CN109005964B - 一种用于研究植物根系与环境相互作用的无菌滤纸栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于研究植物根系与环境相互作用的无菌滤纸栽培方法，包括步骤：S1.设计可视的栽培***，包括透明的栽培容器、处理介质、三角支架和和生长介质；S2.植物种子灭菌和催芽，出芽后移苗到栽培容器，保持植物在生长介质中自然生长；S3.待植物种子萌发，进行生物或非生物胁迫处理，然后倾斜培养；S4.采用照相机拍照***，体式显微镜和扫描仪对根系进行扫描，进行根系二维的原位观察和图像捕获。该方法可在不改变植物根系及其周围生长环境的前提下，直接将植物根系原位生长状况进行二维可视化，并结合计算机图像分析，从而对根系响应环境的状况进行原位观察和测定，从而实现动态的、原位的而非破坏性的根系与环境相互作用的观察和测定。

Description

一种用于研究植物根系与环境相互作用的无菌滤纸栽培方法

技术领域

本发明属于植物生理学技术领域。更具体地，涉及一种用于研究植物根系与环境相互作用的无菌滤纸栽培方法。

背景技术

根系是植物吸收养分和水分的主要器官，也是植物与土壤环境进行物质和信号交流的主要器官(Barber，1995；Bailey et al，2002；Lynch，2007；White et al.,2010；Vacheron et al.,2013；Hasan et al.,2016；Hippler et al.,2018)。因此，研究植物根系生长对了解植物对养分的需求及其与环境的相互作用具有十分重要的意义。

在自然条件下，由于土壤介质不透明，因此进行根系的原位观察需要大规模从土里挖取植物根系。然而植物在自然条件下受多种环境因子的影响，根系的形态构型比较复杂，因此，进行土壤原位观察和测定所获得的数据并不能准确地反应单一环境因子对根系生长的影响(马新明等，2003；Zhu et al，2006)。

因此，能反应在土壤自然生长时植物根系与环境的相互作用的技术探究，具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有根系形态构型观察和测定方法的不足，提供一种用于研究植物根系与环境相互作用的无菌滤纸栽培方法，可实现植物根系在通气良好且可视的环境中自然生长，是原位研究植物与环境相互作用的基础。

本发明的目的是提供一种用于研究植物根系与环境相互作用的无菌滤纸栽培方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种用于研究植物根系与环境相互作用的无菌滤纸栽培方法，步骤如下：

S1.设计可视的栽培***；所述栽培***包括透明的栽培容器、处理介质、三角支架和和生长介质，所述生长介质为透明培养基；

所述栽培***的构建方法如下：

A.处理介质(滤纸)裁剪成与栽培容器内部形状一致，略小于栽培容器，121℃灭菌30min备用；

B.将透明培养基搅拌均匀，并调节pH值，在121℃灭菌30分钟；灭菌结束后倒入栽培容器内；

C.静置待培养基冷却凝固后，将灭菌的处理介质(滤纸)平铺在培养基上；以上操作均在超净工作台进行；

S2.植物种子灭菌和催芽，出芽后移苗到步骤S1的栽培容器，保持植物在所述的生长介质中自然生长；

S3.待植物种子萌发，根系长度为1-3cm后，进行生物或非生物胁迫处理，然后倾斜放于光照培养箱内培养；

S4.采用照相机拍照***，体视显微镜和扫描仪对根系进行扫描，进行根系二维的原位观察和图像捕获。

优选地，步骤S1中所述栽培容器为透明的无菌方形培养皿。根据不同的植物无菌方形培养皿大小有所不同。

优选地，所述无菌方形培养皿的尺寸为长宽10cm×10cm、高1.5cm。

优选地，步骤S1中所述处理介质为方形滤纸(普通定性滤纸)。即所述生物或非生物胁迫处理采用的介质。具体方式可为将处理液体浸润滤纸。

优选地，所述滤纸长宽比为9cm×9cm。

优选地，步骤S1中所述透明培养基是：与植物适应的相应营养液和0.8％琼脂的混合物。

一种可选择的优选方案，所述与植物适应的相应营养液组成为(μM)KNO₃ 2.5×10³，MgSO₄·7H₂O 1×10³，Ca(NO₃)₂ 2.5×10³，ZnSO₄·7H₂O 0.3，K₂SO₄ 0.25×10³，CuSO₄·5H₂O0.16，Fe-EDTA(Na)80，H₃BO₃ 20，MnCl₂·4H₂O 4.57，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.16。

步骤S2所述植物种子灭菌和催芽的方法为：将植物种子用10％次氯酸钠浸泡5-10分钟进行灭菌；再用无菌水将次氯酸钠冲洗干净，然后将灭菌后的植物种子用灭菌牙签或镊子小心播种在处理介质(滤纸)表面，盖上盖子后用透气医用胶带沿边缘封好，转移至培养箱内，待其萌发。

步骤S3所述的生物处理可以包括细菌和真菌等处理；非生物处理可以包括重金属离子和有机污染物等。

处理具体操作为：选取新的9cm×9cm滤纸用处理培养液润湿后直接平铺于新的10cm×10cm的方形培养皿中，备用。用镊子将带苗滤纸从琼脂表面揭下并用无菌水清洗2遍，然后用处理培养液清洗2-3遍，然后覆于上述准备好的方形培养皿中，用移液枪吸取2ml处理培养液从苗的上方均匀注下，培养过程中幼苗可通过滤纸吸取水分。盖上盖子后，用透气医用胶带沿边缘封好皿，并在表面包上保鲜膜防止水分蒸发，倾斜放于光照培养箱内培养。可随时通过拍照***，体视显微镜或扫描仪观察植物根系生长状态。

步骤S4观察植物根系的方法是采用照相机拍照***，体视显微镜或扫描仪扫描的方法。从移苗处理后第1天到第7天每12-24小时利用照相机拍照***，体视显微镜或扫描仪扫描植株根系一次。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种用于研究植物根系与环境相互作用的无菌滤纸栽培方法，通过设计适宜植物生长的环境，保证植物根系在可视的生长环境中自然生长，有利于原位观察植物根系在受到生物或非生物胁迫时的生长状况。本发明可在不改变植物根系及其周围生长环境的前提下，直接将植物根系原位生长状况进行二维可视化，并结合计算机图像分析，从而对根系响应环境的状况进行原位观察和测定，从而实现动态的、原位的而非破坏性的根系与环境相互作用的观察和测定

本发明在取材简单，降低成本低的同时，提供适宜的培养基组成和生长容器，实现植物的根系在可控和可视的生长环境中自然生长。通过改变处理培养液的组分，结合植物根系生长状况的可视化分析，能直接反映环境因子如生物胁迫和非生物胁迫等对根系生长的影响，无破坏性地实现根系生长的动态观测。

附图说明

图1为本发明所需材料示意图。

图2为本发明栽培步骤示意图。

图3为拟南芥铝处理后第1、2、3、4天的植物根系相对生长量计算结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明取材简单，成本低；无需进行破坏性的取样，实现了原位观察和测定环境因子对植物根系生长的影响。下述实施例仅以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为例用于辅助说明本发明思路，并不因此将本发明的范围限定于拟南芥。

实施例1铝胁迫下拟南芥根系的形态构型的原位观察和测定

1、设计透明的栽培容器和生长介质；

如附图1所示，采用无菌方形培养皿长宽比为10cm×10cm；高为1.5cm；

透明培养基为改良的固体培养基，是与植物生长营养液与0.8％琼脂(sigma；A1296)的混合物，参照本领域技术人员常规技术，pH值调节为5.8。

处理介质为普通定性滤纸；铝处理包括无铝对照或50uM ACl₃处理，参照本领域技术人员常规技术，pH值调节为4.2；按照常规技术采用盐酸或氢氧化钠等试剂进行调节。

植物营养液组成为(μM)：KNO₃ 2.5×10³，MgSO₄·7H₂O 1×10³，Ca(NO₃)₂ 2.5×10³，ZnSO₄·7H₂O 0.3，K₂SO₄ 0.25×10³，CuSO₄·5H₂O 0.16，Fe-EDTA(Na)80，H₃BO₃ 20，MnCl₂·4H₂O 4.57，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.16。

铝处理营养液组成为(μM)：KNO₃ 2.5×10³，MgSO₄·7H₂O 1×10³，Ca(NO₃)₂ 2.5×10³，ZnSO₄·7H₂O 0.3，K₂SO₄ 0.25×10³，CuSO₄·5H₂O 0.16，Fe-EDTA(Na)80，H₃BO₃ 20，MnCl₂·4H₂O 4.57，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.16，50uMAlCl3.

对照营养液组成为(μM)：KNO₃ 2.5×10³，MgSO₄·7H₂O 1×10³，Ca(NO₃)₂ 2.5×10³，ZnSO₄·7H₂O 0.3，K₂SO₄ 0.25×10³，CuSO₄·5H₂O 0.16，Fe-EDTA(Na)80，H₃BO₃ 20，MnCl₂·4H₂O 4.57，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.16。

如附图1所示，每个方形培养皿分别装0.7mm高的培养基。

培养基配置步骤如下：

A.配制植物固体培养基基本成分后，加入琼脂，用磁力搅拌器搅拌均匀，调节pH值为5.8；采用高压灭菌锅将培养基在121℃灭菌30分钟。

滤纸剪成9cm×9cm，略小于无菌方形培养皿，121℃灭菌30分钟备用；

B.灭菌完成后，将培养基倒入无菌方形培养皿，以上操作在超净工作台进行；

C.静置待培养基冷却凝固后，将灭菌的滤纸平铺在培养基上；

2、栽培步骤如图2所示

种子灭菌和催芽，出芽后移苗到步骤(1)所述的栽培容器进行铝处理，保持植物根系在所述的生长介质中自然生长；

种子在播种前必须要进行灭菌以防止生长过程中产生污染。

拟南芥种子灭菌与催芽的方法是：将拟南芥种子放入无菌的1.5ml离心管。在超净工作台加入1mL 75％乙醇，涡旋30秒，去除乙醇，加入1mL灭菌水洗一次，再加入1mL10％NaClO溶液，涡旋消毒6分钟；最后用无菌水洗5～6遍。然后将灭菌后的植物种子用灭菌牙签小心播种在9cm×9cm滤纸表面，每皿15颗，盖上盖后用胶带沿边缘封好，放入4℃冰箱中，24h后转移至光照培养箱内，待其萌发，待种子萌发五天后进行铝处理，具体操作为：选取新的滤纸用上述的铝处理营养液润湿后直接铺于新的10cm×10cm的方形培养皿中，备用。用镊子将带有小苗的滤纸从琼脂表面揭下，并用无菌水小心清洗3遍，然后用上述的铝处理营养液润洗3遍，将润洗后的带苗滤纸直接铺在上述准备好的方形培养皿中。用移液枪吸取2ml铝处理营养液从拟南芥幼苗的上方均匀注下，确保培养过程中幼苗可通过滤纸吸取水分。盖上盖子后，用医用胶带沿边缘封好方形培养皿，并在表面包上保鲜膜防止水分蒸发，30度倾斜放于光照培养箱内培养。对照材料的处理除了营养液为上述的对照营养液外，其他步骤和材料均与铝处理相同。培养箱内的条件为：白天和晚上的温度均为23℃，光照强度120μmol·m-2·S-1，每天光照时间为16小时，相对湿度为60％。处理2、4、6天后观察其根系生长量。

处理2、4、6天后采用照相机照相***对根系进行拍照获得图像，进一步利用ImageJ进行根系图像的分析。

结果见图3，利用本发明的无菌滤纸培养方法对拟南芥进行了铝处理。结果显示，在铝处理第2天后，植株根系受铝毒害明显抑制；而且随着铝处理时间的延长，其根系受到的抑制程度越明显。这与前人的研究结果相符。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于研究植物根系与环境相互作用的无菌滤纸栽培方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.设计可视的栽培***；所述栽培***包括透明的栽培容器、处理介质、三角支架和生长介质，所述生长介质为透明培养基；

所述栽培***的构建方法如下：

A.处理介质裁剪成与栽培容器内部形状一致，略小于栽培容器，灭菌备用；

B.将透明培养基搅拌均匀，并调节pH值，灭菌后倒入栽培容器内；

C.静置待培养基冷却凝固后，将灭菌的处理介质平铺在培养基上；

S2.植物种子灭菌和催芽，出芽后移苗到步骤S1的栽培容器，保持植物在所述的生长介质中自然生长；

S3.待植物种子萌发，根系长度为1-3cm，进行生物胁迫处理或非生物胁迫处理，然后倾斜放于光照培养箱内培养；

S4.采用照相机拍照***，体视显微镜和扫描仪对根系进行扫描，进行根系二维的原位观察和图像捕获。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述栽培容器为透明的无菌方形培养皿。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述无菌方形培养皿的尺寸为长宽10cm×10cm、高1.5cm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述处理介质为滤纸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述滤纸长宽尺寸为9cm×9cm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述透明培养基是：与植物适应的相应营养液和质量比0.8％琼脂的混合物。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述植物种子灭菌和催芽的方法为：将植物种子用次氯酸钠浸泡灭菌，再用无菌水冲洗干净，然后将灭菌后的植物种子播种在处理介质表面，盖上盖子后用透气医用胶带沿边缘封好，转移至培养箱内，待其萌发。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述的生物胁迫处理包括细菌或真菌处理；非生物胁迫处理包括重金属离子或有机污染物处理。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，处理方法为：选取新的灭菌后的处理介质滤纸，用处理培养液润湿后直接平铺于新的灭菌后的栽培容器方形培养皿中，备用；用灭菌镊子将带苗滤纸从琼脂表面揭下并用无菌水清洗2遍，然后用处理培养液清洗2-3遍，然后覆于准备好的方形培养皿中，用移液枪吸取2ml处理培养液从苗的上方均匀注下，培养过程中幼苗可通过滤纸吸取水分；盖上盖子后，用透气医用胶带沿边缘封好皿，并在表面包上保鲜膜防止水分蒸发，倾斜放于光照培养箱内培养；可随时通过拍照***，体视显微镜或扫描仪观察植物根系生长状态。

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