CN108956816A - 同时测定血浆中姜黄素和5-氟尿嘧啶浓度的hplc分析方法 - Google Patents

同时测定血浆中姜黄素和5-氟尿嘧啶浓度的hplc分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物动力学分析技术领域，涉及一种同时测定动物血浆中姜黄素和5‑氟尿嘧啶浓度的HPLC分析方法。起步骤包括标准品溶液的制备、样品预处理、样品分离、检测样品峰面积和制作标准曲线。该方法克服了姜黄素和5‑氟尿嘧啶的极性相差大，在同一个色谱体系中不容易洗脱分离的困难，能够在血浆中同时测定姜黄素和5‑氟尿嘧啶的浓度。

Description

同时测定血浆中姜黄素和5-氟尿嘧啶浓度的HPLC分析方法
技术领域
本发明属于药物动力学分析技术领域，涉及体内药物的分析测定方法，更具体地，涉及一种同时测定动物血浆中姜黄素和5-氟尿嘧啶浓度的HPLC分析方法。
背景技术
姜黄素(CU)是从姜科植物姜黄等的根茎中提取的一种酚类色素，姜黄素为橙黄色结晶粉末，味稍苦，不溶于水。现代研究发现姜黄素具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用，在抗癌领域具有良好的实用性和应用前景。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种嘧啶类抗癌药物，同时也是临床使用的一线抗肿瘤药物，对多种癌症(如肝，胃，胰腺癌和乳腺癌)都具有较好的疗效，但其具有胃肠道毒性、骨髓抑制等严重的不良反应，使其临床使用受到限制。根据化疗药物组合原则，将具有光谱抗肿瘤活性的姜黄素与5-氟尿嘧啶联合应用，有望达到协同增效目的。
药代动力学评估是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和***规律，并运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化的规律。随着药物化学的发展及人类健康水平的不断提高，对药物的药代动力学性质的要求越来越高，判断一个药物的应用前景特别是市场前景，不单纯是疗效强，毒副作用小，更要具备良好的药代动力学性质。而药物在血浆中浓度的检测技术是药代动力学分析评估的重要前提技术。
由于姜黄素和5-氟尿嘧啶的极性相差大，在同一个色谱体系中不容易洗脱分离，目前还未见有文献报道在同一色谱***中同时测定生物样品中姜黄素和5-氟尿嘧啶含量的分析方法。使用的分析方法中比较常见的有：利用HPLC或液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分别检测生物样品中姜黄素和5-氟尿嘧啶含量。比如：
1.取实验小鼠血浆置于含枸橼酸葡萄糖的离心管内，涡旋离心，吸取上清液置于另一离心管中，贮存于-20℃冰箱，备用。精密吸取血浆样品，经甲醇沉淀后于-20℃过夜处理，离心(4000rpm，15min)，取适量上清液，进HPLC分析。检测姜黄素的HPLC色谱条件为：色谱柱：Luna5μm C18；流动相：乙腈：乙酸(75：25)；检测波长：429nm。检测5-氟尿嘧啶的HPLC色谱条件为：色谱柱：Qualisil BDS C18柱。(5μm,4.6×250mm)；流动相：甲醇：水(1：9)；检测波长：262nm。流速1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积：20μL；在上述色谱条件下进行测定。
2.建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定人血浆中5-氟尿嘧啶的浓度。取受试者血浆样品50μL,加入内标溶液(500ng/mL的5-溴尿嘧啶溶液)50μL,加甲醇至1000μL,旋涡混合30s,15000r/min低温4℃离心10min,取上清液氮气吹干,100μL流动相复溶,进样分析。色谱条件：采用A gilent-C a8反相色谱柱(2.1mm×150mm，3.5μm)，以甲醇-去离子水(0.1％甲酸)(80：20)为流动相，柱温20℃，流速0.2mL/m in，进样量为1μL。
质谱条件:采用电喷雾负离子化，多反应监测(MRM)进行定量分析；离子喷射电压为5.5kV，离子源温度为550℃；源内气体1(GS1)压力为310kPa，源内气体2(GS2)压力为55lkPa，气帘气体压力为103kPa，5-氟尿嘧啶和内标5-溴尿嘧啶的DP电压(解簇电压)分别为65V；用于定量分析的离子反应对分别为质荷比m/z 128.70一m/z 42.0(5-氟尿嘧啶)和m/z 188.60一m/z 42.0(5-溴尿嘧啶，内标)。
虽然相对于HPLC法，HPLC-MS/MS法体现了色谱和质谱优势互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来的优点，但是最大的不足是，用以上分析方法都只能在不同的色谱***中分别检测姜黄素和5-氟尿嘧啶的含量，而没有在同一色谱***中一起分析。
发明内容
本发明目的是提供一种同时测定血浆中姜黄素和5-氟尿嘧啶浓度的HPLC分析方法，克服姜黄素和5-氟尿嘧啶的极性相差大，在同一个色谱体系中不容易洗脱分离的困难，能够在血浆中同时测定姜黄素和5-氟尿嘧啶的浓度。
本发明所述同时测定血浆中姜黄素和5-氟尿嘧啶浓度的HPLC分析方法，包括以下步骤：
步骤一、标准品溶液的制备
将姜黄素标准品和5-氟尿嘧啶标准品按摩尔比为1:1混合，用甲醇溶解，得姜黄素和5-氟尿嘧啶的混合标准品母液，再用甲醇稀释，得一系列浓度的姜黄素和5-氟尿嘧啶的混合标准品溶液。
步骤二、样品预处理
取一系列等量的动物空白血浆，分别加入等量的步骤一所述的一系列浓度的姜黄素和5-氟尿嘧啶混合标准品溶液，得一系列待测动物血浆样品，向各待测动物血浆样品中加入柠檬酸溶液或酒石酸溶液，涡旋，加入萃取剂，旋涡、离心，取上层有机溶液氮气吹干得干燥物，向干燥物中加入复溶剂，涡旋、离心，取上清液即为供试品溶液。
步骤三、样品分离
采用色谱柱为Inertsil ODS-SP C18，5μm，4.6×250mm，保护柱Phenomenex C18，4.0×3.0mm；柱温25℃，进样量20μL，分别以甲醇和水混合液、乙腈和缓冲液混合液为流动相，对各供试品溶液进行梯度洗脱。
步骤四、检测样品峰面积
对进HPLC分析的供试品溶液采用通用型紫外检测器检测峰面积，在425nm波长处检测姜黄素的峰面积，在265nm波长处检测5-氟尿嘧啶的峰面积，经过25～30分钟HPLC分析后得到姜黄素和5-氟尿嘧啶的峰面积。
步骤五、制作标准曲线
分别以动物血浆样品中姜黄素和5-氟尿嘧啶的浓度为横坐标，对应的姜黄素和5-氟尿嘧啶的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线得到标准曲线方程；将姜黄素和5-氟尿嘧啶的峰面积带入标准曲线方程中换算得姜黄素和5-氟尿嘧啶的浓度。
所述柠檬酸溶液或酒石酸溶液的浓度为0.03～0.18g/ml。
所述萃取剂为乙酸乙酯和甲醇的混合液，两者的体积比为9:1。
所述复溶剂为甲醇和2％吐温80的混合溶液，体积比为3:7。
步骤二中所述的加入复溶剂之前的离心为8000r/min、离心3min；加入复溶剂之后的离心为10000r/min、离心10min。
步骤三中梯度洗脱的程序包括：按体积百分比计，0～12.4min，甲醇：水(1:99，v/v)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长265nm；12.5～22.5min，乙腈：0.1％磷酸缓冲液(65:35，v/v)为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长425nm；22.6～30min，甲醇：水(1:99，v/v)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长265nm。
所述0.1％磷酸缓冲液为用三乙胺调节pH至3.5的0.1％磷酸溶液。
本发明具有以下有益效果：
1.同时测定。只需一种方法，在同一色谱***中既可测定生物样品中姜黄素又可测定5-氟尿嘧啶的含量，克服了姜黄素和5-氟尿嘧啶的极性相差大，在同一个色谱体系中不容易洗脱分离的困难。
2.预处理方法简便。采用一步蛋白沉淀法，简便易行。以乙酸乙酯：甲醇(9:1，v/v)为萃取剂沉淀蛋白的效果优于乙酸乙酯、异丙醇、乙酸乙酯与异丙醇、乙酸乙酯等。以甲醇：2％吐温80水溶液(3:7，v/v)为复溶剂能克服有机相比例过大造成的5-FU裂峰和CU回收率不高的缺陷。
3.采样量少。测定一份样品只需100μl生物样品。
4.选择性强、含量测定准确。提高药物在分析过程中的稳定性是保证其血浆浓度测定方法准确度的关键。本发明在血浆生物样品的预处理过程中，加入柠檬酸或酒石酸溶液，消除了血浆內源物质对姜黄素和5-氟尿嘧啶稳定性的影响，提高CU萃取回收率，同时杂质峰与5-FU峰也能实现较好的分离，使得测定更准确。
5.节约分析时间和成本。本发明不需要使用大型精尖端仪器、不需要制备内标溶液，工艺简单，操作方便简捷，成本更低，对环境的污染更小，并且同时测定两药含量，简化了分析步骤，缩短了分别测定含量的时间，节约分析时间。
6.本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便。本方法的CU、5-FU血浆标准曲线线性范围为0.01-20μg/ml、0.056-7.062μg/ml。CU、5-FU的相对回收率为86.29-106.05％，绝对回收率为70.90-93.20％。CU、5-FU、CU/5-FU日内和日间精密度RSD均小于9.29％。
附图说明
图1～4为实施例1建立的HPLC分析方法专属性考察色谱图。其中图1为大鼠空白血浆色谱图；图2为大鼠空白血浆加入CU标准品溶液后的色谱图；图3为大鼠空白血浆加入5-FU标准品溶液后的色谱图；图4为大鼠空白血浆加入CU和5-FU混合标准品溶液后的色谱图。
图5为实施例1建立的空白血浆中加入CU和5-FU混合标准品溶液后CU的标准曲线图。
图6为实施例1建立的空白血浆中加入CU和5-FU混合标准品溶液后5-FU的标准曲线图。
图7为实施例1建立的测定大鼠单次尾静脉注射姜黄素和5-氟尿嘧啶混合标准品溶液后5-氟尿嘧啶的药时曲线图。
图8为实施例1建立的测定大鼠单次尾静脉注射姜黄素和5-氟尿嘧啶混合标准品溶液后姜黄素的药时曲线图。
图9为实施例2建立的测定SD大鼠血浆中药物各比例下姜黄素的药时曲线图。
图10为实施例2建立的测定SD大鼠血浆中药物各比例下5-氟尿嘧啶的药时曲线图。
图11～14为实施例3建立的考察HPLC分析方法专属性考察色谱图。其中图11为家兔空白血浆色谱图；图12为家兔空白血浆加入CU标准品溶液后的色谱图；图13为家兔空白血浆加入5-FU标准品溶液后的色谱图；图14为家兔空白血浆加入CU和5-FU混合标准品溶液后的色谱图；
图15为实施例3建立的在家兔空白血浆中加入CU和5-FU混合标准品溶液后CU的标准曲线图。
图16为实施例3建立的在家兔空白血浆中加入CU和5-FU混合标准品溶液后5-FU的标准曲线图。
图17为实施例3建立的测定家兔血浆中5-氟尿嘧啶的药时曲线图。
图18为实施例3建立的测定家兔血浆中姜黄素的药时曲线图。
图19～22为实施例4建立的考察HPLC分析方法专属性考察色谱图。其中图19为大鼠肝组织液空白色谱图；图20为大鼠肝组织液加入CU标准品溶液后的色谱图；图21为大鼠肝组织液加入5-FU标准品溶液后的色谱图；图22为大鼠肝组织液加入CU和5-FU混合标准品溶液后的色谱图。
图23为实施例4建立的测定姜黄素在大鼠肝脏中分布情况的标准曲线图。
图24为实施例4建立的测定5-氟尿嘧啶在大鼠肝脏中分布情况的标准曲线图。
具体实施方案
为了使本发明技术方法更加清楚，现结合实施例对本发明作进一步说明。除非特别说明，本发明采用的试剂和设备均为本技术领域常规试剂和设备。
所用SD大鼠实验动物许可证：SCXK(川)2013-17。CU，含量为99.59％，由成都曼斯特生物科技有限公司提供；5-FU，含量为99.40％，由重庆莱美药业有限公司提供。
实施例1SD大鼠血浆中姜黄素、5-氟尿嘧啶浓度的测定。
1、标准溶液的制备
姜黄素标准品溶液的制备：精密称取姜黄素标准品，溶解于甲醇溶液中震荡摇匀，得80μg/ml的姜黄素标准溶液。
5-氟尿嘧啶标准品溶液的制备：精密称取5-氟尿嘧啶标准品，溶解于甲醇溶液中震荡摇匀，得28.2500μg/ml的5-氟尿嘧啶标准溶液。
姜黄素和5-氟尿嘧啶混合标准品溶液的配置：按CU:5-FU摩尔比为1:1配制CU/5-FU标准混合品溶液。即：精密称取2000μg CU和706.25μg 5-FU于50ml容量瓶中，加入50ml甲醇溶解，得到CU/5-FU混合品母液，其中CU和5-FU浓度分别为40μg/ml和14.1250μg/ml。再用甲醇稀释，配制成6个不同浓度的混合品溶液，其中每个浓度的混合品溶液中CU的浓度分别为0.3200，1.6000，3.200，4.8000，6.4000，40.0000μg/ml和5-FU的浓度分别为0.1130，0.5710，1.1300，1.6950，2.2600，14.1250μg/ml。
2、液相色谱条件：
色谱柱：Inertsil ODS-SP C18，5μm，4.6×250mm；保护柱：Phenomenex C18，4.0×3.0mm；柱温：25℃；进样量：20μL。分别以甲醇和水混合液、乙腈和缓冲液混合液为流动相，对各供试品溶液进行梯度洗脱。梯度洗脱程序为：0-12.4min，甲醇：水(1:99，v/v)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为265nm；12.5-22.5min，乙腈：0.1％磷酸缓冲液(pH 3.5，65:35，v/v)为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为425nm；22.6-30min，甲醇：水(1:99，v/v)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为265nm。总分析时间30min。
3、血浆样品预处理
取SD大鼠血浆样品100μL于5ml EP管中，精密加入50μl CA溶液(0.05g/ml)，涡旋混匀1min，再加入1.5ml萃取剂(乙酸乙酯：甲醇，9:1，v/v)，涡旋混匀3min，8000rpm/min离心3min，取上清液氮气吹干，向干燥残留物中加入200μl复溶溶剂(甲醇：2％吐温80水溶液，3:7，v/v)，涡旋混匀4min，10000rpm/min离心10min，取上清液进样分析。
4、专属性
分别取100μl经血浆样品预处理后的大鼠空白血浆、大鼠空白血浆+CU标准溶液、大鼠空白血浆+5-FU标准溶液、大鼠空白血浆+CU/5-FU混合品标准溶液，按照上述色谱条件，经HPLC分析得到的色谱图见图1～4。结果显示，在本实验所采用的HPLC条件下，CU和5-FU完全分离，峰形良好，基线平稳，两种药物互不干扰，且不受血浆内源性物质干扰。5-FU保留时间约为9min，CU保留时间约为20min。由于色谱***的柱压等因素影响，药物的保留时间存在细微差异。
5、标准曲线
(1)取大鼠空白血浆，加入一系列浓度的CU/5-FU标准液各50μl，按照“血浆样品预处理”方法操作。
(2)标准曲线的绘制：以血浆样品中药物浓度C为横坐标(X)，对应的药物峰面积A为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算得到线性回归方程和线性相关系数。以信噪比S/N＝3计算，得该方法的最低检测浓度。
血浆生物样品标准曲线如表1和图5～6所示。
表1血浆生物样品标准曲线及其线性范围
药物 标准曲线 线性范围(μg/ml) 相关系数R2
混合品中CU y＝1.0357x-0.0077 0.0100-20.0000 0.9998
混合品中5-FU y＝0.5208x+0.013 0.0560-7.0620 0.9999
表1结果表明，CU/5-FU混合品中CU标准曲线：y＝1.0357x-0.0077，线性范围：0.01-20μg/ml(R2＝0.9998)；CU/5-FU混合品中5-FU标准曲线：y＝0.5208x+0.013，线性范围：0.056-7.062μg/ml(R2＝0.9999)，线性相关系数均大于0.999。在本发明条件下，测得5-FU的血药浓度的定量下限为0.0560μg/ml，CU的定量下限为0.0100μg/ml。
6、回收利用率
(1)相对回收率实验：分别配制低、中、高三个浓度的CU/5-FU溶液，每种浓度3份平行试样，再按上述“血浆样品预处理”项下依法操作后检测。依据标准曲线计算各自的浓度，计算所得的药物浓度与相应药物标准液的浓度的比值，为相对回收率，相对回收率即为准确度。相对回收率结果如表2所示。
(2)绝对回收率实验：分别配制低、中、高三个浓度的CU/5-FU溶液，每种浓度3份试样，再按实例1中“血浆样品预处理”项下依法操作后检测。另取离心管18支，两个一组；每组加入与配制血浆标准品溶液相同的药物标准品溶液，氮气吹干后用200μl复溶剂复溶，取20μl进样检测；记录不同浓度的药物峰面积，即为该浓度的纯标准品的峰面积。计算同浓度血浆样品的峰面积与纯标准品的峰面积的比值，即为绝对回收率。绝对回收率结果如表2所示。
表2药物的回收率(x±s，n＝3)
表2结果表明，混合品中CU、5-FU的相对回收率为86.29-106.05％，绝对回收率为70.90-93.20％。
7、精密度
分别配制低、中、高三个浓度的CU/5-FU溶液，每种浓度3份平行试样，按实例1中“血浆样品预处理”项下处理后于同一日内测定，依据对应的标准曲线计算检测浓度，计算日内精密度；连续三日同样操作，计算日间精密度。结果见表3。
表3大鼠血浆中药物的精密度(x±s，n＝3)
表3结果表明，CU、5-FU、CU/5-FU日内和日间精密度RSD均小于9.29％，
8、稳定性
(1)冻存稳定性考察：分别配制低、中、高三个浓度的CU/5-FU溶液，每种浓度3份平行试样；药物溶液加入血浆后，冻存一天，经历3次冰冻-解冻循环后，按按实例1中“血浆样品预处理”项下处理检测，考察其稳定性。结果见表4。
表4药物的冻存稳定性(x±s，n＝3)
如表4所示，低、中、高3个浓度的RE和CV均小于14.82％，即表明一天之内冻融条件对血浆样品的检测结果没有明显的影响，本分析方法稳定性良好。经过考察，发现血浆生物样品冻存两天以上，样品的浓度明显降低，RE大于15％，提示我们此条件下，CU、5-FU大鼠血浆生物样品在冻存条件下保存不能超过一天。
(2)室温下24h稳定性考察：分别配制低、中、高三个浓度的CU/5-FU溶液，按实例1中“血浆样品预处理”项下处理检测，考察其室温下24h稳定性。结果见表5。
表5样品的24h稳定性(x±s，n＝3)
如表5所示，混合品中CU、5-FU低、中、高3个浓度的CV均小于12.42％，即表明血浆样品的检测结果在24h内没有明显的差异。即，在冻存一天和室温下24小时内，本分析方法稳定性良好。
9、SD大鼠单次尾静脉注射姜黄素和5-氟尿嘧啶混合液后血浆中姜黄素和5-氟尿嘧啶代谢情况的测定
SD大鼠给药前均禁食12h(不禁水),分组后根据实验设计的给药方案进行给药。给药后依照实验设计采样时间进行取血。各时间点姜黄素、5-氟尿嘧啶的浓度绘制成药时曲线。结果如图7～8所示。
实施例2测定不同比例的姜黄素、5-氟尿嘧啶混合品在SD大鼠血浆中代谢情况。
对SD大鼠尾静脉注射摩尔比为1:1、1:2、1:4的CU/5-FU混合液后，用本分析方法检测血浆中CU、5-FU的含量。
(1)SD大鼠给药前均禁食12h(不禁水),分组后根据实验设计的给药方案进行给药。给药后依照实验设计采样时间进行取血。将血样置于肝素管中，全血经5000rpm/min离心3min后取上清液血浆分装为100μl，存储于-80℃冰箱至测定。
(2)取大鼠血浆样品100μL，同实施例1所述的“血浆样本预处理”方法进行处理后，取上清100μL移入进样瓶中进行HPLC分析，条件同实施例1，根据标准曲线计算血浆样本浓度。
SD大鼠血浆中药物各比例下姜黄素的代谢药时曲线图如图9所示。5-氟尿嘧啶的代谢曲线图如图10所示。
实施例3测定家兔血浆中姜黄素、5-氟尿嘧啶的浓度。
1、标准品溶液的制备
姜黄素标准溶液的制备：精密称取姜黄素标准品，溶解于甲醇溶液中震荡摇匀，得80μg/ml的姜黄素标准溶液。
5-氟尿嘧啶标准品溶液的制备：精密称取5-氟尿嘧啶标准品，溶解于甲醇溶液中震荡摇匀，得28.2500μg/ml的5-氟尿嘧啶标准溶液。
姜黄素/5-氟尿嘧啶混合品标准品溶液的配置：按CU:5-FU摩尔比为1:1配制CU/5-FU标准混合品溶液。即：精密称取2000μg CU和706.25μg 5-FU于50ml容量瓶中，加入50ml甲醇溶解，得到CU/5-FU混合品母液，其中CU和5-FU浓度分别为40μg/ml和14.1250μg/ml。再用甲醇稀释，配制成6个不同浓度的混合品溶液，其中每个浓度的混合品溶液中CU的浓度分别为0.3200，1.6000，3.200，4.8000，6.4000，40.0000μg/ml和5-FU的浓度分别为0.1130，0.5710，1.1300，1.6950，2.2600，14.1250μg/ml。
2、色谱条件：
色谱柱：Inertsil ODS-SP C18，5μm，4.6×250mm；保护柱：Phenomenex C18，4.0×3.0mm；柱温：25℃；进样量：20μL。分别以甲醇和水混合液、乙腈和缓冲液混合液为流动相，对各供试品溶液进行梯度洗脱。梯度洗脱程序为：0-12.4min，甲醇：水(1:99，v/v)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为265nm；12.5-22.5min，乙腈：0.1％磷酸缓冲液(pH 3.5，65:35，v/v)为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为425nm；22.6-30min，甲醇：水(1:99，v/v)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为265nm。总分析时间30min。
3、家兔血浆样品预处理
取清洁级家兔含药血浆100μL于5ml EP管中，精密加入50μl CA溶液(0.05g/ml)，涡旋混匀1min，再加入1.5ml萃取剂(乙酸乙酯：甲醇，9:1，v/v)，涡旋混匀3min，8000rpm/min离心3min，取上清液氮气吹干，向干燥残留物中加入200μl复溶溶剂(甲醇：2％吐温80水溶液，3:7，v/v)，涡旋混匀4min，10000rpm/min离心10min，取上清液进样分析。
4、专属性
分别取100μl经“血浆样品预处理”后的清洁级家兔空白血浆、清洁级家兔空白血浆+CU标准溶液、清洁级家兔空白血浆+5-FU标准溶液、清洁级家兔空白血浆+CU/5-FU混合品标准溶液，按照上述色谱条件进行专属性评价。色谱图见图11～14。未发现生物基质对姜黄素、5-氟尿嘧啶的测定有干扰。姜黄素和5-氟尿嘧啶的色谱保留时间分别为9min，20min。
5、线性试验
取空白家兔血浆，分别加入上述一系列浓度的CU/5-FU标准液50μl，按照“家兔血浆样品预处理”方法操作。以组织样品中药物浓度C为横坐标(X)，对应的药物峰面积A为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算得到线性回归方程和线性相关系数。如图15～16两者的标准曲线回归方程分别为：CU y＝0.9884x-0.074，R2＝0.9999；5-FU y＝0.451x+0.0011，R2＝0.9997。
6、准确度和精密度
取空白血浆，配制低、中、高三个浓度的CU/5-FU血浆质控样品，每种浓度3份平行试样，再按上述“家兔血浆样品的预处理”操作，考察日内、日间精密度和准确度。依据标准曲线计算各自的浓度，计算相对回收率，和绝对回收率即为准确度。回收率和精密度结果如表6和表7所示。
表6家兔血浆中药物的回收率(x±s，n＝3)
表6结果表明，单品及混合品中CU、5-FU的相对回收率为86.69-104.50％，绝对回收率为78.41-93.03％。
表7家兔血浆中药物的精密度(x±s，n＝3)
表7结果表明，CU、5-FU、CU/5-FU日内和日间精密度RSD均小于10.15％，
将耳缘静脉注射清洁级家兔血浆中各时间点姜黄素、5-氟尿嘧啶的浓度绘制成药时曲线。结果如图17～18所示。
实施例4测定姜黄素、5-氟尿嘧啶在大鼠肝脏中的分布情况。
1、标准品溶液的制备
姜黄素标准溶液的制备：精密称取姜黄素标准品，溶解于甲醇溶液中震荡摇匀，得80μg/ml的姜黄素标准溶液。
5-氟尿嘧啶标准品溶液的制备：精密称取5-氟尿嘧啶标准品，溶解于甲醇溶液中震荡摇匀，得28.2500μg/ml的5-氟尿嘧啶标准溶液。
姜黄素/5-氟尿嘧啶混合标准品溶液的配置：按CU:5-FU摩尔比为1:1配制CU/5-FU标准混合品溶液。即：精密称取2000μg CU和706.25μg 5-FU于50ml容量瓶中，加入50ml甲醇溶解，得到CU/5-FU混合品母液，其中CU和5-FU浓度分别为40μg/ml和14.1250μg/ml。再用甲醇稀释，配制成6个不同浓度的混合品溶液，其中每个浓度的混合品溶液中CU的浓度分别为0.3200，1.6000，3.200，4.8000，6.4000，40.0000μg/ml和5-FU的浓度分别为0.1130，0.5710，1.1300，1.6950，2.2600，14.1250μg/ml。
2、色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-SP C18，5μm，4.6×250mm；保护柱：Phenomenex C18，4.0×3.0mm；柱温：25℃；进样量：20μL。分别以甲醇和水混合液、乙腈和缓冲液混合液为流动相，对各供试品溶液进行梯度洗脱。梯度洗脱程序为：0-12.4min，甲醇：水(1:99，v/v)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为265nm；12.5-22.5min，乙腈：0.1％磷酸缓冲液(pH 3.5，65:35，v/v)为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为425nm；22.6-30min，甲醇：水(1:99，v/v)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为265nm。总分析时间30min。
3、组织样品预处理
取SD大鼠肝脏组空白匀浆液100μL于5ml EP管中，精密加入50μl CA溶液(0.05g/ml)，涡旋混匀1min，再加入1.5ml萃取剂(乙酸乙酯：甲醇，9:1，v/v)，涡旋混匀3min，8000rpm/min离心3min，取上清液氮气吹干，向干燥残留物中加入200μl复溶溶剂(甲醇：2％吐温80水溶液，3:7，v/v)，涡旋混匀4min，10000rpm/min离心10min，取上清液进样分析。
4、专属性
分别取100μl经组织样品预处理后的大鼠空白肝脏组织匀浆液、大鼠空白肝脏组织匀浆液+CU标准溶液、大鼠空白肝脏组织匀浆液+5-FU标准溶液、大鼠空白肝脏组织匀浆液+CU/5-FU混合品标准溶液，按照上述色谱条件进行专属性评价。色谱图见19～22。未发现生物基质对姜黄素、5-氟尿嘧啶的测定有干扰。姜黄素和5-氟尿嘧啶的色谱保留时间分别为9min，20min。
5、线性试验
取空白肝脏匀浆液，分别加入上述一系列浓度的CU/5-FU标准液50μl，按照“组织样品预处理”方法操作。以组织样品中药物浓度C为横坐标(X)，对应的药物峰面积A为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算得到线性回归方程和线性相关系数。如图23～24两者的标准曲线回归方程分别为：CU y＝1.142x-0.384，R2＝0.9993；5-FU y＝0.4529x-0.0377，R2＝0.9993。
6、准确度和精密度
取空白肝脏组织匀浆液，配制低、中、高三个浓度的CU/5-FU组织质控样品，每种浓度3份平行试样，再按上述“组织样品的预处理”操作，考察日内、日间精密度和准确度。依据标准曲线计算各自的浓度，计算相对回收率，和绝对回收率即为准确度。回收率和精密度结果如表8和表9所示。
表8大鼠肝脏组织中药物的回收率(x±s，n＝3)
表8结果表明，单品及混合品中CU、5-FU的相对回收率为87.12-103.03％，绝对回收率为78.22-91.63％。
表9大鼠肝脏组织中药物的精密度(x±s，n＝3)
表9结果表明，CU、5-FU、CU/5-FU日内和日间精密度RSD均小于11.42％。

Claims (7)

1.一种同时测定血浆中姜黄素和5-氟尿嘧啶浓度的HPLC分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、标准品溶液的制备
将姜黄素标准品和5-氟尿嘧啶标准品按摩尔比为1:1混合，用甲醇溶解，得姜黄素和5-氟尿嘧啶的混合标准品母液，再用甲醇稀释，得一系列浓度的姜黄素和5-氟尿嘧啶的混合标准品溶液；
步骤二、样品预处理
取一系列等量的动物空白血浆，分别加入等量的步骤一所述的一系列浓度的姜黄素和5-氟尿嘧啶混合标准品溶液，得一系列待测动物血浆样品，向各待测动物血浆样品中加入柠檬酸溶液或酒石酸溶液，涡旋，加入萃取剂，旋涡、离心，取上层有机溶液氮气吹干得干燥物，向干燥物中加入复溶剂，涡旋、离心，取上清液即为供试品溶液；
步骤三、样品分离
采用色谱柱为Inertsil ODS-SP C18，5μm，4.6×250mm，保护柱Phenomenex C18，4.0×3.0mm；柱温25℃，进样量20μL，分别以甲醇和水混合液、乙腈和缓冲液混合液为流动相，对各供试品溶液进行梯度洗脱；
步骤四、检测样品峰面积
对进HPLC分析的供试品溶液采用通用型紫外检测器检测峰面积，在425nm波长处检测姜黄素的峰面积，在265nm波长处检测5-氟尿嘧啶的峰面积，经过25～30分钟HPLC分析后得到姜黄素和5-氟尿嘧啶的峰面积；
步骤五、制作标准曲线
分别以动物血浆样品中姜黄素和5-氟尿嘧啶的浓度为横坐标，对应的姜黄素和5-氟尿嘧啶的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线得到标准曲线方程；将姜黄素和5-氟尿嘧啶的峰面积带入标准曲线方程中换算得姜黄素和5-氟尿嘧啶的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述柠檬酸溶液或酒石酸溶液的浓度为0.03～0.18g/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述萃取剂为乙酸乙酯和甲醇的混合液，两者的体积比为9:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述复溶剂为甲醇和2％吐温80的混合溶液，体积比为3:7。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤二中所述的加入复溶剂之前的离心为8000r/min、离心3min；加入复溶剂之后的离心为10000r/min、离心10min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中梯度洗脱的程序包括：按体积百分比计，0～12.4min，甲醇：水(1:99，v/v)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长265nm；12.5～22.5min，乙腈：0.1％磷酸缓冲液(65:35，v/v)为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长425nm；22.6～30min，甲醇：水(1:99，v/v)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长265nm。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述0.1％磷酸缓冲液为用三乙胺调节pH至3.5的0.1％磷酸溶液。
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