CN113391067B - 抗尼帕病毒g蛋白抗体的间接elisa检测方法 - Google Patents

抗尼帕病毒g蛋白抗体的间接elisa检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及抗尼帕病毒G蛋白抗体的间接ELISA检测方法。本发明以尼帕病毒G蛋白包被酶标板，利用方阵滴定法确定间接ELISA的最适工作条件，并对该方法的特异性、灵敏性、稳定性等进行分析。本发明成功建立了小鼠血清尼帕病毒G蛋白抗体间接ELISA检测方法，可应用于小鼠血清中抗尼帕病毒G蛋白抗体分析以及疫苗激发的特异性抗体效价的评价研究。

Description

抗尼帕病毒G蛋白抗体的间接ELISA检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及抗尼帕病毒G蛋白抗体的间接ELISA检测方法。
背景技术
尼帕病毒病作为一种新出现的烈性***共患传染病，可导致人类严重且高度致死(致死率40％-70％)，其病原为尼帕病毒(Nipahvirus,NiV)，为单股负链RNA病毒，属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)亨尼帕病毒属(Henipavirus)成员[1]，NiV能通过直接接触或气溶胶的形式进行传播，导致人或动物感染甚至死亡。该病毒在马来西亚和新加坡的养猪户暴发脑炎后首次发现，随后孟加拉国或印度几乎每年都会暴发脑炎。由于该病毒在尼帕双溪(Sungai Nipah)地区被分离到，因此得名。NiV目前主要有2个遗传谱系：NiV马来西亚株(NiV Malaysia,NiV-MY)和NiV孟加拉株(NiV Bangladesh,NiV-BD)。其中NiV-MY株基因组18246个核苷酸，而NiV-BD株基因组18252个核苷酸，其RNA基因组从3’-5’，由核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合糖蛋白(F)、附着糖蛋白(G)和长聚合酶(L)6个基因连续排列而成，附着在病毒RNA上的N、P和L，形成病毒核糖核蛋白(vRNP)。M、F、G构成病毒粒子的囊膜，其中M与维持病毒形态以及介导病毒出芽有关，而F、G参与介导病毒对宿主细胞的附着与入侵。
自2001年至今几乎每年都在孟加拉国和印度发生致死率超过70％-100％的NiV暴发，而最近一次暴发是在印度克日克德州(Kozhikode)，造成19人感染17人死亡，致死率高达89％，我国与印度接壤，并和孟加拉国邻近，虽然还没有病例报道，但该病具有传入我国的风险。由于该病毒的高致病性、潜在的大流行性，以及目前尚无许可的疫苗与成熟的治疗体系，因此急需研究和开发抗病毒药物和疫苗以及有效的检测方法，以帮助预防和控制未来可能暴发的疫情。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了小鼠抗尼帕病毒(Nipah virus,NiV)G蛋白抗体间接ELISA检测方法。本发明建立了小鼠血清尼帕病毒G蛋白抗体间接ELISA检测方法，为疫苗的后续开发以及特异性抗体的检测与评价奠定了坚实基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了抗尼帕病毒G蛋白抗体的间接ELISA检测方法，以尼帕病毒G蛋白作为抗原包被酶标板，拍净液体，洗涤，封闭，洗涤，加入稀释后的一抗孵育，拍净一抗，洗涤，加入酶标二抗孵育，拍净二抗，洗涤，显色孵育，终止反应，获得OD450值；
所述一抗包括阳性样本血清或阴性样本血清；
所述抗原的包被浓度为2μg/mL～10μg/mL；所述一抗的稀释度为1：200～1：800；所述一抗的孵育时间为30min～90min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗原的包被浓度为10μg/mL；所述一抗的稀释度为1：400，所述一抗的孵育时间为60min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述酶标二抗的工作浓度为1:5000～1:20000；所述酶标二抗的孵育时间为30min～120min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述酶标二抗的稀释度为1︰20000，所述酶标二抗的孵育时间为30min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述封闭具体为：以5％脱脂乳-TBST为封闭液，37℃封闭1.5h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述显色的时间为5min～20min。
在本发明的一些具体实施方案中，所述显色的时间为15min。
在本发明的一些具体实施方案中，Cut-off值为阴性对照血清OD450均值×2.1。
基于上述研究，本发明还提供了尼帕病毒候选疫苗的确定方法，以候选疫苗作为一抗，按照所述的间接ELISA检测方法进行检测。
本发明还提供了待测血清中抗尼帕病毒G蛋白抗体的确定方法，以待测血清作为一抗，按照所述的间接ELISA检测方法进行检测。
本发明以尼帕病毒G蛋白包被酶标板，利用方阵滴定法确定间接ELISA的最适工作条件，并对该方法的特异性、灵敏性、稳定性等进行分析。结果该ELISA方法样品的最佳稀释度为1：400，最佳孵育时间为60min；HRP标记的羊抗小鼠IgG最佳稀释度为1︰20000，最佳孵育时间为30min；抗原最佳包被浓度为10μg/mL；最佳显色时间为15min，以阴性对照血清OD450均值×2.1(阳性对照血清大于4.00按照4.00计算)为Cut-off值。样本实验内3次重复变异系数(CV)小于10％，样本实验间3次重复CV小于10％。结论成功建立了小鼠血清尼帕病毒G蛋白抗体间接ELISA检测方法，可应用于小鼠血清中抗尼帕病毒G蛋白抗体分析以及疫苗激发的特异性抗体效价的评价研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示阴性血清间接ELISA检测结果。
具体实施方式
本发明公开了抗尼帕病毒G蛋白抗体的间接ELISA检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
尼帕病毒作为一种宿主谱甚广的病原体[7]，其宿主包括了狐蝠科的果蝠、猪、牛、马、山羊、猫、狗、鼠、兔、狐狸、掠鸟、八哥等常见动物[8]，果蝠活动范围较广，NiV有可能在一定区域内的食果蝙蝠中相互传播,因此，相同种类蝙蝠分布的国家和地区会面临病毒突变、疫病暴发流行的危险。我国作为生猪养殖大国，一旦疫情暴发，将对我国人民的生命财产安全造成巨大威胁。虽然我国目前尚未检出NiV，但是我国东南沿海地区和云南地区具有适合NiV流行的生态环境和宿主动物，且已发现NiV的自然宿主，在蝙蝠体内存在尼帕病毒抗体，提示我国可能面临着疫情爆发流行的威胁，因此，有必要开展针对NiV检测手段以及疫苗的相关研究。使用病毒抗原进行血清学检测(IgM和IgG)开发的间接ELISA已用于人类的血清学抗体检测以及蝙蝠和其他动物的野外研究。但是由于此病毒高度危险，一般实验室条件无法培养该病毒，因此难以用全病毒作为抗原进行检测。Eshaghi等[10]建立了使用杆状病毒表达***表达尼帕病毒N蛋白，并发现该N蛋白可以代替全病毒作为抗原进行IgG抗体捕捉ELISA。Kaku等建立了利用多克隆抗体进行抗原捕获夹心ELISA，构建了两种载体质粒(编码F蛋白的质粒与编码G蛋白的质粒)免疫家兔获得多克隆抗体IgG作为抗原捕获抗体，并在两种IgG上分别加上辣根过氧化物酶作为酶标偶联抗体，通过ELISA分别比较反应性，最终结果是G蛋白的多克隆抗体反应性最优，并分别对假型VSV、两种不同毒株的NiV以及HeV活毒进行试验，获得检测下限，普通VSV作为阴性对照，结果显示，假型VSV以及NiV的检测灵敏度尚可，而HeV的检测下限较高且不灵敏，此方法只能用于检测亨尼帕病毒属病毒，不能分辩NiV与HeV，但多抗的制备较为简便经济，不用进行单抗的制备，且对NiV的检测灵敏度比较高，鉴于现在由于亨尼帕病毒属的遗传变异问题，以及对于现存的各种PCR检测可靠性问题，这种ELISA可以作为一个备用检测方法。
我国目前尚无商品化尼帕病毒G蛋白抗体检测试剂盒用于评价尼帕病毒候选疫苗，故作者尝试建立一种检测抗尼帕病毒G蛋白IgG的间接ELISA方法，ELISA以其敏感、快速、安全和高通量的特点，非常适合作为流行病学调查和血清学筛查工具。本发明以真核表达的尼帕病毒G蛋白作为包被抗原，通过对于各种条件的摸索，最终成功建立了具有高特异性、敏感性以及稳定性的间接ELISA方法，适用于流行病学调查以及对候选疫苗的评价。
本发明提供的抗尼帕病毒G蛋白抗体的间接ELISA检测方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1间接ELISA方法基本流程
尼帕G蛋白的制备方法：
尼帕病毒G蛋白序列分析、设计以及合成
根据NCBI上尼帕病毒的28个全基因组序列，将G蛋白的基因序列进行对比，绘制进化树，并分析G蛋白的氨基酸同源性。通过线上疏水性分析工具、抗原决定簇预测工具(http://www.detaibio.com/tools/)进行分析，得到尼帕病毒代表毒株(NCBI登录号：AF212302.2)的G蛋白序列，删除细胞质尾部区、跨膜疏水区以及部分茎区，仅保留胞外球形头部区(命名为sG)。N端添加人组织纤溶酶原激活物信号肽(tPA)序列、Strep标签，两端分别添加酶切位点HindⅢ和Bam HⅠ，序列设计完成后由上海生工有限公司进行密码子优化并合成，得到含有目的基因质粒(pUC57-NiV-sG)的甘油菌。
重组质粒的构建
将合成的含有目的基因质粒(pUC57-NiV-sG)的10μL甘油菌接种于5mL带有氨苄霉素抗性的液体LB培养基，37℃震荡培养12h，进行质粒的小量提取制备，Hind III和Bam HI双酶切后连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)，得到真核表达质粒pcDNA-sG，将重组质粒采用热激法转化感受态细胞Trans1-T1，经氨苄抗性筛选，挑取阳性菌落，提取质粒，双酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送至上海生工生物工程有限公司测序，序列比对确认无误后，大量制备与纯化，测定质粒浓度，用于细胞转染。
细胞转染
转染前一天，Expi293F细胞在8％CO2、37℃、125r/min条件下悬浮培养，将60mL体系的293F细胞培养物测定存活率以及活细胞密度，活细胞生长至4.2×106个/mL,存活率为97％，将细胞培养物稀释为2.1×106个/mL，转染当天，细胞密度为3×106个/mL，将60μg真核表达质粒pcDNA-sG与3mL Opti-MEMTM I Reduced Serum Medium混匀，160μLExpiFectamineTM 293 Reagent与2.8mL Opti-MEMTM I Reduced Serum Medium混匀，室温孵育5min后将二者混匀继续室温下孵育20min。然后将溶液缓慢转移到的细胞培养物摇瓶中，在加入过程中轻轻旋转摇瓶。
收集目的蛋白
转染后12h，加入300μL转染增强剂1和3mL的转染增强剂2，继续培养96h，将培养物以800g离心10min，分别收集培养基上清与细胞沉淀，培养基上清命名为sG-MS，细胞沉淀用IP裂解液重悬后冰上裂解10min，使用超声细胞破碎机破碎10min，离心收集上清命名为sG-DS。
将军事医学研究院军事兽医研究所分子病毒学与免疫学实验室制备并保存的抗原(尼帕G蛋白)由ELISA蛋白包被液稀释后包被酶标板，4℃过夜(16h-24h)；拍净液体，加入TBST洗涤两次，每次2min；加入5％脱脂乳-TBST37℃封闭1.5h；拍净封闭液，加入TBST洗涤3次，每次2min；PBS稀释样本血清(一抗)后37℃孵育酶标板60min；拍净一抗，TBST洗涤三次，每次5min，加入TBST稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(二抗)，37℃孵育60min；拍净二抗，TBST洗涤三次每次10min，每孔加入100μLTMB单组分显色液，37℃孵育15min；每孔加入50μLELISA终止液，终止反应。使用酶标仪测定OD450值。以上为该方法的初始基本流程，而后通过各种条件的摸索确定最佳条件。
实施例2抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
以方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度，将尼帕G蛋白分别稀释为2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、10μg/mL，每孔50μL，包被酶标板，4℃孵育过夜。将阳性样本血清以及阴性样本血清分别稀释为1：200、1:400、1:800与上述蛋白包被浓度进行方阵滴定，做三组平行实验。以P/N值(阳性对照血清A450均值/阴性对照血清A450均值)大于2.1且最大时的血清稀释倍数以及抗原包被浓度为血清最佳稀释倍数抗原和最佳包被浓度。
当抗原包被浓度为10μg/mL，血清稀释度为1：400时，阳性对照血清OD450及P/N值的组合满足设定的条件，且P/N值最高，见表1。因此，确定抗原最佳包被浓度为10μg/ml，血清稀释度为1:400。
表1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的方阵滴定结果(OD450)
Tab 1.Block titration results at various antigen concentrations forcoating and serum dilutions(OD450)
实施例3酶标二抗最佳工作浓度和反应时间的确定
以前文确定的抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度进行操作，将山羊抗小鼠IgG-HRP分别稀释为1∶5000、1∶10000、1∶20000，孵育酶标板，37℃孵育30min、60min、90min、120min，进行三组平行实验，酶标仪读数显示为OVER以OD450值为4.000计算，以P/N值大于2.1且最大时作为酶标二抗最佳工作浓度和最佳反应时间。
山羊抗小鼠IgG-HRP(酶标二抗)稀释度为1∶20000，反应时间为30min，结果最符合设定条件，见表2。故最佳酶标二抗工作浓度为1∶20000，最佳反应时间为30min。
表2 不同酶标抗体浓度和反应时间的方阵滴定结果(OD450)
Tab 2.Block titration results of various HRP-labeled antibodyconcentrations and reaction time(OD450)
实施例4封闭条件的确定
以前文确定的最佳条件进行操作，分别使用5％脱脂乳-TBST、3％BSA-TBST进行封闭，37℃条件下分别封闭1h、1.5h、2h，进行三组平行实验，以P/N值大于2.1且最大时作为最佳封闭条件。
分别以两种不同的封闭液进行封闭，设定3个时间，由表3可以看出，当以5％脱脂乳-TBST作为封闭液，37℃下封闭1.5h时，P/N值最大，表明最符合设定条件。故最佳封闭条件为5％脱脂乳-TBST、37℃下封闭1.5h。
表3 封闭液和封闭时间的方阵滴定结果(OD450)
Tab 1.Block titration results at various blocking solution andblocking time(OD450)
实施例5待检血清最佳反应时间的确定
以前文确定的最佳条件进行操作，将阳性血清样品和阴性血清样本分别进行37℃条件下孵育30min、60min、90min，每组进行三个平行实验，以P/N值大于2.1且最大时作为最佳反应时间。
待检血清37℃条件下孵育60min最符合所设定条件见表4，故确定为最佳反应时间。
表4 不同待检血清孵育时间的结果(OD450)
Tab 4.Values of different incubation time of serum to be tested(OD450)
实施例6最佳显色时间的确定
按照已确定的最佳条件，加入底物后，37℃分别反应5min、10min、15min、20min，每组进行三个平行实验，以P/N值大于2.1且最大时确定为最佳显色时间。
底物颜色随显色时间的延长而加深，在显色10min时为P/N最大的时间节点，见表5，故将最佳显色时间确定为15min。
表5 不同显色时间的结果(OD450)
Tab 5.Values of samples after coloration for various minutes (OD450)
实施例7 cut-off值的确定
用建立的间接ELISA法测定32份阴性对照血清，计算OD450均值(x)及标准差(SD)，确定该方法的Cut-off值。
按照所建立的间接ELISA方法对32份阴性对照血清进行实验，OD450平均值为0.071，标准差为0.012，根据公式故该间接ELISA方法的理论临界值(Cut-off值)为0.095，但本方法主要目的为评价疫苗激发特异性抗体能力，故提高标准按照阴性对照血清OD450均值×2.1作为该方法的Cut-off值，经计算确定为0.149，见图1。
效果例1特异性验证
用所建立方法对新型冠状病毒、基孔肯雅病毒、盖塔病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪传染性胃肠炎病毒小鼠阳性血清以及阴性对照血清进行检测，判断是否阳性从而验证该方法的特异性。
为验证所建立方法的特异性，用该间接ELISA方法检测新型冠状病毒、基孔肯雅病毒、盖塔病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪传染性胃肠炎病毒小鼠阳性血清，结果均为阴性，见表6，证明该间接ELISA方法具有良好的特异性。
表6 方法特异性实验检测结果(OD450)
Tab 6.Result of specificity test
效果例2稳定性验证
将实验室制备的三份尼帕G蛋白小鼠阳性血清分别设置组内3个复孔，以及组间3次重复试验，计算CV，判断该方法的稳定性。
为验证本研究建立方法的可重复性，选择本实验室制备的阳性血清样本3份，经组内3次重复以及组间三次重复实验，组内CV为1.1％-8.5％，组间CV为6.2％-7.0％，见表7，证明该间接ELISA方法具有良好的重复性。
表7 稳定性实验结果
Tab 7.Results of stability test
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.抗尼帕病毒G蛋白抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，
以尼帕病毒G蛋白作为抗原包被酶标板，拍净液体，洗涤，封闭，洗涤，加入稀释后的一抗孵育，拍净一抗，洗涤，加入酶标二抗孵育，拍净二抗，洗涤，显色孵育，终止反应，获得OD450值；
所述一抗包括阳性样本血清或阴性样本血清；
所述抗原的包被浓度为2μg/mL～10μg/mL；所述一抗的稀释度为1：200～1：800；所述一抗的孵育时间为30min～90min；
所述酶标二抗的工作浓度为1:5000～1:20000；所述酶标二抗的孵育时间为30min～120min；
所述封闭具体为：以5％脱脂乳-TBST为封闭液，37℃封闭1.5h；
所述显色的时间为5min～20min；
所述抗原的包被浓度为10μg/mL；所述一抗的稀释度为1：400，所述一抗的孵育时间为60min；
尼帕病毒G蛋白的制备方法：
尼帕病毒G蛋白序列分析、设计以及合成
根据NCBI上尼帕病毒的28个全基因组序列，将G蛋白的基因序列进行对比，绘制进化树，并分析G蛋白的氨基酸同源性；通过线上疏水性分析工具和抗原决定簇预测工具进行分析，得到尼帕病毒代表毒株NCBI登录号：AF212302.2的G蛋白序列，删除细胞质尾部区、跨膜疏水区以及部分茎区，仅保留胞外球形头部区，通过设计得到的这段序列命名为sG；N端添加人组织纤溶酶原激活物信号肽序列和Strep标签，两端分别添加酶切位点HindⅢ和Bam HⅠ，序列设计完成后由上海生工有限公司进行密码子优化并合成，得到含有目的基因质粒pUC57-NiV-sG的甘油菌；
重组质粒的构建
将合成的含有目的基因质粒pUC57-NiV-sG的10μL甘油菌接种于5mL带有氨苄霉素抗性的液体LB培养基，37℃震荡培养12h，进行质粒的小量提取制备，Hind III和Bam HI双酶切后连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)，得到真核表达质粒pcDNA-sG，将重组质粒采用热激法转化感受态细胞Trans1-T1，经氨苄抗性筛选，挑取阳性菌落，提取质粒，双酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送至上海生工生物工程有限公司测序，序列比对确认无误后，大量制备与纯化，测定质粒浓度，用于细胞转染；
细胞转染
转染前一天，Expi293F细胞在8％CO2、37℃和125r/min条件下悬浮培养，将60mL体系的293F细胞培养物测定存活率以及活细胞密度，活细胞生长至4.2×106个/mL,存活率为97％，将细胞培养物稀释为2.1×106个/mL，转染当天，细胞密度为3×106个/mL，将60μg真核表达质粒pcDNA-sG与3mL Opti-MEMTM I Reduced Serum Medium混匀，160μLExpiFectamineTM 293 Reagent与2.8mL Opti-MEMTMI Reduced Serum Medium混匀，室温孵育5min后将二者混匀继续室温下孵育20min；然后将溶液缓慢转移到的细胞培养物摇瓶中，在加入过程中轻轻旋转摇瓶；
收集目的蛋白
转染后12h，加入300μL转染增强剂1和3mL的转染增强剂2，继续培养96h，将培养物以800g离心10min，分别收集培养基上清与细胞沉淀，细胞沉淀用IP裂解液重悬后冰上裂解10min，使用超声细胞破碎机破碎10min。
2.如权利要求1所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述酶标二抗的稀释度为1︰20000，所述酶标二抗的孵育时间为30min。
3.如权利要求1至2任一项所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述显色的时间为15min。
4.如权利要求1至2任一项所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，Cut-off值为阴性对照血清OD450均值×2.1。
5.尼帕病毒候选疫苗的确定方法，其特征在于，以候选疫苗免疫小鼠后诱导的抗体作为一抗，按照如权利要求1至4任一项所述的间接ELISA检测方法进行检测。
6.待测血清中抗尼帕病毒G蛋白抗体的确定方法，其特征在于，以待测血清作为一抗，按照如权利要求1至4任一项所述的间接ELISA检测方法进行检测。
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