CN103808822A - 一种区分不同来源白藜芦醇的lc-qtof分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，以虎杖来源的白藜芦醇和葡萄藤来源的白藜芦醇为研究对象，利用高灵敏度高分辨率的液质联用技术(LC-QTOF)以提供更多化合物结构信息的特点，研究白藜芦醇样品中的微量成分差异，找到了可以区分不同来源白藜芦醇的四种标示化合物，进一步确认了虎杖和葡萄藤来源白藜芦醇样品中的微量成分差异，对于区分不同原料来源的白藜芦醇样品提供了方法借鉴，对天然保健食品-白藜芦醇的真实属性识别具有重要的意义。同时，该技术方法也可以广泛的推广应用于进出口农产品和生物原料的真实属性检测和鉴别标准中，为天然产物原料真实属性的识别提供技术示范和参考标准的建立。

Description

一种区分不同来源白藜芦醇的LC-QTOF分析方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，提供了一种识别白藜芦醇原料来源的LC-QTOF（液相色谱/四级杆-飞行时间质谱联用）分析方法。

背景技术

白藜芦醇具有抗肿瘤、预防心血管疾病、免疫调节及抗菌等广泛的生物活性，它所具有的特殊保健功效使得其在市场上广受欢迎。随着白藜芦醇的生物活性逐渐被认识，越来越多的保健品生产企业都非常看好白藜芦醇的功能性，它作为终端产品的应用面有望不断拓宽。现阶段，国内外市场对白藜芦醇的需求量越来越大，白藜芦醇将会更加广泛、更安全的应用到各个领域当中。

通常白藜芦醇的来源有化学合成、微生物、生物合成及天然植物提取。化学合成能大量的生产白藜芦醇，但现阶段化学合成白藜芦醇的各种方法存在不同程度的环境污染等问题；而微生物发酵生物合成白藜芦醇技术的投入较大，在市场上尚未大规模形成产业化前景。因此市场上98%原料级白藜芦醇主要源自于天然植物虎杖中提取获得和合成获得，但市场上有5%-20%不同规格的产品分别来自虎杖和其他植物如葡萄藤等。

中药虎杖原材料本身含有少量的白藜芦醇，但其含有高达3%左右的虎杖苷，通过生物酵解的方法可以得到高含量的白藜芦醇，所以虎杖是工业生产白藜芦醇的极为重要的原材料。中药虎杖中白藜芦醇主要开发的产品规格为50%、98%，产品价格约为800-3000元/公斤左右，具有较为广阔的应用市场。但由于虎杖为中国传统药材中的一种，并非药食同源植物，在国外如日本，从虎杖中提取开发的白藜芦醇产品只能应用于医药领域，在食品行业中使用具有一定的法律瓶颈。

而葡萄藤来源的白藜芦醇含量相对较低（含量一般在几十到几百ppm），其产品的开发在我国相对滞后，但以药食同源植物-葡萄藤为原料开发的白藜芦醇相关产品其安全性在国际市场上能够得到更广泛地接受，可以在医药领域中使用，也可以广泛应用到诸如保健品、食品领域中。同时，葡萄藤中不仅含有白藜芦醇，而且还含有丰富的白藜芦醇低聚物，如ε-viniferin、α-viniferin、Miyabenol C等，这些白藜芦醇低聚物可以向单体转化，从而提高白藜芦醇的含量。葡萄藤中白藜芦醇产品生产规格一般为5%或15-20%，价格分别在200欧元/公斤和1000欧元/公斤左右，远高于传统的虎杖来源白藜芦醇产品价格，虽然价格昂贵，但受到健康食品制造商的青睐与欢迎。

不同植物来源生产的白藜芦醇产品价格的巨大差异导致市场上一些不法商家为获得高额利润以相对低廉的虎杖来源的白藜芦醇假冒较昂贵的葡萄藤来源白藜芦醇应用到保健品、食品领域中，市场上存在将高纯度的虎杖来源白藜芦醇添加到低纯度葡萄藤来源的白藜芦醇中的现象，从而导致消费者的身体健康受到一定程度的损害和威胁，也扰乱了相关产品的国际国内的市场秩序，引起不同程度的贸易纠纷。国际市场上明确规定，具有药用保健的产品不能添加到保健食品当中，因此，为保证民众身体健康、应对国际贸易壁垒，维护我国产品的国际声誉，维护国家经济社会稳定和国际贸易健康发展，亟待加强白藜芦醇产品原料来源的真实属性表征与识别技术研究。

目前应用得最多的白藜芦醇的分析检测方法如下：

（1）高效液相色谱法（HPLC）

白藜芦醇的极性较小，分析检测上普遍采用反相高效液相色谱进行分析，常采用乙腈-磷酸水、甲醇-冰乙酸等常用流动相分析。通用检测器包括紫外分光光度计、二级管阵列、电化学、荧光扫描检测等。吴波等人应用高效液相色谱荧光检测法建立了一种快速、灵敏、适用于水果中顺、反白藜芦醇及其苷的定量分析方法，此法已得到较好的应用。

（2）液质联用技术（LC-MS）

由于白藜芦醇与其衍生物结构相近，且白藜芦醇代谢物在植物体内含量较低，单一的分析技术一般难以获得准确的结果，因此液质联用技术成为用于分析此类复杂组分的重要手段之一，杨润涛等人以Lichrospher C18柱作为分析色谱柱，乙腈-水为流动相，采用电喷雾离子源，内标法定量以及多反应监测模式，在已选定的条件下，建立了对血浆中白藜芦醇苷及其代谢产物同时测定的LC-MS定量分析方法。LC-QTOF指的是液相色谱-四级杆-飞行时间质谱，LC-MS指的是液相色谱-单级质谱，LC-QTOF技术是一种近年才兴起的更先进、更可靠、更准确的质谱技术，能获得的化合物信息比LC-MS要多很多。

（3）气质联用技术（GC-MS）

栾天罡等人通过采用甲基硅烷化与固相微萃取技术（SPME）相结合的预处理方法，应用GC-MS技术对葡萄藤酒中的19种极性有机物和多酚类化合物进行定性分析，同时对反式白藜芦醇进行了定量分析。

（4）毛细管电泳法（CE）

目前已经用于白藜芦醇定量检测研究的电泳模式包括毛细管区带电泳、非水介质毛细管电泳等，能同时对白藜芦醇的正、反异构体进行分离检测。毛细管电泳检测白藜芦醇的技术通过与连续进样技术和固相萃取技术相结合，已经实现了样品的自动化预处理过程。曹佳等人以苄基三甲基碘化胺为内标，建立了7分钟内使白藜芦醇与白藜芦醇苷达到基线分离、且线性动态范围和检出限效果均较好的方法。郑妍鹏等采用三（羟甲基）氨基甲烷-硼酸（THAM-H3BO3）作为支持电解质，甲醇作为分离介质，用电导检测技术对虎杖中的白藜芦醇进行了测定分析，结果表明采用非水介质毛细管电泳电导检测对白藜芦醇进行测定时其干扰物质分离效果优于气质联用技术。

（5）薄层扫描色谱法（TLC）

周国海等人以氯仿:丙酮:乙酸:水（4:4:0.5:0.2）为展开剂，硅胶G作为薄层吸附剂，对虎杖各部位白藜芦醇的含量测定进行了方法学考察。舒友琴等人以苯:甲醇:甲酸（10:5:1）为展开剂，首次采用聚酰胺薄膜作固定相，利用荧光扫描法定量分析对虎杖白藜芦醇4种异构体进行了测定，结果表明其测定灵敏度比硅胶作固定相的薄层扫描法提高了将近100倍，此法同样也可应用于其他样品中的白藜芦醇及其异构体含量测定。

此外，目前用于白藜芦醇的检测方法还包括二次微分简易示波伏安法，电化学方法、酶标法、离子共振光谱法、电子顺磁共振法等。

至今为止，关于白藜芦醇原料来源真实属性识别与质量控制的研究相对较少，国外对不同植物来源的白藜芦醇的识别研究鲜有报道，国内仅刘岱琳等对葡萄藤来源白藜芦醇样品进行研究，采用高效液相色谱法建立了葡萄藤来源白藜芦醇样品的分析谱图，并对谱图中主要色谱峰进行识别与含量测定，且对易混淆的虎杖来源白藜芦醇样品进行大黄素检测，结果显示葡萄藤白藜芦醇样品中含有其特有成分ε-viniferin，ε-viniferin与白藜芦醇成一定比例存在于植物提取物中，并且葡萄藤来源的白藜芦醇样品中不应检出大黄素。

国内刘岱琳的对葡萄白藜芦醇提取物研究的具体方法为：利用高效液相色谱法建立葡萄来源白藜芦醇提取物的分析图谱，对其主要色谱峰白藜芦醇及ε-viniferin进行了识别，并建立了含量测定方法。

葡萄来源白藜芦醇提取物的高效液相图谱分析条件为：

色谱柱：C18，250mm*4.6mm,5um

流速：1.0ml/min  柱温：25℃  检测波长：310nm

流动相：A：1%冰醋酸水溶液  B：1%冰醋酸甲醇溶液

白藜芦醇及ε-viniferin的含量测定方法均为：

高效液相检测条件：流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（30:70），检测波长：303nm

色谱柱：C18，150mm*4.6mm,5um  流速：1.0ml/min

大黄素的含量测定方法为：

高效液相检测条件：流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（85:15），检测波长：254nm

色谱柱：C18，150mm*4.6mm,5um  流速：1.0ml/min

刘岱琳文章中采用不同的分析方法对葡萄白藜芦醇提取物中白藜芦醇、ε-葡萄素及大黄素进行了分析和含量测定，其结果表明，葡萄来源的白藜芦醇中含有其特有成分ε-葡萄素，并与白藜芦醇成一定比例存在于植物提取物中，且葡萄来源白藜芦醇提取物中不应检测出大黄素。

刘岱琳等人的研究方法只针对葡萄来源的白藜芦醇提取物进行了研究，得出葡萄来源白藜芦醇中含有其特有成分ε-葡萄素，并猜测性的对葡萄来源白藜芦醇中大黄素的含量进行了测定，结果显示葡萄来源白藜芦醇中不应检测出大黄素，故此将ε-葡萄素与大黄素两种化合物作为区别葡萄来源白藜芦醇的依据。若将高纯度的虎杖白藜芦醇与葡萄白藜芦醇混在一起，采用此法则无法辨别白藜芦醇的真实来源，此法也未将其他原料来源白藜芦醇如虎杖来源白藜芦醇进行对比研究，也不能明确如何鉴别不同原料来源的白藜芦醇，在白藜芦醇的识别技术上存在一定的缺陷。

该方法在一定程度上为识别葡萄藤来源的白藜芦醇产品提供了借鉴与参考，但并未形成一套识别不同来源白藜芦醇真实属性的完整体系，该方法不能明确如何鉴别不同原料来源的白藜芦醇，在白藜芦醇的识别技术上存在一定的缺陷。因此，对于进一步完善白藜芦醇的分析检测方法以及不同原料来源的白藜芦醇识别技术，深化对白藜芦醇真实属性识别研究，研究出一套完整的白藜芦醇识别研究方法，对其产品质量管理控制具有重大的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种区分不同来源白藜芦醇的LC-QTOF分析方法，用同一种分析方法即可区分白藜芦醇的不同来源，对天然保健食品-白藜芦醇的真实属性识别具有重要的意义。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种区分不同来源白藜芦醇的LC-QTOF分析方法，具体步骤为：

（1）配制检测样品：取白藜芦醇质量含量相同的虎杖提取物样品和葡萄藤提取物样品，加入醇溶解，配制成样品质量浓度相同的溶液，在25℃-30℃下超声25-35min，静置冷却，微孔滤膜过滤，滤液作为检测样品；

（2）检测：将检测样品进行液相色谱/四级杆-飞行时间质谱联用方法进行分析，得到液相色谱图和质谱图和数据；其中，分析条件控制如下：

a）液相色谱分析条件

色谱柱：XUnion C18；

流动相：乙腈-水；

梯度洗脱：0-30min，流动相中乙腈的体积浓度为10%-50%；

30-40min，流动相中乙腈的体积浓度为50%-95%；

40-42min，流动相中乙腈的体积浓度为95%-10%；

42-50min，流动相中乙腈的体积浓度为10%；

流速：0.1-0.3mL/min；

柱温：25℃-35℃；

检测波长：287nm；

b）质谱分析条件

离子源：ESI            雾化气：50-60psig；

扫描方式：负离子模式   干燥气流速：5-7L/min；

鞘气温度：400℃；      毛细管电压：3000V；

鞘气流速：10-14L/min； 裂解电压：125-145V；

锥孔电压：50-70V；     质量扫描范围：100-1700m/z，每0.2s采集1次图谱；

（3）对图谱和数据分析：

对采集到的虎杖及葡萄藤来源白藜芦醇质谱图和数据进行分析，得到共有峰；

（4）特征化合物确认

利用质谱分析获得的虎杖、葡萄藤来源白藜芦醇指纹图谱中共有峰的化合物信息，根据精确分子量进一步对总离子流图进行离子提取，得到EIC图，对比EIC图中的出峰差异，得到两者间具有明显差异性的特征化合物；

（5）判断

根据特征化合物来判断白藜芦醇的不同来源。

步骤（3）所述对图谱和数据分析优选如下：

采用Agilent Mass Hunter分析软件对采集到的虎杖及葡萄藤来源白藜芦醇质谱图和数据进行分析，得到11个共有峰，具体如下：

在虎杖来源白藜芦醇质谱图中，出峰时间为10.26mi的峰为虎杖苷，出峰时间为16.02min的峰为3-甲基-5-羟基-7-甲氧基-色酮，出峰时间为17.087min的峰为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷，出峰时间为17.627min的峰为大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷，出峰时间为20.2min的峰为大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷，出峰时间为22.093min的峰为山奈酚，出峰时间为34.487min的峰为大黄素；

在葡萄藤来源白藜芦醇质谱图中，出峰时间为18.427min的峰为葡萄素A，出峰时间为19.4min的峰为葡萄素H，出峰时间为20.953min的峰为ε-葡萄素，出峰时间为22.867min的峰为α-葡萄素;

步骤（4）的特征化合物确认优选如下：

利用质谱分析获得的虎杖、葡萄藤来源白藜芦醇指纹图谱中共有峰的化合物信息，根据精确分子量进一步对总离子流图进行离子提取，得到EIC图，虎杖来源的白藜芦醇提取物中在保留时间为20.200min处，34.827min处有相应峰，分别为大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素，且大黄素峰较高，而葡萄藤来源白藜芦醇提取物中在20.200min处没有色谱峰，在34.827min处也不见峰形；对ε-葡萄素及α-葡萄素进行EIC提取时，葡萄藤来源白藜芦醇提取物在保留时间为21.368min及23.253min处有相应峰，而虎杖来源白藜芦醇提取物在相应的保留时间内没有相应峰，因此，得到两者间具有明显差异性的4个特征化合物，它们分别是虎杖来源的白藜芦醇提取物中的大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素以及葡萄藤来源白藜芦醇提取物中的ε-葡萄素和α-葡萄素；

步骤（5）判断方法优选如下：

通过上述分析，在EIC图中，只在20.200min处和34.827min处有相应峰，则为虎杖来源的白藜芦醇；只在21.368min和23.253min处有相应峰，则为葡萄藤来源的白藜芦醇；在以上四个出峰时间均不出峰，则为其它来源的白藜芦醇；在以上四个出峰时间均出峰，则为两者的混合物。

分析条件优选控制如下：

a）液相色谱分析条件

色谱柱：XUnion C18；

流动相：乙腈-水；

梯度洗脱：0-30min，流动相中乙腈的体积浓度为10%-50%；

30-40min，流动相中乙腈的体积浓度为50%-95%；

40-42min，流动相中乙腈的体积浓度为95%-10%；

42-50min，流动相中乙腈的体积浓度为10%；

流速：0.2mL/min；

柱温：30℃；

检测波长：287nm；

进样量：5μL

b）质谱分析条件

离子源：ESI            雾化气：55psig；

扫描方式：负离子模式   干燥气流速：6L/min；

鞘气温度：400℃；      毛细管电压：3000V；

鞘气流速：12L/min；    裂解电压：135V；

锥孔电压：65V；        质量扫描范围：100-1700m/z，每0.2s采集1次图谱。

优选所述白藜芦醇的质量含量为5%，所述样品质量浓度10mg/100mL。

与现有技术相比，本发明的优势是：

1、该分析方法可以通过一种分析方法来区别白藜芦醇的不同来源，特别是在葡萄藤来源的白藜芦醇中区分是否含有虎杖来源的白藜芦醇，防止将高纯度的虎杖来源白藜芦醇添加到低纯度葡萄藤来源的白藜芦醇中的现象发生。

2、该分析方法精确性高、重复性好、稳定性好。

附图说明

图1是5%虎杖白藜芦醇TIC图；

图2是5%葡萄白藜芦醇TIC图；

图3是98%虎杖白藜芦醇TIC图；

图4是5%虎杖RES提取TIC图；

图5是5%虎杖RES提取大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷EIC图；

图6是5%虎杖RES提取大黄素EIC图；

图7是5%虎杖RES提取ε-葡萄素EIC图；

图8是5%虎杖RES提取α-葡萄素EIC图；

图9是5%葡萄RES提取TIC图；

图10是5%葡萄RES提取大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷EIC图；

图11是5%葡萄RES提取大黄素EIC图；

图12是5%葡萄RES提取ε-葡萄素EIC图；

图13是5%葡萄RES提取α-葡萄素EIC图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1样品材料

同一产地（湖北宜昌）不同时期虎杖提取物（白藜芦醇含量均为5%）八批，同一产地（湖南永安）不同时期葡萄藤提取物（白藜芦醇含量均为5%）八批，同一产地（湖北宜昌）不同时期虎杖提取物（白藜芦醇含量均为98%）均由湖南美可达生物资源有限公司提供。

1.1.2仪器与设备

Agilent1290液相色谱-G6530系列四美国安捷伦公司

级杆-飞行时间质谱联用仪

超纯水装置              美国Milipore公司

电子分析天平            上海Mettler-Tolede仪器有限公司

KQ5200DE型数控超声装置  昆山市超声仪器有限公司

1.1.3主要试剂

甲醇（安徽时联特种溶剂股份有限公司）为色谱纯、乙腈（美国默克公司）为色谱纯；所用水为实验室自制超纯水(总有机碳TOC≤5ppb)；

白藜芦醇（RES,≥99%）和虎杖苷（Polydatin,≥96%）、山奈酚（Kaempferol,≥96%）、大黄素（Emodin,≥98%）标准样品均购自中国药品生物制品检定所。

1.2实验方法

1.2.1混合对照品溶液制备

分别精密称取标准品白藜芦醇、虎杖苷、山奈酚、大黄素适量，置于100mL棕色容量瓶中，加入适量色谱甲醇溶解，保持25℃超声，直至样品完全溶解，静置冷却定容，储备液用色谱甲醇稀释，配置成浓度为10-50μg/mL的混合对照品溶液，过0.22μm有机微孔滤膜，备用。

1.2.2供试液溶液制备

精密称取5%、98%的虎杖提取物、5%的葡萄藤提取物样品各10mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入适量色谱甲醇溶解，保持25℃，超声30min，静置冷却定容，过0.22μm有机微孔滤膜，滤液作为供试品溶液备用。

1.2.3色谱分析条件

色谱柱：XUnion C18(2.8μm,4.6×150mm)（华谱新创科技有限公司）；

流动相：乙腈(B)-水(A)；梯度洗脱（0-30min，10%-50%B；30-40min，50%-95%B；40-42min，95%-10%B，42-50min，10%B）

流速：0.2mL/min；

柱温：30℃；

检测波长：287nm；

进样量：5μL

1.2.4质谱分析条件

离子源：ESI            雾化气：55psig；

扫描方式：负离子模式   干燥气流速：6L/min；

鞘气温度：400℃；      毛细管电压：3000V；

鞘气流速：12L/min；    裂解电压：135V；

锥孔电压：65V；        质量扫描范围：100-1700m/z，每0.2s采集1次图谱。

2结果与分析

2.1方法学考察

2.1.1精密度

取虎杖提取物（白藜芦醇含量5%）样品1号（HZ1），按照1.2.2项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录样品色谱图。结果表明主要色谱峰白藜芦醇的相对保留时间RSD值为0.52%，相对峰面积的RSD值为1.59%，如表3.1所示，符合特征图谱要求，表明仪器的精密度良好。

表3.1精密度实验数据

2.1.2重复性

取虎杖提取物（白藜芦醇含量5%）样品1号（HZ1）6份，按照1.2.2项下方法制备供试品溶液，分别对样品进行检测，记录样品色谱图。色谱图中主要色谱峰白藜芦醇的相对保留时间RSD值为0.25%，相对峰面积的RSD值为0.82%，如表3.2所示，符合特征图谱要求，表明方法的重复性良好。

表3.2重复性数据

2.1.3稳定性

取虎杖提取物（白藜芦醇含量5%）样品1号（HZ1），按照1.2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0、1、2、4、6、12、18、24h进行检测，记录样品色谱图。计算得主要色谱峰白藜芦醇的相对保留时间RSD值为0.47%，相对峰面积的RSD值为2.66%，如表3.3所示，符合特征图谱要求，表明供试样品溶液在24h内稳定。

表3.3重复性数据

2.1.4最低检测限

在选定的色谱及质谱条件下，当S/N=3时对虎杖和葡萄藤提取物样品中的大黄素的最低检测限进行计算，结果表明大黄素的最低检测限为0.569ng/mL。

2.2质谱数据采集

将同一产地不同时期8批5%的虎杖来源白藜芦醇、8批5%的葡萄藤来源白藜芦醇和8批98%虎杖来源白藜芦醇提取物样品的供试溶液通过飞行时间质谱仪自动进样，进行质谱及高效液相色谱数据采集，各类样品的总离子流图（TIC），如图1-3所示。

5%虎杖来源白藜芦醇、5%葡萄藤来源白藜芦醇及98%虎杖来源白藜芦醇在总离子流图之间的差异均较大。由于98%虎杖来源白藜芦醇在工艺生产过程中经过了精细的加工纯化，其样品所含杂质量较少，故此98%虎杖来源白藜芦醇样品峰均比5%的虎杖及葡萄藤来源白藜芦醇样品图谱明显减少；5%虎杖白藜芦醇与5%葡萄藤白藜芦醇样品谱图之间峰形存在较大差异，在分析方法确定的情况下，5%虎杖来源白藜芦醇样品总离子流图上的峰在时间上的分布较为均匀，且峰与峰之间的分离度也较好，而5%葡萄藤来源白藜芦醇样品在总离子流图上，化合物出峰的时间均较早，集中在30min之前出峰，且峰在时间轴上的分布较为密集聚拢状态。

2.3特征图谱中化学成分推断

采用Agilent Mass Hunter分析软件对采集到的5%虎杖及5%葡萄藤来源白藜芦醇样品数据进行分析，采用标准品对照确认保留时间的方法，并对各精确分子量的元素组成进行检索，充分考虑各化合物元素组成的理论分子量与各化合物实测分子量之间的绝对误差≤10×10^-6的原则，保留检索所得到的元素组成并与虎杖及葡萄藤化学成分数据库中各化合物进行对比分析，共获得5%的虎杖来源白藜芦醇样品指纹图谱和5%的葡萄藤来源白藜芦醇样品指纹图谱各共有峰中11个化学成分的信息，见表3.4。

表3.4虎杖、葡萄藤白藜芦醇样品中化学成分质谱数据

表3.4中所示的11个化合物质谱信息均根据标准品对照确认或精确分子量推断所得，各化合物推断分析过程如下：

（1）虎杖苷t_R=10.260min的峰在ESI^-模式下得到精确分子量m/z389.132的离子峰。虎杖中存在的虎杖苷化合物元素组成为C₂₀H₂₂O₈，相对分子质量理论值为390.1315，实测值为390.132，误差为1.3ppm，同时，采用虎杖苷对照品对照确认，保留时间在10.260min与对照品保留时间吻合，故推断此化合物为虎杖苷。

（2）白藜芦醇t_R=16.02min的峰在ESI^-模式下得到精确分子量m/z227.0792的离子峰。白藜芦醇其化合物元素组成为C₁₄H₁₂O₃，相对分子质量理论值为228.0786，实测值为228.0792，误差为2.6ppm，同时，采用白藜芦醇对照品对照确认，保留时间在16.02min与对照品保留时间一致，故推断此化合物为白藜芦醇。

（3）3-甲基-5-羟基-7甲氧基-色酮t_R=17.087min的峰在ESI^-模式下得到精确分子量m/z205.0585的离子峰。据文献^[60]报道，其化合物元素组成为C₁₁H₁₀O₄，相对分子质量理论值为206.0579，实测值为206.0585，误差为1.9ppm，据此推断该化合物为3-甲基-5-羟基-7甲氧基-色酮。

（4）大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷t_R=17.627min的峰在ESI^-模式下得到精确分子量m/z431.1062的离子峰。据文献^[60]报道，其化合物元素组成为C₂₁H₂₀O₁₀，相对分子质量理论值为432.1056，实测值为432.1062，误差为1.4ppm，据此推断该化合物为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷。

（5）大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷t_R=20.2min的峰在ESI^-模式下得到精确分子量m/z445.1218的离子峰。据文献^[60]报道，其化合物元素组成为C₂₂H₂₂O₁₀，相对分子质量理论值为446.1213，实测值为446.1218，误差为1.1ppm，据此推断该化合物为大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷。

（6）山奈酚t_R=22.093min的峰在ESI^-模式下得到精确分子量m/z285.0483的离子峰。虎杖中存在的虎杖苷化合物元素组成为C₁₅H₁₀O₆，相对分子质量理论值为286.0477，实测值为286.0483，误差为2.1ppm，同时，采用山奈酚对照品对照确认，保留时间在22.093min与对照品保留时间相同，故推断此化合物为山奈酚。

（7）大黄素t_R=34.827min的峰在ESI^-模式下得到精确分子量m/z269.0534的离子峰。其化合物元素组成为C₁₅H₁₀O₅，相对分子质量理论值为270.0528，实测值为270.0534，误差为2.2ppm，同时，采用大黄素对照品对照确认，保留时间在34.827min与对照品保留时间一致，故推断此化合物为大黄素。

（8）葡萄素t_R=18.427min的峰在ESI^-模式下得到精确分子量m/z469.1371的离子峰。据文献^[61]报道，葡萄素A化合物元素组成为C₂₈H₂₂O₇，相对分子质量理论值为470.1336，实测值为470.1371，误差为7.4ppm，据此推断该化合物为葡萄素A。

（9）葡萄素t_R=19.4min的峰在ESI^-模式下得到精确分子量m/z905.2682的离子峰。据文献^[61]报道，葡萄中存在的葡萄素H化合物元素组成为C₅₆H₄₂O₁₂，相对分子质量理论值为906.2676，实测值为906.2682，误差为0.6ppm，据此推断该化合物为葡萄素H。

（10）ε-葡萄素t_R=20.953min的峰在ESI^-模式下得到精确分子量m/z454的离子峰。据文献^[61]报道，葡萄中存在的ε-葡萄素化合物元素组成为C₂₈H₂₂O₆，相对分子质量理论值为454.1416，实测值为454.1422，误差为1.3ppm，据此推断该化合物为ε-葡萄素。

（11）α-葡萄素t_R=20.953min的峰在ESI^-模式下得到精确分子量m/z677.1895的离子峰。据文献^[61]报道，葡萄中存在的α-葡萄素化合物元素组成为C₄₂H₃₀O₉，相对分子质量理论值为678.189，实测值为678.1895，误差为0.7ppm，据此推断该化合物为α-葡萄素。

2.4特征化合物确认

利用质谱分析获得的虎杖、葡萄藤来源白藜芦醇指纹图谱中共有峰的化合物信息，根据精确分子量进一步对总离子流图（TIC）进行离子提取（EIC），由图4-13可知，通过对大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷及大黄素的精确分子量提取时，虎杖来源的白藜芦醇提取物中在保留时间为20.200min处34.827min处有相应峰，且大黄素峰高较高，而葡萄来源白藜芦醇提取物中在20.200min处没有色谱峰，在34.827min处也不见峰形；对ε-葡萄素及α-葡萄素进行EIC提取时，葡萄来源白藜芦醇提取物在保留时间为21.368min及23.253min处有相应峰，而虎杖来源白藜芦醇提取物在相应的保留时间内没有相应峰的出现。因此，根据质谱推断所得到的11个化合物信息，对比虎杖样品指纹图谱与葡萄样品指纹图谱，通过UPLC-QTOF分析软件分子式查找验证，初步得到两者间具有明显差异性的4个特征化合物，它们分别是虎杖中的大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素和葡萄中的ε-葡萄素和α-葡萄素。质谱推断的11种化合物中，葡萄来源白藜芦醇中不能检测到大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷及大黄素的存在，而虎杖来源白藜芦醇不能检测到ε-葡萄素和α-葡萄素2种化合物。其中大黄素与ε-葡萄素两种化合物各自分别在虎杖来源与葡萄来源的白藜芦醇样品中的相对含量较高。故此，可以以大黄素与ε-葡萄素两种化合物为主，并结合大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷和α-葡萄素作为4种特征化合物来区分虎杖和葡萄不同来源白藜芦醇。

3讨论

本实验利用高分辨高效率的超高效液相串联飞行时间质谱仪对虎杖及葡萄藤来源的白藜芦醇样品识别方法进行了深入研究，获得了虎杖及葡萄来源白藜芦醇样品中11个化合物信息即虎杖苷、白藜芦醇、3-甲基-5-羟基-7-甲氧基-色酮、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、大黄素、葡萄素A、葡萄素H、ε-葡萄素和α-葡萄素，并初步找到了可以区分虎杖、葡萄藤来源白藜芦醇的4个潜在标识化合物即大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、ε-葡萄素和α-葡萄素，其中以大黄素与ε-葡萄素为主，大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷和α-葡萄素为辅来区分虎杖和葡萄不同来源的白藜芦醇，为白藜芦醇的原料来源及质量的鉴别提供了科学依据，也为其他药材的质量控制提供一定的借鉴。采用UPLC-Q/TOF技术对葡萄藤及虎杖来源的白藜芦醇进行分析，对比不同原料来源的白藜芦醇样品总离子谱图，对其进行子离子TIC提取，可以获得更加准确的原料来源表征谱图与更为精确的化合物信息，为实验结果的精确性和可靠性提供了技术保障。同时，通过液质联用技术对不同植物来源白藜芦醇的表征，以及对葡萄藤和虎杖两种来源的白藜芦醇样品中潜在标示化合物的确定，为白藜芦醇真实原料来源的识别提供了操作简单、行之有效的方法。

Claims (5)

1.一种区分不同来源白藜芦醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，具体步骤为：

（1）配制检测样品：取白藜芦醇质量含量相同的虎杖提取物样品和葡萄藤提取物样品，加入醇溶解，配制成样品质量浓度相同的溶液，在25℃-30℃下超声25-35min，静置冷却，微孔滤膜过滤，滤液作为检测样品；

（2）检测：将检测样品进行液相色谱/四级杆-飞行时间质谱联用方法进行分析，得到液相色谱图和质谱图和数据；其中，分析条件控制如下：

a）液相色谱分析条件

色谱柱：XUnion C18；

流动相：乙腈-水；

梯度洗脱：0-30min，流动相中乙腈的体积浓度为10%-50%；

30-40min，流动相中乙腈的体积浓度为50%-95%；

40-42min，流动相中乙腈的体积浓度为95%-10%；

42-50min，流动相中乙腈的体积浓度为10%；

流速：0.1-0.3mL/min；

柱温：25℃-35℃；

检测波长：287nm；

b）质谱分析条件

离子源：ESI            雾化气：50-60psig；

扫描方式：负离子模式   干燥气流速：5-7L/min；

鞘气温度：400℃；      毛细管电压：3000V；

鞘气流速：10-14L/min； 裂解电压：125-145V；

锥孔电压：50-70V；     质量扫描范围：100-1700m/z，每0.2s采集1次图谱；

（3）对图谱和数据分析：

对采集到的虎杖及葡萄藤来源白藜芦醇质谱图和数据进行分析，得到共有峰；

（4）特征化合物确认

利用质谱分析获得的虎杖、葡萄藤来源白藜芦醇指纹图谱中共有峰的化合物信息，根据精确分子量进一步对总离子流图进行离子提取，得到EIC图，对比EIC图中的出峰差异，得到两者间具有明显差异性的特征化合物；

（5）判断

根据特征化合物来判断白藜芦醇的不同来源。

2.根据权利要求1所述一种区分不同来源白藜芦醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，分析条件控制如下：

a）液相色谱分析条件

色谱柱：XUnion C18；

流动相：乙腈-水；

梯度洗脱：0-30min，流动相中乙腈的体积浓度为10%-50%；

30-40min，流动相中乙腈的体积浓度为50%-95%；

40-42min，流动相中乙腈的体积浓度为95%-10%；

42-50min，流动相中乙腈的体积浓度为10%；

流速：0.2mL/min；

柱温：30℃；

检测波长：287nm；

进样量：5μL

b）质谱分析条件

离子源：ESI            雾化气：55psig；

扫描方式：负离子模式   干燥气流速：6L/min；

鞘气温度：400℃；      毛细管电压：3000V；

鞘气流速：12L/min；    裂解电压：135V；

锥孔电压：65V；        质量扫描范围：100-1700m/z，每0.2s采集1次图谱。

3.根据权利要求1或2所述一种区分不同来源白藜芦醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，所述白藜芦醇的质量含量为5%，所述样品质量浓度10mg/100mL。

4.根据权利要求1或2所述一种区分不同来源白藜芦醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，步骤（3）所述对图谱和数据分析如下：

采用Agilent Mass Hunter分析软件对采集到的虎杖及葡萄藤来源白藜芦醇质谱图和数据进行分析，得到11个共有峰，具体如下：

在虎杖来源白藜芦醇质谱图中，出峰时间为10.26mi的峰为虎杖苷，出峰时间为16.02min的峰为3-甲基-5-羟基-7-甲氧基-色酮，出峰时间为17.087min的峰为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷，出峰时间为17.627min的峰为大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷，出峰时间为20.2min的峰为大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷，出峰时间为22.093min的峰为山奈酚，出峰时间为34.487min的峰为大黄素；

在葡萄藤来源白藜芦醇质谱图中，出峰时间为18.427min的峰为葡萄素A，出峰时间为19.4min的峰为葡萄素H，出峰时间为20.953min的峰为ε-葡萄素，出峰时间为22.867min的峰为α-葡萄素。

5.根据权利要求1或2所述一种区分不同来源白藜芦醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，步骤（4）所述特征化合物分别是虎杖来源的白藜芦醇提取物中的大黄素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素以及葡萄藤来源白藜芦醇提取物中的ε-葡萄素和α-葡萄素。

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