CN109078179A

CN109078179A - Hendra和Nipah病毒G糖蛋白免疫原性组合物

Info

Publication number: CN109078179A
Application number: CN201810896473.2A
Authority: CN
Inventors: J.M.哈达姆; J.黄; P.J.多米诺夫斯基
Original assignee: Zoetis LLC
Current assignee: Zoetis LLC; Zoetis Services LLC
Priority date: 2013-09-05
Filing date: 2014-09-03
Publication date: 2018-12-25
Also published as: US20160199482A1; HK1224177A1; US20190083604A1; CN105530956A; AU2014315353A1; MX2016002903A; WO2015034903A1

Abstract

本发明涉及Hendra病毒和Nipah病毒免疫原性组合物以及使用方法。本发明进一步涉及包含Hendra病毒G糖蛋白的免疫原性组合物，以及预防Nipah病毒感染和疾病的方法。本发明还涉及区分接种本发明的所述免疫原性组合物的受试者与感染Hendra和/或Nipah病毒的受试者的方法。

Description

Hendra和Nipah病毒G糖蛋白免疫原性组合物

本申请是申请日为2014年9月3日、申请号为201480048928.5、发明名称″Hendra和Nipah病毒G糖蛋白免疫原性组合物″的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及免疫原性和疫苗组合物，其包含来自Hendra病毒(HeV)和/或Nipah病毒(NiV)的G糖蛋白，并且涉及与其相关的使用方法。本发明还涉及包含适用于预防由NiV引起的感染和疾病的来自HeV的G糖蛋白的组合物。

背景技术

NiV的导致大量人类灾祸的复发型发作最近已很成问题(参见例如Butler(2000)Nature 429，7；Gurley等，(2007)Emerging Infectious Diseases 13(7)，1031-1037)。病例研究已经将人的疾病与来自猪的动物传染病传播联系起来(参见例如Parashar等，(2000)J Infect Dis.181，1755-1759)。还已知HeV会导致人和动物的灾祸，并且在基因和免疫学上与NiV紧密相关。Nipah病毒与Hendra病毒都是美国国家过敏症和传染病研究所生物防御问题C类优先试剂，并且是USDA-APHIS High-Consequence Tier 3外来兽疫试剂，这意谓关于对策储备要求，其在程序优先级方面得到极大考虑。

目前有一种得到许可的用于预防由Hendra病毒引起的感染或疾病的疫苗(HeV；Zoetis)；而不存在用于预防Nipah病毒感染的得到许可的疫苗。因为这些病毒是动物传染病的4级生物安全试剂(BSL-4)，所以与安全问题关联的疫苗生产和/或诊断具有极高成本并且是困难的。

多个团队已经证明基于源自HeV(参见例如McEachern等，(2008)Vaccine 26，3842-3852；Bossart等，(2012)Sci Transl Med.4(146)，1-8)或源自NiV(参见例如Mungall等，(2006)J Virol.80(24)，12293-12302；Weingartl等，(2006)J Viro1.80(16)，7929-7938)的抗原的重组型G蛋白疫苗可提供针对感染的保护。然而，无一已成功商业化这些疫苗中的任一种。因此，仍需要允许高产量生产的Nipah病毒或Hendra病毒疫苗和诊断剂。

副粘病毒如HeV和NiV在病毒颗粒的包膜中具有两种主要的膜锚定糖蛋白。将病毒颗粒与宿主细胞上的受体连接所需的一种糖蛋白命名为血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)或血凝素蛋白(H)，并且另一个是糖蛋白(G)，其既不具有血细胞凝集活性也不具有神经氨酸酶活性。连接糖蛋白是II型膜蛋白，其中分子的氨基(N)端向着细胞质定向并且蛋白质的羧基(C)端是细胞外的。另一种主要糖蛋白是融合(F)糖蛋白，其为含有两个七肽重复(HR)区域和疏水性融合肽的I类三聚融合包膜糖蛋白。HeV和NiV通过与pH值无关的进入受体宿主细胞的膜融合过程、通过其连接G糖蛋白与F糖蛋白在受体结合之后的一致行动来感染细胞。HeV和NiV连接G糖蛋白的主要功能在于将适当受体接合在宿主细胞的表面上，对于大部分充分表征的副粘病毒来说为唾液酸部分。HeV和NiV G糖蛋白利用宿主细胞蛋白受体肝配蛋白B2和/或肝配蛋白B3，并且已经开发出阻断通过G糖蛋白实现的病毒连接的抗体(WO2006137931，Bishop(2008)J.Virol.82：11398-11409)。此外，已经开发出还使用G糖蛋白作为产生针对HeV和NiV感染的免疫保护反应的手段的G糖蛋白的疫苗(WO2009117035)。K.Bossart等(Journal of Virology，第79卷，第6690-6702页，2005)和B.Mungall等(Journal of Virology，第80卷，第12293-12302页，2006)合理地提出，Hendra病毒G糖蛋白可能交叉预防由Nipah引起的病毒感染。当然，待解决的问题是提供增强交互保护并且使其高效并且在医学上和商业上实用的高效疫苗组合物。

HeV和/或NiV G糖蛋白与生物学上可接受的佐剂在疫苗中的组合代表了开发有效HeV和NiV疫苗中的进步，这是考虑到当这些组分组合施用时，有着免疫反应性增强与佐剂副作用减小的潜力。

发明内容

本发明涵盖一种免疫原性组合物，其包含Hendra和/或Nipah病毒G蛋白、佐剂和一种或多种赋形剂，其量会在向受试者施用之后有效引发针对Hendra和/或Nipah病毒的中和抗体的产生。

在一些实施方案中，可溶性Hendra病毒G糖蛋白由原生Hendra G糖蛋白的氨基酸73至604(SEQ ID NO：2)组成。在一些实施方案中，可溶性Hendra病毒G糖蛋白由包含SEQ IDNO：16的核苷酸64至1662的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，可溶性Hendra病毒G蛋白以二聚体形式存在，其中每一可溶性Hendra病毒G糖蛋白二聚体亚单元由一个或多个二硫键连接。在一些实施方案中，可溶性Hendra病毒G蛋白以四聚体形式存在。在一些实施方案中，四聚体形式以由一个或多个二硫键非共价键联和/或连接的二聚体的二聚体形式存在。在一些实施方案中，可溶性Hendra病毒G蛋白的浓度可为在免疫原性组合物中约5μg/ml至250μg/ml(也参见WO2006/085979)。

在一些实施方案中，佐剂可为水包油乳液。

在一些实施方案中，佐剂可为SP-油。

在一些实施方案中，佐剂可以包含皂角苷、固醇、季铵化合物、聚合物、糖脂和免疫刺激性低核苷酸。

在一些实施方案中，本发明还涵盖一种在受试者中产生针对Hendra和/或Nipah病毒的中和抗体反应的方法，其包括以有效产生中和抗体反应的量和持续时间向所述受试者施用本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，中和抗体反应会减少Hendra和/或Nipah病毒在受试者体内复制，并且还可以减少Hendra和/或Nipah病毒在受试者体内脱落。在一些实施方案中，受试者已经暴露于Hendra和/或Nipah病毒，而在其它实施方案中，受试者正遭受Hendra和/或Nipah病毒感染。在一些实施方案中，本发明涵盖一种在受试者中产生针对Hendra病毒的中和抗体反应的方法，其包括以有效产生中和抗体反应的量和持续时间向所述受试者施用本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，本发明涵盖一种在受试者中产生针对Nipah病毒的中和抗体反应的方法，其包括以有效产生中和抗体反应的量和持续时间向所述受试者施用本文所述的免疫原性组合物。

在一些实施方案中，肌肉内施用免疫原性组合物。在一些实施方案中，分多次剂量施用免疫原性组合物，并且第二剂在第一剂之后至少约21天至约28天。在一些实施方案中，每一剂含有约50μg、约100μg或约250μg可溶性Hendra病毒G蛋白。

本发明进一步涵盖一种区分接种有本文所述的免疫原性组合物的受试者与暴露于Hendra和/或Nipah病毒的受试者的方法，其包括针对选自融合蛋白(F)、基质蛋白(M)、磷蛋白(P)、大型蛋白质(L)和核衣壳蛋白(N)的以下HeV和/或NiV病毒蛋白中的任意种中的至少一种，检测从受试者分离的生物样本中抗体的存在。

可向受试者如人、马、奶牛、绵羊、猪、山羊、鸡、狗或猫施用本发明的免疫原性组合物和方法。

本发明还涵盖一种在人受试者中产生针对Hendra和/或Nipah病毒的中和抗体反应的方法，其包括以有效产生中和抗体反应的量和持续时间向所述受试者施用包含Hendra病毒可溶性G糖蛋白的免疫原性组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物进一步包含佐剂。关于适用于实践本发明的Hendra病毒G糖蛋白多肽、其重组表达和配制到疫苗组合物中，已公布的国际专利申请WO 2012/158643和WO2006/085979的整个公开内容以引用的方式并入本文中，如同完整地阐述一样。

附图说明

图1描绘了sGHeV接种和NiV激发时程的示意图。sGHeV接种、NiV激发和安乐死的日期由箭头指示。如所示(*)在激发后第-42、-7、0、3、5、7、10、14、21和28天收集血液和拭子样品。灰色文本表示激发时间线(顶行)；黑色文本表示接种时间线(底行)。示出了在每一疫苗剂量组中的受试者和一个对照受试者的非洲绿猴(AGM)数目。

图2描绘了NiV感染受试者的存活率曲线。使用来自对照受试者(n＝2)和sGHeV接种受试者(n＝9)的数据以产生Kaplan-Meier存活率曲线。对照包括来自另一个历史对照受试者的数据。接种受试者接受皮下施用的10μg、50μg或100μg sGHeV两次。在对照受试者中到末级疾病的平均时间为11天，而所有接种受试者都存活到研究结束时安乐死为止。

图3描绘了接种受试者中的NiV和HeV特异性免疫球蛋白(Ig)。从接种受试者收集血清和鼻拭物，并且使用sGHeV和sGNiV多工微球分析来评价IgG、IgA和IgM反应。个别地分析来自同一疫苗剂量组(n＝3)中的受试者的血清或拭抹物，并且计算微球中值荧光强度(M.F.I)的平均值，将其示于Y轴上。误差条表示平均值的标准误差。血清sG特异性Ig示为黑色(sGHeV(空心三角形)、sGNiV(实心三角形))，并且粘膜sG特异性IgA示为灰色符号(sGHeV(空心三角形)、sGNiV(固体状三角形))。

序列表简述

SEQ ID NO：1提供原生Hendra G糖蛋白和相应密码子的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2提供原生Hendra G糖蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3提供原生Nipah G糖蛋白和相应密码子的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4提供编码Nipah G糖蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5提供人造引物，参见实施例1。

SEQ ID NO：6提供人造引物，参见实施例1。

SEQ ID NO：7提供人造引物，参见实施例1。

SEQ ID NO：8提供人造引物，参见实施例1。

SEQ ID NO：9提供人造引物，参见实施例1。

SEQ ID NO：10提供人造引物，参见实施例1。

SEQ ID NO：11提供人造引物，参见实施例1。

SEQ ID NO：12提供人造引物，参见实施例1。

SEQ ID NO：13提供人造引物，参见实施例1。

SEQ ID NO：14提供另一Hendra G蛋白可溶性片段氨基酸序列，和相应核苷酸序列。

SEQ ID NO：15提供具有Ig(κ)前导序列的Hendra G糖蛋白。

SEQ ID NO：16提供编码可溶性Hendra G糖蛋白的密码子优化的核苷酸序列。

SEQ ID NO：17提供另一Hendra G蛋白序列。

SEQ ID NO：18提供人造引物，参见实施例1。

SEQ ID NO：19提供人造引物，参见实施例1。

具体实施方式

疫苗和免疫原性组合物

本发明的疫苗和免疫原性组合物在已被施用所述组合物的受试者中诱导许多体液和细胞免疫反应中的至少一种，或者有效增强至少一种针对HeV和/或NiV病毒株中的至少一种病毒株的免疫反应，以使所述施用适用于接种目的和/或通过一种或多种HeV和/或NiV病毒株来预防HeV和/或NiV感染。本发明的组合物从HeV和/或NiV和佐剂向有需要的受试者递送G糖蛋白，包括可溶性G糖蛋白。在一些实施方案中，G糖蛋白的量包括但不限于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200或250μg/ml。对于猪，G糖蛋白抗原的推荐量在每剂约5μg与100μg之间，每剂优选为约0.5ML至约2.0ML。优选给予2剂，例如隔开2周与3个月之间，保护性免疫的持续时间延长到一年或更长。按照本发明的实践，还可以对断奶前后(即在约21天寿命之前或之后)的小猪接种。

A.HeV和NiV G蛋白。在一些实施方案中，疫苗和免疫原性组合物包含一种或多种如本文所述的HeV和/或NiV G糖蛋白。术语蛋白质在本文中广泛用于包括多肽或其片段。举例来说并且不加限制，HeV G糖蛋白可以呈可溶形式并且包含Wang(2000)J.Virol.74，9972-9979(也参见Yu(1998)Virology 251，227-233)中的HeV G糖蛋白的氨基酸序列的氨基酸73-604。又举例来说并且不加限制，NiV G糖蛋白可以呈可溶形式并且包含Harcourt(2000)Virology 271：334-349，2000(也参见Chua(2000)Science，288，1432-1)中的NiV G糖蛋白的氨基酸序列的氨基酸71-602。

一般来说，HeV和NiV G糖蛋白的可溶形式包含HeV或NiV的G糖蛋白的胞外域(例如细胞外)的全部或部分，并且通常通过缺失G糖蛋白的跨膜域的全部或部分和G糖蛋白的细胞质尾部的全部或部分来产生。举例来说，可溶性G糖蛋白可以包含HeV或NiV G糖蛋白的完整胞外域。又举例来说并且不加限制，可溶性G糖蛋白可以包含HeV或NiV G糖蛋白的胞外域的全部或部分和跨膜域的部分。

本发明的可溶性HeV或NiV G糖蛋白通常保留相应原生病毒糖蛋白的一种或多种特征，如与病毒宿主细胞受体相互作用或结合的能力、可以低聚形式产生，或引发能够识别原生G糖蛋白的抗体(包括但不限于病毒中和抗体)的能力。其它特征的实例包括但不限于阻断或预防宿主细胞感染的能力。可以利用常规方法以评价可溶性HeV或NiV G糖蛋白的一种或多种特征。

举例来说并且不加限制，编码可溶性HeV G糖蛋白的聚核苷酸可以包含编码Wang(2000)J.Virol.74，9972-9979中的HeV G糖蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的约氨基酸73-604的聚核苷酸序列。又举例来说并且不加限制，编码可溶性HeV G糖蛋白的聚核苷酸可以包含Wang(2000)J.Viro1.74，9972-9979中的HeV G糖蛋白的聚核苷酸序列的核苷酸9129-10727。另外，也可以利用编码HeV G糖蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的约氨基酸73-604的密码子优化聚核苷酸序列。在一些实施方案中，这些密码子优化序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：16的核苷酸64-1662。在其它实施方案中，密码子优化序列包含以下或由以下组成：包括编码Igκ前导序列的核苷酸的SEQ ID NO：16。

举例来说并且不加限制，NiV G糖蛋白可以呈可溶形式并且包含Harcourt(2000)Virology 271，334-349中的NiV G糖蛋白的氨基酸序列的氨基酸71-602。可用于构筑可溶性NiV G糖蛋白的序列的非限制性实例可见于Harcourt(2000)Virology 271，334-349中。一般来说，来自任何Nipah病毒分离物或病毒株的G糖蛋白序列都可以用于产生本发明的聚核苷酸和多肽。

举例来说并且不加限制，编码可溶性NiV G糖蛋白的聚核苷酸可以包含编码Harcourt(2000)Virology 271，334-349中的NiV G糖蛋白的氨基酸序列的约氨基酸71-602的聚核苷酸序列。又举例来说并且不加限制，编码可溶性NiV G糖蛋白的聚核苷酸可以包含Harcourt(2000)Virology 271，334-349中的NiV G糖蛋白的聚核苷酸序列(SEQ ID NO：4)的234-2042。另外，也可以利用编码NiV G糖蛋白的氨基酸序列的约氨基酸71-602的密码子优化聚核苷酸序列。

这些G糖蛋白的功能等效体可用于本发明的免疫原性和疫苗组合物中。举例来说并且不加限制，功能等效多肽具有一种或多种以下特征：与病毒宿主细胞受体相互作用或结合的能力、可以二聚或四聚形式产生、引发能够识别原生G糖蛋白的抗体(包括但不限于HeV和/或NiV病毒中和抗体)的能力和/或阻断或预防宿主细胞感染的能力。

在一些实施方案中，G糖蛋白可以呈二聚和/或四聚形式。这些二聚体取决于在G糖蛋白中的半胱氨酸残基之间形成的二硫键的形成。当在HeV或NiV的表面表达时，这些二硫键可对应于在原生G糖蛋白中形成的那些(例如半胱氨酸的位置保持不变)，或者可以在G糖蛋白的存在性和位置上有改变(例如通过改变氨基酸序列中半胱氨酸的位置来实现)，以形成增强抗原性的G糖蛋白的不同的二聚和/或四聚形式。另外，非二聚和四聚化形式也在本发明中，这再次考滤到G糖蛋白呈现许多构象依赖性抗原表位(即由三级三维结构产生的那个)并且保持许多这些天然抗原表位是极优选的以赋予中和抗体反应。

本发明的HeV免疫原性和疫苗组合物可以含有可变长度的蛋白质，但是包括SEQID NO：2的氨基酸残基73-604。在本发明的一个实施方案中，本发明的包膜蛋白与SEQ IDNO：2(包括氨基酸73-604)的HeV糖蛋白至少约85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一。因此，本发明的HeV G糖蛋白包含具有足以产生构象抗原表位的数目的氨基酸的原生HeV G糖蛋白的免疫原性片段。免疫原性片段的非限制性实例包括长度可为至少530、531、532、533、534或535个或更多个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，HeV G糖蛋白包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：2或进一步包含Igκ前导序列(SEQ ID NO：15)的合成构筑体。

本发明的NiV免疫原性和疫苗组合物可以含有可变长度的蛋白质，但是包括SEQID NO：4的氨基酸残基71-602。在本发明的一个实施方案中，本发明的包膜蛋白与SEQ IDNO：4(包括氨基酸71-602)的NiV糖蛋白至少约85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一。因此，本发明的NiV G糖蛋白包含具有足以产生构象抗原表位的数目的氨基酸的原生NiV G糖蛋白的免疫原性片段。免疫原性片段的非限制性实例包括长度可为至少528、529、530、531、532或535个或更多个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV G糖蛋白包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：4或进一步包含前导序列的合成构筑体。

如本文所述的免疫原性片段将含有抗原的至少一个抗原表位，并且显示HeV和/或NiV抗原性，并且当呈现于合适的构筑体中时，如当与其它HeV和/或NiV抗原稠合或者呈现于载体上时能够产生免疫反应，所述免疫反应针对原生抗原。在本发明的一个实施方案中，免疫原性片段含有至少20个来自HeV和/或NiV抗原的邻接氨基酸，例如至少50、75或100个来自HeV和/或NiV抗原的邻接氨基酸。

HeV和NiV G糖蛋白实施方案进一步包括包含与原生HeV或NiV G糖蛋白具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列的分离多肽，其中所述多肽序列可以与原生HeV或NiV G糖蛋白氨基酸序列同一，或者可以与原生HeV或NiV G蛋白氨基酸序列相比包括最多某一整数个氨基酸变化，其中所述变化选自至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守性和非保守性取代，或***)，并且其中所述变化可以发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置，或者在那些末端位置之间的任一处，个别地散于参考序列或原生HeV或NiV G糖蛋白氨基酸序列内的一个或多个邻接基团中的氨基酸之间。

在氨基酸序列层面的序列一致性或同源性可通过BLAST(局部比对搜索基本工具)分析来测定，所述BLAST分析使用定制用于序列相似性搜索的程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx(Altschul(1997)Nucleic Acids Res.25，3389-3402和Karlin(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，2264-2268)所用的算法。BLAST程序所用的方法在于首先考虑类似区段，有间隙(非邻接)和无间隙(邻接)、在查询序列与数据库序列之间，然后评价所有所鉴别的匹配的统计意义，最后仅概括满足有意义的预选临限值的那些匹配。为了讨论序列数据库的相似性搜索中的基本问题，参见Altschul(1994)Nature Genetics 6，119-129。直方图、描述、比对、预期(即针对数据库序列报道匹配的统计意义临限值)、截断值、矩阵和滤镜(低复杂性)的搜索参数为默认设置。blastp、blastx、tblastn和tblastx所用的默认计分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10915-10919)，其被推荐用于超过85个氨基酸长度的查询序列。

本发明的疫苗和免疫原性组合物可以进一步包含来自不同病毒株的可以进一步加强本发明的免疫方法的其它HeV和/或NiV G蛋白。

B.佐剂

本发明大体来说提供免疫原性组合物，包括疫苗组合物，所述疫苗组合物包含可溶形式的HeV和/或NiV G糖蛋白包膜蛋白与佐剂的组合，以及将这些组合物用于预防和治疗受试者的HeV和/或NiV感染的方法。在本发明中，疫苗和/或免疫原性组合物包含佐剂。如本文中使用，“佐剂”是指虽然本身不具有任何特异性抗原作用，但是可刺激免疫***从而提高对抗原的反应的试剂。

本文所述的组合物中所用的佐剂的浓度将取决于佐剂的性质。佐剂典型地以约1-50％(v/v)的最终浓度并且更典型地以约10％、15％、20％、25％或30％(v/v)的最终浓度存在于本文所述的组合物中。在包含SP-油的组合物中，佐剂典型地以约1％与约25％(v/v)之间、更典型地在约5％与约15％(v/v)之间，如以约10％(v/v)存在。在包含丙烯酸聚合物以及包含一或更多种萜烃和聚氧化乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的可代谢油混合物的组合物中，丙烯酸聚合物与可代谢油/聚氧化乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物的比率典型地是在约1∶25与约1∶50之间的比率并且典型地处于在约1％与约25％(v/v)之间的最终浓度。

在一个实施方案中，生物学上可接受的佐剂包含SP-油。SP-油是流化油乳液，其包括聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物(L121，BASF公司)、角鲨烷、聚氧化乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(80，ICI Americas)和缓冲盐溶液。SP-油是有效的疫苗佐剂，并且当向受试者施用时能够诱导细胞介导性(CMI)与体液免疫反应(参见例如US 5,709,860)。

聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物是有助于悬浮固体和液体组分的表面活性剂。这些表面活性剂可作为聚合物以商品名商购获得。优选的表面活性剂是泊洛沙姆401，其可以商品名L121商购获得。一般来说，SP-油乳液是一种免疫刺激性佐剂混合物，其将包含约1％至3％体积/体积嵌段共聚物、约2％至6％体积/体积角鲨烷、更具体地约3％至6％角鲨烷，和约0.1％至0.5％体积/体积聚氧化乙烯失水山梨糖醇单油酸酯，其余部分为缓冲盐溶液。

在一个实施方案中，SP-油以在约1％与约25％v/v之间的浓度存在。在一个实施方案中，SP-油以在约5％与约15％v/v之间的浓度存在。在一个实施方案中，SP-油以约10％v/v的浓度存在。

在一些实施方案中，佐剂可以包含皂角苷如Quil A、固醇如胆固醇、季铵化合物如二甲基双十八基溴化铵(DDA)、聚合物如聚丙烯酸(Lubrizol公司)、糖脂如N-(2-去氧-2-L-亮氨酰基氨基-b-D-葡萄哌喃糖基)-N-十八烷基十二酰基酰胺氢乙酸盐和免疫刺激性低核苷酸，包括基于DNA和基于RNA的低核苷酸。

在一些实施方案中，用于本发明的皂角苷是Quil A和/或其衍生物。Quil A是从南美的树：皂树(Quillaja saponaria Molina)分离的皂角苷制剂，并且由Dalsgaard(1974)，Saponin adjuvants，Archiv.für die gesamte Virusforschung，第44卷，SpringerVerlag，第243-254页首次描述为具有佐剂活性。已经通过HPLC分离出Quil A的纯化片段，其保留了佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性(EP 0362278)，例如QS7和QS21(也称作QA7和QA21)。QS21是源自皂树树皮的天然皂角苷，其会诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、Th1细胞和占优势的IgG2a抗体反应，并且是用于本发明的情形中的皂角苷。其它适用于佐剂的皂角苷包括但不限于Quil A的QH-A、QH-B和QH-C亚级分、来自除皂树以外的物种的那些，如来自人参属(人参)、黄芪属、牛膝属、大豆属、***胶属和党参属的那些。在一些实施方案中，从除皂树(Quillaja saponaria)以外的物种分离皂角苷。

在一些实施方案中，佐剂可以包含固醇。固醇共有常见的化学核，所述核是具有通常与碳-3连接的羟基(OH)的类固醇环结构。脂肪酸取代基的烃链的长度从16至20个碳原子变化，并且可为饱和或不饱和的。固醇通常在环结构中含有一个或多个双键，以及与环连接的多个取代基。固醇并且其脂肪酸酯基本上不溶于水。鉴于这些化学相似性，共有这个化学核的固醇因此当用于本发明的疫苗组合物中时可能将具有类似性质。适用于佐剂的固醇包括胆固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、麦角醇和麦角钙化醇。这些固醇为本领域所熟知，并且可商购得。例如，Merck Index，第12版，第369页中公开了胆固醇。适用于佐剂的固醇的量取决于所用固醇的性质。然而，其通常以每剂约1μg至约5,000μg的量使用。其还以每剂约1μg至约4,000μg、每剂约1μg至约3,000μg、每剂约1μg至约2,000μg和每剂约1μg至约1,000的量使用。其还以每剂约5μg至约750μg、每剂约5μg至约500μg、每剂约5μg至约200μg、每剂约5μg至约100μg、每剂约15μg至约100μg和每剂约30μg至约75μg的量使用。

在一些实施方案中，佐剂可以包含季胺化合物。这些化合物基于铵，具有四个烃基。实际上，烃基通常限于烷基或芳基。在一个实施方案中，季胺化合物由四条烷基链组成，其中两条为C10-C20烷基，并且其余两条为C1-C4烷基。在一个实施方案中，季胺为二甲基双十八基溴化铵(DDA)、氯化物或药学上可接受的反离子。

在一些实施方案中，佐剂可以包含一种或多种免疫调节剂，如白细胞介素、干扰素或其它细胞因子。这些材料可商购得。适用于佐剂的免疫调节剂的量取决于所用免疫调节剂的性质和受试者。然而，其通常以每剂约1μg至约5,000μg的量使用。其还以每剂约1μg至约4,000μg、每剂约1μg至约3,000μg、每剂约1μg至约2,000μg和每剂约1μg至约1,000的量使用。其还以每剂约5μg至约750μg、每剂约5μg至约500μg、每剂约5μg至约200μg、每剂约5μg至约100μg、每剂约15μg至约100μg和每剂约30μg至约75μg的量使用。

在一些实施方案中，佐剂可以包含一种或多种聚合物，例如像DEAE葡聚糖、聚乙二醇和聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸(例如)。这种材料可商购得。适用于佐剂的聚合物的量取决于所用聚合物的性质。然而，其通常以约0.0001％(体积比体积，v/v)至约75％v/v的量使用。在其它实施方案中，其以0.001％v/v至约50％v/v、约0.005％v/v至约25％v/v、约0.01％v/v至约10％v/v、约0.05％v/v至约2％v/v和约0.1％v/v至约0.75％v/v的量使用。在另一实施方案中，其以约0.02％v/v至约0.4％v/v的量使用。DEAE-葡聚糖的分子尺寸可在50,000Da至5,000,000Da的范围内，或者其可在500,000Da至2,000,000Da的范围内。这种材料可以商购得或者从葡聚糖制备。

在一些实施方案中，佐剂可以包含糖脂。合适的糖脂通常为活化Th2反应的糖脂。糖脂包括不限于由式I涵盖并且通常描述于美国公布20070196384(Ramasamy等)中的那些。

在式I的结构中，R1和R2独立地为氢，或者具有最多20个碳原子的饱和烷基；X为-CH2-、-O-或-NH-；R2为氢或者具有最多20个碳原子的饱和或者不饱和烷基；R3、R4和R5独立地为氢、-SO42-、-PO42-、-COC1-10烷基；R6为L-丙氨酰基、L-α-氨基丁基、L-精氨酰基、L-天冬酰基、L-天冬氨酰基、L-半胱氨酰基、L-谷氨酰基、L-甘氨酰基、L-组氨酰基、L-羟脯氨酰基、L-异白氨酰基、L-白氨酰基、L-赖氨酰基、L-甲硫氨酰基、L-鸟氨酰基、L-苯基丙氨酰基(L-phenyalany)、L-脯氨酰基、L-丝氨酰基、L-苏氨酰基、L-酪氨酰基、L-色氨酰基和L-缬氨酰基或其D-异构体。

在一个实施方案中，合适的糖脂为N-(2-去氧-2-L-白氨酰基氨基-b-D-葡萄哌喃糖基)-N-十八烷基十二酰胺或者其乙酸盐，其也以商品名Bay所知。

在一些实施方案中，佐剂可以包含免疫刺激性低核苷酸。合适的免疫刺激性低核苷酸包括ODN(基于DNA)和ORN(基于RNA)低核苷酸，其可以具有经过改性的主链，其包括不限于硫逐磷酸酯改性、卤化、烷基化(例如乙基或甲基改性)和磷酸二酯改性。在一些实施方案中，可以使用聚次黄嘌呤核苷-胞嘧啶核苷酸或其衍生物(聚I：C)。在一组实施方案中，本发明的低核苷酸含有回文序列并且优选能够形成包含干和环的发夹状二级结构。在某些实施方案中，免疫刺激性低核苷酸为单股的，但其可以含有回文结构并因此形成双股，例如干-环结构。本领域已知若干类别的免疫刺激性低核苷酸。

用于佐剂中的免疫刺激性低核苷酸的量取决于所用免疫刺激性低核苷酸的性质和预期的物种。然而，其通常以每剂约1μg至约5,000μg的量使用。其还以每剂约1μg至约10mg、每剂约1μg至约5mg、每剂约1μg至约4mg、每剂约μg至约3mg、每剂约1μg至约2mg和每剂约1μg至约1mg的量使用。其还以每剂约5μg至约750μg、每剂约5μg至约500μg、每剂约5μg至约200μg、每剂约5μg至约100μg、每剂10μg至约100μg、每剂约15μg至约100μg的量并且以每剂约30μg至约75μg的量使用。

在一些实施方案中，佐剂可以包含基于铝的组分。铝是一种已知的佐剂或佐剂制剂的组分，并且以如铝胶(Brenntag；Denmark)或(Reheis公司；NewJersey)的形式商购获得。是结晶氢氧化物铝，在矿物学上称为水铝石。当需要结合带负电的蛋白质时，其在疫苗中有效。Al₂O₃的含量根据级别在2％至10％的范围内，并且其粘度为1000-1300cP。大体来说，其可以描述为吸附性氢氧化铝凝胶。

在一些实施方案中，本发明包括但不限于一种免疫原性组合物，其包含能够诱导产生针对多种体外HeV和/或NiV病毒株的可交叉反应的中和性抗血清的分离的HeV或NiV G蛋白，和佐剂，所述佐剂包含聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物(L121)、角鲨烷、聚氧化乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(80)和缓冲盐溶液，例如其中所述组合物含有：5μg、50μg、100μg或250μg可溶性HeV或NiV G蛋白，和适量的佐剂组分。

在本发明的另一实施方案中，疫苗和免疫原性组合物可为药物组合物的部分。本发明的药物组合物可以含有合适的药学上可接受的载体，其包括有助于将活性化合物加工成可在药学上用于递送到作用部位的制剂的赋形剂和辅助剂。

C.赋形剂

本发明的免疫原性和疫苗组合物可进一步包含呈冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂(参见例如Remington：药学科学和实践(The Scienceand practice of Pharmacy)(2005)Lippincott Williams)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所述剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如Mercury((邻羧基苯基)硫基)乙基钠盐(THIOMERSAL)、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁基或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天门酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)、TWEEN或PLURONICS。

本发明的组合物可呈悬浮于体积足以携带剂量的任何适当药物媒介物或载体中的剂量。一般来说，最终体积(包括载体、佐剂等)典型地将为至少1.0ml。上限取决于待施用的量的实践性，通常不超过约0.5ml至约2.0ml。

使用方法

本发明涵盖预防和/或治疗Hendra和/或Nipah病毒感染的方法，其包括在任何哺乳动物受试者中施用本发明的免疫原性和疫苗组合物。由接种HeV和/或NiV G糖蛋白与本文所述的佐剂引发的主动免疫性可初免或加免细胞或体液免疫反应。可将有效量的HeV和/或NiV G糖蛋白或其抗原片段制备成与佐剂的混合物以制备疫苗。

本发明涵盖在人受试者中预防和/或治疗Hendra和/或Nipah病毒感染的方法，其包括施用一种免疫原性和/或疫苗组合物，所述组合物包含单独的可溶性HeV和/或NiV G糖蛋白或其组合，或者与至少一种适用于人的佐剂的组合。适用于人的佐剂可以单独使用或组合使用。适用于人的佐剂的实例包括但不限于铝盐。铝盐的实例包括但不限于氢氧化铝、氢氧化铝凝胶(Alhydrogel^TM)、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾)或混合铝盐。适用于人的佐剂的其它实例包括但不限于油包水乳液、水包油乳液和AS04(氢氧化铝与单磷酰基脂质A的组合)和CpG低聚脱氧核苷酸。CpG低聚脱氧核苷酸为合成的低核苷酸，其在特定序列情形(CpG基序)下含有未甲基化的CpG二核苷酸。这些CpG基序在细菌DNA中以比哺乳动物DNA大20倍的频率存在。CpG低聚脱氧核苷酸由钟样受体9(TLR9)识别，从而产生强的免疫刺激作用。合适的免疫刺激性低核苷酸还包括ODN(基于DNA)和ORN(基于RNA)低核苷酸，其可以具有经过改性的主链，其包括不限于硫逐磷酸酯改性、卤化、烷基化(例如乙基或甲基改性)和磷酸二酯改性。

施用包含HeV和/或NiV G糖蛋白与一种或多种本文所述的佐剂的疫苗或免疫原性组合物可用于防治或治疗目的。在本发明的一方面，组合物适用于防治目的。当防治提供时，在HeV和/或NiV感染的任何检测或症状之前提供疫苗组合物。防治性施用有效量的化合物用于预防或减弱任何后续的HeV和/或NiV感染。

当治疗提供时，在检测到实际感染的症状后提供有效量的疫苗。如果接受者可耐受组合物的施用，那么将所述组合物称为“药理学上可接受”。如果施用量为生理学上显著的，那么称这种组合物以“治疗上或防治上有效量”施用。如果本发明的疫苗或免疫原性组合物的存在使得接受患者的生理学发生可检测的变化，例如通过增强对一种或多种HeV和/或NiV病毒株的广泛反应性体液或细胞免疫反应来实现，那么本发明的疫苗或免疫原性组合物为生理学上显著的。所提供的保护无需为绝对的(即HeV或NiV感染无需被全部预防或消除)，只要相对于对照群体有统计上显著的改进即可。保护可限于减轻疾病症状发作的严重度或速度。

本发明的疫苗或免疫原性组合物可赋予对多种HeV和/或NiV病毒株的抵抗力。如本文所用，如果向受试者施用疫苗使得感染症状或状况全部或部分减弱(即抑制)或使得个体对感染有全部或部分免疫性，那么称所述疫苗预防或减弱了感染。

至少一种本发明的疫苗或免疫原性组合物可使用如本文所述的药物组合物、通过任何达到预期目的的手段来施用。例如，这种组合物可通过多种胃肠外途径如皮下、静脉内、皮内、肌肉内、腹膜内、鼻内、透皮或经颊途径来施用。在本发明的一个实施方案中，皮下施用所述组合物。胃肠外施用可通过快速注射或通过随时间逐渐灌注来实现。

用于预防、抑制或治疗可通过细胞免疫反应、通过活性特异性细胞免疫疗法缓解的疾病或病状的典型方案包括施用有效量的如上所述的疫苗组合物，作为单次治疗施用，或作为增强或追加剂量来重复，历经最多并且包括一周至约二十四个月的时期。非限制性实例包括第一剂，接着是在第一剂(第0天)之后约至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24天的第二剂。免疫原性或疫苗组合物的剂量的量可以小于、等于或大于在第0天施用的第一剂。

根据本发明，疫苗或免疫原性组合物的“有效量”是足以达到所需生物效应(在这种情况下是至少一种对一种或多种HeV和/或NiV病毒株的细胞或体液免疫反应)的量。应了解，有效剂量将取决于受试者的年龄、性别、健康状况和体重、同时进行的治疗的种类(有的话)、治疗频率和所需效果的性质。下文提供的有效剂量的范围并不意图限制本发明，并且代表了可适用于施用本发明的组合物的剂量范围的实例。然而，剂量可以适于个别受试者，如可由本领域技术人员在没有不当实验的情况下了解和决定。

本发明的疫苗和免疫原性组合物的接受者可为任何受试者，其可通过对HeV和/或NiV的细胞或体液免疫反应来获取特异性免疫，其中所述细胞反应由MHC i类或ii类蛋白质介导。在哺乳动物中，接受者可为灵长类动物级别的哺乳动物(包括人、黑猩猩、猿和猴)。在本发明的一个实施方案中，提供一种用本发明的疫苗或免疫原性组合物治疗人的方法。受试者可能感染HeV和/或NiV或提供如在实验研究中的HeV或NiV感染模型。在一些实施方案中，受试者为驯化的哺乳动物，包括但不限于马、奶牛、牛、水牛、绵羊、猪(Mingyi(2010)Vet.Res.41，33)、山羊、狗(Biosecurity Alert-Hendra Virus Update，2011年7月27日，Press Release，Biosecurity Queensland)或猫。在一些实施方案中，受试者为家禽，包括鸡。

本发明的疫苗还在用于预防Hendra病毒感染的剂量下提供针对Nipah病毒感染的交叉保护，因此还提供针对Nipah病毒的有效接种。

对有效免疫反应的提及应理解成对直接或间接产生有利的防治或者治疗效果的免疫反应的提及。在免疫原包含如本文所述的HeV或NiV G糖蛋白的情况下，这种反应包括在动物中减少或阻断病毒复制和/或病毒脱落和/或减轻病征。应了解，功效是功能度量并且不由单独提及抗HeV和/或抗NiV抗体滴定度来定义，因为仅存在循环抗体未必表明所述循环抗体阻断病毒复制和脱落的能力。

又举例来说并且不加限制，如果正在施用本发明的可溶性G蛋白多肽以增强感染或怀疑感染Hendra或Nipah的受试者的免疫反应，和/或如果正在以被动免疫疗法形式施用本发明的抗体，那么组合物可进一步包含例如其它治疗剂(例如抗病毒剂)。

下文实施例4提供了关于某些用于为马接种的优选组合物的信息。关于可能感染Hendra病毒并因此要保证接种以保护动物与因此人都不受Hendra与Nipah病毒感染的其它动物，以下信息通常适用并且可容易地由本领域技术人员进行调适。一般来讲，伴侣动物(狗和猫)要保证约25微克Hendra抗原，并且可受益于在25-150微克范围内的ISC佐剂，5∶1∶1比率的皂角苷、磷脂质和固醇为使用任一如本文所公开的组分物质时的优选ISC组合物。对于伴侣动物，最终剂量优选为约1ml。Polygen^TM(MVP Technologies)，即一种基于共聚物的佐剂也可以在优选约5-15％(v/v)下使用。

一般来讲，对于较大型农畜(绵羊、奶牛、猪等)，在本文中另外为马提供的抗原和佐剂给药(和最终给药体积)量为适用的，为50-250微克抗原，并且可以使用典型地约250微克ISC，最终体积为例如1-3ml。关于猪，替代性并且有效的佐剂制剂包括(对于大约相同量的抗原来说)以下的共混物：ISC与离子型多糖，具体地100mg DEAE葡聚糖与800微克ISC(最终剂量体积1-3ml)(又是5∶1∶1 Quil A∶磷脂酰胆碱∶胆固醇(参见WO 2000/41720))。

接种动物的区分

本发明还涵盖区分健康接种动物与暴露于或感染HeV和/或NiV的动物的方法。在病毒感染期间，HeV和NiV表达除G糖蛋白(G)以外的其它蛋白质，包括融合蛋白(F)、基质蛋白(M)、磷蛋白(P)、大型蛋白质(L)和核衣壳蛋白(N)。这些其它蛋白质具有在动物中诱导免疫反应(以结合于这些蛋白质的形式)或T细胞免疫性的潜力。对这些其它蛋白质的抗体反应的水平通常可通过分析如酶联免疫分析(EIA)来测量。本发明的免疫原性和疫苗制剂在一些实施方案中仅含有作为HeV和/或NiV抗原的G糖蛋白，因此将用抗体诱导仅对HeV和/或NiV的G糖蛋白的免疫反应。接种本文所述的免疫原性组合物的随后由HeV或NiV感染的动物将产生对G糖蛋白的追加免疫反应，但是还将显示对一些除G糖蛋白以外的其它HeV和NiV蛋白的抗体呈现的变化。因此，融合蛋白(F)、基质蛋白(M)、磷蛋白(P)、大型蛋白质(L)和核衣壳蛋白(N)中的任一个的抗体的存在可在EIA中测量，以测定对血清样本中的这些蛋白质具有特异性的抗体存在与否。如果检测到这些其它蛋白质(即除G糖蛋白以外)中的任一个的抗体，那么动物已经暴露于HeV和/或NiV。或者，如果没有发现这些其它蛋白质的抗体并且仅检测到结合G蛋白的抗体，那么动物仅得到接种。

本发明的EIA在检测和区分感染HeV和/或NiV的动物与已经接种本文所述的免疫原性组合物的健康动物方面具有高度特异性和高度选择性。本发明可以在同源和异源环境中利用多种分析程序，包括ELISA。可以对样本如血液、血清、奶或含有抗体的任何其它体液实施分析程序。

在一些实施方案中，EIA中所用的抗体可以与由接种G糖蛋白诱导的抗体，而非在动物中由感染HeV和/或NiV诱导的抗体独特地竞争。这不仅允许血清学诊断HeV和NiV感染，而且在单一分析中将接种与感染区分开。可以对标准血清样本或含有抗体的任何体液或分泌物进行EIA程序。EIA程序可以采用G糖蛋白和任何其它HeV和/或NiV病毒蛋白(例如融合蛋白(F)、基质蛋白(M)、磷蛋白(P)、大型蛋白质(L)和核衣壳蛋白(N)，因为这些蛋白质不存在于还没有暴露于HeV和/或NiV的接过种的健康动物中)的单克隆和/或多克隆抗体。可以在任何数目的有或无计算机辅助资料分析还原软件和硬件的商购获得的固定或便携式人工、半自动化或机器人自动化ELISA设备中进行EIA。在一些实施方案中，可以对从驯化哺乳动物(包括但不限于马、奶牛、绵羊、猪、山羊、狗或猫)分离的生物样本实施区分健康接种动物与暴露于或感染HeV和/或NiV的动物的方法。在一些实施方案中，受试者为家禽，包括鸡。在一些实施方案中，受试者是人。

实施例

以下实例仅说明本发明的某些而非所有实施方案，因此不应被视为限制本发明的范围。

实施例1：载体构筑体

构筑载体以表达跨膜/细胞质尾部缺失的HeV G或NiV G。通过PCR扩增全长HeV或NiV G蛋白的克隆cDNA，以产生约2600个编码跨膜域/细胞质尾部缺失的HeV或NiV G蛋白的核苷酸的片段。

合成以下低聚核苷酸引物以扩增HeV G。sHGS：5′-GTCGACCACCATGCAAAATTACACCAGAACGACTGATAAT-3′(SEQ ID NO：5)。sHGAS：5′-GTTTAAACGTCGACCAATCAACTCTCTGAACATTGGGCAGGTATC-3′(SEQ ID NO：6)。

合成以下低聚核苷酸引物以扩增NiV G。sNGS：5′-CTCGAGCACCATGCAAAATTACACAAGATCAACAGACAA-3′(SEQ ID NO：7)。

sNGAS：5′-CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATTGCTCTGGTATC-3′(SEQ ID NO：8)。

所有PCR反应都是使用Accupol DNA polymerase(PGS Scientifics公司)、用以下设置进行的：起初94℃持续5分钟，然后94℃持续1分钟、56℃持续2分钟、72℃持续4分钟；25个循环。这些引物产生侧接Sal 1位点的sHeV G ORF和侧接Xho 1位点的sNiV G ORF的PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化(Qiagen)。在凝胶纯化之后，将sHeV G和sNiV G亚克隆到TOPO载体中(Invitrogen)。

购得PSectag2B(Invitrogen)并且改性成含有S肽标签或myc抗原表位标签。合成重叠低核苷酸，其编码S肽和消化的Kpn 1和EcoR1悬垂部分的序列。

SPEPS：5′-CAAGGAGACCGCTGCTGCTAAGTTCGAACGCCAGCACATGGATTCT-3′(SEQ ID NO：9)。SPEPAS：5′AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTTAGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC-3′(SEQ IDNO：10)。

合成重叠低核苷酸，其编码myc抗原表位标签和消化的Kpn 1和EcoR1悬垂部分的序列。

MTS：5′-CGAACAAAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3′(SEQ ID NO：11)。MTAS 5′-AATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGCTTTTGTTCGGTAC-3′(SEQ ID NO：12)。

将64ρmol SPEPS与64ρmol SPEPAS混合并且加热至65℃持续5分钟，并且缓慢冷却到50℃。将64ρmol MTS与64ρmol MTAS混合并且加热至65℃持续5分钟，并且缓慢冷却到50℃。将两种混合物稀释并且克隆到Kpn1-EcoR1消化的pSecTag2B中以产生S肽改性的pSecTag2B或myc抗原表位改性的pSecTag2B。所有构筑体起初都通过限制消化来筛选并且通过测序来进一步验证。

用纯化的Sal 1凝胶(Qiagen)消化TOPO sG构筑体，并且框中亚克隆到S肽改性的pSecTag2B或myc抗原表位改性的pSecTag2B的Xho 1位点。所有构筑体起初都通过限制消化来筛选并且通过测序来进一步验证。

然后将Igκ前导序列-S-肽-s(sGS-_tag)并且Igκ前导序列-myc标签-sHeVG(sGmyc-_tag)构筑体亚克隆到牛痘穿梭载体pMCO2中。合成低核苷酸SEQS：5′-TCGACCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTA-3′(SEQ ID NO：13)并且与低核苷酸sHGAS组合使用以通过PCR扩增sGS-_tag和sGmyc-_tag。所有PCR反应都是使用Accupol DNA polymerase(PGSScientifics公司)、用以下设置进行的：起初94℃持续5分钟，然后94℃持续1分钟、56℃持续2分钟、72℃持续4分钟；25个循环。这些引物产生侧接Sal 1位点的PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化(Qiagen)。在凝胶纯化之后，将sGS-_tag和sGmyc-_tag亚克隆到TOPO载体中(Invitrogen)。用Sal 1消化sG S-_tag和sG myc-_tag，并且亚克隆到pMCO2的Sal 1位点。所有构筑体起初都通过限制消化来筛选并且通过测序来进一步验证。随后产生密码子优化的核苷酸序列以有助于描绘于SEQ ID NO：16中的真核细胞系中的产生。

为了使用Chromos人造染色体表达(ACE)***将Hendra sG蛋白表达于CHO细胞中，通过PCR使用Pfx聚合酶(Invitrogen)，根据制造商说明书来扩增编码Hendra sG蛋白的DNA。模板是pCDNA Hendra sG(没有S肽标签)。用于扩增DNA的低核苷酸引物为：5′-GATATCGCCACCATGGAAACCGACACCCTG-3′(SEQ ID NO：18)和5′-GGTACCTCAGCTCTCGCTGCACTG-3′(SEQ ID NO：19)。使用QiaQuick凝胶提取(Qiagen)，按照制造商说明书进行片段的凝胶纯化。然后将PCR产物接合到Zero(Invitrogen)中，并且将接合混合物转型于One Shot Max效率细胞(Invitrogen)中。纯化来自阳性转化子的DNA，并且使用KpnI和EcoRV切除sG***物，并且将其接合到pCTV927，即ACE***靶载体(ATV)中。然后将接合反应物转型于大肠杆菌OmniMax细胞(Invitrogen)中。在鉴别阳性克隆体之后，分离pCTV927/Hendra sG T1质粒，然后通过测序来证实***物。

实施例2：使用CHO细胞进行可溶性G蛋白的蛋白质制造

将中国仓鼠卵巢(CHO)ChK2细胞解冻并且转移到含有CD-CHO培养基(Invitrogen)和6mM Glutamax(Gibco)的无菌125ml烧瓶，并且进行传代。在转染之前1小时，去除培养基并且用新鲜ChK2粘附培养基代替。将pCTV927/Hendra sG T1质粒分离、乙醇沉淀并且重悬到0.85μg/μL的浓度。根据制造商说明书，使用OptiMEM I(Gibco)将粘附细胞与ACE整合酶(pSI0343)以及pCTV927/Hendra sG T1与Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)共同转染。ACE整合酶由从噬菌体λDNA扩增但是优化用于哺乳动物表达的整合酶基因组成。在37℃/5％CO₂下用新鲜ChK2粘附培养基孵育培养物隔夜。次日，去除培养基，并且用PBS小心地洗涤细胞，接着添加2mL胰蛋白酶溶液以使细胞脱离，并且添加另外4mL新鲜ChK2粘附培养基。然后使细胞在96孔板中经受限制性连续稀释，接着在存放于96孔板中之后24小时用2mg/mL潮霉素进行选择。

在小心监测17天之后，选择80个个别的转染克隆体并且与1ml含有6mM glutamax(Gibco)和0.1mg/mL潮霉素(维持选择培养基)的CD-CHO(Invitrogen)一起分配到24孔板中。4天后，将克隆体与维持选择培养基一起分到如下所示新的24块板中。从每一表达烧瓶去除500微升(μL)混悬液培养物，并且将其在500×g下离心5分钟。去除上清液并且转移到清洁的新鲜管子中，并且冷冻在-20℃下。稍后解冻所有上清液并且使用Bis-Tris Mini Gels(Invitrogen)对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。每一样本进行两组，一组用于凝胶染色并且另一组用于西方墨点分析。使用凝胶转移装置(Invitrogen)将第二组凝胶转移到硝化纤维素上。将抗G蛋白多克隆抗体用作一次抗体，接着是过氧物酶缀合亲和力纯化的抗兔IgG抗体(Rockland)。然后通过添加TMB膜过氧化酶底物(KPL)来产生墨点。证实G蛋白的表达。

实施例3：使用牛痘进行可溶性G蛋白的蛋白质制造

为了制造蛋白质，使用含有密码子优化序列的遗传构筑体以产生重组型痘病毒载体(牛痘病毒，病毒株WR)。然后使用标准技术，采用tk选择和GUS染色来获得重组型痘病毒。简而言之，使用磷酸钙转染试剂盒(Promega)，用pMCO2 sHeV G融合物或pMCO2 sNiV G融合物来转染CV-1细胞。然后使这些单层在0.05PFU/细胞的感染倍率(MOI)下感染WesternReserve(WR)野生型牛痘病毒株。在2天之后，收集细胞团作为重组型病毒粗料。在25μg/ml5-溴代-2′-脱氧尿苷(BrdU)(Calbiochem)存在下用所述重组型粗料感染TK-细胞。在2小时之后，用含有1％低熔点(LMP)琼脂糖(Life Technologies)和25μg/ml BrdU的EMEM-10上覆液代替病毒。在孵育2天之后，再添加EMEM-10上覆液，其含有1％LMP琼脂糖、25μg/ml BrdU和0.2mg/ml 5-溴代-4-氯代-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(X-GLUC)(Clontech)。在24-48小时内，蓝色斑块显而易见，对其进行挑选并且再进行两轮双倍选择斑块纯化。然后扩增重组型牛痘病毒vKB16(sHeV G融合物)和vKB22(sNiV G融合物)并且通过标准方法纯化。简而言之，通过纯化斑块、细胞培养物扩增、超速离心机中蔗糖缓冲成粒和通过斑块分析进行滴定来纯化重组型牛痘病毒。在细胞溶解产物和培养物上清液中验证sHeV G的表达。

实施例4：使用293F细胞进行可溶性G蛋白的蛋白质制造

使用含有密码子优化序列的遗传构筑体以将293F细胞(Invitrogen)转型以产生表达HeV可溶性G糖蛋白的稳定细胞系。也可以将CHO-S细胞(Invitrogen)用于转型和表达HeV可溶性G糖蛋白。将转型的细胞涂铺于含35ml DMEM-10的162em²组织培养烧瓶上。使细胞在37℃下在5-8％CO₂下粘附并生长几天。当细胞融合时，将其分到多个含DMEM-10与150μg/ml潮霉素B(每个烧瓶30ml)的烧瓶中。当细胞70-80％融合时，将其用30ml PBS洗涤两次，然后添加20ml 293 SFM II(Invitrogen)，并且在37℃下在5-8％CO₂下孵育细胞隔夜。次日，将细胞转移到含200ml SFM II培养基的锥形瓶中。使细胞在37℃下在5-8％CO₂下在125rpm下生长5-6天直到细胞开始死亡为止。在那时，收集上清液。

将每一锥形瓶中的培养基在3,500rpm下离心30分钟。然后将上清液转移到250ml离心瓶中并且在10,000rpm下旋转1小时。收集所得上清液并且根据制造商建议连同TritonX-100一起添加蛋白酶抑制剂，到最终浓度0.1％。然后将上清液过滤通过0.2μm低蛋白结合滤膜。

通过使用S-蛋白琼脂糖亲和力管柱来纯化HeVsG。将20ml床体积的S-蛋白琼脂糖(Novagen)负载到XK 26管柱(GE Healthcare)中。用10倍床体积的结合/洗涤缓冲剂(0.15MNaCl，20mM Tris-HCl，pH 7.5和0.1％Triton X-100)洗涤管柱。将所制备的HeV sG上清液涂覆于管柱以维持3ml/min的流动速率。用10倍床体积(200ml)的结合/洗涤缓冲剂I，接着用6倍床体积(120ml)的洗涤缓冲剂1×洗涤缓冲剂(0.15M NaCl和20mM Tris-HCl，pH 7.5)洗涤管柱。

然后停用泵，并且当添加30ml洗脱缓冲液(0.2M柠檬酸，pH 2)时，使洗涤缓冲剂排出直到其达到珠粒表面为止。收集前10ml流经液(这应仍为洗涤缓冲液)，然后将洗脱缓冲液与珠粒一起孵育10分钟。接着，将15ml洗脱液收集到含有25ml中和缓冲液(1M Tris，pH8)的50mL无菌尖底离心管中。将pH值调节到中性并且重复洗脱和孵育三次。将所有中和的洗脱液都合并且浓缩至约4ml。通过0.2μm低蛋白结合滤膜(具有0.2μm HT Tuffryn膜的Acrodisc 13mm针筒过滤器)纯化所收集的HeV sG(4m1)。

凝胶过滤可用于进一步纯化HeV sG。在质量控制分析并且确认纯度和低聚状态之后，在-80℃下存放四聚体+二聚体、二聚体和单体的等分HeV sG汇集部分。

实施例5：在灵长类动物中Nipah病毒的临床试验

统计.以4级生物安全性(BSL-4)进行动物研究，具体地非人灵长类动物研究会严重独立地限制动物受试者的数目、可获得的生物样本的体积和重复分析的能力，因此会限制统计分析。因此，将数据呈现为由重复样本而非重复分析计算的平均值或中值，并且误差条表示复本间的标准偏差。

病毒.从格鲁吉亚亚特兰大的疾病控制与预防中心特殊病原体分公司获得NiV-马来西亚(基因库寄存号AF212302)。使NiV传代并且如在Rockx等，(2010)J.Virol.84，9831中对HeV所述在Vero细胞上滴定。

疫苗制剂.采用sGHeV的三种疫苗制剂(10μg、50μg或100μg)。如先前在Pallister(2011)Vaccine 29，5623中所述进行sGHeV的制造和纯化。每一疫苗制剂还含有Alhydrogel^TM(Accurate Chemical&Scientific公司)和含有完整硫逐磷酸酯主链的CpG低聚脱氧核苷酸(ODN)2006(Invivogen)。如下配制含有固定量ODN 2006、不同量sGHeV和铝离子(重量比为1∶25)的疫苗剂量：100μg剂量：100μg sGHeV、2.5mg铝离子和150μg ODN 2006；50μg剂量：50μg sGHeV、1.25mg铝离子和150μg ODN 2006；和10μg剂量：5μg sGHeV、250μg铝离子和150μg ODN 2006。对于所有剂量，都在添加ODN 2006之前先混合Alhydrogel^TM与sGHeV。用PBS将每一疫苗剂量调整到1ml，并且在注射之前在转轮上在室温下孵育混合物至少二至三种小时。每一受试者接受相同的1ml剂量以进行初免和加免，并且所有疫苗剂量都通过肌肉内注射来给予。

动物.将十只重4kg至6kg的年轻的成年非洲绿猴(AGM)(绿猴(Chlorocebusaethiops))(Three Springs Scientific公司)分别地关进笼内。通过肌肉内注射***(10-15mg/kg)使受试者麻醉，并且在第-42天(初免)和第-21天(加免)对其接种sGHeV。三个受试者接受两个10μg剂量(AGM 16、AGM 17、AGM 18)、三个受试者接受两个50μg剂量(AGM13、AGM 14、AGM 15)、三个动物接受两个100μg剂量(AGM 10、AGM 11、AGM 12)并且一个受试者(AGM 9)仅接受佐剂。在第0天，将受试者麻醉并且对其气管内接种含1×10⁵TCID₅₀(中值组织培养感染剂量)NiV的4ml杜贝可氏最低必需培养基(DMEM)(Sigma-A1drich)。在感染后(p.i.)第0、3、5、7、10、14、21和28天，使受试者麻醉以进行临床检查，包括体温、呼吸率、胸部射线摄影、抽血和鼻、口腔和直肠粘膜拭抹。对照受试者(AGM 9)必须在感染后第10天根据批准的人道终点进行安乐死。所有其它受试者都存活到研究结束并且在感染后第28天接受安乐死。在尸体解剖后，收集多个组织以用于病毒学和组织病理学。组织样本包括：结膜、扁桃体、口咽/鼻咽、鼻粘膜、气管、右支气管、左支气管、右肺上叶、右肺中叶、右肺下叶、左肺上叶、左肺中叶、左肺下叶、支气管***(LN)、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、胰腺、空肠、横结肠、脑(额叶)、脑(小脑)、脑干、颈脊髓、脑下垂体、颚LN、唾液LN、腹股沟LN、腋窝LN、肠系膜LN、膀胱、睾丸或卵巢、股骨骨髓。在BSL-2牵制下进行接种。接种时程的时间线、激发和生物样品收集天数示于图1中。

接种和NiV激发。之前我们已经证明了以10⁵TCID₅₀(中值组织培养感染剂量)NiV进行气管内接种会得到均匀地致命性结果(Rockx等，(2010)J.Virol.84，9831)。在这些研究中注意到快速渐进式临床疾病；临床症状包括重度抑郁症、导致急性呼吸窘迫的呼吸道疾病、重度神经疾病和活动性严重降低；并且符合批准的人道终点准则以进行安乐死的时间在7天至12天的范围内。在本文中，我们寻求确定sGHeV接种是否可预防AGM的NiV感染和疾病。将10μg、50μg或100μg sGHeV的剂量与明矾和CpG部分混合，如所述方法中所述。在第0天(初免)并且又在第21天(加免)将每一疫苗制剂皮下施用于三个受试者，并且一个对照受试者(AGM 9)仅接受佐剂，在同一天初免和加免。在第42天，用10⁵TCID₅₀ NiV对受试者进行气管内接种。对照受试者(AGM 9)显示食欲不振、重度持续性行为变化(抑郁症、活动减少、蜷身)、血小板数目减少以及疾病末期呼吸率逐渐提高。随后，AGM 9产生急性呼吸窘迫并且必须在感染后第10天根据批准的人道终点进行安乐死。相比之下，无一接种受试者患有临床疾病并且所有都存活到研究结束。图2中示出Kaplan-Meier存活图。

对照受试者中的NiV介导性疾病。对照受试者的大体病理改变与之前在感染NiV的AGM中所见一致(Geisbert等，(2010)PLoS One 5，e10690)。存在脾肿大和脑表面血管充血，并且所有肺叶都湿重。没有从AGM 9血样回收到NiV RNA和感染性病毒，并且没有病毒血症的迹象。AGM 9具有显著水平的NiV特异性IgM和可检测的NiV特异性IgG和IgA。对组织样本的进一步分析揭示类似于之前在AGM中所见的(Geisbert等，(2010)PLoS One 5，e10690)广泛散布的NiV感染的广泛NiV组织向性。如所示AGM 9在大部分组织中具有NiV RNA，并且从许多组织中回收到感染性病毒。明显的病变包括间质性肺炎、亚急性脑炎和脾白髓坏死和出血。肺泡腔由水肿液、纤维蛋白、核破裂和细胞碎屑以及肺泡巨噬细胞填充。多灶性脑炎的特征在于Virchow-Robins空间因适度数目的淋巴细胞和更少的嗜中性球而膨胀。较少数目的这些炎症细胞伸到邻近软组织中。许多神经元膨胀并且形成空泡(退化)或因核溶解(坏死)而破碎。脾白髓中小囊的多灶性生发中心因出血和纤维蛋白以及少数嗜中性球和细胞性和核破裂性碎片而消除。这些发现与脾中生发中心的坏死和损失一致。大量病毒抗原存在于脑干中，突出了中枢神经***中大面积损伤NiV的原因。

对接种sGHeV的受试者的保护。所有生物样品，包括所有在激发之后收集的血样和所有在尸体解剖时收集的组织对于NiV RNA都为阴性，并且没有从任何样品分离出感染性病毒。在靠近检查来自接种受试者的组织切片时，组织结构似乎正常并且使用免疫组织化学技术没有在任何组织中检测到NiV抗原。为了进一步剖析疫苗引发的保护机制，在接种动物中测量了血清和粘膜sGNiV和sGHeV特异性IgM、IgG和IgA以及NiV和HeV血清中和滴度。如图3中所示，在激发之前7天，接受最低sGHeV剂量的受试者具有可检测的抗原特异性血清IgM和最高水平的sGHeV特异性血清IgG。在激发之前7天，得到50μg sGHeV的受试者还具有可检测水平的血清IgM和其最高水平的血清IgG。高剂量受试者不具有可检测的血清IgM，并且在第-7天的血清IgG水平明显小于其它两个组。到NiV激发之日，高剂量受试者的血清IgG水平已经提高并且所有接种受试者都具有类似的IgG水平。在NiV激发之后，在任何受试者中，血清IgM水平都没有变化。在NiV激发之日，中剂量受试者的血清IgG水平降低，并且就在NiV激发之后，低剂量受试者的IgG水平降低。有趣的是，到感染后第3天和第5天，在这些组中，IgG水平都提高，但是从未超过在激发之前7天存在的IgG水平，并且到感染后第28天，组中的滴度都明显降低。

相反地，高剂量组的血清IgG水平持续高并且在感染后第28天达到最高。在接种之后在所有受试者中都可检测到抗原特异性血清IgA；然而，水平极低并且激发前后的水平没有显得有明显不同(图3)。在来自感染后第14天的低剂量受试者的鼻拭抹物中检测到粘膜抗原特异性IgA有最小程度的提高，然而水平因此是低的，这些粘膜抗体可能起不到预防NiV在激发后传播的作用。将血清中和测试(SNT)结果示于表9中。对于所有接种受试者，HeV特异性中和滴度都保持相同或者到感染后第28天降低，并且NiV特异性中和滴度到感染后第7天没有明显变化，甚至在在激发之前具有最低滴度的受试者中也是如此。一个低剂量和一个高剂量受试者的NiV SNT滴度到感染后第14天有对数提高，并且一个中剂量受试者的NiV SNT滴度到感染后第21天有对数提高。对于所有其它接种动物，SNT滴度变化都不一致(滴度将提高，然后降低)或者不重要(滴度提高3-4倍，但是不超过对数)。最后，在接种受试者中在NiV激发之后测量向NiV融合物(F)包膜糖蛋白的血清转化。分别地在感染后第10天和第21天在中低剂量受试者中检测到血清抗NiV F IgM的最小水平，并且这些低M.F.I.值表明在NiV激发之后弱的一次抗体反应。在高剂量受试者中没有检测到血清抗NiV-FIgM，表明这些动物在激发之后具有极少病毒至没有循环病毒。

表1.

实施例6：在猪中Nipah病毒疫苗的临床试验

将在猪中进行研究以评价有佐剂的可溶性Hendra病毒G蛋白疫苗的功效。表2中详述了所述研究的概述。疫苗将由约100微克/剂的根据实施例2的方案从CHO细胞表达并且纯化的佐剂以及10％SP-油佐剂组成。为了本实施例的目的，提供可溶性G蛋白作为原生Hendra病毒G糖蛋白的氨基酸73-604(参见SEQ ID NO：2和其讨论，还参见WO 2012/158643中的SEQ ID NO：2)。其二聚化会自发地发生，伴随着从所用细胞系表达。随着从CHO表达，所得G蛋白片段为约50％二聚体和50％四聚体、极少的其余单体。293F细胞中的表达导致约70％二聚体。10％SP-油佐剂组分和最终浓度为：Pluronic L-121，0.2％；角鲨烷，0.4％；和0.032％。在第0天和第21天通过肌肉内施用(IM)对猪接种两次。

表2.

组	猪的数目	疫苗	接种日期<sup>A</sup>	激发	激发日期<sup>B</sup>
						T01	1	PBS	第0天；第21天	PBS	第35天
T02	1	sG	第0天；第21天	PBS	第35天
						T03	2	PBS	第0天；第21天	10<sup>5</sup>PFUNiV	第35天
T04		sG	第0天；第21天	10<sup>5</sup>PFUNiV	第35天

^A肌肉内(IM)施用疫苗。

^B鼻内(IN)施用激发物质。

激发方法将follow已公布的方法(Weingartl等，2006)。激发病毒将由从先前接种试验的猪肺再分离的斑块纯化的NiV组成，并且将在Vero 76细胞上通过两次。将用总共3ml10⁵PFU NiV鼻内/经口激发本研究中的小猪。

将观测所述动物在每天饲养和清洁活动期间的任何大体效果或异常临床症状。测量直肠温度，持续驯化的前三天、接种后的前三天以及激发后的取样期间。在整个研究中每天更新动物记录。将在研究天数0、7、14、21、28、35、36、40时以及在第41或42天安乐死之前收集每一动物的血样。使PBMC或血清与血液分离以便进一步分析(例如血清抗体、免疫细胞概况，通过集中于CD4、CD8和CD25标记的流式细胞术来实现)。将在第-35天激发之前，和在第1和4天激发后，以及在安乐死之前收集口鼻拭抹物。在死后另外收集以下样本：脑脊髓液；三叉神经节；嗅球；小脑；前脑；后脑；鼻甲；扁桃体；气管；洗肺(BALF)；肺；肺相关***；下颌下***；肠系膜***；小肠；大肠；肾脏；以及尿液(可得的话)。

将在研究天数0、7、14、21、28、35、40时，以及在第41或42天安乐死之前收集用于检测中和抗体的血清样本(通过微量滴定斑块减少中和分析来实现)。将在研究天数0、21、28、35以及在安乐死之时收集用于PBMC制备的血液。将通过流式细胞术评估CD4、CD8和CD25标记以测定特定群体频率和T-记忆细胞产生方面的变化。着眼于由NiV感染造成的免疫细胞信号转导，将在来自阴性对照猪(疫苗和农场对照组)的最终血液上收集的细胞用于其它体外实验。

将重组型可溶性HeV G蛋白间接ELISA用于测定反应于接种(以及感染细胞溶解产物ELISA)的抗体产生。将对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行所选细胞因子(例如IFN-α、IFN-γ、TNF-α)的检测。通过靶向N基因的实时RT-PCR对所有样本都进行病毒RNA检测。将通过斑块分析进行病毒分离分析，并且对来自平行孔的上清液或者通过斑块免疫染色来证实NiV的存在。通过免疫组织化学检测***固定组织中的病毒。

在考虑本文所公开的发明说明和实践后，本发明的其它实施方案和用途将对本领域技术人员显而易见。在本文中引用的所有参考文献，包括所有公布、美国和国外专利和专利申请都以引用的方式被具体地且完全地并入。旨在将说明书和实施例视为仅具有示例性，而本发明的真实范围和精神由以下权利要求书指示。

序列表

<110> 硕腾服务有限责任公司

<120> Hendra和Nipah病毒G糖蛋白免疫原性组合物

<130> ZP000024A

<150> 61/874085

<151> 2013-09-05

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1815

<212> DNA

<213> Hendra病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1815)

<400> 1

atg atg gct gat tcc aaa ttg gta agc ctg aac aat aat cta tct ggt 48

Met Met Ala Asp Ser Lys Leu Val Ser Leu Asn Asn Asn Leu Ser Gly

1 5 10 15

aaa atc aag gat caa ggt aaa gtt atc aag aat tat tac ggc aca atg 96

Lys Ile Lys Asp Gln Gly Lys Val Ile Lys Asn Tyr Tyr Gly Thr Met

20 25 30

gac atc aag aaa att aac gat ggg tta tta gat agt aag ata ctt ggg 144

Asp Ile Lys Lys Ile Asn Asp Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Gly

35 40 45

gcg ttt aac aca gtg ata gct ttg ttg gga tca atc atc atc att gtg 192

Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Ile Ile Ile Val

50 55 60

atg aat atc atg ata att caa aat tac acc aga acg act gat aat cag 240

Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln

65 70 75 80

gca cta atc aaa gag tca ctc cag agt gta cag caa caa atc aaa gct 288

Ala Leu Ile Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala

85 90 95

tta aca gac aaa atc ggg aca gag ata ggc ccc aaa gtc tca cta att 336

Leu Thr Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile

100 105 110

gac aca tcc agc acc atc aca att cct gct aac ata ggg tta ctg gga 384

Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly

115 120 125

tcc aag ata agt cag tct acc agc agt att aat gag aat gtt aac gat 432

Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp

130 135 140

aaa tgc aaa ttt act ctt cct cct tta aag att cat gag tgt aat atc 480

Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile

145 150 155 160

tct tgt ccg aat cct ttg cct ttc aga gaa tac cga cca atc tca caa 528

Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln

165 170 175

ggg gtg agt gat ctt gta gga ctg ccg aac cag atc tgt cta cag aag 576

Gly Val Ser Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys

180 185 190

aca aca tca aca atc tta aag ccc agg ctg ata tcc tat act cta cca 624

Thr Thr Ser Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro

195 200 205

att aat acc aga gaa ggg gtt tgc atc act gac cca ctt ttg gct gtt 672

Ile Asn Thr Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val

210 215 220

gat aat ggc ttc ttc gcc tat agc cat ctt gaa aag atc gga tca tgt 720

Asp Asn Gly Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys

225 230 235 240

act aga gga att gca aaa caa agg ata ata ggg gtg ggt gag gta ttg 768

Thr Arg Gly Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu

245 250 255

gat agg ggt gat aag gtg cca tca atg ttt atg acc aat gtt tgg aca 816

Asp Arg Gly Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr

260 265 270

cca ccc aat cca agc acc atc cat cat tgc agc tca act tac cat gaa 864

Pro Pro Asn Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu

275 280 285

gat ttt tat tac aca ttg tgc gca gtg tcc cat gtg gga gat cct atc 912

Asp Phe Tyr Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile

290 295 300

ctt aac agt act tcc tgg aca gag tca ctg tct ctg att cgt ctt gct 960

Leu Asn Ser Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala

305 310 315 320

gta aga cca aaa agt gat agt gga gac tac aat cag aaa tac atc gct 1008

Val Arg Pro Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala

325 330 335

ata act aaa gtt gaa aga ggg aag tac gat aag gtg atg cct tac ggt 1056

Ile Thr Lys Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly

340 345 350

cca tca ggt atc aag caa ggg gat aca ttg tac ttt ccg gcc gtc ggt 1104

Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly

355 360 365

ttt ttg cca agg acc gaa ttt caa tat aat gac tct aat tgt ccc ata 1152

Phe Leu Pro Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile

370 375 380

att cat tgc aag tac agc aaa gca gaa aac tgt agg ctt tca atg ggt 1200

Ile His Cys Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly

385 390 395 400

gtc aac tcc aaa agt cat tat att ttg aga tca gga cta ttg aag tat 1248

Val Asn Ser Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr

405 410 415

aat cta tct ctt gga gga gac atc ata ctc caa ttt atc gag att gct 1296

Asn Leu Ser Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala

420 425 430

gac aat aga ttg acc atc ggt tct cct agt aag ata tac aat tcc cta 1344

Asp Asn Arg Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu

435 440 445

ggt caa ccc gtt ttc tac cag gca tca tat tct tgg gat acg atg att 1392

Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile

450 455 460

aaa tta ggc gat gtt gat acc gtt gac cct cta aga gta cag tgg aga 1440

Lys Leu Gly Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg

465 470 475 480

aat aac agt gtg att tct aga cct gga cag tca cag tgt cct cga ttt 1488

Asn Asn Ser Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe

485 490 495

aat gtc tgt ccc gag gta tgc tgg gaa ggg aca tat aat gat gct ttt 1536

Asn Val Cys Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe

500 505 510

cta ata gac cgg cta aac tgg gtt agt gct ggt gtt tat tta aac agt 1584

Leu Ile Asp Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser

515 520 525

aac caa act gca gag aac cct gtg ttt gcc gta ttc aag gat aac gag 1632

Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu

530 535 540

atc ctt tac caa gtt cca ctg gct gaa gat gac aca aat gca caa aaa 1680

Ile Leu Tyr Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys

545 550 555 560

acc atc aca gat tgc ttc ttg ctg gag aat gtc ata tgg tgt ata tca 1728

Thr Ile Thr Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser

565 570 575

cta gta gaa ata tac gat aca gga gac agt gtg ata agg cca aaa cta 1776

Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu

580 585 590

ttt gca gtc aag ata cct gcc caa tgt tca gag agt tga 1815

Phe Ala Val Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser

595 600

<210> 2

<211> 604

<212> PRT

<213> Hendra病毒

<400> 2

Met Met Ala Asp Ser Lys Leu Val Ser Leu Asn Asn Asn Leu Ser Gly

1 5 10 15

Lys Ile Lys Asp Gln Gly Lys Val Ile Lys Asn Tyr Tyr Gly Thr Met

20 25 30

Asp Ile Lys Lys Ile Asn Asp Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Gly

35 40 45

Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Ile Ile Ile Val

50 55 60

Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln

65 70 75 80

Ala Leu Ile Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala

85 90 95

Leu Thr Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile

100 105 110

Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly

115 120 125

Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp

130 135 140

Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile

145 150 155 160

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165 170 175

Gly Val Ser Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

Asp Arg Gly Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr

260 265 270

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275 280 285

Asp Phe Tyr Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile

290 295 300

Leu Asn Ser Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala

305 310 315 320

Val Arg Pro Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala

325 330 335

Ile Thr Lys Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly

340 345 350

Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly

355 360 365

Phe Leu Pro Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile

370 375 380

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385 390 395 400

Val Asn Ser Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr

405 410 415

Asn Leu Ser Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala

420 425 430

Asp Asn Arg Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu

435 440 445

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450 455 460

Lys Leu Gly Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg

465 470 475 480

Asn Asn Ser Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu

580 585 590

Phe Ala Val Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser

595 600

<210> 3

<211> 1809

<212> DNA

<213> Nipah病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1809)

<400> 3

atg ccg gca gaa aac aag aaa gtt aga ttc gaa aat act act tca gac 48

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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115 120 125

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

aat aac acg gta ata tca aga ccc ggg caa tca caa tgc cct aga ttc 1488

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

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Phe Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr

595 600

<210> 4

<211> 602

<212> PRT

<213> Nipah病毒

<400> 4

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1 5 10 15

Lys Gly Lys Ile Pro Ser Lys Val Ile Lys Ser Tyr Tyr Gly Thr Met

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Ser Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu

245 250 255

Asp Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr

260 265 270

Pro Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn

275 280 285

Glu Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile

290 295 300

Leu Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala

305 310 315 320

Val Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala

325 330 335

Leu Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly

340 345 350

Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly

355 360 365

Phe Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile

370 375 380

Thr Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly

385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

Lys Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg

465 470 475 480

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Ile Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys

545 550 555 560

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565 570 575

Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu

580 585 590

Phe Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr

595 600

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<212> DNA

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<220>

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<213> 人造序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

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<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

ctcgagcacc atgcaaaatt acacaagatc aacagacaa 39

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ctcgagtagc agccggatca agcttatgta cattgctctg gtatc 45

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成低核苷酸

<400> 9

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<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成低核苷酸

<400> 10

aattagaatc catgtgctgg cgttcgaact tagcagcagc ggtctccttg gtac 54

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成低核苷酸

<400> 11

cgaacaaaag ctcatctcag aagaggatct g 31

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成低核苷酸

<400> 12

aattcagatc ctcttctgag atgagctttt gttcggtac 39

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成低核苷酸

<400> 13

tcgacccacc atggagacag acacactcct gcta 34

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<211> 1662

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> HeV sG病毒序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1662)

<400> 14

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1 5 10 15

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50 55 60

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65 70 75 80

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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465 470 475 480

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485 490 495

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500 505 510

gat tgc ttc ttg ctg gag aat gtc ata tgg tgt ata tca cta gta gaa 1584

Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu Val Glu

515 520 525

ata tac gat aca gga gac agt gtg ata agg cca aaa cta ttt gca gtc 1632

Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val

530 535 540

aag ata cct gcc caa tgt tca gag agt tga 1662

Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser

545 550

<210> 15

<211> 553

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 15

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile

20 25 30

Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu Thr Asp

35 40 45

Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp Thr Ser

50 55 60

Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile

65 70 75 80

Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys

85 90 95

Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro

100 105 110

Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly Val Ser

115 120 125

Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser

130 135 140

Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr

145 150 155 160

Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly

165 170 175

Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly

180 185 190

Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly

195 200 205

Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn

210 215 220

Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr

225 230 235 240

Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser

245 250 255

Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro

260 265 270

Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys

275 280 285

Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly

290 295 300

Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro

305 310 315 320

Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys

325 330 335

Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser

340 345 350

Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser

355 360 365

Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg

370 375 380

Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro

385 390 395 400

Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly

405 410 415

Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser

420 425 430

Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys

435 440 445

Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu Ile Asp

450 455 460

Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr

465 470 475 480

Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile Leu Tyr

485 490 495

Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr Ile Thr

500 505 510

Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu Val Glu

515 520 525

Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val

530 535 540

Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser

545 550

<210> 16

<211> 1662

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 哺乳动物-密码子优化Hendra病毒sG

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1662)

<400> 16

atg gaa acc gac acc ctg ctg ctg tgg gtg ctg ctc ctg tgg gtc ccc 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

ggc agc aca ggc gac tac acc cgg acc acc gac aac cag gcc ctg atc 96

Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile

20 25 30

aaa gag tcc ctg cag agc gtc cag cag cag atc aag gcc ctg acc gac 144

Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu Thr Asp

35 40 45

aag atc ggc acc gag atc ggc ccc aaa gtg tcc ctg atc gac acc agc 192

Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp Thr Ser

50 55 60

agc acc atc acc atc ccc gcc aac atc ggg ctg ctg ggc tcc aag atc 240

Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile

65 70 75 80

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Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys

85 90 95

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Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro

100 105 110

aac ccc ctg ccc ttc cgg gag tac cgg ccc atc agc cag ggc gtg agc 384

Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly Val Ser

115 120 125

gac ctg gtg ggc ctg ccc aac cag atc tgc ctg cag aaa acc acc tcc 432

Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser

130 135 140

acc atc ctg aag ccc cgg ctg atc agc tac acc ctg ccc atc aac acc 480

Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr

145 150 155 160

cgg gag ggc gtg tgc atc acc gac cct ctg ctg gcc gtg gac aac ggc 528

Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly

165 170 175

ttc ttc gcc tac agc cac ctg gaa aag atc ggc agc tgc acc cgg ggc 576

Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly

180 185 190

att gcc aag cag cgg atc atc ggc gtg ggc gag gtg ctg gac cgg ggc 624

Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly

195 200 205

gac aag gtg ccc agc atg ttc atg acc aac gtg tgg acc ccc ccc aac 672

Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn

210 215 220

ccc agc aca atc cac cac tgc agc agc acc tac cac gag gac ttc tac 720

Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr

225 230 235 240

tac acc ctg tgc gcc gtg agc cac gtg ggc gac ccc atc ctg aac agc 768

Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser

245 250 255

acc agc tgg acc gag agc ctg agc ctg atc cgg ctg gcc gtg cgg ccc 816

Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro

260 265 270

aag agc gac agc ggc gac tac aac cag aag tat atc gcc atc acc aag 864

Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys

275 280 285

gtg gag cgg ggc aag tac gac aaa gtg atg ccc tac ggc ccc agc ggc 912

Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly

290 295 300

atc aag cag ggc gac aca ctg tac ttc ccc gcc gtg ggc ttc ctg ccc 960

Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro

305 310 315 320

cgg acc gag ttc cag tac aac gac agc aac tgc ccc atc atc cac tgc 1008

Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys

325 330 335

aag tac agc aag gcc gag aac tgc aga ctg agc atg ggc gtg aac agc 1056

Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser

340 345 350

aag agc cac tac atc ctg cgg agc ggc ctg ctg aag tac aac ctg tcc 1104

Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser

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Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg

370 375 380

ctg acc atc ggc agc ccc agc aag atc tac aac agc ctg ggc cag ccc 1200

Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro

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gtg ttc tac cag gcc agc tac agc tgg gac acc atg atc aag ctg ggg 1248

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gac gtg gac acc gtg gac ccc ctg cgg gtg cag tgg cgg aac aac agc 1296

Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser

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gtg atc agc aga ccc ggc cag agc cag tgc ccc cgg ttc aac gtg tgc 1344

Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys

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Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr

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515 520 525

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Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val

530 535 540

aag atc ccc gcc cag tgc agc gag agc tga 1662

Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser

545 550

<210> 17

<211> 553

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 17

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile

20 25 30

Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu Thr Asp

35 40 45

Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp Thr Ser

50 55 60

Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile

65 70 75 80

Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys

85 90 95

Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro

100 105 110

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115 120 125

Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser

130 135 140

Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr

145 150 155 160

Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly

165 170 175

Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly

180 185 190

Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly

195 200 205

Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn

210 215 220

Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr

225 230 235 240

Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser

245 250 255

Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro

260 265 270

Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys

275 280 285

Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly

290 295 300

Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro

305 310 315 320

Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys

325 330 335

Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser

340 345 350

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355 360 365

Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg

370 375 380

Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro

385 390 395 400

Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly

405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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485 490 495

Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr Ile Thr

500 505 510

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Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val

530 535 540

Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser

545 550

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造引物

<400> 18

gatatcgcca ccatggaaac cgacaccctg 30

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造引物

<400> 19

ggtacctcag ctctcgctgc actg 24

Claims

1.一种免疫原性组合物，其包含Hendra病毒G糖蛋白、佐剂制剂和一种或多种赋形剂，其量会在向受试者施用之后有效引发针对Nipah病毒的中和抗体的产生，其中所述佐剂制剂包括皂角苷、固醇、季铵化合物、丙烯酸聚合物和糖脂。

2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂制剂进一步包括选自基于DNA(ODN)和基于RNA(ORN)低核苷酸的免疫刺激性低核苷酸。

3.如权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述最终佐剂制剂包括：皂角苷如QuilA；固醇如胆固醇；季铵化合物如二甲基双十八基溴化铵(DDA)；糖脂如N-(2-去氧-2-L-亮氨酰基氨基-b-D-葡萄哌喃糖基)-N-十八烷基十二酰基酰胺氢乙酸盐；和免疫刺激性低核苷酸如CpG。

4.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述可溶性Hendra病毒G糖蛋白由原生Hendra G糖蛋白(SEQ ID NO：2)的氨基酸73至604组成。

5.如权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述可溶性Hendra病毒G糖蛋白由包含SEQ ID NO：16的核苷酸64至1662的核苷酸序列编码。

6.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述可溶性Hendra病毒G糖蛋白以二聚体形式存在。

7.如权利要求6所述的免疫原性组合物，其中每一可溶性Hendra病毒G糖蛋白二聚体亚单元由一个或多个二硫键连接。

8.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述可溶性Hendra病毒G糖蛋白以四聚体形式存在。

9.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中可溶性Hendra病毒G糖蛋白的所述浓度为约5μg/ml至约250μg/ml。

10.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述受试者为人、马、奶牛、绵羊、猪、山羊、鸡、狗或猫。

11.如权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于在受试者中产生针对Nipah病毒的中和抗体反应的药物中的应用。

12.如权利要求11所述的应用，其中所述中和抗体反应会减少所述受试者体内的Nipah病毒复制。

13.如权利要求11所述的应用，其中所述中和抗体反应会减少所述受试者体内的Nipah病毒脱落。

14.如权利要求11所述的应用，其中所述受试者已经暴露于Nipah病毒。

15.如权利要求14所述的应用，其中所述受试者正在遭受Nipah病毒感染。

16.如权利要求11所述的应用，其中通过选自肌肉内、鼻内和皮下的途径施用所述免疫原性组合物。

17.如权利要求11所述的应用，其中以单次剂量施用，或以多次剂量施用所述免疫原性组合物。

18.如权利要求17所述的应用，其中接着第一剂量的是在所述第一剂之后至少约21天至约42天的第二剂量。

19.如权利要求18所述的应用，其中每一剂量包含约50至约250μg的可溶性Hendra病毒G糖蛋白。