TW201934748A - Hpv專一性t細胞之產生技術 - Google Patents

Hpv專一性t細胞之產生技術 Download PDF

Info

Publication number
TW201934748A
TW201934748A TW108103877A TW108103877A TW201934748A TW 201934748 A TW201934748 A TW 201934748A TW 108103877 A TW108103877 A TW 108103877A TW 108103877 A TW108103877 A TW 108103877A TW 201934748 A TW201934748 A TW 201934748A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
hpv
csf
dcs
specific
Prior art date
Application number
TW108103877A
Other languages
English (en)
Inventor
卡洛斯 Ａ 拉莫斯
克里歐納 Ｍ 魯尼
桑德亞 莎瑪
鉉鍾 申
艾力克斯 莎萊爾
Original Assignee
貝勒醫學院
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 貝勒醫學院 filed Critical 貝勒醫學院
Publication of TW201934748A publication Critical patent/TW201934748A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/02—Compounds of the arachidonic acid pathway, e.g. prostaglandins, leukotrienes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/05—Adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/05—Adjuvants
    • C12N2501/051—Lipid A (MPA, MPL)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/05—Adjuvants
    • C12N2501/056—Immunostimulating oligonucleotides, e.g. CpG
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2312—Interleukin-12 (IL-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1107—B cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1121—Dendritic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本揭露內容的具體例係有關於供用於人類乳突病毒感染及其相關疾病的免疫療法之方法與組成物。在特定具體例中，該等方法係有關於產生靶向HPV16及/或HPV18的一或多種抗原之免疫細胞，包括所具有的刺激步驟係採用IL-7與IL-15而非IL-6及/或IL-12之該等方法。其他的特定具體例係在特定細胞之存在下，諸如共刺激細胞與特定的抗原呈現細胞之存在下使用刺激作用。

Description

HPV專一性T細胞之產生技術
相關申請案
本申請案為2017年9月15日提申之國際申請案序號PCT/EP2017/073274之部分延續申請案。國際申請案序號PCT/EP2017/073274主張於2016年9月16日提申之美國臨時專利申請案序號62/395,440及於2016年10月21日提申之美國實用新型申請案序號15/331,659之優先權。美國實用新型申請案序號15/331,659亦主張美國臨時專利申請案序號62/395,440之優先權。此申請案亦主張於2017年9月13日提申之國際申請案序號PCT/US17/51284之優先權。國際申請案序號PCT/US17/51284主張於2016年9月16日提申之美國臨時專利申請案序號62/395,438之優先權。引用的所有申請案在此均併入本案以為參考資料。
關於聯邦政府贊助的研究或開發之聲明
本發明係在國家癌症研究所的P50 CA097007與PO1 CA94237項下的政府贊助下進行。該政府對於本發明擁有一定的權利。
發明領域
技術領域
本揭露內容至少涉及免疫學、細胞生物學、分子生物學及包括癌症醫學在內的醫學領域。
發明背景
背景
人類乳突病毒(HPV)係一種DNA病毒，其導致皮膚角質細胞或黏膜的增殖性感染。HPV的類型超過170種，HPV類型中的一子集係具致癌性，該等類型包括可發展成生殖器贅瘤之高風險的性傳染類型在內，該等生殖器贅瘤例如包括子宮頸上皮內贅瘤(CIN)、外陰上皮內贅瘤(VIN)、陰莖上皮內贅瘤(PIN)及/或肛門上皮內贅瘤(AIN)。當病毒序列被納入宿主細胞的細胞DNA時，則引發HPV誘發型癌症。部分的HPV“早期”基因，諸如E6與E7係作用為致癌基因，而促進腫瘤生長與惡性轉化。
Ramos等人(J Immunother 2013;36:66-76)述及一種供用於刺激周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells)而產生HPV16 E6與E7專一性T細胞之方法。簡言之，該方法包含用樹突細胞刺激周邊血液單核細胞，其中該等細胞係在具有或不具有細胞介素IL-6、IL-7、IL-12及IL-15的組合物之CTL培養基中培養；第二刺激作用係在共培養中增補IL-2，及在IL-15存在下，每星期用加載肽混物(pepmix)的輔助性抗原呈現細胞(如B芽母細胞(B-blasts))進行刺激。該參考文獻教導，為使得T細胞反應可供檢測，從病患樣本增生HPV專一性T細胞時需要細胞介素IL-6、IL-7、IL-12及IL-15的組合物。
本揭露內容紓解了HPV相關疾病治療領域中長期以來的需求，該等疾病至少包括例如該等HPV16與HPV18相關疾病。
發明概要
簡要概要
本揭露內容係針對涉及免疫系統細胞之方法與組成物，該等免疫系統細胞係經修飾而在免疫性上辨識特定標的。在一些具體例中，本揭露內容係有關免疫細胞(包括胞毒型T淋巴細胞(CTL，且亦稱作胞毒型T細胞))之開發，該等免疫細胞係靶向在一個體中引發免疫反應之一生物部分。在特定具體例中，本揭露內容係有關開發靶向一種HPV抗原之胞毒型T細胞，包括HPV疾病相關抗原在內。在一些情況下，所產生的是胞毒型T細胞混合物，而該混合物係靶向一種以上的HPV抗原，及在一些情況包括一種以上的HPV類型之一種以上的抗原在內。
本揭露內容的具體例係有關於對於感染HPV或罹患HPV相關疾病的個體提供療法之方法與組成物，HPV相關疾病例如包括癌症在內。“HPV相關疾病”可為HPV感染所引起或加劇之一疾病；HPV感染係其風險因子之一疾病及/或HPV感染與疾病發病、發展、進程或嚴重性呈現正相關之一疾病。HPV相關疾病可為本發明的方法與組成物對其提供治療效果(如抑制疾病的發展/進程、延遲/阻止疾病的發病、減輕疾病症狀的嚴重性、逆轉疾病症狀及/或提高存活)之一疾病。本技術領域的嫻熟技術人員將明白本發明的方法與組成物之治療效用實質上擴及因感染HPV的細胞數目減少而獲益的任何疾病/病況。在特定具體例中，該揭露內容係有關於供用於授受性細胞免疫療法(adoptive cellular immunotherapy)之方法與組成物，該細胞免疫療法可靶向HPV相關，諸如HPV16相關、HPV18相關、HPV1相關、HPV2相關及/或HPV3相關醫學病況(包括癌症在內)並且對其具有治療性。
就特定態樣而言，本揭露內容係有關開發靶向來自HPV，如HPV16、HPV18、HPV1、HPV2及/或HPV3的抗原之多種T細胞。本揭露內容係在用於產生具有對抗HPV，如HPV16、HPV18、HPV1、HPV2及/或HPV3抗原的專一性之T細胞株之方法上，提供了顯著且非顯而易見之改良。
在本揭露內容的一些具體例中，一個體係需要本揭露內容的方法及/或組成物。在特定具體例中，一個體已暴露於HPV，如HPV16、HPV18、HPV1、HPV2及/或HPV3(該個體可能察覺或未察覺其存在)，或者該個體疑似已暴露於HPV，如HPV16、HPV18、HPV1、HPV2及/或HPV3，或具有暴露之風險。在特定具體例中，該個體已罹患或疑似罹患HPV相關疾病，或具有罹患之風險，諸如HPV16相關、HPV18相關、HPV1相關、HPV2相關及/或HPV3相關疾病，包括癌症在內。
在該方法的一部分之特定具體例中，特定HPV，如HPV16、HPV18、HPV1、HPV2及/或HPV3抗原係以跨越某些抗原的一部分或全部之一或多種肽的形式呈現於抗原呈現細胞(APCs)。可按可稱作肽混物之肽混合物庫的形式，將抗原肽提供予抗原呈現細胞。就本揭露內容的特定態樣而言，將各種肽混物匯集以供暴露於APCs。表現該等抗原的APCs可在特定條件下暴露於周邊血液T細胞而導致對於特定HPV抗原專一性T細胞之刺激作用。
本揭露內容的一些態樣及具體例係有關於產生及/或增生HPV專一性T細胞。
就第一態樣而言，本揭露內容提供一種用於刺激周邊血液細胞，較佳周邊血液T細胞之方法，其中該方法係包含在介白素(IL)-7與IL-15存在下，及至少在一些情況下，在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。根據本文所揭露的各態樣，當在一特定細胞介素“存在下”進行刺激/培養時，在該刺激作用/培養中可能已添加該相關細胞介素(如重組型及/或外源性細胞介素)。當在一特定細胞介素“不存在下”進行刺激/培養時，則尚未在該刺激作用/培養中添加該相關細胞介素(如重組型及/或外源性細胞介素)。
在一些具體例中，提供一種產生供用於人類乳突病毒(HPV)相關疾病的治療性T細胞的方法，該方法包含在介白素IL-7與IL-15中的一或多者存在下，及至少在一些情況下，在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞之步驟，其中該刺激作用產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在一些具體例中，所進行刺激的周邊血液T細胞係從先前的周邊血液細胞刺激作用中獲得。先前的刺激作用可包含在IL-7與IL-15存在下，及至少在一些情況下，在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
因此，在刺激周邊血液T細胞之前，該等方法可進一步包含在IL-7與IL-15存在下，及至少在一些情況下，在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液細胞，以產生周邊血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在一些具體例中，一或多種肽所包含的序列係對應於下列各者的至少部分序列：一或多種HPV16蛋白；一或多種HPV18蛋白；或者一或多種HPV16蛋白及一或多種HPV18蛋白二者。在一些具體例中，一或多種肽所包含的序列係對應於下列各者的至少部分序列：一或多種HPV1蛋白；一或多種HPV2蛋白；一或多種HPV3蛋白；或者一或多種HPV1、HPV2及/或HPV3的蛋白。在一些具體例中，一或多種肽所包含的序列係對應於蛋白E5、E6、E7、L1及L2中的一或多者。在一些具體例中，一或多種肽可為一肽庫，包括E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2肽。
在一些具體例中，該方法可產生對於HPV或對於一種HPV抗原具專一性之免疫細胞，諸如T細胞。在一些具體例中，該方法可增生存在於周邊血液T細胞中之對於HPV或對於至少一種HPV抗原具專一性的T細胞群體。藉由本揭露內容的方法可產生的免疫細胞除了T細胞以外，還包括自然殺手細胞與自然殺手T細胞。
在一些具體例中，抗原呈現細胞例如為活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或PBMC。
在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之周邊血液T細胞的刺激作用係在至少IL-2不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之周邊血液T細胞的刺激作用係在至少IL-4不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之周邊血液T細胞的刺激作用係在至少IL-6不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之周邊血液T細胞的刺激作用係在至少IL-12不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之周邊血液T細胞的刺激作用係在至少IL-21不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之周邊血液T細胞的刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些特定的具體例中，在本發明第一態樣的方法中之細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些具體例中，周邊血液T細胞可存在於周邊血液單核細胞(PBMC)群體中或從其中獲得或分離出來。群體中的PBMC可為非附著型PBMC。抗原呈現細胞例如可為活化型T細胞、樹突細胞、B芽母細胞或PBMC。
就第二態樣而言，本揭露內容提供一種用於刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞的方法，其中該方法包含在IL-7與IL-15存在下，及可選擇性地在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在一些具體例中提供一種產生供用於人類乳突病毒(HPV)相關疾病的治療性T細胞的方法，該方法包括在介白素IL-7與IL-15中的一或多者存在下，及可選擇性地在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞之步驟；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中該刺激作用產生對於一或多種HPV相關疾病具治療性之T細胞。
在一些具體例中，抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或PBMCs。在特定具體例中，抗原呈現細胞係活化型T細胞。
在一些具體例中，共刺激細胞係選自由下列所組成之群組之一或多種細胞類型：CD80+細胞、CD86+細胞、CD83+細胞、4-1BBL+細胞、CD40+細胞、OX40+細胞及其組合。共刺激細胞可為CD80+/CD86+/CD83+/ 4-1BBL+細胞。
在一些具體例中，HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞之刺激作用並非第一刺激步驟。受刺激的T細胞可能是先前刺激作用的產物，先前刺激作用例如使用本揭露內容第一態樣之方法。
在一些具體例中，一或多種肽所包含的序列係對應於下列各者的至少部分序列：一或多種HPV16蛋白；一或多種HPV18蛋白；或者一或多種HPV16蛋白及一或多種HPV18蛋白。在一些具體例中，一或多種肽所包含的序列係對應於下列各者的至少部分序列：一或多種HPV1蛋白；一或多種HPV2蛋白；一或多種HPV3蛋白；或者一或多種HPV1、HPV2及/或HPV3的蛋白。在一些具體例中，一或多種肽所包含的序列係對應於蛋白E5、E6、E7、L1及L2中的一或多者。在一些具體例中，一或多種肽可為一肽庫，包括E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2肽。
在一些具體例中，該方法可產生HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞。在一些具體例中，該方法可增生HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞之群體。
在特定具體例中，HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞之刺激作用包含在IL-7、IL-15存在下，及在一或多種類型的共刺激細胞之存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞。
在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-2不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-4不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-6不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-7不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-12不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-21不存在下進行。在一些具體例中，在本發明第一態樣的方法中之T細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
如本揭露內容第一與第二態樣之方法可為產生供用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法。細胞刺激作用可產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞。
就第三態樣而言，可將第一與第二態樣的方法組合而提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包含：
刺激周邊血液細胞，較佳為周邊血液T細胞，其中該方法包含在介白素(IL)-7與IL-15存在下，及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；
在介白素(IL)-7與IL-15存在下，及可選擇性地在一或多種類型的共刺激細胞之存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
於一些具體例中，在步驟(ii)之前，從(i)所獲得的T細胞可在IL-7與IL-15存在下但並非在共刺激細胞存在下，及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，再度進行刺激。該再刺激作用可根據需要進行一、二、三、四、五或更多回合。
在一些具體例中，(i)中所用的抗原呈現細胞係樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或PBMC。在一些具體例中，(ii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或PBMC。在一些具體例中，(i)中所用的抗原呈現細胞係不同於(ii)中所用的抗原呈現細胞，雖然在特定情況下其等可能相同。在特定具體例中，(ii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞。
在一些具體例中，共刺激細胞係選自由下列所組成之群組之一或多種細胞類型：CD80+細胞、CD86+細胞、CD83+細胞、4-1BBL+細胞、CD40+細胞、OX40+細胞及其組合。共刺激細胞可為CD80+/CD86+/CD83+/ 4-1BBL+細胞。
在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-2不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-4不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-6不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-12不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-21不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些較佳具體例中，步驟(i)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些具體例中，步驟(ii)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
因此，在一些具體例中，提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包含：
(i)刺激周邊血液細胞，其中該方法包含在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；
(ii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(ii)一或多次；及
(iii)在IL-7與IL-15存在下，及可選擇性地在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(ii)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(iii)一或多次。
在一些具體例中，(i)與(ii)中所用的抗原呈現細胞係樹突細胞(DC)B芽母細胞(BB)或PBMCs。在一些具體例中，(iii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或PBMCs。在一些具體例中，(iii)中所用的抗原呈現細胞係不同於(i)及/或(ii)中所用的抗原呈現細胞。在較佳具體例中，(iii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞。
在較佳具體例中，(iii)中的刺激作用係在共刺激細胞存在下進行。在一些具體例中，共刺激細胞係選自由下列所組成之群組之一或多種細胞類型：CD80+細胞、CD86+細胞、CD83+細胞、4-1BBL+細胞、CD40+細胞、OX40+細胞及其組合。共刺激細胞可為CD80+/ CD86+/CD83+/4-1BBL+細胞。
在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-2不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-4不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-6不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-12不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-21不存在下進行。在一些具體例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些較佳具體例中，步驟(i)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。在其他一些具體例中，步驟(i)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12存在下進行。
在一些特定的具體例中，步驟(ii)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。在一些特定的具體例中，步驟(iii)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些特定的具體例中，本揭露內容的方法係用於產生HPV16專一性及/或HPV18專一性T細胞。在一些特定的具體例中，本發明的方法係用於產生HPV16相關疾病專一性及/或HPV18相關疾病專一性T細胞。
在一些具體例中，可自一個體獲得周邊血液T細胞，該個體係已知感染或疑似感染HPV；感染HPV16或HPV18；感染HPV16與HPV18二者；感染HPV1、HPV2及/或HPV3。
在一些具體例中，可自一個體獲得抗原呈現細胞，該個體係已知感染或疑似感染HPV；感染HPV16或HPV18；感染HPV16與HPV18二者；感染HPV1、HPV2及/或HPV3。
在一些具體例中，可在不將該方法所產生的T細胞暴露於活化型B細胞之情況下，進行該方法，該活化型B細胞係先前已暴露於一肽庫。
在一些具體例中，就意欲用所獲得的治療性T細胞進行治療之一個體而言，抗原呈現細胞可為自體或同種異體性。
在一些具體例中，一或多種肽所包含的序列係對應於下列各者的至少部分序列：一或多種HPV16蛋白；一或多種HPV18蛋白；或者一或多種HPV16蛋白及一或多種HPV18蛋白。在一些具體例中，一或多種肽所包含的序列係對應於下列各者的至少部分序列：一或多種HPV1蛋白；一或多種HPV2蛋白；一或多種HPV3蛋白；或者一或多種HPV1、HPV2及/或HPV3的蛋白。在一些具體例中，一或多種肽所包含的序列係對應於來自HPV16、HPV18或HPV16及HPV18的一或多種E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2蛋白。
在本揭露內容的具體例中，該等肽所包含的序列可對應於HPV蛋白E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2中的一或多者。在一些具體例中，該等肽所包含的序列可對應於一或多種HPV蛋白，如在原病毒嵌入後，在感染HPV的一細胞中所表現者(如E1、E2、E3、E4、E5、E6及/或E7)。在一些具體例中，該等肽所包含的序列可對應於一或多種轉形HPV蛋白(如E6及/或E7)。該等肽可對應於該HPV蛋白內所存在的一鄰接胺基酸序列。肽的長度可為至少或不超過8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之長度，或為具有15個胺基酸之長度。該等肽的集合可形成一庫及該庫中的肽可與其他肽在序列上有任何適當量的重疊，包括舉例而言，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個胺基酸。該等肽所包含的序列可對應於：a)HPV18 E6蛋白及/或HPV18 E7蛋白，及/或b)HPV16 E6蛋白及/或HPV16 E7蛋白。
在本揭露內容的具體例中，HPV可為HPV16或HPV18，或為二者。在涉及治療HPV相關疾病之具體例中，該疾病可為癌症而該等肽所包含的一序列可對應於E6與E7中的一或二者。當該HPV相關疾病係一種癌前病灶時，該等肽所包含的序列可對應於E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及L2中的一者、多者或所有者。
藉由本揭露內容的方法所產生之T細胞可予以分離及/或純化，例如從其他細胞中分離/純化出來。
在一些具體例中，對於已暴露於HPV或罹患HPV相關疾病的一個體，提供藉由本揭露內容的方法所產生之一治療有效量的T細胞。就一相關態樣而言，藉由本揭露內容的方法所產生之T細胞係供用於治療HPV相關疾病。就另一相關態樣而言，藉由本揭露內容之方法所產生的T細胞之用途，係供用於製造HPV相關疾病用的一治療藥物。
就本發明的一態樣而言，提供T細胞供用於一種授受性細胞免疫療法的方法中，其中該等T細胞係藉由本申請案中所述之一種用於刺激周邊血液或T細胞的方法或一種產生治療性T細胞的方法獲得，或為藉由該方法可獲得者，或為該方法的產物；授受性細胞免疫療法之方法包含對於該受試者投予T細胞。
就本發明的一態樣而言，所提供的T細胞之用途係製造用於授受性細胞免疫療法的一種方法之一藥物，該授受性細胞免疫療法之方法包含對於該受試者投予T細胞，其中該等T細胞係藉由本申請案中所述之一種用於刺激周邊血液或T細胞的方法或一種產生治療性T細胞的方法獲得，或為藉由該等方法可獲得者，或為該等方法的產物。
就本發明的一態樣而言，提供製備一藥學組成物、藥物或疫苗之一種方法，該方法包含依據本申請案中所述的一種方法刺激周邊血液或T細胞，或者依據本申請案中所述的一種方法產生治療性T細胞，及將所得的細胞與一種藥學上可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑混合。
待治療的疾病可為贅生物(neoplasm)。該贅生物可為癌症。該癌症可為一種HPV陽性癌症，如一種HPV16陽性癌症及/或HPV18陽性癌症。
待治療的該個體可為人類。該個體可為一病患。該個體可能已經暴露於HPV，諸如HPV16、HPV18或HPV16與HPV18二者，或者罹患一種HPV、HPV16及/或HPV18相關疾病。該HPV、HPV16及/或HPV18相關疾病可為贅生物。該贅生物可為癌症。
癌症可為任何一種癌症。在一些具體例中，該癌症係子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、***癌、陰莖癌或口咽癌。在一些具體例中，該癌症可為一種HPV相關癌症。“HPV相關癌症”可為HPV感染所引發或加劇之一癌症；HPV感染係其風險因子之一癌症；及/或HPV感染係與其發病、發展、進程、嚴重性或轉移正相關之一癌症。HPV相關癌症可為本發明的方法與組成物對其提供治療效果之一癌症(如抑制該癌症發展/進程、延遲/阻止該癌症發病、減少/延遲/阻止轉移、降低該癌症症狀的嚴重性、減少癌細胞的數目、縮小腫瘤尺寸及/或提高存活率)。在一些具體例中，該癌症係一種HPV相關的癌、HPV陽性口咽癌、HPV陽性子宮頸癌、HPV陽性肛門癌、HPV陽性陰門癌、鼻咽癌、HPV陽性陰莖癌、任一部位的HPV陽性發育異常或喉部乳突狀瘤病。
該個體或受試者可能已接受、正在接受或將接受一種額外的癌症療法。額外的癌症療法可為外科手術、放射線治療、荷爾蒙療法、化學療法、免疫療法或其組合。
該個體或受試者可能確定患有HPV相關癌症或HPV陽性癌症。該個體可能確定患有HPV16相關癌症或HPV16陽性癌症。該個體可能確定患有HPV18相關癌症或HPV18陽性癌症。該個體或受試者可為任何動物或人類。該個體或受試者較佳為哺乳類動物，更佳為人類。該個體或受試者可為人類以外的哺乳類動物，但更佳為人類。該個體或受試者可為雄性或雌性。該個體或受試者可為一病患。
如本揭露內容之涉及細胞刺激步驟的方法可在活體外或擬體內或進行。“活體外”一詞係意欲涵蓋在實驗室條件或在培養中使用材料、生物物質、細胞及/或組織進行的研究。“擬體內”係指某事存在於或發生於一生物體之外，如在人體或動物身體之外，其可指在從該生物體所取出的組織(如整個器官)或細胞上。
在一具體例中，提供一種用於刺激周邊血液細胞之方法，該方法包含在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種人類乳突病毒(HPV)蛋白的至少部分序列。可從周邊血液細胞的先前刺激作用獲得周邊血液T細胞，諸如其中周邊血液細胞的先前刺激作用包含在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。在特定情況下，在刺激周邊血液T細胞之前，該方法進一步包含在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液細胞，以產生周邊血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在一具體例中，提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包含下列步驟：在IL-7與IL-15中的一或多者存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞，其中該刺激作用產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。可從周邊血液細胞的先前刺激作用獲得周邊血液T細胞，諸如其中周邊血液細胞的先前刺激作用係包括在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。在特定情況下，在刺激周邊血液T細胞之前，該方法進一步包含在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液細胞，以產生周邊血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在本揭露內容所涵蓋方法的具體例中，抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞、B芽母細胞或PBMCs。至少在一些情況下，周邊血液T細胞可存在於周邊血液單核細胞(PBMCs)群體中或從其中獲得或分離出來，而群體中的PBMCs可為非附著型PBMCs。當使用共刺激細胞時，該等共刺激細胞可為CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。
在一特定具體例中，提供一種用於刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞的方法，該方法包含在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在特定具體例中，提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞的方法，該方法所包含之步驟係在IL-7與IL-15中的一或多者存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞，其中該刺激作用產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在一具體例中，提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包含：(i)刺激周邊血液細胞，其中該方法包含在IL-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；及(ii)在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。在特定具體例中，在步驟(ii)之前，可在IL-7與IL-15存在下但並非在共刺激細胞存在下，再度刺激從(i)所獲得的T細胞。
在一具體例中，提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包含：(i)刺激周邊血液細胞，其中該方法包含在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；(ii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(ii)一或多次；及(iii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下，及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(ii)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(iii)一或多次。
在本揭露內容的任一方法中，HPV可為HPV16、HPV18、HPV1、HPV2及HPV3。在本揭露內容的任一方法中可使用之該等肽所包含的序列係對應於E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及L2中的一或多者。該等肽所包含的序列可對應於：a)HPV18E6蛋白及/或HPV18E7蛋白，及/或b)HPV16 E6蛋白及/或HPV16 E7蛋白。在一些情況下，對其提供如本申請案中所述之一有效量的細胞之一個體係罹患一種HPV相關疾病，諸如癌症，及該等肽所包含的序列係對應於E6與E7中的一或二者。就特定態樣而言，該一或多種肽係包含長度至少或不超過8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之肽，尤其該一或多種肽係包含長度為15個胺基酸之肽。在特定具體例中，一或多種肽形成一庫，及該庫中的肽與其他肽在序列上有11個胺基酸之重疊。
在特定具體例中，對於已暴露於HPV或患有HPV相關疾病的一個體提供藉由該方法所產生之一治療有效量的T細胞。在特定具體例中，HPV相關疾病包含贅生物。
對於已暴露於HPV16、HPV18或二者或患有HPV16相關疾病及/或HPV18相關疾病之一個體，可提供藉由本揭露內容的一種方法所產生之一治療有效量的T細胞，該等相關疾病係包括贅生物如癌症。
在特定具體例中，該癌症係子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、***癌、陰莖癌、口咽癌、鼻咽癌、喉部乳突狀瘤病、喉癌、頭頸癌或其任何部位的發育異常。
在一些情況下，已接受及/或將接受本揭露內容的細胞之一個體係已接受、正在接受或將接受一種額外的癌症療法，諸如外科手術、放射線治療、荷爾蒙療法、化學療法、免疫療法或其組合。
就特定態樣而言，已接受及/或將接受本揭露內容的細胞之一個體係經測定患有HPV相關癌症，諸如HPV16相關癌症或HPV18相關癌症。
下列編號段落包含本申請案所揭露之本發明技術特徵的廣泛組合之說明：
1. 一種用於刺激周邊血液細胞之方法，該方法包含在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種人類乳突病毒(HPV)蛋白的至少部分序列。
2.一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包含下列步驟：
在IL-7與IL-15中的一或多者存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，
其中該刺激作用係產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞。
3. 如段落1或2之方法，其中該周邊血液T細胞係從周邊血液細胞的先前刺激作用而獲得。
4. 如段落3之方法，其中周邊血液細胞的先前刺激作用包含在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
5. 如段落1或2之方法，其中在刺激該周邊血液T細胞之前，該方法進一步包含在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液細胞，以產生周邊血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
6.如段落1至7中任一段落之方法，其中該等抗原呈現細胞係樹突細胞、B芽母細胞或PBMCs。
7.如段落1至6中任一段落之方法，其中該等周邊血液T細胞係存在於周邊血液單核細胞(PBMC)群體中或從其中獲得或分離出來。
8.如段落7之方法，其中該群體中的PBMCs係非附著型PBMCs。
9. 一種用於刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞之方法，該方法包含在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
10. 一種產生供用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包含之步驟係在IL-7與IL-15中的一或多者存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞，其中該刺激作用產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
11.如段落9或10之方法，其中該等抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞、B芽母細胞或PBMCs。
12.如段落9至11中任一段落之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。
13. 一種產生供用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包含：
(i)刺激周邊血液細胞，其中該方法包含在IL-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；及
(ii)在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
14.如段落13之方法，其中在步驟(ii)之前，可在IL-7與IL-15存在下但並非在共刺激細胞存在下，再度刺激從(i)所獲得的T細胞。
15.如段落13或14之方法，其中(i)中所用的抗原呈現細胞係樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或PBMCs。
16.如段落13至15中任一段落之方法，其中(ii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)或B芽母細胞(BB)。
17. 如段落13至16中任一段落之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。
18. 提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包含：
(i)刺激周邊血液細胞，其中該方法包含在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；
(ii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(ii)一或多次；及
(iii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(ii)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(iii)一或多次。
19.如段落18之方法，其中(i)與(ii)中所用的抗原呈現細胞係DC、BB或PBMCs。
20.如段落18或19之方法，其中(iii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、DC、BB或PBMCs。
21.如段落18至20中任一段落之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。
22.如段落1至21中任一段落之方法，其中該HPV係HPV16或HPV18。
23.如段落1至22中任一段落之方法，其中該等肽所包含的序列係對應於E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及L2中的一或多者。
24.如段落1至23中任一段落之方法，其中該HPV相關疾病係癌症及該等肽所包含的序列係對應於E6與E7中的一或二者。
25. 如段落1至25中任一段落之方法，其中該等肽所包含的序列係對應於：
a)HPV18 E6蛋白及/或HPV18 E7蛋白，及/或
b)HPV16 E6蛋白及/或HPV16 E7蛋白。
26.如段落1至25中任一段落之方法，其中該一或多種肽係包含長度至少或不超過8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之肽。
27.如段落1至26中任一段落之方法，其中該一或多種肽包含長度為15個胺基酸之肽。
28.如段落1至27中任一段落之方法，其中一或多種肽形成一庫及該庫中的該等肽與其他肽在序列上有11個胺基酸之重疊。
29.如段落1至28中任一段落之方法，其中對於已暴露於HPV或患有HPV相關疾病的一個體提供藉由該方法所產生之一治療有效量的T細胞。
30.如段落29之方法，其中該HPV相關疾病包含贅生物。
31.如段落1至30中任一段落之方法，其中對於已暴露於HPV16、HPV18或二者或患有HPV16相關疾病及/或HPV18相關疾病之一個體，提供藉由該方法所產生之一治療有效量的T細胞。
32.如段落31之方法，其中該HPV16相關疾病及/或HPV18相關疾病包含贅生物。
33.如段落31或32之方法，其中該贅生物係癌症。
34.如段落33之方法，其中該癌症係子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、***癌、陰莖癌、口咽癌、鼻咽癌、喉部乳突狀瘤病、喉癌、頭頸癌或其任何部位的發育異常。
35.如段落33或34之方法，其中該個體已接受、正在接受或將接受一種額外的癌症療法。
36.如段落35之方法，其中該額外的癌症療法係外科手術、放射線治療、荷爾蒙療法、化學療法、免疫療法或其組合。
37.如段落33至36中任一段落之方法，其中該個體係經測定患有HPV相關癌症。
38.如段落33至37中任一段落之方法，其中該個體係經測定患有HPV16相關癌症。
39.如段落33至38中任一段落之方法，其中該個體係經測定患有HPV18相關癌症。
40.供用於授受性細胞免疫療法的一種方法之T細胞，其中該等T細胞係藉由如段落1至39中任一段落之一種用於刺激周邊血液或T細胞的方法或一種產生治療性T細胞的方法獲得，或為藉由該方法可獲得者，或為該方法的產物；其中授受性細胞免疫療法之該方法包含對於該受試者投予T細胞。
41. T細胞在製造用於授受性細胞免疫療法的一種方法之一藥物之用途，該授受性細胞免疫療法之方法包含對於該受試者投予T細胞，其中該等T細胞係藉由如請求項1至39中任一項之一種用於刺激周邊血液或T細胞的方法或一種產生治療性T細胞的方法獲得，或為藉由該方法可獲得者，或為該方法的產物。
42. 一種製備一藥學組成物、藥物或疫苗之方法，該方法包含如請求項1至39中任一項之刺激周邊血液或T細胞或者產生治療性T細胞，及將所得的細胞與一種藥學上可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑混合。
43. 一種治療一受試者的一癌症之方法，該方法包含：
(1)從一受試者分離出T細胞；
(2)藉由一種方法產生或增生人類乳突病毒(HPV)專一性T細胞之群體，該方法包含：在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；及
(3)對於一受試者投予所產生或所增生之T細胞群體。
44. 如段落43之方法，其中在(2)中所刺激的T細胞係從周邊血液細胞或T細胞的先前刺激作用而獲得。
45. 如段落43之方法，其中在刺激該等T細胞之前，該方法包含在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激周邊血液細胞或T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
46. 如段落43之方法，其中在(2)之後及在(3)之前，該方法包含在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(2)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
47. 如段落46之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。
48. 如段落43之方法，其中在(2)之後及在(3)之前，該方法包含(i)在IL-7與IL-15存在下但並非在共刺激細胞存在下，再刺激從(2)所獲得的T細胞，及(ii)在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激在(i)之後所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
49.如段落43之方法，其中該等抗原呈現細胞係樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或周邊血液單核細胞(PBMCs)。
50.如段落43之方法，其中在(1)中係從周邊血液單核細胞(PBMCs)群體中分離出該T細胞。
51.如段落43之方法，其中該癌症係子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、***癌、陰莖癌、口咽癌、鼻咽癌、喉部乳突狀瘤病、喉癌、頭頸癌或其任何部位的發育異常。
52.如段落43之方法，其中該癌症係HPV陽性。
53.如段落43之方法，其中該受試者係經測定患有HPV相關癌症。
54. 一種治療一受試者的一癌症之方法，該方法包含：
(1)從一受試者分離出T細胞；
(2)藉由一種方法產生或增生人類乳突病毒(HPV)專一性T細胞之群體，該方法包含：
(i) 在介白素(IL)-7與IL-15存在下，用抗原呈現細胞刺激該等T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；
(ii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(ii)一或多次；及
(iii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(ii)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(iii)一或多次。
(3)對於一受試者投予所產生或所增生之T細胞群體。
55.如段落54之方法，其中(i)中的T細胞刺激作用係在IL-6及/或IL-12存在下進行。
56.如段落54之方法，其中(i)與(ii)中所用的抗原呈現細胞係樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或周邊血液單核細胞(PBMCs)。
57.如段落54之方法，其中(iii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或周邊血液單核細胞(PBMCs)。
58.如段落54之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。
59. 一種治療一受試者的一癌症之方法，該方法包含：
(1)從一受試者分離出T細胞；
(2)藉由一種方法產生或增生人類乳突病毒(HPV)專一性T細胞之群體，該方法包含：在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；及
(3)對於一受試者投予所產生或所增生之T細胞群體。
60.如段落59之方法，其中該等抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或周邊血液單核細胞(PBMCs)。
61.如段落59之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。
上述內容已相當廣泛地概述了本發明的特徵與技術優點以利於更加理解本發明的下列詳細描述。下文將說明本發明的其他特徵與優點，其等構成本發明的申請專利範圍之主體。本技術領域的嫻熟技術人員應理解，即可採用所揭露的概念與特定具體例作為基礎，供修改或設計用於實現本發明的相同目的之其他結構。本技術領域的嫻熟技術人員亦應理解該等等效結構不偏離如所附申請專利範圍中所闡述之本發明的精神與範圍。當連同考量所附圖式時，從下列說明中將更加理解新穎特徵以及其他目的與優點；就本發明的組織與操作方法而言，據信該等新穎特徵即為本發明的特徵。然而，應當明確地理解，各圖式之提供僅為了說明與敘述之目的而非意欲界定本發明之限制。
本發明包括所述各態樣與較佳特性之組合，除非該組合係顯然不容許或明確表示需避免者。
本申請案中所用各節標題僅為了組織編排之目的而不應解釋為限制所述主題。
現在將藉由實例及參照所附圖式說明本發明的各態樣與各具體例。其他態樣與具體例將為本技術領域的嫻熟技術人員所顯而易見。內文中所提及的所有文獻皆在此併入本案以為參考資料。
在本說明書及包括其後的申請專利範圍在內，除非上下文另有要求，否則應理解“包含(comprise)”一詞及其變體諸如“包含(comprises)”與“包含(comprising)”係意味著包括一所述整數或步驟或者多個整數或步驟之群組，但不排除其他任一整數或步驟或者其他多個整數或步驟之群組。
較佳實施例之詳細說明
本申請案的範圍並非意欲受限於說明書中所述的過程、機器、生產、物質組成物、方式、方法及步驟的特定具體例。
根據長久以來的專利法慣例，本說明書及包含申請專利範圍中所用之“一(a)”與“一(an)”等詞當與包含一詞組合時，係表示“一或多個”。本發明的一些具體例可由本發明的一或多種元件、方法步驟及/或方法所組成，或實質上由本發明的一或多種元件、方法步驟及/或方法所組成。相對於本申請案中所述之其他任何方法或組成物而言，預期本申請案中所述之任一方法或組成物皆可實施。
本揭露內容係有關產生治療性T細胞及供用於需要HPV專一性T細胞如HPV16及/或HPV18專一性T細胞之個體，包括用於治療HPV感染與HPV相關醫學病況。在特定具體例中，該方法與組成物係適用於治療與HPV感染間接或直接相關之贅生物，及該等贅生物可為良性或惡性。在經特徵化已知賦予高致癌風險之13至18種HPV病毒株當中，有12種病毒株係屬於HPV物種7(HPV-18、-39、-45、-59、-68)與物種9(HPV-16、-31、-33、-35、-52、-58、-67)。HPV第6型與第11型係引發喉部乳頭狀瘤病。
I.HPV 抗原與肽混物(Pepmixes) 之產生
本揭露內容的方法係使用對於T細胞呈現肽混合物之抗原呈現細胞。該等“加載型”APCs之產生係在暴露於周邊血液T細胞以供刺激周邊血液T細胞之前，及該等加載型APCs可由或不由進行周邊血液T細胞的刺激步驟之該個體或實體來產生。因而，在一些具體例中，對於APCs提供一有效量的肽庫作為最終產生治療性CTLs之方法的一部分。在本揭露內容的方法中，在一刺激步驟之前，APCs係暴露於一足量的肽庫。在特定情況下，該庫係包含跨越該同一抗原的一部分或全部之肽的混合物(“肽混物”)；雖然在一些情況下，該庫係包含跨越一或多種抗原的一部分或全部之肽混物，而該一或多種抗原可能來自或並非來自同一HPV。在特定具體例中，用於APCs的肽並非天然的，及其等可能藉由或並非藉由化學方式合成或藉由重組方式產生。
當所使用之庫係來自一或多種HPV抗原的肽混合物時，該等不同的肽可來自一特定蛋白的任一部分，但在特定情況下，該等肽集體跨越該蛋白的大部分或全部長度，其中該等肽的序列係至少部分重疊以利於覆蓋該特定抗原的整個所欲區域。在一些情況下，該等肽係跨越該等肽所對應個別抗原的一或多種已知表位或域之長度。特定區域可由跨越該區域長度的該等肽所覆蓋，該區域例如包括諸如一個N端域、C端域、細胞外域或細胞內域之一區域。
衍生出該等肽之抗原可為任一HPV類型的抗原，但在特定具體例中，該等抗原係得以促成將胞毒型T細胞導向與HPV感染相關聯的贅生物，包括癌症在內。在特定具體例中，該等肽係衍生自包括HPV16及/或HPV18在內的至少一種HPV類型之一或多種抗原的至少一部份，或者具有與其對應之序列。例如，在晚期子宮頸癌中，HPV病毒嵌入腫瘤細胞基因體中及失去E6與E7以外的其他所有基因，因此在一些情況係靶向該等抗原。在治療諸如在病毒嵌入前的早期階段癌症之具體例中，所使用的肽可來自E6與E7以外的抗原，例如包括E5及L1與L2。然而，鑑於高風險HPV類型的二種主要致癌蛋白係E6與E7，在特定具體例中，該等肽的序列係從來自任何HPV的E6及/或E7獲得，尤其來自HPV16及/或HPV18。在本揭露內容的方法中可使用來自抗原E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2中的任一者之肽。
在一些情況下，肽混物庫所包括的肽係對應於來自單一HPV病毒類型之一或多種抗原，而該等肽的序列可能覆蓋或不覆蓋所論及的整個抗原。在其他情況下，肽混物庫所包括的肽係對應於來自一種以上的HPV病毒之一或多種抗原，而該等肽的序列可能覆蓋或不覆蓋所論及的整個抗原。肽混物可富集或不富集對應於一或多種特定抗原的一或多種特定區域之肽，或者可富集或不富集對應於一或多種特定抗原的整體之肽。
本揭露內容中所採用的肽混物例如可來自市售的肽庫或者可合成產生。可用的庫之實例包括該等來自JPT技術公司(美國維吉尼亞州史普林菲爾德(Springfield))或美天旎生物科技(Miltenyi Biotec)公司(美國加州奧本(Auburn))者。基於例如HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6及HPV18E7的已知序列，本技術領域的嫻熟技術人員將具有充分資訊而能產生對應於其等個別例示性序列之肽。可在美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)之GenBank®資料庫，按GenBank®登錄序號AIQ82776.1 GI:688010703取得HPV16 E6蛋白序列之一實例。按GenBank®登錄序號AIQ82814.1 GI:688010789取得HPV16 E7蛋白序列之一實例。按GenBank®登錄序號AGU90423.1 GI:537801975取得HPV18 E6蛋白序列之一實例。按GenBank®登錄序號AGU90424.1 GI:537801976取得HPV18 E7蛋白序列之一實例。
在特定具體例中，一庫係由對應於其等個別抗原之特定長度的肽所組成，雖然在一些情況下，一庫係由具有二或多種不同長度的肽混合物所組成。該等肽可具有一特定長度及其等的序列可有一特定量的重疊，雖然在一些庫中的重疊長度可能有所變化。在特定具體例中，該等肽的長度係例如至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個或更多個胺基酸。在特定具體例中，該等肽之間的重疊長度係例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個胺基酸。在特定具體例中，該等肽的長度係15個胺基酸而彼此間的重疊為11個胺基酸。由不同肽組成的混合物可按任何比例包括不同的肽，儘管在一些具體例中，混合物中所存在的各特定肽之數目係實質上與另一特定肽相同。雖然該等肽在序列上對於一抗原的覆蓋範圍可能是隨機及實質上甚至覆蓋一抗原的一特定區域，在一些具體例中，可富集一庫中的一或多種特定肽，例如諸如已知編碼一表位或其一部分之一或多種肽。
在特定具體例中，用於一特定抗原蛋白之肽混物係例如包含長度為8至10個胺基酸之所有可能的HLA第I類表位。在特定具體例中，使用更長的肽以覆蓋一特定肽之所有第II類表位。就特定態樣而言，該等肽的長度最多為30個胺基酸及重疊為25個胺基酸。
II. 產生與使用治療性T 細胞之方法
A. 產生治療性T 細胞
就特定態樣而言，本揭露內容係有關研發靶向來自至少一種HPV病毒的一或多種抗原之免疫細胞，諸如胞毒型T細胞。
本申請案中所揭露之方法可涉及刺激及/或增生免疫細胞。該等方法可涉及刺激及/或增生周邊血液細胞，諸如周邊血液單核細胞。該等方法可涉及從免疫細胞(如PBMCs)的一群體內增生一免疫細胞群體(如T細胞群體)。例如，可藉由刺激PBMCs群體內的T細胞，而從一PBMCs群體內增生T細胞群體。因此，在本申請案所揭露方法之具體例中，T細胞的刺激及/或增生作用可涉及刺激一PBMCs群體。在一些具體例中，可藉由刺激腫瘤浸潤型淋巴細胞群體內的T細胞，而從一腫瘤浸潤型淋巴細胞群體內增生T細胞群體。因此，在本申請案所揭露方法之具體例中，T細胞的刺激及/或增生作用可涉及刺激一腫瘤浸潤型淋巴細胞群體。在一些具體例中，可從自一血液樣本、一PBMCs群體或從一腫瘤浸潤型淋巴細胞群體所獲得之T細胞群體(如具有異質專一性的T細胞群體)內，增生T細胞群體。該刺激/增生作用可能導致HPV專一性免疫細胞(如HPV專一性T細胞，諸如HPV專一性CTLs)數目之增加，及/或在刺激/增生作用結束時導致該等細胞在細胞群體中的比例增加。該等方法可涉及T細胞之刺激及/或增生。可能從待治療的病患(亦即自體性細胞)或從另一個體(亦即同種異體細胞)獲得該等細胞。在特定具體例中，該等方法涉及所分離的免疫細胞之刺激及/或增生。亦即，可在實質上不含有非免疫細胞，諸如紅血球之一細胞群體上進行特定方法。在一些情況下，該等免疫細胞係所分離的PBMCs或所分離的T細胞。可從一血液樣本中獲得該等細胞，諸如從該病患或個體所取得的一血液樣本。可從組織樣本或生物檢體取得該等細胞。可從一腫瘤獲得該等細胞(如腫瘤浸潤型淋巴細胞)。本申請案中所揭露的特定方法係涉及從該病患所取得的一樣本獲得PBMCs及/或T細胞之一步驟。該等方法的特定具體例並未涉及從該病患或個體取得一血液樣本或細胞之步驟，而是在先前已取得的一樣本或細胞上進行。該方法可涉及樣本之處理，諸如富集該樣本中的免疫細胞，諸如PBMCs及/或T細胞。該等方法可涉及移除或實質上減少一樣本中之紅血球、血小板、血清及/或血漿的量。其可產生實質上不含有其他細胞，諸如紅血球之一免疫細胞群體。本申請案中所揭露之方法可在分離的免疫細胞上進行，或在除了其他細胞之外尚含有免疫細胞的一樣本上進行。
在產生T細胞之方法中，起初可用APCs刺激周邊血液T細胞，該等抗原呈現細胞已暴露於跨越至少一種HPV抗原的一部分或全部之一或多種肽。可提供位於一庫的肽混合物中之抗原肽給APCs，及可提供多種肽混物庫給相同的APCs集合。在一些具體例中，該集合係包括免疫顯性與亞顯性抗原二者。
在本揭露內容的具體例中，產生治療性T細胞及提供予一個體，該個體係感染HPV或具有罹患HPV相關醫學病況之風險，而該HPV相關醫學病況係間接或直接由HPV感染引起。在產生治療性T細胞之方法中，周邊血液T細胞係在特定條件下與APCs混合，該等APCs係加載跨越一或多種抗原的一部分或全部之一肽庫，一或多種抗原例如包括HPV16及/或HPV18抗原的一部分或全部，包括E6及/或E7。在特定具體例中，就刺激步驟而言，該等T細胞係位於一PBMCs群體內。
在一些具體例中，在特定步驟中所用的APCs可為樹突細胞(DCs)。用於產生DCs之方法係技術領域中眾所周知，如見上文所提及之Ramos等人乙文。可藉由CD14選擇作用及培養於DC培養基與2 mM丙胺醯基-麩醯胺酸以及800單位/毫升的顆粒性白血球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及1000單位/毫升的介白素4(IL-4)中達5天，而從PBMCs分離出單核細胞。可在第3天補充GM-CSF與IL-4。在第5天，DCs係在具有10奈克/毫升的介白素-1β(IL-1β)、100奈克/毫升的介白素6(IL-6)、10奈克/毫升的***素E2、800單位/毫升的GM-CSF及1000單位/毫升的IL-4之DC培養基中成熟。可藉由流動式細胞測量術檢測CD80、CD83、CD86及HLA-DR的上調作用而評估DC成熟程度。
在一些具體例中，在特定步驟中所用的APCs係活化型T細胞。活化型T細胞可為多株T細胞(T-APCs)，其係使用從靜脈切開放血術所得血液所分離出之一部分的自體性PBMC而產生。可藉由在塗覆抗CD3與抗CD28抗體的細胞培養皿中培養而活化該等細胞。然後在IL-2存在下培養2星期而增生該等細胞。可將所增生的T-APC冷凍保存以備後用。在使用T-APC進行刺激作用(如進行第三循環的刺激作用及可選擇性地進行後續刺激作用)之2至3天前，將冷凍保存的細胞解凍及在經抗CD3與抗CD28抗體塗覆的細胞培養皿中再度進行刺激作用。在進行刺激作用當天，收穫T-APC細胞及用HPV E6/E7肽進行脈衝，接著按1:1的比例添加至持續培養中之經HPV刺激的T細胞。
在一些具體例中，在特定步驟及/或方法中所用的APCs係B芽母細胞(BBs)。B芽母細胞例如可從病患的自體性PBMC產生。藉由與經輻射照射之同種異體的CD40L表現型MRC5上皮細胞株共同培養而活化PBMCs當中的B淋巴細胞，及在含有100單位/毫升的IL-4與1微克/毫升的環孢素A之培養基中進行增生。
在一些具體例中提供一種產生T細胞的方法，該T細胞係靶向來自HPV16與HPV18中之一或二者的至少一抗原，及其一般藉由使多種APCs與多種PBMCs接觸而進行，該等APCs係加載來自對應於一或多種特定HPV16及/或HPV18病毒抗原的一肽庫之肽。在特定具體例中，藉由該二細胞群體之接觸而得以增生T細胞。在特定具體例中，該刺激步驟係在一或多種特定的細胞介素存在下進行，該等細胞介素可為哺乳類動物(如鼠類、人類)或人類細胞介素。在特定具體例中，該一或多種細胞介素係IL-7與IL-15；雖然在任擇的具體例中，細胞介素係選自由IL-15、IL-7、IL-21、IL-12、IL-6、IL-4及其組合所組成之群組。在特定具體例中，該等方法的一或多個步驟並非在IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12及/或IL-21存在下進行，雖然任擇地可使用IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12及/或IL-21。當提及存在一細胞介素時係指存在外源添加的細胞介素，亦即排除存在於細胞培養中或由所培養細胞分泌的任何細胞介素。在一些具體例中，該等肽係進一步界定為在序列中重疊而跨越一種HPV抗原的一部分或全部之肽。例如，就特定態樣而言，該等肽係重疊至少10個胺基酸，及特別是重疊11個胺基酸，及在一些具體例中，該等肽的長度係至少12個胺基酸或更長，及特別是15個胺基酸之長度。
納入細胞培養中之一特定細胞介素的一適當量或適當濃度之選擇係於本領域人員或普通技術人員的能力範圍內。舉例而言，下列係特定介白素之清單及可使用的適當濃度之實例：
介白素6(IL-6)：50至150奈克/毫升，約50奈克/毫升、60奈克/毫升、70奈克/毫升、80奈克/毫升、90奈克/毫升、100奈克/毫升、110奈克/毫升、120奈克/毫升、130奈克/毫升、140奈克/毫升或150奈克/毫升中之一者；
介白素7(IL-7)：5至15奈克/毫升，約5奈克/毫升、6奈克/毫升、7奈克/毫升、8奈克/毫升、9奈克/毫升、10奈克/毫升、11奈克/毫升、12奈克/毫升、13奈克/毫升、14奈克/毫升或15奈克/毫升中之一者；
介白素12(IL-12)：5至15奈克/毫升，約5奈克/毫升、6奈克/毫升、7奈克/毫升、8奈克/毫升、9奈克/毫升、10奈克/毫升、11奈克/毫升、12奈克/毫升、13奈克/毫升、14奈克/毫升或15奈克/毫升中之一者；
介白素15(IL-15)：5至15奈克/毫升，約5奈克/毫升、6奈克/毫升、7奈克/毫升、8奈克/毫升、9奈克/毫升、10奈克/毫升、11奈克/毫升、12奈克/毫升、13奈克/毫升、14奈克/毫升或15奈克/毫升中之一者。
下列之表1係提供本揭露內容的特定方法具體例之實例。
表1 ：一方法之元件實例
因而，在特定具體例中，T細胞群體(其中該群體所包含者可實質上皆為T細胞或其中T細胞群體係位於另一細胞群體當中，諸如位於PBMC當中)係暴露於一APCs群體以產生具特定特徵之T細胞株，該等特徵係至少包括：a)靶向HPV16 E6及/或E7之有效性及/或靶向HPV18 E6及/或E7之有效性；b)多株性；c)TH1型偏移；或d)其等之組合。所生成的T細胞株可進行生產使其有效靶向HPV物種7(HPV-18、-39、-45、-59、-68)與物種9(HPV-16、-31、-33、-35、-52、-58、-67)，及第6與第11類型，而這可為導向下列抗原中的任一或多者之肽混物之結果：E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2。
在一些情況下，可進行一次以上的T細胞刺激，而該細胞群體在不同的刺激步驟中所暴露之條件可能相同或不同。在特定具體例中，第一刺激作用的條件係不同於包括第二刺激作用及/或第三刺激作用在內的後續刺激作用。在特定具體例中，該方法的第一刺激步驟所使用的APCs係加載肽混物的DCs或加載肽混物的PBMCs，及使用IL-7與IL-15。該刺激步驟可選擇性地重複進行一或多次。
在該等方法的特定具體例中，在周邊血液T細胞(或PBMCs)最初暴露於肽混物或APCs之後的第8天至第10天之間，可在第8天、第9天或第10天但不得更遲，進行PBMCs的再刺激作用，而後續的再刺激作用可在第15天、第16天或第17天進行。
在第一刺激步驟(包括可選擇性地重複進行第一刺激步驟在內)之後的一個刺激步驟中，在第一刺激作用後獲得之所生成的T細胞(及其等可能位於一異質的細胞群體當中)係暴露於加載肽混物的DCs或加載肽混物的PBMCs及/或自體活化型T細胞。在第一與第二刺激步驟之後的一刺激作用中，在第二刺激作用或後續刺激作用之後所獲得的T細胞(及其等可能位於一異質的細胞群體當中)係暴露於肽混物-自體活化型T細胞。可用於任一刺激步驟中之共刺激細胞至少包括表現CD86、4-1BB、CD83、CD40、OX40及/或CD80之細胞。在特定情況下，共刺激細胞可為K562細胞。
在一些具體例中，在該方法的步驟期間將培養中的細胞予以修飾。在特定具體例中，細胞係經修飾而含有表現一基因產物之多核苷酸，該基因產物使得細胞在一特定目的或功能上具有效用或更有效用，例如諸如有效或更有效靶向一特定標的及/或提高T細胞媒介型細胞毒性之功能，及/或經修飾而對抗腫瘤抗原專一性細胞之免疫性。
在一些具體例中，該等細胞經修飾而表現一特定的非天然受體使T細胞得以有效或更有效地靶向所欲的標的細胞，諸如表現一特定抗原者。該等細胞可經修飾而表現一嵌合抗原受體(CAR)、一αßT細胞受體等等。在該方法期間的特定時間點，該等細胞可經修飾而表現一表現載體(可為病毒型(包括逆轉錄病毒型、慢病毒型、腺病毒型、腺相關病毒型等等)或非病毒型)，諸如例如在培養第2天與第5天之間將載體導入。在一些具體例中，該等細胞係在各次刺激作用後的約3天之內暴露於表現載體，但在該等情況下，修飾作用係發生在分化程度較高且長期潛力較低的T細胞(就特定情況而言，其係合乎需求的)。
在特定具體例中，該等細胞係經修飾而表現靶向一癌症抗原之CAR，諸如EphA2、HER2、GD2、第3型磷脂肌醇蛋白聚醣、5T4、8H9、αvβ6整合蛋白(integrin)、B細胞成熟抗原(BCMA)B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ輕鏈、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎兒AchR、葉酸鹽受體α、GD2、GD3、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2、IL11Ra、IL13Ra2、KDR、l、路易士(Lewis)-Y、MCSP、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配位體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSC1、PSMA、ROR1、Sp17、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、胚性癌抗原、HMW-MAA、VEGF受體，及/或存在於腫瘤的細胞外基質之其他例示性抗原，諸如纖維接合素的癌胚胎變異體、細胞黏合素(tenascin)或腫瘤的壞死區域與其他腫瘤相關抗原，或者例如經由腫瘤的基因體分析及/或差異表現研究所辨識出之可靶向的突變作用。
在一些具體例中，該等細胞係經修飾而對抗腫瘤抗原專一性細胞之免疫性，如藉由轉形生長因子β (TGF-β)所媒介者。例如，該等細胞可經修飾而表現TGF-β的一顯性陰性受體(DNRII)，如Foster等人所述(Antitumor activity of EBV-specific T lymphocytes transduced with a dominant negative TGF-beta receptor.J Immunother . 2008;31:500-505，其在此併入本案以為參考資料)。其可包含使用編碼一顯性陰性TGF-β類型II受體(DNRII)的一種逆轉錄病毒表現載體來轉染該等細胞，其中該顯性陰性TGF-β類型II受體係藉由移除免疫原性血球凝集素標籤而進行修飾。在分泌TGF-β的腫瘤存在下，已顯示該等經修飾的T細胞具有優於未經修飾的T細胞之功能優點，包括增強的抗腫瘤活性(上文中之Foster等人乙文)。
相較於先前技術之方法，如本發明的方法可增進病毒專一性T細胞群體之增生率。可藉由嫻熟技術人員眾所周知的方法分析T細胞群體之增生率。該等方法包括在一或多個時間點測量T細胞數目。例如，可在如本發明的一種方法進行之後測量T細胞數目及與該方法開始時的T細胞數目相比較；然後可計算T細胞數目的增生倍數。
可藉由分析T細胞在一段時間內的細胞***而測定增生率。如Fulcher與Wong，Immunol Cell Biol (1999) 77(6): 559-564中所述，例如可藉由活體外分析3 氫-胸腺嘧啶核苷之納入或藉由CFSE稀釋測定法，分析一特定的T細胞群體之細胞***，該文獻在此完整地併入本案以為參考資料。
可藉由進行如本發明的一種方法，及將該方法中的T細胞增生與一種可相比的對照方法相比較，而測定如本發明的方法在增生率上之改良，如按照Ramos等人之方法(J Immunother 2013;36:66-76)。
在一些具體例中，如本發明的一種方法中之T細胞群體的增生率係下列之至少一者：一種可相比的對照方法之增生率的1.001倍、1.002倍、1.003倍、1.004倍、1.005倍、1.006倍、1.007倍、1.008倍、1.009倍、1.01倍、1.02倍、1.03倍、1.04倍、1.05倍、1.06倍、1.07倍、1.08倍、1.09倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2倍。
該增生率可為病毒專一性T細胞群體的增生率，或為總T細胞群體的增生率。
如本發明的方法所產生/所增生之病毒專一性T細胞至少可保有與先前技術的方法所產生/所增生之病毒專一性T細胞相同的功能特性。亦即，加速的增生率並未對於所增生的T細胞之功能特性產生負面影響。
例如，在產生/增生病毒專一性T細胞的群體之該等方法的具體例中，該等T細胞對於受感染或包含/表現一病毒肽的細胞所展現之細胞毒性與依據先前技術方法所增生的病毒專一性T細胞相近。
例如可在T細胞係對於該病毒肽具專一性之不同的效應子(亦即T細胞)相對於標的(亦即APC)之比例下，藉由將所增生的T細胞群體與呈現一病毒肽的抗APCs一起培養且測量該等APCs的專一性溶解作用而分析所增生的T細胞之細胞毒性。例如，可在效應子相對於標的之不同比例，藉由測量HPV轉形的LCL細胞之專一性溶解作用而分析HPV專一性CTL群體的細胞毒性。
B. 使用治療性T 細胞
在特定具體例中，對於有需要的一個體提供由本揭露內容的方法所產生之細胞以治療一醫學病況，其中該醫學病況包括由病毒感染所引起者，或在一醫學病況尚無可檢測或已顯出的症狀時靶向一病毒感染。如本申請案中所用之“治療(treatment)”或“治療(treating)”包括對於一疾病或病理狀況的症狀或病理之任何有益或所欲的效應，及可包括在所治療的疾病或病況，如癌症之一或多種可測量的標記之甚至最微小的下降。治療可選擇性地涉及減輕或改善該疾病或病況的症狀，或延遲該疾病或病況的進程。“治療”不一定表示完全根除或治癒該疾病或病況或其相關症狀。
在本揭露內容所涵蓋的方法中，使用治療性T細胞來治療由單一非HPV病毒所直接或間接引發的病毒相關疾病，或者在其他情況下提供予對於單一非HPV病毒呈現血清陽性之一個體。在其他情況下，使用治療性T細胞來治療由一種以上的病毒所直接或間接引發的病毒相關疾病，或者在其他情況下提供予對於一種以上的病毒呈現血清陽性之一個體。在治療性T細胞的集合中，各T細胞及其子代僅對於來自一病毒的一抗原上之一肽具專一性，而在產生治療性T細胞的集合之際，即增生了集體具有多重專一性之T細胞殖株群體，例如諸如對於各病毒抗原中的多個表位具有專一性。
在本揭露內容的至少一些方法中，對於一個體，例如已知罹患或疑似罹患或易於罹患HPV16及/或HPV18相關疾病之一個體，投予一治療有效量之所產生的CTLs。在特定具體例中，該等細胞例如藉由注射投予，諸如靜脈內、肌內、皮內、皮下、腹膜內注射等等。在一些具體例中，將CTLs進一步界定為多株CD4+與CD8+ CTLs。PBMCs對於該個體而言可為同種異體性或為自體性。
在特定情況下，本揭露內容的細胞係用於治療贅生物，而該贅生物可為良性、惡性或為一種可轉成癌症的癌前病灶。因而，可用本揭露內容的方法所產生之細胞治療之一個體可能處於癌前病灶期及/或處於該病灶轉為惡性之後。該個體可能患有早期或晚期癌症，而嫻熟技術人員明瞭，可針對癌症的不同期程，諸如藉由使用來自早期癌症相對於晚期癌症相關抗原之APCs的肽來量身訂製產生細胞的方法。在特定具體例中，該癌症可為原發性、轉移性、復發性、難治性癌症等。
在特定情況下，藉由本揭露內容的方法所產生之細胞係用於治療可轉為癌症的癌前病灶，例如諸如子宮頸、陰門、***、陰莖、喉、口咽、肛門及其他上呼吸消化道區之癌前病灶。因而，可用本揭露內容的方法所產生之細胞治療之一個體可能處於癌前病灶期及/或處於該病灶轉為惡性之後。可用藉由本揭露內容的方法所產生之細胞治療之HPV相關醫學病況至少包括生殖器區的發育異常、子宮頸上皮內贅瘤、外陰上皮內贅瘤、陰莖上皮內贅瘤、肛門上皮內贅瘤、子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、***癌、陰莖癌、生殖器癌、口咽癌、鼻咽癌、口腔乳突狀瘤病及其他上呼吸消化道病灶。
在一些情況下，在投予該等細胞之前可確定與一癌症相關聯的血清型；雖然在一些情況下並未確定血清型。在特定具體例中，HPV16專一性或HPV18專一性細胞分別對於HPV16陽性或HPV18陽性腫瘤具有活性；雖然在一些情況下，不同的HPV血清型之間具有交叉反應性。可能得知或不得知交叉反應的能力，及在特定情況下，例如對於感染HPV16或患有HPV16相關醫學病況的一個體投予HPV18專一性T細胞，反之亦然。在該等情況下，可能在未知該個體是否具一特定血清型時即用該血清型專一性細胞治療該個體，並且因為交叉反應性之故，該等細胞仍為治療上有效的。
在該方法的刺激步驟中之APCs係同時加載HPV16與HPV18肽混物之情況下，投予經由該等APCs所增生的T細胞之結果係取決於該個體是否曾經暴露於所探討的病毒。例如，若一個體感染HPV18而非HPV16，則僅HPV18專一性T細胞會發生反應，這是因為感染作用最初曾刺激T細胞對於HPV 18產生反應之故。該等T細胞將在該個體中增生然後成為記憶T細胞，及其數目將高於例如未曾被活化的HPV16專一性T細胞。
所治療的該個體可能已知患有癌症、疑似患有癌症或具有罹患癌症之風險(諸如個人或家族病史；性行為活躍，包括性行為雜亂；及/或在遺傳上具有易罹病傾向，包括具有一或多種專一性標記)。所治療的一個體體內可能已有HPV病毒存在但尚未出現HPV相關醫學病況的任何不良症狀。該個體可能具有一良性或惡性贅生物。該個體可能患有早期或晚期癌症，而嫻熟技術人員明瞭可針對癌症的不同期程，諸如藉由使用來自早期癌症相對於晚期癌症相關抗原之APCs的肽來量身訂製產生細胞的方法。在特定具體例中，HPV相關疾病係口腔或生殖器區的惡性癌症。在特定具體例中，該癌症可為原發性、轉移性、復發性、難治性癌症等。該個體可能由於任何種類的性行為或任何種類的親密肢體接觸而感染HPV16及/或HPV18。
本揭露內容所涵蓋的細胞可用於治療任一期程的HPV感染。使用本揭露內容的方法所治療之確定患有HPV相關癌症的個體包括患有原位(第0期)、第I期、第II期、第III期或第IV期癌(其可藉由MRI、CT掃描、PET掃描等確定)的個體。此外，亦可治療具有癌前病灶(發育異常)之個體。
在一些具體例中，對於有需要的一個體投予藉由本揭露內容的方法所產生之細胞一或多次。不同的投予作用之間的時間長度可為任何適宜的期間，包括下列順序：1至7天、1至4星期、1至12個月或1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更多年。在一些情況下，可在約一年的期間內進行多次輸注。在對於該個體進行一次以上的細胞投予之情況下，該等細胞所靶向的抗原可能與先前投予作用中所用細胞所靶向之抗原相同或不同。例如，在首次投予細胞時，該等細胞可靶向HPV18 E6，而在另一次投予細胞時，該等細胞則靶向HPV18 E7，或反之亦然。例如，當癌症變成難治性癌症時可能需要額外的投予作用。額外的刺激作用可能與一或多種其他類型的癌症治療合併使用。
在一些情況下，藉由本技術領域中的任何適宜方式來可選擇性地檢測一個體是否感染HPV。因為無法在細胞培養中培養HPV，故可採用HPV感染診斷方法，諸如使用PCR進行DNA測試、南方印漬雜合法及/或原位雜合法，及該等方法例如可與或不與***鏡檢查；醋酸檢測；生物檢體；身體檢查；及/或抹片檢查合併使用。
在特定具體例中，對於一名男性個體提供一有效量之藉由本揭露內容的方法所產生之細胞以靶向其所感染的HPV，及在該情況下，降低該個體日後經由性行為傳染他人諸如傳染一女性個體之機率。該男性個體在暴露於本揭露內容的方法之細胞前可能已確定或未確定感染HPV。在一些情況下，若顯示一個體已感染致癌性HPV，則值得用該等細胞進行治療以消弭其風險。若該等細胞具有效用，其等亦降低這名個體將病毒傳染給其伴侶之機率。
在特定具體例中，該個體的免疫功能低下(其例如可定義為一個體的免疫系統抵抗感染性疾病或癌症之能力受損或完全缺乏)。在特定具體例中，該免疫功能低下的個體例如曾接受幹細胞移植(包括造血幹細胞移植在內)；曾接受器官移植及/或曾接受一或多種癌症治療，包括化學療法或放射線治療在內。在一些情況下，該個體罹患或遺傳得到免疫不全症。在一些具體例中，對於因其等之疾病及/或因疾病的治療而免疫功能低下的該等個體，提供本揭露內容的方法及/或組成物。
醫療方法可涉及藉由一種在人類受試者中改善、治療或預防一惡性腫瘤(malignancy)之方法而治療癌症，其中該方法的步驟係協助或促進免疫系統根除癌細胞。該等方法可包括投予如本發明的細胞，該等細胞係調用一種主動免疫反應(或達成一種被動免疫反應)以毀滅癌細胞。治療方法可選擇性地包括共同投予生物性佐劑(如介白素、細胞介素、卡介苗(Bacillus Comette-Guerin)、單磷醯脂A等)及與用於治療癌症的習用療法諸如化學療法、放射線治療或外科手術組合使用。治療方法可涉及投予如本發明的一組成物作為疫苗，其藉由活化免疫系統來預防或破壞癌細胞生長而發揮效用。醫療方法亦可涉及活體內、擬體內及授受性細胞免疫療法，包括使用自體及/或異種細胞或永生化細胞株之該等方法。
III. 藥學組成物
如本揭露內容，“藥學組成物”一詞係有關於用於投予至一個體之一組成物。在一特定具體例中，該藥學組成物包含一組成物，該組成物所包含的治療性免疫細胞係供非經腸、經皮、血管腔內、動脈內、髓鞘內或靜脈內投予或供直接注射至一贅生物，諸如一癌症中。尤其設想該藥學組成物係經由輸注或注射而投予該個體。可藉由不同方式投予適宜的組成物，如藉由靜脈內、皮下、腹膜內、肌內、局部或皮內方式投予。
本揭露內容的藥學組成物可進一步包含一種藥學上可接受的載劑。適宜的藥學載劑之實例係技術領域中眾所周知及包括磷酸鹽緩衝型鹽水溶液、水、乳化液諸如油/水乳化液、各種類型的潤濕劑、無菌溶液等。可藉由熟知的習用方法調配包含該等載劑之組成物。該等藥學組成物可按適宜的劑量投予至該受試者。
給藥方式將由主治醫師與臨床因素決定。如醫療領域眾所周知者，用於一病患之劑量將依眾多因素而定，包括病患體型、體表面積、年齡、所投予的特定化合物、性別、投藥時間與途徑、整體健康狀況及同時投予的其他藥物。所投予的一特定劑量可能位於每平方公尺體表面積為2x107 個細胞至每平方公尺體表面積為1x1010 個細胞之範圍內。可藉由定期評估來監測進展。
可按局部或全身方式投予本揭露內容的組成物。在一較佳具體例中，該藥學組成物係按皮下方式投予而在一個甚至更佳的具體例中係靜脈內方式投予。供非經腸投藥之製劑包括無菌的水溶液或非水溶液、懸浮液及乳化液。非水溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之植物油及可注射性有機酯類諸如油酸乙酯。水性載劑包括水、醇性/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水與經緩衝的介質在內。非經腸載體包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer)葡萄糖、葡萄糖與氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發性油。靜脈內載體包括液體與營養素補給、電解質補充液(諸如該等以林格氏葡萄糖為基礎者)等。亦可存在例如諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體等之防腐劑及其他添加劑。此外，本揭露內容的藥學組成物可包含蛋白質載劑，如較佳來自人類之血清白蛋白或免疫球蛋白。依藥學組成物的預期用途而定，設想除了本揭露內容所述的細胞之外，本揭露內容的藥學組成物可進一步包含生物活性劑。
IV. 組合療法
在涉及所產生之抗HPV抗原的CTLs之本揭露內容的特定具體例中，本揭露內容的方法在臨床態樣係與有效治療過度增殖性疾病的其他藥劑諸如抗癌劑併用。“抗癌”劑可藉由下列方式而對於一受試者的癌症產生負面影響，例如殺滅癌細胞、引發癌細胞凋亡、減緩癌細胞的生長速率、減少轉移的發生率或數量、縮小腫瘤尺寸、抑制腫瘤生長、減少對於腫瘤或癌細胞的血液供應、促進對癌細胞或腫瘤的免疫反應、預防或抑制癌症進程或延長罹癌受試者的壽命。更普遍而言，可按有效殺滅細胞或抑制細胞增殖之組合量提供該等其他組成物。這方面之達成係可藉由將癌細胞與包括該二藥劑的單一組成物或藥用調配物接觸；或藉由將癌細胞同時與二種不同的組成物或調配物接觸，其中一組成物包括該表現建構物而另一組成物則包括第二藥劑。在其他情況下，該等細胞與第二組成物可能分開投予及其可藉由不同的投藥途徑及/或載體投予。
腫瘤細胞對於化學療法及放射治療劑的抗性係臨床腫瘤學所面臨的主要問題。目前癌症研究的一目標係藉由與額外療法併用而尋求增進化學及/或放射療法功效之方法。在本揭露內容的上下文中，預期細胞療法同樣地可與例如化學治療性、放射治療性及/或免疫治療性處置合併使用。
任擇地，本發明療法可在另一藥劑治療之前或之後進行，其間的間隔係從數分鐘至數星期、數個月或數年不等。在另一藥劑與本發明係分別施用至該個體之具體例中，通常要確保各次投予之間的時間並未過長，使得該藥劑與本發明療法仍能對於該細胞展現有利的組合效應。在該等情況下，預期可在彼此相距約12至24小時內，且更佳在彼此相距約6至12小時內，使該細胞與該二方式接觸。然而，在一些情況下，當個別的投予作用之間相隔數天(2、3、4、5、6或7天)至數星期(1、2、3、4、5、6、7或8個星期)時，可能需要顯著延長治療期間。
預期可視需要重複該等治療週期。亦預期各種標準療法以及外科手術處置可與本發明的細胞療法組合施用。
可與本揭露內容的方法所產生之細胞合併使用之HPV相關癌症治療實例(作為示例)包括至少下列各者：1)外科手術(腫瘤切除術、頸部廓清術、子宮頸錐形切除術、子宮切除術等等)；2)藥物療法，其可包括癌思停®(Avastin®)(貝伐珠單株抗體(Bevacizumab))、硫酸博萊黴素(Blenoxane)(博萊黴素(Bleomycin))、癌康定®(Hycamtin®)(鹽酸托泊替康(topotecan))或其等之組合；3)放射療法；4)本揭露內容以外的免疫療法；5)荷爾蒙療法；或6)其等之組合。
V. 本揭露內容之套組
在一套組中可包含本申請案中所述之任一組成物。在一非限制性實例中，在一套組中可包含一肽混物庫，可在該套組中提供任何類型的細胞，及/或可在該套組中提供用於操作肽混物及/或細胞之試劑。在該套組中可包括細胞介素或用於產生其等的構件(諸如編碼其等的載體)。可包括細胞培養試劑及/或器具。該等組分係在適宜的容器構件中提供。
在一具體例中，一套組所包含的一容器可包含藉由本發明的一種方法所獲得之一量的T細胞，該等T細胞係經調配而較佳藉由輸注供投予至受試者(如藉由與一適宜的載劑、賦形劑、稀釋劑或佐劑的摻合物形式)；更佳在一種自體授受性細胞免疫療法中、藉由輸注而供投予。該套組可維持在一預定溫度，例如低於約4℃，低於約-2℃或低於約-50℃。該套組可進一步包含有關套組儲存及/或運送及/或有關投予T細胞之說明書。
該等套組可包含本發明之一適當等分的組成物。該等套組的組分可包裝在水性介質中或以冷凍乾燥形式包裝。該等套組的容器構件通常包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其他容器構件，其中可放置組分，及較佳經適當地分裝成等分。當套組中具有一種以上的組分時，則該套件通常亦包含第二個、第三個或其他額外的容器且可將額外組分分開放置其中。然而，可將各種組分的組合包含於一小瓶中。本發明的套組通常亦包括將組分緊密封閉之容器構件以供商業銷售之用。該等容器可包括射出成型或吹氣成型的塑膠容器並將所需的小瓶存放在其中。
然而，套組的組分可按乾燥粉末形式提供。當試劑及/或組分係以乾燥粉末形式提供時，可藉由添加一適宜溶劑而將該粉末重新組成。亦設想可在另一容器構件中提供該溶劑。
在一些情況下，可在該套組中包括檢測HPV感染之試劑及/或裝置。實例包括拭棉、刮勺、細胞採樣刷、載玻片、蓋玻片、細胞樣本收集容器等等。可在套組中包括用於HPV感染或癌症的其他藥物，諸如貝伐珠單株抗體(Bevacizumab)；博萊黴素(Bleomycin)；鹽酸托泊替康(Topotecan Hydrochloride)；或其等之組合。
VI. 高IL-15
在本揭露內容的態樣之ㄧ些具體例中，刺激作用係在IL-15存在下執行。在ㄧ些具體例中，刺激作用係在IL-7與IL-15存在下執行。在ㄧ些具體例中，刺激作用係在只有IL-7與IL-15存在下執行。在ㄧ些具體例中，刺激作用係在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下執行)。
於刺激作用在IL-15存在下執行之本揭露內容的ㄧ些具體例中，該培養內可存在最終濃度大於15奈克/毫升的IL-15。在本申請案中最終IL-15濃度大於15奈克/毫升可稱為高IL-15。於ㄧ些具體例中，該培養內可存在的IL-15之最終濃度係下列中之一者：20-1000奈克/毫升、20-900奈克/毫升、20-800奈克/毫升、20-700奈克/毫升、20-600奈克/毫升、20-500奈克/毫升、30-500奈克/毫升、40-500奈克/毫升、50-500奈克/毫升、50-400奈克/毫升、50-300奈克/毫升、50-200奈克/毫升、50-175奈克/毫升、50-150奈克/毫升、75-150奈克/毫升、75-125奈克/毫升、80-120奈克/毫升、90-110奈克/毫升或100奈克/毫升。預期使用高IL-15的刺激作用特別是可與從耗乏CD45RA+細胞之細胞群體(例如血液細胞、免疫細胞或PBMCs)中產生/增生之HPV專一性免疫細胞群體的方法合併。
使用高IL-15的刺激作用可提供有利的性質。舉例而言，包含使用高IL-15的刺激作用之方法可適用於以提高的效率來產生/增生對HPV專一性的免疫細胞群體(例如在同一段時間內更大的增生倍數)。包含使用高IL-15的刺激作用之方法可適用於產生/增生對HPV專一性的免疫細胞群體，相較於依據先前技藝方法所產生/增生的群體，該細胞群體包含非所欲的免疫細胞子集(例如NK細胞、調節性T細胞(Tregs)及/或初始T細胞)的數量/頻率減少、所欲的免疫細胞子集(例如CD8+ T細胞、CD8+胞毒型T淋巴細胞、CD4+ T細胞、CD4+ T輔助細胞、產生IFNγ的細胞、記憶T細胞、中央記憶T細胞、已接觸抗原型T細胞、CD45RO+ T細胞)的比例/頻率增高，及/或病毒及/或抗原專一性細胞的比例/頻率增高於所產生/增生的群體內。
VII. HLA 陰性LCLs
在本揭露內容的態樣中，本申請案中所述之刺激步驟中使用的共刺激細胞可以為缺少MHC第一型及/或MHC第二型的基因及/或蛋白表現的類淋巴母細胞株(LCL)細胞。在一些具體例中，LCLs可能缺少MHC第一型及MHC第二型的表面表現；此等LCLs在本申請案中可稱為“HLA陰性LCLs”、“通用LCLs(universal LCLs)”或“ULCLs”。
LCLs可以藉由B細胞之病毒轉形來製備。LCLs典型地係藉由以艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)進行B細胞轉形來生產。LCLs之產生及特徵係舉例而言於Hui-Yuen等人，J Vis Exp (2011) 57: 3321，以及Hussain and Mulherkar, Int J Mol Cell Med (2012) 1(2): 75-87之內詳細地描述，二者係以整體併入於此以作為參考資料。簡言之，LCLs可以藉由在環孢素A(cyclosporin A)存在下、用生產EBV的細胞，舉例而言B95-8細胞，之濃縮細胞培養懸浮液予以孵育PBMCs而生產。
HLA陰性LCLs可能缺少MHC第一型多肽及MHC第二型多肽的表面表現。“MHC第一型多肽”係指MHC第一型分子的組分多肽(即MHC第一型α鏈多肽及B2M多肽之多肽複合體)。“MHC第二型多肽”係指MHC第二型分子的組分多肽(即MHC第二型α鏈多肽及MHC第二型β鏈多肽之多肽複合體)。表面表現係指於細胞表面(即在細胞膜中或位於細胞膜)可檢測的相關多肽/多肽複合體之表現。完整的細胞上之表面表現可使用例如對該多肽/多肽複合體的一區域專一性的抗原結合分子來分析，當該多肽/多肽複合體表現於細胞表面上時，該多肽/多肽複合體的區域對於細胞而言為細胞外的。
在一些具體例中，例如由偵測基因及/或蛋白表現的適當方法來判定，顯示出HLA陰性LCLs實質上沒有MHC第一型及MHC第二型的基因/蛋白表現。在一些具體例中，例如由透過使用能結合MHC第一型的抗體及MHC第二型的抗體之流動式細胞測量術的分析來判定，顯示出HLA陰性LCLs實質上沒有MHC第一型及MHC第二型的表面表現。於此等分析中，HLA陰性LCLs以相關抗體染色的位準可能不會明顯大於以相同的同型之合適的陰性對照抗體染色細胞的位準。
可能藉由修飾(例如核酸，譬如藉由一或多個核苷酸之***、取代或缺失)以減少/避免MHC第一型分子及MHC第一型分子的一或多個多肽(例如B2M多肽、MHC第一型α鏈多肽(例如HLA-A、HLA-B或HLA-C)、MHC第二型α鏈多肽(例如HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQA2或HLA-DRA)及/或MHC第二型β鏈多肽(例如HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4或HLA-DRB5))之基因及/或蛋白表現而獲得HLA陰性LCLs。在一些具體例中，相較於未經修飾的LCL之基因及/或蛋白表現，HLA陰性LCLs包含會減少/避免MHC第一型多肽(例如B2M)之基因及/或蛋白表現的修飾，以及包含會減少/避免一或多個MHC第二型多肽(例如HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP)之基因及/或蛋白表現的修飾。在一些具體例中，HLA陰性LCLs包含會減少/避免B2M、HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQA2及HLA-DP之基因及/或蛋白表現的修飾。在一些具體例中，可藉由舉例而言使用序列專一性核酸酶(SSNs)來靶定基因剔除編碼B2M、HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQA2及HLA-DP之基因而獲得HLA陰性LCLs；使用SSNs之基因編輯舉例而言於Eid and Mahfouz, Exp Mol Med. 2016 Oct; 48(10): e265內被回顧，其之整體藉此被併入以作為參考資料。在一些具體例中，會減少/避免MHC第一型多肽(例如B2M)之基因及/或蛋白表現的修飾及/或會減少/避免一或多個MHC第二型多肽(例如HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP)之基因及/或蛋白表現的修飾之達成係使用CRISPR/Cas-9系統，其包含靶定編碼相關多肽的核酸之crRNA。在一些具體例中，藉由相繼基因剔除編碼B2M、HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQA2及HLA-DP之基因而獲得HLA陰性LCLs。[0232]在一些具體例中，HLA陰性LCLs額外包含對編碼EBV複製/感染所需的一或多個多肽之核酸的修飾。包含會減少/避免EBV複製/感染的修飾之LCLs於本申請案中可以描述為EBV複製缺陷型。於是，在一些具體例中，HLA陰性LCLs為EBV複製缺陷型。在一些具體例中，HLA陰性LCLs舉例而言使用SSNs而包含對核酸的修飾(譬如藉由一或多個核苷酸之***、取代或缺失)，該核酸編碼BFLF1、BFLF2、BFRF1、BFRF2及BFRF3中之一或多者。在一些具體例中，HLA陰性LCLs包含對編碼BFLF1的核酸及/或編碼BFRF1的核酸的修飾。在一些具體例中，修飾之達成係使用CRISPR/Cas-9系統，其包含靶定編碼相關多肽的核酸之crRNA。在一些具體例中，HLA陰性LCLs係藉由一種包含在抑制病毒複製的一製劑(如環鳥糞核苷(acyclovir)存在下培養的方法而獲得。在一些具體例中，相較於從PBMCs與先前技藝所述的LCLs共培養後之PBMCs群體中增殖的B細胞位準，該EBV複製缺陷型HLA陰性LCLs從與PBMCs共培養後的PBMCs群體中，刺激的B細胞增殖較少。在一些具體例中，該EBV複製缺陷型HLA陰性LCLs在與PBMCs共培養時缺乏促進B細胞過度生長的能力。相較於缺乏會減少/避免EBV複製所需的一或多個多肽之基因及/或蛋白表現的修飾之LCLs，經修飾以減少/避免EBV複製所需的一或多個多肽之基因及/或蛋白表現的HLA陰性LCLs可能具有改良的安全性剖繪。
本揭露內容的HLA陰性LCLs係於用於產生/增生病毒專一性T細胞的方法中典型使用共刺激細胞的方式，用作為共刺激細胞。舉例而言，HLA陰性LCLs可提供為經輻射照射的細胞群體，且按對反應者細胞與抗原呈現細胞(APCs)之合適比例。在一些具體例中，HLA陰性LCLs係在使用於刺激作用之前，經輻射照射或用一物質(例如，絲裂黴素C)予以處理以預防其等的增殖。依據本方法之LCLs輻射照射典型地係以6000至12000雷德(rads)來進行。在一些具體例中，HLA陰性LCLs係存在於一刺激作用中，該刺激作用包含按1:1:1至1:1:10中一者，例如約1:1:5之比例的反應者細胞：APCs：HLA陰性LCLs。
本申請案中所述之HLA陰性LCLs於供用於產生/增生HPV專一性免疫細胞群體的方法中，可提供與其等使用作為共刺激細胞有關之有利性質。舉例而言，HLA陰性LCLs可適用於以提高的效率來產生/增生對HPV專一性的免疫細胞群體(例如在同一段時間內更大的增生倍數)。HLA陰性LCLs可適用於產生/增生對HPV專一性的免疫細胞群體之方法中，相較於依據先前技藝方法所產生/增生的群體，該細胞群體包含非所欲的免疫細胞子集(例如NK細胞、調節性T細胞(Tregs)及/或初始T細胞)的數量/頻率減少、所欲的免疫細胞子集(例如CD8+ T細胞、CD8+胞毒型T淋巴細胞、CD4+ T細胞、CD4+ T輔助細胞、產生IFNγ的細胞、記憶T細胞、中央記憶T細胞、已接觸抗原型T細胞、CD45RO+ T細胞)的比例/頻率增高，及/或病毒及/或抗原專一性細胞的比例/頻率增高於所產生/增生的群體內。
HLA陰性LCLs可適用於產生/增生HPV專一性免疫細胞群體，相較於先前技藝用於產生/增生HPV專一性免疫細胞群體的方法，該群體有降低的同種異體反應性(alloreactivity)。因此，HLA陰性LCLs可適用於產生/增生HPV專一性免疫細胞群體供用於自體性及同種異體性應用二者。在一些具體例中，相較於HLA-陽性LCLs(即先前技藝所述的LCLs)，於包含該HLA陰性LCLs與從同種異體捐贈者獲得的PBMCs之共培養中，該HLA陰性LCLs刺激的PBMCs增殖較少。在一些具體例中，相較於HLA-陽性LCLs，於包含該HLA陰性LCLs與從HLA匹配的捐贈者獲得的PBMCs之共培養中，該HLA陰性LCLs刺激的PBMCs增殖較少。
VIII. 樹突細胞
在本揭露內容的態樣中，本申請案中所述之刺激步驟中使用的樹突細胞可以從一受試者獲得的血液細胞群體內的細胞所衍生。在一些具體例中，樹突細胞係從周邊血液單核細胞(PBMCs)群體內的細胞所衍生。在一些具體例中，樹突細胞係從PBMCs群體內的CD14+陽性細胞所衍生。在一些具體例中，樹突細胞係單核細胞所衍生的樹突細胞(在本申請案中亦可稱為moDCs)。
在一些具體例中，樹突細胞係透過一方法獲得，該方法包含從，例如PBMCs群體內分離CD14+細胞與其他細胞(即CD14-細胞)。分離可藉由合適的正向或負向選擇來執行。在一些具體例中，CD14+陽性細胞可使用能專一結合CD14之抗體塗覆的小珠而從細胞群體內正向選擇出。舉例而言，CD14+細胞可藉由使用CD14微珠(MicroBeads) (美天旎生物科技)之MACS細胞分離作用予以分離。
在一些具體例中，樹突細胞係透過一方法獲得，該方法包含在促進不成熟的樹突細胞(在本申請案中亦可稱為iDCs)分化的因子存在下、從CD14+細胞培養細胞。在促進iDCs分化的因子存在下所培養的細胞可以為，例如PBMCs或從PBMCs群體分離的CD14+細胞。可以任何合適的密度來培養細胞，例如0.1 x 106 至1 x 106 個細胞/毫升、0.2 x106 至0.9 x 106 個細胞/毫升、0.3 x106 至0.8 x 106 個細胞/毫升、0.4 x106 至0.7 x106 個細胞/毫升或0.5 x 106 個細胞/毫升中之一者。促進不成熟的樹突細胞分化的因子可包括IL-4及/或GM-CSF。在一些具體例中，該培養包含IL-4及GM-CSF。該培養內可存在的IL-4之最終濃度係下列中之一者：50-1000國際單位/毫升、100-800國際單位/毫升、150-700國際單位/毫升、200-600國際單位/毫升、250-500國際單位/毫升、300-500國際單位/毫升或400國際單位/毫升。該培養內可存在的GM-CSF之最終濃度係下列中之一者：100-1500國際單位/毫升、200-1400國際單位/毫升、300-1300國際單位/毫升、400-1200國際單位/毫升、500-1100國際單位/毫升、600-1000國際單位/毫升、700-900國際單位/毫升或800國際單位/毫升。該培養可歷時任何合適的一段時間供不成熟的DCs分化，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9 天或10天中之一者。
在一些具體例中，本申請案中所述之刺激步驟中使用的樹突細胞係透過一方法獲得，該方法包含培養細胞(即成熟的樹突細胞之前驅細胞，例如不成熟的樹突細胞)成為成熟的樹突細胞。在一些具體例中，該方法包含在促進成熟的DCs(例如moDCs)分化的因子存在下、培養該細胞。在促進成熟的DCs分化的因子存在下所培養的細胞可以為例如PBMCs、從PBMCs群體分離(即分離及/或純化)的CD14+細胞，或不成熟的樹突細胞(iDCs)。可以任何合適的密度來培養細胞，例如0.1 x 106 至1 x 106 個細胞/毫升、0.2 x106 至0.9 x 106 個細胞/毫升、0.3 x106 至0.8 x 106 個細胞/毫升、0.4 x106 至0.7 x106 個細胞/毫升或0.5 x 106 個細胞/毫升中之一者。促進不成熟的樹突細胞分化成為成熟的DCs的因子可以為下列中的一或多者：GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1、CD40L、Poly (I:C)、MPLA、雷西莫特(Resiquimod)、IFNα、IFNγ或AmpB。在一些具體例中，該培養包含IL-4及GM-CSF。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及PGE-1。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6及TNFα。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1及CD40L。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及CD40L。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1及Poly (I:C)。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及Poly (I:C)。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1及MPLA。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及MPLA。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1及雷西莫特。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及雷西莫特。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1及IFNα。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及IFNα。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1及IFNγ。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及IFNγ。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1、IFNα及IFNγ。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、IFNα及IFNγ。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1、Poly (I:C)及MPLA。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、Poly (I:C)及MPLA。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、MPLA及IFNγ。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF及IFNα。在一些具體例中，該培養包含GM-CSF、IL-4、IFNγ及AmpB。該培養內可存在的IL-4之最終濃度係下列中之一者：50-1000國際單位/毫升、100-800國際單位/毫升、150-700國際單位/毫升、200-600國際單位/毫升、250-500國際單位/毫升、300-500國際單位/毫升或400國際單位/毫升。該培養內可存在的GM-CSF之最終濃度係下列中之一者：100-1500國際單位/毫升、200-1400國際單位/毫升、300-1300國際單位/毫升、400-1200國際單位/毫升、500-1100國際單位/毫升、600-1000國際單位/毫升、700-900國際單位/毫升或800國際單位/毫升。該培養內可存在的IL-1β之最終濃度係下列中之一者：1-100皮克/毫升、1-75皮克/毫升、5-50皮克/毫升、5-40皮克/毫升、5-30皮克/毫升、5-25皮克/毫升、5-20皮克/毫升、5-15皮克/毫升或10皮克/毫升。該培養內可存在的IL-6之最終濃度係下列中之一者：10-1000皮克/毫升、10-750皮克/毫升、50-500皮克/毫升、50-400皮克/毫升、50-300皮克/毫升、50-250皮克/毫升、50-200皮克/毫升、50-150皮克/毫升或100皮克/毫升。該培養內可存在的TNFα之最終濃度係下列中之一者：1-100皮克/毫升、1-75皮克/毫升、5-50皮克/毫升、5-40皮克/毫升、5-30皮克/毫升、5-25皮克/毫升、5-20皮克/毫升、5-15皮克/毫升或10皮克/毫升。該培養內可存在的PGE-1之最終濃度係下列中之一者：0.1-10奈克/毫升、0.1-7.5奈克/毫升、0.5-5奈克/毫升、0.5-4奈克/毫升、0.5-3奈克/毫升、0.5-2.5奈克/毫升、0.5-2奈克/毫升、0.5-1.5奈克/毫升或1奈克/毫升。該培養內可存在的CD40L之最終濃度係下列中之一者：10-1000皮克/毫升、10-750皮克/毫升、50-500皮克/毫升、50-400皮克/毫升、50-300皮克/毫升、50-250皮克/毫升、50-200皮克/毫升、50-150皮克/毫升或100皮克/毫升。該培養內可存在的Poly (I:C)之最終濃度係下列中之一者：0.1-10微克/毫升、0.1-7.5微克/毫升、0.5-5微克/毫升、0.5-4微克/毫升、0.5-3微克/毫升、0.5-2.5微克/毫升、0.5-2微克/毫升、0.5-1.5微克/毫升或1微克/毫升。該培養內可存在的MPLA之最終濃度係下列中之一者：0.1-10微克/毫升、0.1-7.5微克/毫升、0.5-5微克/毫升、0.5-4微克/毫升、0.5-3微克/毫升、0.5-2.5微克/毫升、0.5-2微克/毫升、0.5-1.5微克/毫升或1微克/毫升。該培養內可存在的雷西莫特之最終濃度係下列中之一者：0.1-10微克/毫升、0.1-7.5微克/毫升、0.5-5微克/毫升、0.5-4微克/毫升、0.5-3微克/毫升、0.5-2.5微克/毫升、0.5-2微克/毫升、0.5-1.5微克/毫升或1微克/毫升。該培養內可存在的IFNα之最終濃度係下列中之一者：10-1000奈克/毫升、10-750奈克/毫升、50-500奈克/毫升、50-400奈克/毫升、50-300奈克/毫升、50-250奈克/毫升、50-200奈克/毫升、50-150奈克/毫升或100奈克/毫升。該培養內可存在的IFNγ之最終濃度係下列中之一者：10-1000奈克/毫升、10-750奈克/毫升、50-500奈克/毫升、50-400奈克/毫升、50-300奈克/毫升、50-250奈克/毫升、50-200奈克/毫升、50-150奈克/毫升或100奈克/毫升。該培養內可存在的AmpB之最終濃度係下列中之一者：0.1-10微克/毫升、0.1-7.5微克/毫升、0.5-5微克/毫升、0.5-4微克/毫升、0.5-3微克/毫升、0.5-2.5微克/毫升、0.5-2微克/毫升、0.5-1.5微克/毫升或1微克/毫升。該培養可歷時任何合適的一段時間供成熟的DCs分化，例如6小時至5天、12小時至4天、12小時至72小時、12小時至48小時、12小時至36小時或24小時中之一者。在一些具體例中，刺激作用所使用的樹突細胞係透過一方法獲得，該方法包含在GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及CD40L存在下、培養不成熟的DCs。在一些具體例中，刺激作用所使用的樹突細胞係透過一方法獲得，該方法包含在GM-CSF、IL-4、MPLA及IFNγ存在下、培養不成熟的DCs。
相較於依據先前技藝所揭示之方法培養所獲得的樹突細胞，依據本申請案中所述之方法培養所獲得的樹突細胞可顯示較高的CD80及/或CD83之表面表現。相較於依據先前技藝所揭示之方法培養所獲得的樹突細胞群體，依據本申請案中所述之方法培養所獲得的樹突細胞群體可包含較高比例的細胞顯示CD80及/或CD83之表面表現。
依據本申請案中所述之方法培養所獲得的樹突細胞於供用於增生HPV專一性免疫細胞的方法中，可提供與其等使用作為抗原呈現細胞(APCs)有關之有利性質。舉例而言，DCs可適用於以提高的效率來產生/增生對HPV專一性的免疫細胞群體(例如在同一段時間內更大的增生倍數)。依據本申請案中所述之方法培養所獲得的DCs可適用於產生/增生對HPV專一性的免疫細胞群體之方法中，相較於依據先前技藝方法所產生/增生的群體，該細胞群體包含非所欲的免疫細胞子集(例如NK細胞、調節性T細胞(Tregs)及/或初始T細胞)的數量/頻率減少、所欲的免疫細胞子集(例如CD8+ T細胞、CD8+胞毒型T淋巴細胞、CD4+ T細胞、CD4+ T輔助細胞、產生IFNγ的細胞、記憶T細胞、中央記憶T細胞、已接觸抗原型T細胞、CD45RO+ T細胞)的比例/頻率增高，及/或病毒及/或抗原專一性細胞的比例/頻率增高於所產生/增生的群體內。
VIII. CD45RA+ 細胞耗乏作用
在本揭露內容的態樣中，從耗乏CD45RA+細胞(即CD45RA-細胞群體)之細胞群體(例如血液細胞、免疫細胞或PBMCs)來產生/增生HPV專一性免疫細胞群體。在一些具體例中，從耗乏CD45RA+細胞之PBMCs群體來產生/增生HPV專一性免疫細胞群體。在一些具體例中，CD45RA+細胞耗乏作用可透過分離CD45RA-細胞與其他細胞(即CD45RA+細胞)來達成。分離可藉由合適的正向或負向選擇來執行。在一些具體例中，CD45RA-細胞可使用能專一結合CD45RA之抗體塗覆的小珠而與CD45RA+細胞分離。舉例而言，CD45RA-細胞可藉由使用CD45RA微珠(美天旎生物科技公司)之MACS細胞分離作用而與CD45RA+細胞分離。在一些具體例中，細胞群體可額外耗乏CD14+細胞。
CD45RA+細胞耗乏作用可移除NK細胞、Tregs及/或初始T細胞，於依據本揭露內容的刺激作用期間避免此等細胞類型實質性的過度生長。CD45RA+細胞耗乏作用亦可富集CD45RO+細胞及/或已接觸抗原型T細胞之起始細胞群體，於依據本揭露內容的刺激作用時促進此等所欲的細胞類型優先增生。
在一些具體例中，特別是在一或多個刺激作用中使用IL-7及IL-15，以及特別是在使用高濃度的IL-15(即濃度大於15奈克/毫升，例如~100奈克/毫升)的方法中考慮CD45RA+細胞耗乏作用，因為此等方法可能特別容易出現NK細胞過度生長的問題。亦考慮從增生作用所用的起始細胞群體耗乏CD45RA+細胞，特別是於供用於產生/增生HPV專一性免疫細胞群體的方法中使用K562cs共刺激細胞的方法中，及/或於從一病患，例如患有HPV相關疾病的一病患所取得的免疫細胞(PBMCs)群體所增生的HPV專一性免疫細胞的方法中。
從耗乏CD45RA+細胞之細胞群體(例如血液細胞、免疫細胞或PBMCs)中產生/增生HPV專一性免疫細胞群體可提供超越先前技藝用於產生/增生HPV專一性免疫細胞群體的方法之優點。舉例而言，耗乏CD45RA+細胞之免疫細胞群體可適用於以提高的效率來產生/增生對HPV專一性的免疫細胞群體(例如在同一段時間內更大的增生倍數)。耗乏CD45RA+細胞之免疫細胞群體(如耗乏CD45RA+細胞之PBMCs)可適用於產生/增生對HPV專一性的免疫細胞群體之方法中，相較於依據先前技藝方法所產生/增生的群體，該細胞群體包含非所欲的免疫細胞子集(例如NK細胞、調節性T細胞(Tregs)及/或初始T細胞)的數量/頻率減少、所欲的免疫細胞子集(例如CD8+ T細胞、CD8+胞毒型T淋巴細胞、CD4+ T細胞、CD4+ T輔助細胞、產生IFNγ的細胞、記憶T細胞、中央記憶T細胞、已接觸抗原型T細胞、CD45RO+ T細胞)的比例/頻率增高，及/或病毒及/或抗原專一性細胞的比例/頻率增高於所產生/增生的群體內。
IX. 同種異體性及自體性應用
於產生/增生HPV專一性免疫細胞供用於自體性及同種異體性應用二者，例如細胞免疫療法的上下文中會考慮本申請案中所揭露之方法。依據本申請案中所揭露之方法所製備之對HPV專一性免疫細胞群體可以於其等產生/增生後使用，或可冷凍供日後使用。
在一些具體例中，該所產生/增生的對HPV專一性免疫細胞群體係予以製備供受試者使用，經產生/增生的群體之起始免疫細胞群體係從該受試者獲得/衍生。在一些具體例中，該所產生/增生的對HPV專一性免疫細胞群體係予以製備供任一受試者使用，例如與獲得/衍生出經產生/增生的群體之起始免疫細胞群體之受試者不同的受試者。
因此，在一些具體例中，該所產生/增生的對HPV專一性免疫細胞群體係授受性轉移至受試者，經產生/增生的群體之起始免疫細胞群體係從該受試者獲得/衍生。在一些具體例中，該所產生/增生的對HPV專一性免疫細胞群體係授受性轉移至與獲得/衍生出經產生/增生的群體之起始免疫細胞群體之受試者不同的受試者。
實施例
呈現下列實施例係為了更完整說明本發明的較佳具體例。然而，不應在任何方面將其等解釋為限制本發明的寬廣範圍。
實施例1
治療性T細胞之產生
在本揭露內容的一些具體例中，藉由所提供的一機制可迅速產生包括多株(例如CD4+與CD8+)CTLs在內之T細胞的單一製劑，其對於衍生自一或多種證實可致死的人類乳突病毒之多種抗原持續具有專一性。本揭露內容即可適用於臨床應用且可按“成品”抗HPV病毒劑形式使用。本方法與組成物即可適用於臨床應用並且可用於個體作為一種安全有效的抗HPV病毒劑。
在特定具體例中，在特定的輔助性細胞介素存在或不存在下，使用單核細胞所衍生的樹突細胞及加載跨越E6/E7之肽混物[重疊11個胺基酸(aa)的15聚體之肽庫]來刺激周邊血液T細胞。所產生的T細胞株則用加載肽混物的活化型B芽母細胞進一步進行增生。已成功活化與增生(＞1200倍)來自8/16子宮頸病患與33/52口咽癌病患的E6專一性/E7專一性T細胞。
在該等方法的特定具體例中，介白素(IL)-6、IL-7、IL-12及IL-15等細胞介素之存在對於該方法係有幫助的。所產生的T細胞株具有下列所欲特性：多株性、多重T細胞子集呈現(包括記憶區劃)與TH1型偏移及消滅E6/E7標的。本揭露內容已表明可能從罹患HPV16相關癌症的病患有力地產生導向HPV16 E6/E7的T細胞株。因為該技術具有可擴展性並且符合優良製造規範，該等細胞株係適用於HPV16癌症病患的授受性細胞免疫療法也可能適用於HPV18癌症。
用於產生針對HPV16的T細胞之已知方法係示於圖1A中，其顯示3名HPV相關癌症病患的結果(在藉由僅加載HPV16-肽混物的DCs刺激PBMCs後所得的細胞株中進行γIFN ELISpot分析而得)。在圖1B中顯示2名病患之結果，其亦顯示於圖1A中，再加上第三名個體之結果。圖1B顯示γIFN ELISpot分析之結果，該分析係在藉由加載HPV16-肽混物與HPV18-肽混物的DCs刺激PBMCs後所得的細胞株中進行。可檢測出同時對抗HPV16與HPV18抗原之反應性(並非所有病患具有對抗該二血清型之反應性)。
就該等方法的細節而言，在特定情況下，DCs係加載HPV16-E6/E7與HPV18-E6/E7肽混物庫。在該等情況下，該等細胞株可同時辨識HPV16與HPV18 E6與E7抗原(而非例如僅辨識HPV16抗原)。至少在特定情況下，T細胞之增生係在IL-7與IL-15存在下進行而非在IL-2存在下。在該方法的條件下，各刺激與增生步驟可能在或可能不在IL-7與IL-15之存在下進行。在一些具體例中，在用DCs進行初始產生/增生後之HPV專一性T細胞的增生作用並非在IL-15存在下用加載肽混物的自體性B芽母細胞進行，而是在共刺激細胞(CD80/CD86/CD83/4-1BBL)及IL-7與IL-15存在下，採用加載肽混物之自體性多株活化型T細胞。當採用該等條件時，T細胞的增生速率更快，成功地證明在3回合的刺激作用後，該速率至少為已知方法的10倍並且不喪失專一性。
表2提供使用已知方法進行之3名HPV相關癌症病患的細胞增生倍數之摘要。
使用本揭露內容的新穎方法進行之3名HPV相關癌症病患的細胞增生倍數之摘要係示於表3。在3回合的刺激作用後，增生倍數平均比使用已知方法時高約50倍。保有專一性(如＃1所示)。
實施例2
增生HPV T細胞之操作程序
經HPV刺激的T細胞(HPVST)係按10-20:1之PBMC:DC比例，首先藉由HPV E6/E7肽所脈衝的自體性樹突細胞(DCs)進行活化，及在含有IL-6(100奈克/毫升)、IL-7(10奈克/毫升)、IL-12(10奈克/毫升)、IL-15(10奈克/毫升)的培養基中培養8天(如按照Ramos等人，(J Immunother 2013;36:66-76)所述的第一刺激步驟)。
在第9天，在含有IL-7(10奈克/毫升)與IL-15(100奈克/毫升)的培養基中、按5-10:1之PBMC:DC比例、使用經肽脈衝的DCs進行第二刺激步驟。
繼而在含有IL-7(10奈克/毫升)與IL-15(100奈克/毫升)的培養基中及在相等數目之經輻射照射的同種異體K562-cs共刺激細胞存在下，按1:1的比例使用經HPV E6/E7肽脈衝的自體性T-APC來進行每星期後續的刺激/增生步驟以達到所欲的HPVSTs數目。使用從靜脈切開放血術所得血液中所分離出之一部分的自體PBMC來產生多株T細胞(T-APCs)。藉由在塗覆抗CD3與抗CD28抗體的細胞培養皿中培養而活化該等細胞。然後在IL-2存在下培養2星期而增生該等細胞。可將所增生的T-APC冷凍保存以備後用。在使用T-APC進行HPVST再刺激作用(第三及後續回合的HPVST再刺激作用)的2至3天前，將冷凍保存的細胞解凍及在經抗CD3與抗CD28抗體塗覆的細胞培養皿中予以再刺激。在進行HPVST再刺激作用當天，收穫T-APC細胞及用HPV E6/E7肽進行脈衝，接著按1:1的比例添加至持續培養中的HPVST。
實施例3
所輸注的HPVSTs在人類病患的活體內增生作用與持久性
用TGF-β的顯性陰性受體(DNRII)將從實施例2所得的HPVSTs予以轉導[參見Foster等人，Antitumor activity of EBV-specific T lymphocytes transduced with a dominant negative TGF-beta receptor.J Immunother. 2008;31:500-505]。
對二名人類病患投予HPVSTs及測試活體內增生作用與持久性。患者#1所罹患的口咽癌已廣泛轉移並已停止了先前的治療。病患# 2的口咽癌已轉移到頸部且正在接受伴隨投予的納武單抗(nivolumab)治療，其先前對於單獨投予的納武單抗並無反應。
在從該病患的周邊血液所分離出之PBMCs中，藉由針對DNRII基因所進行的qPCR來評估所輸注的HPVSTs之活體內增生作用與持久性。圖2與圖3中的數據點表示在輸注HPVSTs後之關鍵性輸注後間隔。
在患者#1中觀察到漸進性增生(圖2)。患者#2的增生雖然有限(圖3)，其在第6個星期的峰值係與再次輸注HPVSTs相符合，但是患者展現局部的臨床反應。相較於治療前基線，在輸注HPVST之6個星期後，藉由PET掃描與身體檢查之測量顯示患者#2的疾病負擔減輕了(圖4)。
實施例4
DC成熟的最佳化
從EBV反應性捐贈者採集血液樣本於肝素真空採血管內且藉由菲科爾(Ficoll)密度梯度離心以自血液樣本分離PBMCs。繼而使用CD14微珠(美天旎生物科技)以藉由正向選擇從PBMCs內分離出CD14+細胞。計數細胞數目，且冷凍並儲存CD14-細胞群體。[0275] CD14+細胞繼而分化為不成熟的樹突細胞(iDCs)。簡言之，CD14+細胞在含有400國際單位/毫升IL-4及800國際單位/毫升GM-CSF的DC細胞培養基中、以0.5 x 106 個細胞/毫升的濃度於24孔平盤的孔內培養5天。
繼而依據以下的表4中1至20中之一者所示的條件、藉由在DC細胞培養基中培養24小時而使iDCs成熟為成熟的DCs：
成熟DCs繼而藉由流動式細胞測量術來分析CD80、CD83、CCR7及PD-L1的表現。將之前冷凍的CD14-餾分解凍且於細胞培養基內休眠24小時。
不成熟及成熟的樹突細胞接著用個別的EBV抗原肽混物(LMP1、LMP2、BRAF1或EBNA1)進行脈衝，且在IL-7(10奈克/毫升)與IL-15(100奈克/毫升)存在下、藉由使用經肽脈衝的DCs共同培養來刺激自體性CD14- 細胞歷時9天。所增生的T細胞群體繼而藉由流動式細胞測量術來分析CCR7、CD45RO的表現、EBV肽反應性及IFNγ之細胞內染色。
圖5A與5B顯示在依據實驗條件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(見表4)培養後、從捐贈者1 CD14+ PBMCs衍生的單核細胞衍生的DCs的CD83、CD80、CCR7及PD-L1表現。
圖6A與6B顯示CD4+T細胞及CD8+ T細胞之CCR7及CD45RO之表現，該等細胞係依據實驗條件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者1衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得。觀察到所增生的T細胞群體之T細胞記憶表現型沒有顯著差異。
圖7顯示依據實驗條件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者1衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之病毒專一性T細胞的總數。
圖8顯示由ELISPOT分析來判定，依據實驗條件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者1衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞的比例。所示為減去不存在EBV肽刺激的對照條件所得到的背景信號之頻率。
圖9顯示由ELISPOT分析來判定，依據實驗條件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者1衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之EBV抗原反應性IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞的比例。所示為減去不存在EBV肽刺激的對照條件所得到的背景信號之頻率。捐贈者1對LMP2的反應更強烈。
圖10顯示病毒專一性T細胞的總數與IFNγ+CD8+ CTLs的比例，其等係於不同的實驗條件下用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者1衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得。因為條件編號5(‘CD40L wo’)顯示出比條件2(‘標準PGE’)更好的表現，所以確定其為有希望進一步評估的候選者。
圖11A與11B顯示在依據實驗條件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20培養後、從捐贈者2 CD14+ PBMCs衍生的單核細胞衍生的DCs之CD83、CD80、CCR7及PD-L1表現。
圖12A與12B顯示CD4+T細胞及CD8+T細胞之CCR7及CD45RO表現，該等細胞係依據實驗條件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者2衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得。觀察到所增生的T細胞群體之T細胞記憶表現型沒有顯著差異。
圖13顯示依據實驗條件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者2衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之病毒專一性T細胞的總數。
圖14顯示由ELISPOT分析來判定，依據實驗條件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者2衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞的比例。所示為減去不存在EBV肽刺激的對照條件所得到的背景信號之頻率。
圖15顯示由ELISPOT分析來判定，依據實驗條件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者2衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之EBV抗原反應性IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞的比例。所示為減去不存在EBV肽刺激的對照條件所得到的背景信號之頻率。捐贈者2對LMP2的反應更強烈。
圖16顯示病毒專一性T細胞的總數與IFNγ+CD8+ CTLs的比例，其等係於不同的實驗條件下用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者2衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得。因為條件編號18、19及20(‘PolyIC MPLA wo’、‘PolyIC MPLA PGE’及‘MPLA IFNγ’)顯示出比條件2(‘標準PGE’)更好的表現，所以確定其等為有希望進一步評估的候選者。
本發明人接著進行四種最有希望的DC成熟條件5、18、19及20(見表4) 進一步研究，特徵化擴展至三位不同的捐贈者衍生的細胞。
圖17A與17B顯示在依據實驗條件1、2、5、18、19及20培養後、從三位不同的捐贈者衍生的單核細胞衍生的DCs之代表性的CD83、CD80、CCR7及PD-L1表現。圖17C顯示CD80+CD83- DCs的比例、圖17D顯示CD80+CD83+ DCs的比例以及17E顯示PD-L1+ DCs的比例。
圖18顯示依據實驗條件2、5、18、19及20、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從三位不同的捐贈者衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之病毒專一性T細胞的總數。於不同條件下增生的成熟DCs有相似的總增生位準。
圖19顯示由ELISPOT分析來判定，依據實驗條件2、5、18、19及20、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從不同的捐贈者衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞的比例。所示為減去不存在EBV肽刺激的對照條件所得到的背景信號之頻率。
圖20顯示由ELISPOT分析來判定，依據實驗條件2、5、18、19及20、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從不同的捐贈者衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之EBV抗原反應性IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞的比例。所示為減去不存在EBV肽刺激的對照條件所得到的背景信號之頻率。
圖21顯示於不同的實驗條件下、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從三位捐贈者衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之病毒專一性T細胞的定標(scaled)總數及IFNγ+T細胞的定標頻率。
總的來說，該等結果暗示DCs成熟最佳的條件是在GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及CD40L存在下培養。另一種良好的條件是在GM-CSF、IL-4、MPLA及IFNγ存在下培養。
實施例5
DC成熟的進一步最佳化
從EBV反應性捐贈者採集血液樣本於肝素真空採血管內且藉由菲科爾密度梯度離心以自血液樣本分離PBMCs。繼而使用CD14+微珠以藉由正向選擇從PBMCs內分離出CD14+細胞。計數細胞數目，且冷凍並儲存CD14-細胞群體。
CD14+細胞繼而分化為不成熟的樹突細胞(iDCs)。簡言之，CD14+細胞在含有400國際單位/毫升IL-4及800國際單位/毫升GM-CSF的DC細胞培養基中、以0.5 x 106 個細胞/毫升的濃度於24孔平盤的孔內培養5天。
繼而依據以下的表5之1、2、21或25中之一者所示的條件、藉由在DC細胞培養基中培養24小時而使iDCs成熟為成熟的DCs：
成熟DCs繼而藉由流動式細胞測量術來分析CD80、CD83、CCR7及PD-L1的表現。將之前冷凍的CD14-餾分解凍且於細胞培養基內休眠24小時。
不成熟及成熟的DCs接著用個別的EBV抗原肽混物(LMP1、LMP2、BRAF1或EBNA1)進行脈衝，且在IL-7(10奈克/毫升)與IL-15(100奈克/毫升)存在下、藉由使用經肽脈衝的DCs共同培養來刺激自體性CD14-細胞歷時3天或9天。所增生的T細胞群體繼而藉由流動式細胞測量術來分析CCR7、CD45RO的表現、EBV肽反應性及IFNγ之細胞內染色。
相較於依據條件2成熟的DCs，預期依據條件21及22成熟的DCs會與有利性質有相關。
實施例6
在不同的共刺激細胞存在下、藉由刺激作用培養所增生的病毒專一性T細胞之特徵化
本發明人接著研究使用K562cs細胞及HLA陰性LCLs(在本申請案中亦可稱為通用LCLs(ULCLs))於用於產生/增生病毒專一性T細胞群體之方法的刺激作用中作為共刺激細胞。簡言之，收穫PBMCs，且在IL-7(10奈克/毫升)與IL-15(100奈克/毫升)存在下，以相應於EBV抗原(EBNA-1、LMP-1、LMP-2及BARF-1)之EBV肽混物予以脈衝以刺激EBV專一性T細胞之增生。在第9天，及之後每7天，用下列來執行再刺激步驟(i)經EBV肽混物脈衝、經輻射照射的自體性ATCs，在IL-7(10奈克/毫升)與IL-15(100奈克/毫升)存在下，且在經輻射照射的K562-cs共刺激細胞存在下，按1:1:5之反應者細胞:ATCs:K562-cs之比例，或(ii)經EBV肽混物脈衝、經輻射照射的自體性ATCs，在IL-7(10奈克/毫升)與IL-15(100奈克/毫升)存在下，且在經輻射照射的ULCLs存在下，按1:1:5之反應者細胞:ATCs:ULCLs之比例。
缺少HLA第I類及HLA第II類的表面表現之LCLs(即HLA-陰性LCLs)係藉由靶定基因剔除編碼HLA第I類及HLA第II類分子的基因而獲得。HLA陰性LCLs係進一步修飾以基因剔除EBV複製所需的基因。分析三種不同的ULCL殖株(#4、#5及#13)。
圖22A及22B顯示二個單獨實驗的結果，其顯示使用K562-cs細胞，相較於ULCLs，作為共刺激細胞來增生的細胞，培養之細胞總增生倍數較高。然而，如圖23A及23B中所示，由產生IFNγ的細胞數目之ELISPOT分析來判定，發現ULCL殖株#5會增生更多數目的病毒專一性T細胞。
本發明人接著藉由使用對細胞表面標誌專一性的抗體之流動式細胞測量術、來分析於使用K562-cs或ULCLs作為共刺激細胞進行所示數量的刺激作用後所增生的不同細胞類型的比例。圖32A至32C顯示來自代表性捐贈者(n=7)的散布圖，其顯示增生的群體內的CD3-CD56+ NK細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、γδ T細胞及αβ T細胞的比例。於增生的群體內(圖24A)發現相似的CD3-CD56+ NK細胞比例，同時藉由使用K562-cs細胞刺激獲得的群體傾向於增生的群體內之CD4+ T細胞比例減少(圖24B)，且藉由使用ULCLs刺激獲得的群體傾向於增生的群體內之αβ T細胞比例增加(圖24C)。圖25顯示ULCL殖株#5及#13之γδ TCR表現之特徵化的代表性結果，相較於K562-cs細胞表現者。
本發明人接著於第二及第三刺激作用結束時藉由產生IFNγ的之ELISPOT分析、來分析使用ULCL殖株#5或#13或K562cs細胞之刺激作用所增生的細胞群體內之抗原專一性T細胞的頻率。圖26A及26B顯示從二位不同的捐贈者獲得的結果。使用ULCL細胞作為共刺激細胞之刺激作用所增生的細胞內偵測到更多的病毒專一性細胞。圖27A至27D顯示於使用K562cs細胞、ULCL殖株#5或LCLs作為共刺激細胞進行所示數量的刺激作用後，四位不同的捐贈者之每100,000個細胞對於所示的EBV抗原專一性的細胞數目，由ELISPOT分析來判定。
本發明人將病毒專一性T細胞增生的分析擴展至四個刺激作用，且發現相較於使用K562cs細胞所執行的刺激作用，使用ULCLs作為共刺激細胞之刺激作用增生的群體含有較高比例的病毒專一性細胞(圖28A至28D)。發現ULCL殖株#4細胞與親代ULCL殖株關於使產生IFNγ的病毒專一性T細胞增生的能力沒有顯著不同(圖29A及29B)。
於另外使用從二位不同的捐贈者得到的PBMCs的實驗中，使用ULCL殖株#5的刺激作用產出的細胞群體包含較高頻率的產生IFNγ的病毒專一性T細胞，相較於刺激作用使用K562cs細胞所增生的群體之頻率(圖30A及30B)，而增生倍數是相似的(圖31A及31B)。圖32及33顯示使用ULCL殖株#5增生的群體與使用K562cs細胞所增生的群體相比，所增生的群體中CD3+及CD56+細胞的比例沒有顯著不同，以及圖34及35顯示使用K562cs細胞所增生的群體會增生比例略高的中央記憶細胞。
圖36A及36B顯示使用從二位另外的捐贈者獲得的PBMCs得到之實驗結果，其顯示使用ULCL殖株#5的刺激作用產出的細胞群體包含較高頻率的產生IFNγ的病毒專一性T細胞，相較於刺激作用使用K562cs細胞所增生的群體之頻率。在此等實驗中，刺激作用使用K562cs細胞時的總增生倍數較高(圖37A及37B)。圖38及39顯示使用ULCL殖株#5增生的群體與使用K562cs細胞所增生的群體相比，所增生的群體中CD3+及CD56+細胞的比例沒有顯著不同，以及圖40及41顯示使用K562cs細胞所增生的群體會增生比例略高的中央記憶細胞。
實施例7
在不同的細胞介素組合及不同的共刺激細胞存在下、藉由刺激作用培養所增生的HPV專一性T細胞之進一步特徵化
經HPV刺激的T細胞(HPVST)係按10-20:1之PBMC:DC比例，首先藉由HPV E6/E7肽所脈衝的自體性樹突細胞(DCs)進行活化，及在含有IL-6(100奈克/毫升)、IL-7(10奈克/毫升)、IL-12(10奈克/毫升)、IL-15(10奈克/毫升)的培養基中培養8天(如按照Ramos等人，(J Immunother 2013;36:66-76)所述的第一刺激步驟)。
繼而如表6中所示來進行每星期後續的再刺激步驟，總共4次刺激作用：
於每次刺激作用結束時計數細胞，且藉由流動式細胞測量術予以分析來判定所增生的群體中不同細胞類型的比例，並藉由ELISPOT予以分析來判定所增生的群體中產生IFNγ的病毒專一性細胞的頻率。
圖42顯示相較於刺激作用在只有IL-7與IL-15存在下執行，使用在IL-6、IL-7、IL-12及IL-15存在下的刺激作用之方法所增生的細胞群體內存在的HPV專一性T細胞的頻率較高。相較於使用K562cs細胞作為共刺激細胞之方法，藉由使用ULCLs作為共刺激細胞之方法所增生的細胞群體內存在的HPV專一性T細胞的頻率也較高。
圖43顯示依據不同的操作程序所增生的細胞之總增生倍數。發現到相較於包含在IL-6、IL-7、IL-12及IL-15存在下的刺激作用之方法，包含在只有IL-7與IL-15存在下的刺激作用之方法所增生的HPV專一性T細胞較多。相較於包含使用K562cs細胞作為共刺激細胞的刺激作用之方法，使用ULCLs作為共刺激細胞的刺激作用之方法顯示所增生的HPV專一性T細胞較多。
圖44顯示依據不同的操作程序刺激的細胞，於所示數量的刺激作用後之CD3及CD56表現。相較於在IL-6、IL-7、IL-12及IL-15存在下的刺激作用所增生的細胞，在只有IL-7與IL-15存在下的刺激作用所增生的細胞顯示有較高比例的CD3+CD56-細胞。相較於使用K562cs作為共刺激細胞的刺激作用所增生的細胞，使用HLA陰性LCLs作為共刺激細胞的刺激作用所增生的細胞顯示有較高比例的CD3+CD56-細胞。
圖45顯示依據不同的操作程序刺激的細胞，於所示數量的刺激作用後之CD4及CD8表現。相較於在只有IL-7與IL-15存在下的刺激作用所增生的細胞，在IL-6、IL-7、IL-12及IL-15存在下的刺激作用所增生的細胞顯示有較高比例的CD8+細胞。
圖46顯示依據不同的操作程序刺激的細胞，於所示數量的刺激作用後之CD45RO及CCR7表現。相較於在IL-6、IL-7、IL-12及IL-15存在下的刺激作用所增生的細胞，在只有IL-7與IL-15存在下的刺激作用所增生的細胞顯示有較高比例的中央記憶(即CD45RO+CCR7+)細胞。
實施例8
從耗乏CD45RA+細胞之PBMCS產生病毒專一性T細胞
本發明人研究供用於增生病毒專一性T細胞的方法之修改以使所增生的群體中病毒專一性抗原專一性T細胞的頻率增高並使NK細胞的頻率降低。
圖47提供用於產生本實施例的病毒專一性T細胞之方法步驟的示意圖。簡言之，在第0天PBMCs(其可耗乏CD45RA+細胞，或其可不耗乏CD45RA+細胞)係在IL-7(10奈克/毫升)及IL-15(100奈克/毫升或5奈克/毫升)存在下或在IL-4及IL-7存在下，用病毒肽予以脈衝。在第9天，細胞係在作為共刺激細胞之經輻射照射的HLA陰性LCLs存在下，且在IL-7(10奈克/毫升)及IL-15(100奈克/毫升或5奈克/毫升)存在下或在IL-4及IL-7存在下，使用經肽脈衝的經輻射照射的自體性抗原呈現活化型T細胞(ATCs)予以再刺激。在第16天收穫並分析細胞。
圖48顯示ELISPOT分析的結果，其顯示相較於刺激作用採用IL-4與IL-7的方法，刺激作用採用IL-7與IL-15之方法所增生的病毒專一性T細胞的頻率較高。
發現包含在IL-7及IL-15存在下進行刺激作用的方法能從淋巴瘤病患獲得的PBMCs增生病毒抗原專一性T細胞(圖49)。發現使用IL-7而非IL-4會使病患EBV專一性T細胞中抗原專一性T細胞的頻率提高。
研究刺激作用所要使用的IL-15之最佳濃度顯示較高劑量的IL-15(100奈克/毫升)對於增加病毒專一性T細胞的頻率是最好的(每毫升100奈克相較於每毫升5奈克的標準劑量)-參見圖50。圖51顯示高劑量的IL-15會使增生的細胞群體內之中央記憶EBV專一性T細胞的比例增加。
本發明人接著研究如何使從健康捐贈者與淋巴瘤病患PBMCs產生的增生的細胞群體中NK細胞過度生長減到最小。發現刺激作用使用IL-15的方法中NK細胞優先過度生長的情況較高(刺激作用使用IL-15與IL-7獲得的群體中NK細胞群體似乎較大)。為解決這個問題，發展出避免過量的NK細胞過度生長之條件。研究在刺激作用之前先從PBMCs耗乏CD45RA+細胞。CD45RA係一種初始T細胞標記，也在天然的調節性T細胞與NK細胞上表現，因此CD45RA+細胞之耗乏作用應會從起始的PBMC群體移除NK細胞。CD45RA+細胞之耗乏作用也會移除可抑制抗原專一性T細胞過度生長之調節性T細胞，尤其是於癌症患者，並且也會移除可成長為旁觀細胞而稀釋抗原專一性T細胞之初始細胞。可藉由任何適宜方法進行耗乏作用，例如使用磁性標記與分離作用(例如使用美天旎®生物科技(Miltenyi® Biotec)管柱)。藉由使用磁珠或奈米微泡亦可進行使用抗體而耗乏細胞之耗乏作用。
圖53示意說明從CD45RA耗乏型PBMCs產生肽混物活化型EBV專一性T細胞所使用的方法。如其所示，將完整PBMCs群體中的CD45RA耗乏(或CD45RO用於比較目的)，及從第0天或第1天開始，在IL-7與IL-15存在下，在耗乏型細胞中添加第一刺激作用(S1)EBV肽混物以產生EBVSTs。在S1結束時及在第二刺激作用S2開始之際(例如在第8天與第10天之間)，EBVSTs係在IL-7與IL-15存在下，但在IL-2不存在下，暴露於足量之EBV-肽混物脈衝型ATCs及足量的共刺激細胞(諸如K562cs細胞)，以產生所欲的肽混物活化型EBVSTs。圖54所顯示的結果係發現CD45RA耗乏作用(使用美天旎®(Miltenyi®)管柱與GMP等級CD45RA複合型珠而耗乏來自健康捐贈者的CD45RA+PBMC)，降低了增生的群體中之CD3-CD56+ NK細胞的頻率，其與EBVSTs之增殖作用增加有關(圖55)。圖56係說明在第二刺激步驟結束時，在來自健康捐贈者的CD45RA耗乏作用之後，EBVST的增生倍數提高。此外，發現在第二刺激作用結束時(例如第16天)，CD45RA耗乏作用提高EBVSTs的抗原專一性(見圖57與58，二者均顯示健康捐贈者之數據)。發現在第三刺激作用後，CD45RA+細胞耗乏型PBMCs增生作用所產生的EBVSTs之抗原專一性之增高仍然維持(圖59)。
從淋巴瘤病患獲得的PBMCs增生作用所得到的病毒專一性T細胞繼而進行CD45RA耗乏效應之特徵化，淋巴瘤病患之選擇係因為在未經耗乏之下，其等所生長的EBVSTs顯示高頻率的NK細胞或者因為其等無法產生或顯示抗原專一性。圖60顯示五名淋巴瘤病患在第二刺激步驟結束時的總NK細胞群體，表明CD45RA耗乏作用降低了淋巴瘤病患EBVSTs中的NK細胞群體之過度生長，及該耗乏作用增高抗原專一性T細胞的頻率(藉由在第二刺激作用結束時之IFN-γ釋出ELIspot分析所說明；圖61)。該實驗係在樹突細胞不存在下進行第一刺激作用(即CD45RA+細胞耗乏的PBMCs直接與EBV肽混物接觸)。類似於使用來自健康捐贈者的PBMCs方法中觀察到的結果，發現CD45RA耗乏作用增高了來自淋巴瘤病患的EBVSTs之抗原專一性(圖62)。淋巴瘤病患的EBVSTs之增殖作用係示於圖63。此外，CD45RA耗乏作用增進對抗經肽混物脈衝的自體活化型T細胞(aATCs)之細胞溶解活性；在20：1之效應子對標的之比例觀察溶解百分比(圖64)。
雖然已詳細說明了本發明及其優點，應理解可對本發明進行各種改變、取代及變更，而不偏離由所附申請專利範圍界定之本發明的精神與範圍。此外，本申請案的範圍並非意欲受限於說明書中所述的過程、機器、生產、物質組成物、方式、方法及步驟的特定具體例。如本技術領域的一般技術人員從本發明的揭露內容即可明瞭，若目前已有或日後研發出之過程、機器、生產、物質組成物、方式、方法或步驟所執行的功能或所達到的結果係與本申請案中所述對應具體例實質上相同，即可如本發明使用之。因此，所附申請專利範圍係意欲將該等過程、機器、生產、物質組成物、方式、方法或步驟包括在其等的範圍內。
圖1A係顯示本技術領域中的一種方法，其採用特定條件來產生HPV16專一性T細胞。圖1A係一條形圖，其顯示用未加載肽混物(Neg)、加載HPV16 E6肽混物(HPV16 E6)或加載HPV16 E7肽混物(HPV16 E7)的自體性樹突細胞，在刺激來自三名HPV相關癌症病患(標示為OCV、HND及HNC)的PBMCs時之斑點形成群落(SFC)之產生。就病患OCV而言，所存在的三個條狀從左到右為Neg、HPV16 E6及HPV16 E7。就病患HND與HNC而言，所存在的二個條狀從左到右為HPV16 E6與HPV16 E7。
圖1B係顯示本揭露內容的一種方法，其在特定的新穎條件下，藉由採用在IL-7與IL-15存在下及在IL-6與IL-12不存在下之T細胞刺激作用，產生HPV16或HPV18專一性T細胞之混合物。圖1B係一條形圖，其顯示在刺激來自三名HPV相關癌症病患(標示為OCV、PCV及HND)的PBMCs時之斑點形成群落(SFC)之產生。就病患OCV而言，所存在的五個條狀從左到右為未加載肽混物(Neg)、加載HPV16 E6肽混物(HPV16 E6)、加載HPV16 E7肽混物(HPV16 E7)、加載HPV18E6肽混物(HPV18E6)及HPV18E7肽混物(HPV18E7)。就病患PCD而言，所存在的二個條狀從左到右為HPV16 E6與HPV16 E7。就病患HND而言，所存在的四個條狀從左到右為HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18E6及HPV18E7。
圖2係一圖表，其顯示在病患#1中，所輸注之用TGF-β(DNRII)的一顯性陰性受體轉導且用HPV刺激的T細胞在輸注後的時間點之活體內增生作用與持久性。
圖3係一圖表，其顯示在病患#2中，所輸注之用TGF-β(DNRII)的一顯性陰性受體轉導且用HPV刺激的T細胞在輸注後的時間點之活體內增生作用與持久性。
圖4顯示病患#2的PET掃描(左側與中央)及身體檢查照片(右側)。上排：治療前。下排：用如本發明所產生之經HPV刺激的T細胞治療6星期後。
圖5A與5B為散布圖，其顯示(圖5A)CD83及CD80，及(圖5B)CCR7及PD-L1之表面表現，該表現係由從捐贈者1 CD14+ PBMCs衍生的單核細胞衍生的DCs依據實驗條件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(見表4)培養後所表現者。
圖6A與6B為散布圖，其顯示(圖6A)CD4+T細胞及(圖6B)CD8+ T細胞之CCR7及CD45RO之表面表現，該等細胞係依據實驗條件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者1衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得。
圖7係一條形圖，其顯示依據實驗條件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者1衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之病毒專一性T細胞的總數。
圖8係一條形圖，其顯示依據實驗條件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者1衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞(減去背景)的比例。
圖9係一條形圖，其顯示依據實驗條件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者1衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之EBV抗原反應性IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞(減去背景)的比例。
圖10係一圖，其顯示病毒專一性T細胞的總數與IFNγ+CD8+ CTLs的關係曲線，其等係於不同的實驗條件下(見表4)用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者1衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得。
圖11A與11B為散布圖，其顯示(圖11A)CD83及CD80，及(圖11B)CCR7及PD-L1之表面表現，該表現係由從捐贈者2 CD14+ PBMCs衍生的單核細胞衍生的DCs依據實驗條件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20(見表4)培養後所表現者。
圖12A與12B為散布圖，其顯示(圖12A)CD4+T細胞及(圖12B)CD8+ T細胞之CCR7及CD45RO之表面表現，該等細胞係依據實驗條件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者2衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得。
圖13係一條形圖，其顯示依據實驗條件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者2衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之病毒專一性T細胞的總數。
圖14係一條形圖，其顯示依據實驗條件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者2衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞(減去背景)的比例。
圖15係一條形圖，其顯示依據實驗條件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者2衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之EBV抗原反應性IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞(減去背景)的比例。
圖16係一圖，其顯示病毒專一性T細胞的總數與IFNγ+CD8+ CTLs的關係曲線，其等係於不同的實驗條件下(見表4)用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從捐贈者2衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得。
圖17A、17B、17C、17D與17E為散布圖及條形圖，其顯示由從三位不同的捐贈者衍生的單核細胞衍生的DCs依據實驗條件1、2、5、18、19及20(見表4)培養後之(圖17A)CD80及CD83，及(圖17B)CCR7及PD-L1之表面表現。圖17C顯示CD80+CD83-細胞的比例、圖17D顯示CD80+CD83+細胞的比例，及圖17E顯示PD-L1+細胞的比例。
圖18為一條形圖，其顯示依據實驗條件2、5、18、19及20(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從三位不同的捐贈者衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之病毒專一性T細胞的總數。
圖19為一條形圖，其顯示依據實驗條件2、5、18、19及20(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從不同的捐贈者衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞(減去背景)的比例。
圖20顯示依據實驗條件2、5、18、19及20(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從不同的捐贈者衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之EBV抗原反應性IFNγ+CD8+ CTLs及IFNγ+CD4+ Th細胞(減去背景)的比例。
圖21為一圖，其顯示於不同的實驗條件下(見表4)、用經EBV肽脈衝的成熟DCs刺激從三位捐贈者衍生的自體性CD14- PBMCs培養9天後所獲得之病毒專一性T細胞的定標(scaled)總數及IFNγ+T細胞的定標頻率。
圖22A及22B為顯示二個單獨的實驗結果的圖，該等實驗研究使用K562-cs細胞，相較於ULCL殖株#5及#13，作為共刺激細胞之細胞總增生倍數。
圖23A及23B為顯示二個單獨的實驗結果的圖，該等實驗研究於刺激作用後、使用K562-cs細胞，相較於ULCL殖株#5及#13，作為共刺激細胞之病毒專一性T細胞之總增生倍數，由產生IFNγ的細胞數目之ELISPOT分析來判定。
圖24A、24B與24C提供來自代表性捐贈者(n=7)的散布圖，其顯示於使用K562-cs細胞或ULCL殖株#5及#13作為共刺激細胞予以增生之群體內的(圖24A)CD3-CD56+ NK細胞、(圖24B)CD4+ T細胞及CD8+ T細胞，及(圖24C)γδ T細胞及αβ T細胞的比例。
圖25提供直方圖(histograms)，其顯示ULCL殖株#5及#13之γδ TCR表現之特徵化的代表性結果，相較於K562cs細胞表現者。
圖26A及26B為二位不同的捐贈者的條形圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用K562-cs細胞或ULCL殖株#5及#13作為共刺激細胞所增生的群體內之病毒專一性T細胞的頻率，由產生IFNγ的細胞數目之ELISPOT分析來判定。
圖27A、27B、27C及27D為四位不同的捐贈者的條形圖，其顯示於所示數量的刺激作用後使用K562cs細胞(K)、ULCL殖株#5(5)或LCLs(L)作為共刺激細胞，對於所示的EBV抗原專一性T細胞的頻率，由產生IFNγ的細胞數目之ELISPOT分析來判定。
圖28A、28B、28C及28D為條形圖及圖，其顯示於所示數量的刺激作用後使用K562-cs細胞或ULCL殖株#4、#5及#13作為共刺激細胞所增生的群體內之病毒專一性T細胞的頻率及增生倍數，由產生IFNγ的細胞數目之ELISPOT分析來判定。
圖29A及29B為條形圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#4或親代ULCL細胞作為共刺激細胞所增生的群體內之病毒專一性T細胞的頻率，由產生IFNγ的細胞數目之ELISPOT分析來判定。
圖30A及30B為二位不同的捐贈者的條形圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的群體內之病毒專一性T細胞的頻率，由產生IFNγ的細胞數目之ELISPOT分析來判定。
圖31A及31B為二位不同的捐贈者的條形圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的群體內之病毒專一性T細胞的增生倍數，由產生IFNγ的細胞數目之ELISPOT分析來判定。
圖32提供捐贈者PB的散布圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的細胞之CD3及CD56之表面表現，由流動式細胞測量術來判定。
圖33提供捐贈者KP的散布圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的細胞之CD3及CD56之表面表現，由流動式細胞測量術來判定。
圖34提供捐贈者PB的散布圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的細胞之CD45RO及CCR7之表面表現，由流動式細胞測量術來判定。
圖35提供捐贈者KP的散布圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的細胞之CD45RO及CCR7之表面表現，由流動式細胞測量術來判定。
圖36A及36B為二位不同的捐贈者的條形圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的群體內之病毒專一性T細胞的頻率，由產生IFNγ的細胞數目之ELISPOT分析來判定。
圖37A及37B為二位不同的捐贈者的條形圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的群體內之病毒專一性T細胞的增生倍數，由產生IFNγ的細胞數目之ELISPOT分析來判定。
圖38提供一位捐贈者的散布圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的細胞之CD3及CD56之表面表現，由流動式細胞測量術來判定。
圖39提供一位捐贈者的散布圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的細胞之CD3及CD56之表面表現，由流動式細胞測量術來判定。
圖40提供一位捐贈者的散布圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的細胞之CD45RO及CCR7之表面表現，由流動式細胞測量術來判定。
圖41提供一位捐贈者的散布圖，其顯示於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的細胞之CD45RO及CCR7之表面表現，由流動式細胞測量術來判定。
圖42為一條形圖，其顯示於包含所示的細胞介素之刺激作用中，且於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的群體內之HPV專一性T細胞的頻率，由產生IFNγ的細胞數目之ELISPOT分析來判定。
圖43為一圖，其顯示於包含所示的細胞介素之刺激作用中，且於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的群體內之細胞的增生倍數。
圖44提供散布圖，其顯示於包含所示的細胞介素之刺激作用中，且於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的細胞之CD3及CD56之表面表現，由流動式細胞測量術來判定。
圖45提供散布圖，其顯示於包含所示的細胞介素之刺激作用中，且於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的細胞之CD4及CD8之表面表現，由流動式細胞測量術來判定。
圖46提供散布圖，其顯示於包含所示的細胞介素之刺激作用中，且於所示數量的刺激作用後，使用ULCL殖株#5或K562cs細胞作為共刺激細胞所增生的細胞之CD45RO及CCR7之表面表現，由流動式細胞測量術來判定。
圖47係本揭露內容的病毒專一性T細胞(VST)產生方法之一般具體例的示意圖。
圖48提供條形圖，其顯示相較於採用IL-4與IL-7的已知方法，本揭露內容採用IL-7與IL-15之方法的專一性之改良。
圖49係一條形圖，其顯示由ELISPOT所判定，在IL-7與IL-15存在下執行刺激作用所獲得的淋巴瘤病患EBVSTs的EBV抗原專一性之改良。
圖50係一條形圖，其顯示刺激作用在高劑量的IL-15存在下會增加VSTs的頻率。
圖51係一條形圖，其顯示刺激作用在高劑量的IL-15存在下會增加中央記憶EBVSTs的比例。
圖52提供條形圖，其顯示在來自一些患者的EBVSTs中之過量的NK細胞過度生長。
圖53係從CD45RA+細胞耗乏型PBMCs產生肽混物活化型EBVSTs的示意圖。
圖54係一條形圖，其顯示CD45RA耗乏作用降低從健康捐贈者所增生的EBVSTs中之CD3-CD56+ NK細胞的頻率。
圖55係一條形圖，其顯示CD45RA+細胞之移除提高了EBVSTs增殖作用。
圖56係一圖，其顯示CD45RA耗乏作用提高了EBVSTs的增生倍數。
圖57係一條形圖，其顯示在第二刺激作用結束(在第16天)時，CD45RA耗乏作用增進了EBVSTs的抗原專一性。
圖58係一條形圖，其顯示CD45RA耗乏作用增進了EBVSTs的抗原專一性。
圖59係一條形圖，其顯示在第三刺激作用後，CD45RA耗乏型EBVSTs所增加的抗原專一性仍然維持。
圖60係一條形圖，其顯示CD45RA耗乏作用減少NK細胞群體在淋巴瘤病患EBVSTs中之過度生長。
圖61係一條形圖，其顯示CD45RA耗乏作用增加淋巴瘤病患EBVSTs中的抗原專一性T細胞之頻率。
圖62係一條形圖，其顯示CD45RA耗乏作用提高來自淋巴瘤病患的EBVSTs中之抗原專一性。
圖63係一條形圖，其顯示CD45RA耗乏作用對於淋巴瘤病患的EBVSTs增殖作用之效應。
圖64係一圖表，其顯示CD45RA耗乏作用提高對抗經肽混物脈衝的自體活化型T細胞(aATCs)之細胞溶解活性。

Claims (51)

  1. 一種產生或增生對人類乳突病毒(HPV)專一性的一免疫細胞群體之方法，包含一下述步驟：在HLA陰性類淋巴母細胞株(LCLs)存在下刺激選擇性地(optionally)為周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)群體之一免疫細胞群體，其係藉由在呈現一HPV抗原的一肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下予以培養。
  2. 如請求項1之方法，其中該HLA陰性LCLs為艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)複製缺陷型。
  3. 如請求項1或請求項2之方法，其中該APCs係活化型T細胞(ATCs)、樹突細胞(DCs)或B芽母細胞(BBs)。
  4. 如請求項3之方法，其中該DCs係從CD14+細胞所衍生，該CD14+細胞係從一周邊血液單核細胞(PBMCs)群體所分離出。
  5. 如請求項3或請求項4之方法，其中該DCs係藉由一方法而從CD14+細胞所衍生，該方法包含在介白素-4(IL-4)及顆粒性白血球/巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte/macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)存在下，培養該CD14+細胞以產生不成熟的DCs(iDCs)。
  6. 如請求項5之方法，其中從CD14+細胞衍生該DCs的該方法進一步包含培養該iDCs以產生成熟的DCs，其係藉由在下列存在下予以培養：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及CD40L；(b)GM‐CSF、IL-4、MPLA及IFNγ；(c)GM‐CSF、IFNα；或(d)GM‐CSF、IL‐4、AmpB及IFNγ。
  7. 如請求項3之方法，其中該DCs係藉由一方法而從不成熟的DCs(iDCs)所衍生，該方法包含在下列存在下予以培養：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及CD40L；(b)GM‐CSF、IL-4、MPLA及IFNγ；(c)GM‐CSF、IFNα；或(d)GM‐CSF、IL‐4、AmpB及IFNγ。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中所刺激的該免疫細胞群體係已耗乏CD45RA+細胞。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該刺激係藉由在IL-7及IL-15存在下培養來執行，選擇性地其中該培養內的該IL-15係以大於15奈克/毫升之一最終濃度存在。
  10. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該刺激係藉由在IL-4、IL-6、IL-7及IL-15存在下培養來執行。
  11. 一種產生或增生對HPV專一性的一免疫細胞群體之方法，包含刺激一免疫細胞群體，其係藉由在呈現一HPV抗原的一肽之樹突細胞(DCs)存在下予以培養，其中該DCs係從CD14+細胞所衍生，該CD14+細胞係從一周邊血液單核細胞(PBMCs)群體所分離出。
  12. 如請求項11之方法，其中該DCs係藉由一方法而從CD14+細胞所衍生，該方法包含在IL-4及GM-CSF存在下，培養該CD14+細胞以產生不成熟的DCs(iDCs)。
  13. 如請求項12之方法，其中從CD14+細胞衍生該DCs的該方法進一步包含培養該iDCs以產生成熟的DCs，其係藉由在下列存在下予以培養：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及CD40L；(b)GM‐CSF、IL-4、MPLA及IFNγ；(c)GM‐CSF、IFNα；或(d)GM‐CSF、IL‐4、AmpB及IFNγ。
  14. 一種產生或增生對HPV專一性的一免疫細胞群體之方法，包含刺激一免疫細胞群體，其係藉由在呈現一HPV抗原的一肽之樹突細胞(DCs)存在下予以培養，其中該DCs係藉由一方法而從不成熟的DCs(iDCs)所衍生，該方法包含在下列存在下予以培養：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及CD40L；(b)GM‐CSF、IL-4、MPLA及IFNγ；(c)GM‐CSF、IFNα；或(d)GM‐CSF、IL‐4、AmpB及IFNγ。
  15. 如請求項11至14中任一項之方法，其中該刺激包含在HLA陰性LCLs存在下培養，選擇性地其中該HLA陰性LCLs為EBV複製缺陷型。
  16. 如請求項11至15中任一項之方法，其中所刺激的該免疫細胞群體係已耗乏CD45RA+細胞。
  17. 如請求項11至16中任一項之方法，其中該刺激係藉由在IL-7及IL-15存在下培養來執行，選擇性地其中該培養內的該IL-15係以大於15奈克/毫升之一最終濃度存在。
  18. 如請求項11至16中任一項之方法，其中該刺激係藉由在IL-4、IL-6、IL-7及IL-15存在下培養來執行。
  19. 一種產生或增生對HPV專一性的一免疫細胞群體之方法，包含刺激已耗乏CD45RA+細胞的一免疫細胞群體，其係藉由在呈現一HPV抗原的一肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下予以培養。
  20. 如請求項19之方法，其中該刺激包含在HLA陰性LCLs存在下培養，選擇性地其中該HLA陰性LCLs為EBV複製缺陷型。
  21. 如請求項19或請求項20之方法，其中該APCs係活化型T細胞(ATCs)、樹突細胞(DCs)或B芽母細胞(BBs)。
  22. 如請求項21之方法，其中該DCs係從CD14+細胞所衍生，該CD14+細胞係從一周邊血液單核細胞(PBMCs)群體所分離出。
  23. 如請求項21或請求項22之方法，其中該DCs係藉由一方法而從CD14+細胞所衍生，該方法包含在IL-4及GM-CSF存在下，培養該CD14+細胞以產生不成熟的DCs(iDCs)。
  24. 如請求項23之方法，其中從CD14+細胞衍生該DCs的該方法進一步包含培養該iDCs以產生成熟的DCs，其係藉由在下列存在下予以培養：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及CD40L；(b)GM‐CSF、IL-4、MPLA及IFNγ；(c)GM‐CSF、IFNα；或(d)GM‐CSF、IL‐4、AmpB及IFNγ。
  25. 如請求項21之方法，其中該DCs係藉由一方法而從不成熟的DCs(iDCs)所衍生，該方法包含在下列存在下予以培養：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及CD40L；(b)GM‐CSF、IL-4、MPLA及IFNγ；(c)GM‐CSF、IFNα；或(d)GM‐CSF、IL‐4、AmpB及IFNγ。
  26. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該刺激係藉由在IL-7及IL-15存在下培養來執行，選擇性地其中該培養內的該IL-15係以大於15奈克/毫升之一最終濃度存在。
  27. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該刺激係藉由在IL-4、IL-6、IL-7及IL-15存在下培養來執行。
  28. 一種產生或增生對HPV專一性的一免疫細胞群體之方法，包含一下述步驟：在IL-7及IL-15存在下刺激一免疫細胞群體，其係藉由在呈現一HPV抗原的一肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下予以培養。
  29. 如請求項28之方法，其中該培養內的該IL-15係以大於15奈克/毫升之一最終濃度存在。
  30. 一種產生或增生對HPV專一性的一免疫細胞群體之方法，包含一下述步驟：在IL-4、IL-6、IL-7及IL-15存在下刺激一免疫細胞群體，其係藉由在呈現一HPV抗原的一肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下予以培養。
  31. 如請求項28至30中任一項之方法，其中該刺激包含在HLA陰性LCLs存在下培養，選擇性地其中該HLA陰性LCLs為EBV複製缺陷型。
  32. 如請求項28至31中任一項之方法，其中該APCs係活化型T細胞(ATCs)、樹突細胞(DCs)或B芽母細胞(BBs)。
  33. 如請求項32之方法，其中該DCs係從CD14+細胞所衍生，該CD14+細胞係從一周邊血液單核細胞(PBMCs)群體所分離出。
  34. 如請求項32或請求項33之方法，其中該DCs係藉由一方法而從CD14+細胞所衍生，該方法包含在IL-4及GM-CSF存在下，培養該CD14+細胞以產生不成熟的DCs(iDCs)。
  35. 如請求項34之方法，其中從CD14+細胞衍生該DCs的該方法進一步包含培養該iDCs以產生成熟的DCs，其係藉由在下列存在下予以培養：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及CD40L；(b)GM‐CSF、IL-4、MPLA及IFNγ；(c)GM‐CSF、IFNα；或(d)GM‐CSF、IL‐4、AmpB及IFNγ。
  36. 如請求項32之方法，其中該DCs係藉由一方法而從不成熟的DCs(iDCs)所衍生，該方法包含在下列存在下予以培養：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα及CD40L；(b)GM‐CSF、IL-4、MPLA及IFNγ；(c)GM‐CSF、IFNα；或(d)GM‐CSF、IL‐4、AmpB及IFNγ。
  37. 如請求項28至36中任一項之方法，其中所刺激的該免疫細胞群體係已耗乏CD45RA+細胞。
  38. 如請求項1至37中任一項之方法，其中該APCs或DCs已經以相應於一或多個HPV抗原的一或多個肽予以脈衝。
  39. 如請求項38之方法，其中該一或多個HPV抗原係選自於E1、E2、E3、E4、E5、E6及E7。
  40. 如請求項38或請求項39之方法，其中該一或多個HPV抗原係HPV16、HPV18、HPV1、HPV2及/或HPV3的抗原。
  41. 如請求項1至40中任一項之方法，其中所刺激的該免疫細胞群體係從免疫細胞的一先前刺激而獲得，選擇性地從一PBMCs群體之內，該先前刺激係藉由在呈現一HPV抗原的一肽之APCs存在下培養來進行。
  42. 如請求項1至41中任一項之方法，其中該方法進一步包含一或多個另外的步驟，該步驟包含藉由在呈現一HPV抗原的一肽之APCs存在下培養來刺激一免疫細胞群體。
  43. 一種對HPV專一性的免疫細胞群體，其中對HPV專一性的該免疫細胞群體係藉由如請求項1至42中任一項之方法獲得。
  44. 如請求項43之免疫細胞群體，其供使用於治療或預防一HPV相關疾病的方法。
  45. 一種如請求項43之免疫細胞群體於製造一藥物之用途，該藥物係供用於治療或預防一HPV相關疾病。
  46. 如請求項43或請求項44之供使用的免疫細胞群體，或是如請求項45之用途，其中該治療係藉由授受性細胞轉移(adoptive cell transfer，ACT)來治療或預防一HPV相關疾病的一方法。
  47. 如請求項46之供使用的免疫細胞群體或用途，其中該藉由ACT之治療方法包括投予自體性細胞或同種異體細胞至一受試者。
  48. 一種治療或預防一受試者的一HPV相關疾病之方法，該方法包含投與一治療或預防有效量之如請求項43之免疫細胞群體至一受試者。
  49. 一種治療或預防一受試者的一HPV相關疾病之方法，該方法包含： (a) 依據如請求項1至42中任一項之方法來產生或增生對HPV專一性的一免疫細胞群體，以及 (b) 投與一治療或預防有效量之於步驟(a)所獲得之對HPV專一性的免疫細胞群體至一受試者。
  50. 如請求項44至49中任一項之供使用的免疫細胞群體、用途或方法，其中該HPV相關疾病係癌症。
  51. 如請求項50之供使用的免疫細胞群體、用途或方法，其中該癌症係選自於子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、***癌、陰莖癌、口咽癌、鼻咽癌、喉部乳突狀瘤病、喉癌、頭頸癌或其任何部位的發育異常。
TW108103877A 2016-09-16 2019-01-31 Hpv專一性t細胞之產生技術 TW201934748A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662395440P 2016-09-16 2016-09-16
US15/885,197 US10500265B2 (en) 2016-09-16 2018-01-31 Generation of HPV-specific T-cells
US15/885,197 2018-01-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201934748A true TW201934748A (zh) 2019-09-01

Family

ID=57885783

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106131752A TW201814040A (zh) 2016-09-16 2017-09-15 Hpv專一性t細胞之產生技術
TW108103877A TW201934748A (zh) 2016-09-16 2019-01-31 Hpv專一性t細胞之產生技術

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106131752A TW201814040A (zh) 2016-09-16 2017-09-15 Hpv專一性t細胞之產生技術

Country Status (11)

Country Link
US (4) US9642906B2 (zh)
EP (2) EP3512936B1 (zh)
JP (2) JP2019529417A (zh)
KR (1) KR20190071689A (zh)
CN (2) CN109996869A (zh)
AU (1) AU2017326601A1 (zh)
CA (2) CA3036747A1 (zh)
ES (1) ES2876152T3 (zh)
SG (1) SG11202007187TA (zh)
TW (2) TW201814040A (zh)
WO (2) WO2018050818A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3003678A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Children's National Medical Center Generating hpv antigen-specific t cells from a naive t cell population
US9642906B2 (en) * 2016-09-16 2017-05-09 Baylor College Of Medicine Generation of HPV-specific T-cells
EP3579870A4 (en) 2017-02-07 2020-12-30 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) PHOSPHOLIPID ETHER (PLE) T CAR-LYMPHOCYTE TUMOR (CTCT) TARGETING AGENTS
JP7178355B2 (ja) 2017-02-28 2022-11-25 エンドサイト・インコーポレイテッド Ｃａｒ ｔ細胞療法のための組成物および方法
WO2019070541A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Juno Therapeutics, Inc. HPV-SPECIFIC BINDING MOLECULES
CA3089051A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Endocyte, Inc. Methods of use for car t cells
US20200399348A1 (en) * 2018-02-20 2020-12-24 Emory University HPV Proteins, Antibodies, and Uses in Managing Abnormal Epithelial Cell Growth
WO2019196088A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Syz Cell Therapy Co. Methods of obtaining tumor-specific t cell receptors
GB201821207D0 (en) * 2018-12-24 2019-02-06 Tcer Ab Immunotherapy therapy
WO2021156404A2 (en) * 2020-02-07 2021-08-12 Isa Pharmaceuticals Treatment of hpv-related diseases
WO2021221927A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Parsons Corporation Narrowband iq signal obfuscation
CN117529551A (zh) 2021-04-27 2024-02-06 贝勒医学院 表达嵌合抗原受体的病毒特异性免疫细胞
CN114409744B (zh) * 2022-03-29 2022-10-04 深圳吉诺因生物科技有限公司 Hpv抗原表位及其鉴定方法、应用
WO2024086827A2 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Repertoire Immune Medicines, Inc. Cd8 t cell targeted il2

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001288863A1 (en) * 2000-09-15 2002-03-26 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Compositions and methods for inducing specific cytolytic t cell responses
CA3167595A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Hpv epitopes targeted by t cells infiltrating cervical malignancies for use in vaccines
ES2953434T3 (es) * 2009-08-24 2023-11-13 Baylor College Medicine Generación de líneas de CTL con especificidad frente a múltiples antígenos tumorales o múltiples virus
JP6081483B2 (ja) * 2011-12-12 2017-02-15 セル・メディカ・リミテッド Ｔ細胞を増殖させるプロセス
EP4303229A3 (en) 2014-01-21 2024-04-17 Novartis AG Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
US9642906B2 (en) 2016-09-16 2017-05-09 Baylor College Of Medicine Generation of HPV-specific T-cells
AU2017326173B2 (en) 2016-09-16 2022-08-18 Baylor College Of Medicine Platform for activation and expansion of virus-specific T-cells

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019529417A (ja) 2019-10-17
CA3036747A1 (en) 2018-03-22
US20190224302A1 (en) 2019-07-25
CA3089667A1 (en) 2019-08-08
AU2017326601A1 (en) 2019-04-11
US11590218B2 (en) 2023-02-28
CN109996869A (zh) 2019-07-09
SG11202007187TA (en) 2020-08-28
US20180250379A1 (en) 2018-09-06
KR20190071689A (ko) 2019-06-24
US20210077612A1 (en) 2021-03-18
CN111936619A (zh) 2020-11-13
WO2018050818A1 (en) 2018-03-22
EP3746548A1 (en) 2020-12-09
EP3512936A1 (en) 2019-07-24
JP2021511805A (ja) 2021-05-13
TW201814040A (zh) 2018-04-16
ES2876152T3 (es) 2021-11-12
US10500265B2 (en) 2019-12-10
EP3512936B1 (en) 2021-04-28
US9642906B2 (en) 2017-05-09
US20170028052A1 (en) 2017-02-02
WO2019149801A1 (en) 2019-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10500265B2 (en) Generation of HPV-specific T-cells
TWI780069B (zh) 用於病毒專一性t細胞之活化及增生的平台
US11649437B2 (en) Generating HPV antigen-specific cells from a naive T cell population
TW202104245A (zh) Ebv特異性免疫細胞
US8652482B2 (en) HPV E6 protein T cell epitopes and uses thereof
CN113521270B (zh) 一种ebv复合抗原、树突状细胞疫苗及其应用
US11999967B2 (en) Generating HPV antigen-specific cells from a naive T cell population
JPWO2002100889A1 (ja) ヒトパピローマウイルスｅ７抗原の新規エピトープおよびそのエピトープにより活性化されたｃｄ４陽性ｔ細胞
CN118005806A (zh) 嵌合抗原受体、人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用