白KLH(多肽1：VLFIAKITPNNNGTYACFVSNLAT-KLH，和多肽2：SAENFTVLIKNNIDFPGHNYTTRNILP-KLH)，偶联率需达到90％以上。
在一个具体示例中，两种多肽按照比例(0.2～5):1混合，如可以按照0.2:1、0.5:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1的比例混合，优选按照1:1的比例混合，形成抗原多肽混合物的致敏抗原。
更具体的，在一个示例中，致敏抗原的使用浓度是2μM～20μM，如2μM、5μM、8μM、9μM、9.5μM、10μM、10.5μM、12μM、15μM、18μM、19μM、或20μM等。
本发明还提供了一种DC-CIK共培养细胞的制备方法，其包括如下步骤：
收集单个核细胞，分别诱导培养DC细胞和CIK细胞，在DC细胞的诱导培养过程中添加上述致敏抗原进行刺激诱导；
将致敏抗原刺激诱导后的DC细胞与CIK细胞共培养。
在一个具体示例中，收集单个核细胞是从新鲜的外周血或脐血中收集。优选的，采集新鲜外周血或脐血，加入抗凝剂，运输过程中避免冷冻或冷藏，采集之后2h内进行细胞分离；在分离时，将外周血或脐血加入50ml人淋巴细胞分离管中，每个分离管加入20ml，设置参数20℃～25℃，升降速分别为9和0，800g～1000g离心20min进行离心；离心结束后用巴氏吸管分别收集上部分的血浆以及中间的白膜层，转移到50ml离心管中；将部分血浆添加到生理盐水里，获得生理盐水与血浆终体积浓度为2％的缓冲液，其余血浆56℃灭活30min，然后离心，设置参数为20℃～25℃，升降速均为9，500g离心5min，离心完后弃沉淀获得自体血清；使用生理盐水与血浆终体积浓度为2％的缓冲液洗涤白膜层细胞，离心设置为20℃～25℃，升降速分别为9和1，300g 5min，离心后去上清，然后重复上步离心步骤继续洗涤一次，得到单个核细胞。
在一个具体示例中，共培养时，致敏抗原刺激诱导后的DC细胞与CIK细胞的数量比例是1:(5～20)，如1:5、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:18、1:19或1:20，优选按照1:10的比例共混。
在一个具体示例中，分别诱导培养DC和CIK细胞、致敏抗原进行刺激诱导以及共培养包括如下步骤：
按照2～4×106细胞/ml的密度将单个核细胞接种在贴壁培养容器中，静置一段时间后，轻轻摇晃培养容器，收集未贴壁的细胞，将贴壁细胞加入DC培养基继续培养，DC培养基为AIM-V培养基中添加终体积百分比为2～5％的自体血清、终浓度为20～200ng/ml的GM-CSF以及终浓度为20～200ng/ml的IL-4，未贴壁细胞使用CIK培养基培养进行诱导培养，CIK培养基是AIM-V培养基中添加终体积百分比为2～5％的自体血清、终浓度为500～2000ng/ml的IFN-γ以及终浓度为500～2000ng/ml的IL-2；
第2天向CIK细胞培养液中分别添加终浓度为200～1000ng/ml的CD3抗体和CD28抗体，进行培养；
第4天向DC细胞培养液中加入致敏抗原，继续培养；
第6天向DC细胞培养液中加入促成熟细胞因子：终浓度为20～200ng/ml的TNF-α、终浓度为5～50ng/ml的IL-1β及终浓度为1～5μg/ml的PEG2，继续诱导培养；
第8天收获成熟的DC细胞和CIK细胞，将DC细胞与CIK细胞共培养。
一般共培养到第14天左右时，可以检测DC-CIK共培养细胞对相关肿瘤细胞的杀伤性。
上述DC-CIK共培养细胞通过将分离的单个核细胞分别诱导培养成DC细胞和CIK细胞，其中DC细胞在培养过程中添加自行构建的经过验证在多种肿瘤细胞中都广泛表达的多肽致敏抗原来进行诱导刺激，可以提高对肿瘤杀伤效果。通过该方法培养得到的DC-CIK共培养细胞可以对多种肿瘤细胞均有非常好的杀伤效果，而且培养的DC-CIK细胞活性高，扩增能力强，释放的IFN-γ等细胞因子多，杀伤力强。该DC-CIK共培养细胞可以广泛用于多种癌症，包括肾癌、***癌、乳腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、结肠癌、卵巢癌、骨癌、肺癌、神经母细胞瘤等，适应面广泛。
以下为具体实施例部分。
一、致敏抗原的多肽链的合成
本实施例的致敏抗原设计两条多肽，分别为多肽1和多肽2，氨基酸序列分别为：
多肽1：VLFIAKITPNNNGTYACFVSNLAT-KLH；
多肽2：SAENFTVLIKNNIDFPGHNYTTRNILP-KLH。
多肽1和多肽2均由上海生物工程有限公司合成，纯度﹥98％；多肽采用SMCC方法偶联KLH，偶联率达到90％以上。
将两种多肽按照比例1:1混合，形成抗原多肽混合物的致敏抗原。
二、DC细胞和CIK细胞的分离、诱导培养和共培养
1.采集新鲜脐血，加入抗凝剂混匀后，将脐血加入50ml人淋巴细胞分离管中，每个分离管加入20ml，设置参数20℃～25℃，升降速分别为9和0，800g～1000g离心20min进行离心；
2.离心结束后用巴氏吸管分别收集上部分的血浆以及中间的白膜层，转移到50ml离心管中；
3.将部分血浆添加到生理盐水里，获得生理盐水与血浆终体积浓度为2％的缓冲液，其余血浆56℃灭活30min，然后离心，设置参数为20℃～25℃，升降速均为9，500g离心5min，离心完后弃沉淀获得自体血清；
4.使用生理盐水与血浆终体积浓度为2％的缓冲液洗涤白膜层细胞，离心设置为20℃～25℃，升降速分别为9和1，300g离心5min，离心后去上清，然后重复上步离心步骤继续洗涤一次；
5.细胞计数，然后按照4×106细胞/ml的密度接种在贴壁培养瓶中，静置2h，然后轻轻摇晃培养瓶，收集未贴壁的细胞，贴壁细胞加入DC培养基继续培养，DC培养基为AIM-V培养基中添加终体积百分比为5％的自体血清、终浓度为100ng/ml的GM-CSF以及终浓度为100ng/ml的IL-4，未贴壁细胞使用CIK培养基进行诱导培养，CIK培养基是AIM-V培养基中添加终体积百分比为5％的自体血清、终浓度为1000ng/ml的IFN-γ以及终浓度为1000ng/ml的IL-2；
6.第2天向CIK培养基中添加500ng/ml的CD3和CD28抗体进行培养；
7.第4天向DC细胞中加入上述多肽混合物的致敏抗原至终浓度为10μM，继续培养；
8.第6天加入促成熟细胞因子100ng/ml的TNF-α、20ng/ml的IL-1β及2μg/ml的PEG2，继续诱导培养；
9.第8天收获成熟的DC细胞，将DC细胞与CIK细胞按照1:10的比例共培养到14天左右，然后检测DC-CIK共培养细胞对相关肿瘤细胞的杀伤性等能力。
结果见图1～图3，在镜下可以看到，DC伸出较多伪足，毛刺样的树突，胞质呈星状凸起，核极不规则，流式表型分析可见CD80和CD86表达超过99％，CD83和HLA-DR表达也在74％以上，说明DC细胞生长状态和表型都正常。CIK细胞流式表型分析可见69％的细胞都共表达CD3和CD56，说明CIK细胞状态正常。
三、检测抗原多肽混合物激活的DC-CIK细胞杀伤肿瘤细胞能力
收获处于生长对数期的HepG2肿瘤细胞，将细胞调整密度为105细胞/ml；取经DC刺激的CIK细胞(即DC-CIK共培养细胞)，计数后调整浓度成2×106细胞/ml；将CIK细胞与HepG2细胞按照比例20万:1万、10万:1万、5万:1万接种至96孔板，混匀后放于37℃培养箱中孵育24h左右；孵育结束后取出96孔板，使用LDH乳酸脱氢酶-细胞毒性检测分析试剂盒检测抗原多肽刺激的DC-CIK细胞对HepG2肿瘤细胞的杀伤作用。
对照组细胞为未加入致敏抗原刺激的DC-CIK共培养细胞。
结果见图4，对比可知，使用了致敏抗原(图中Peptides组)相比较对照组(图中Control)对HepG2肿瘤细胞的杀伤效率显著提高。
四、检测致敏抗原刺激的DC-CIK共培养细胞杀伤肿瘤细胞时IFN-γ细胞因子的释放量
收获处于生长对数期的HepG2肿瘤细胞，将细胞调整密度为105细胞/ml；取经DC刺激的CIK细胞，计数后调整浓度成2×106细胞/ml；将CIK与HepG2细胞按照比例20万:1万、10万:1万、5万:1万接种至96孔板，混匀后放于37℃培养箱中孵育24h左右；孵育结束后取出96孔板，取上清液100μl，使用IFN-γELISA试剂盒按说明书测定其IFN-γ的释放量。对照组为未加入抗原多肽混合物刺激的DC-CIK共培养细胞。
结果见图4，对比可知，使用了致敏抗原(图中Peptides组)相比较对照组(图中Control)IFN-γ的释放量显著提高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司
冠昊生物科技股份有限公司
<120> DC-CIK共培养细胞及其制备方法、致敏抗原和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala
1 5 10 15
Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr
20
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Ala Glu Asn Phe Thr Val Leu Ile Lys Asn Asn Ile Asp Phe Pro
1 5 10 15
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro
20 25

Claims (8)

1.一种DC-CIK共培养细胞的致敏抗原，其特征在于，含有多肽1和多肽2，所述多肽1和所述多肽2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述多肽1与所述多肽2的摩尔比为1:1。
2.如权利要求1所述的DC-CIK共培养细胞的致敏抗原，其特征在于，所述致敏抗原的使用浓度是2μM～20μM。
3.如权利要求1～2中任一项所述的DC-CIK共培养细胞的致敏抗原，其特征在于，所述多肽1和所述多肽2上偶联有血蓝蛋白KLH，偶联率不小于90％。
4.一种DC-CIK共培养细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
收集单个核细胞，分别诱导培养DC细胞和CIK细胞，在DC细胞的诱导培养过程中添加如权利要求1～3中任一项所述的致敏抗原进行刺激诱导；
将致敏抗原刺激诱导后的DC细胞与CIK细胞共培养。
5.如权利要求4所述的DC-CIK共培养细胞的制备方法，其特征在于，共培养时，所述致敏抗原刺激诱导后的DC细胞与所述CIK细胞的数量比例是1:(5～20)。
6.如权利要求4所述的DC-CIK共培养细胞的制备方法，其特征在于，共培养时，所述致敏抗原刺激诱导后的DC细胞与所述CIK细胞的数量比例是1:10。
7.如权利要求4～6中任一项所述的DC-CIK共培养细胞的制备方法，其特征在于，所述收集单个核细胞是从新鲜的外周血或脐血中收集。
8.如权利要求4～6中任一项所述的DC-CIK共培养细胞的制备方法，其特征在于，所述分别诱导培养DC和CIK细胞、所述致敏抗原进行刺激诱导以及所述共培养包括如下步骤：
按照2～4×106细胞/ml的密度将所述单个核细胞接种在贴壁培养容器中，静置一段时间后，轻轻摇晃培养容器，收集未贴壁的细胞，将贴壁细胞加入DC培养基继续培养，所述DC培养基为AIM-V培养基中添加终体积百分比为2～5％的自体血清、终浓度为20～200ng/ml的GM-CSF以及终浓度为20～200ng/ml的IL-4，未贴壁细胞使用CIK培养基培养进行诱导培养，所述CIK培养基是AIM-V培养基中添加终体积百分比为2～5％的自体血清、终浓度为500～2000ng/ml的IFN-γ以及终浓度为500～2000ng/ml的IL-2；
第2天向CIK细胞培养液中分别添加终浓度为200～1000ng/ml的CD3抗体和CD28抗体，进行培养；
第4天向DC细胞培养液中加入所述致敏抗原，继续培养；
第6天向DC细胞培养液中加入促成熟细胞因子：终浓度为20～200ng/ml的TNF-α、终浓度为5～50ng/ml的IL-1β及终浓度为1～5μg/ml的PEG2，继续诱导培养；
第8天收获成熟的DC细胞和CIK细胞，将DC细胞与CIK细胞共培养。
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