CN109100436A - 人体尿液中***及其代谢产物的检测方法 - Google Patents

人体尿液中***及其代谢产物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人体尿液中***及其代谢产物的检测方法，涉及***及其代谢产物检测技术领域。该检测方法将人体尿液与内标液混合，随后对其依次进行酶水解、有机溶剂萃取、反相介质固相萃取纯化和目标产物的化学衍生。保证了尿液中***及其代谢产物的充分溶出，排除尿液中杂质的干扰，确保了检测结果的准确性和稳定性。随后，采用液相色谱分离与质谱离子对检测联用的方法对***及其代谢产物进行同步定性和定量分析。该方法适用于人体尿液中结构类似、化学物理性质接近的***及其代谢产物的同步批量检测，具有灵敏度高、精密度高、重复性好、检测速度快等优点。充分满足了临床检验的需要，具有较高的临床应用价值。

Description

人体尿液中***及其代谢产物的检测方法
技术领域
本发明涉及***代谢产物检测技术领域，尤其是涉及一种人体尿液中***代谢产物的检测方法。
背景技术
***是脊椎动物中存在的一类重要的性激素，对机体的生长发育和***的功能维持有着及其重要的作用。在生殖***、内分泌***、神经***等方面发挥着关键性的角色。
***是一类脂溶性的类固醇小分子化合物，有游离态和结合物这俩种形态。其中在机体内主要是以结合态存在，在血中70%与性激素结合球蛋白（SHBG）结合，25%与白蛋白结合，5%保持游离状态。其中，结合态的***不具有生理活性，而游离态的***可以自由透过靶细胞内并与相应的受体结合，调节细胞转录，诱导功能蛋白质的合成，发挥生物学效应。
胆固醇是所有类固醇激素的前体，而***β-Estradiol (E2)是体内最常见的内源性***，可以与受体结合参与调控基因表达，促进人体的生长。雌酮Estrone (E1)是卵巢分泌合成***的前体物质，在酶的催化下可以转化为***。该反应为可逆反应，***也可被还原为雌酮。雌三醇Estriol(E3)是E1和E2的外周组织代谢物，活性较低，被认为是具有解毒功能的一种***。
***在体内主要经过儿茶酚代谢途径发生代谢反应，主要是雌酮或***发生氧化代谢（羟基化反应）与结合代谢（O-甲基化，葡萄糖醛酸化及磺化反应等）。在细胞色素酶P450的催化下， E1和E2的C-2，C-4和C-16位点发生羟基化反应，产生A环代谢物2-OHE1，2-OHE2，4-OHE1，4-OHE2和D环代谢物16α-OHE1。其中，2-OHE1，2-OH E2，4-OHE1，4-OHE2可以在P450和过氧化酶的作用下再进一步形成氧化产物醌类物质。在此转变过程中产生一系列的活性氧自由基，引发脂质过氧化反应，通过不断的氧化代谢循环使其成为羟基化***代谢的协同因子，再与DNA加合导致DNA的氧化损伤。醌类物质同时还可以与乳腺细胞中引起细胞转化和非正常细胞繁殖的致癌基因和抑癌基因的DNA反应形成去嘌呤加合物等毒性代谢物，并且产生脱嘌呤核苷位点，从而引起体内碱基的丢失和致癌性DNA突变。4-OHE1在体内的半衰期相比2-OHE1更长，更容易被氧化成醌类物质，与DNA结合并增加DNA复制的错误机会，在乳腺癌患者中变化更明显，从而增加了乳腺癌的患病风险。因此，E1和E2的羟基化代谢物是致癌性的分子标志物。
***甲基化反应被认为是对***致癌效应起到防御作用的主要途径。2-OHE1，4-OHE1可以在儿茶酚-O-甲基转移酶、磺基转移酶等作用下脱离形成醌类物质的代谢途径，形成甲基化产物，迅速失活并形成可溶于水的代谢产物随尿液排出体外。儿茶酚-O-甲基转移酶介导的部分甲基化***代谢物如2-MeOE2被认为具有解毒作用甚至具有抑癌作用，其与激素受体ER和ER的结合力均很低，因此***活性也很弱。可以通过诱导细胞凋亡、抑制细胞转移和上皮细胞的血管生长和直接抑制肿瘤细胞的增值起到抑癌的作用。
许多研究表明，乳腺癌是一种与患者体内***密切相关的肿瘤，与***的水平及其代谢异常显著相关。一旦内分泌失衡、代谢紊乱就容易造成乳腺增生并导致乳腺癌的发生。在分子水平上，***代谢途径基因的多态性与乳腺癌***的流行病学也表明激素代谢物与乳腺癌发生发展的相关性。
综合分析认为，4-OHE1，4-OHE2，16α-OHE1为可能的致癌性分子标志物，2-OHE1为良性***分子，***甲基化产物如2-MeOE2为潜在的抑癌分子标志物。这些***代谢产物在乳腺癌的发生、发展中发挥着重要的作用。通过对***代谢产物的定性定量分析，可以获得全面完整的代谢物变化信息，有助于了解乳腺癌的发病机制及代谢途径的变化，为乳腺癌的早期诊断及筛查、预防和风险评估提供重要的依据。
因此，本研究开发一种尿液中***代谢产物的检测方法。该方法具有检测灵敏度高、重复性好、检测速度快，检测批量大的优点，能高效的对***代谢产物进行精确的定量检测，具有良好的科研和商业应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱联用串联质谱技术检测人体尿液中***代谢产物的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下。
1、 将人体尿液与内标液混合，随后对混合液依次进行酶水解，有机溶剂萃取和反相介质固相萃取纯化，氮吹仪挥发溶剂，化学衍生法得到待测样本。
2、 将上述待测样本通过液相色谱与质谱联用检测，得到***以及各种***代谢物的种类和含量。
进一步的，上述步骤1 中酶水解的时间为3-12小时、水解温度为37-50°C、水解液与样本的用量体积比为1-3:1。
进一步的，上述步骤1 中有机萃取溶剂为乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和叔丁基甲醚中的一种。
更进一步的，所述的有机萃取溶剂为乙酸乙酯。
进一步的，上述步骤1中反相介质固相萃取法的洗脱溶剂为甲醇。
进一步的，上述步骤1 中化学衍生法使用的试剂为丹酰氯、邻苯二甲醛、苯甲酰氯、荧光胺、对酞内酰胺苯璜酰氯等衍生试剂中的一种。
更进一步的，所述的化学衍生法使用的试剂为丹酰氯。
更进一步的，所述的化学衍生法反应时间为5-30分钟，反应温度为50-70°C。
进一步的，上述步骤2中具体包括以几步：
步骤A：称取***标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；
步骤B: 量取上述甲醇定容后的内标液，将其分别加入步骤A得到的标准液中，用超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；
步骤C：将步骤B得到的待测标准液和步骤1得到的待测样本通过液质联用检测，得到***代谢产物的种类及含量。
进一步的，所述***及其代谢产物包括Estrone(E1), Estradiol(E2),Estriol(E3), 16α-Hydroxyestrone(16α-OHE1), 4-Hydroxyestrone(4-OHE1), 2-Hydroxyestradiol(2-OHE2), 4-Hydroxyestradiol(4-OHE2), 16-Ketoestradiol(16-ketoE2), 2-Hydroxyestrone(2-OHE1), 2-Methoxyestradiol(2-MeOE2), 4-Methoxyestradiol(4-MeOE2), 2-Methoxyestrone(2-MeOE1), 4-Methoxyestrone(4-MeOE1), 2-Hydroxyestrone-3-methylether(3-MeOE1)。
采用有机溶剂萃取和反相介质固相萃取纯化处理人体尿液中的上述***及***代谢产物，利用高效液相色谱将14种***及代谢产物分离，再利用内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述***及其代谢产物的含量。
进一步的，上述步骤C液质联用检测的液相色谱条件为：
色谱柱为键合相色谱柱，进样量为5-20μL，流动相包括A和B，其中A为水溶液， B为混合溶液，流动相的流速为0.1-0.4mL/min; 流动相的梯度（以体积百分比计）：
0-3min, A: 30-100%, B: 70-0%;
3.1-5min, A: 10-60%, B: 90-60%;
5.1-7min, A: 0-50%, B: 100-50%;
7.1-9min, A: 50-100%, B: 50-0%;
9.1min, A: 30-100%, B:70-0%。
更进一步的，上述键合相色谱柱为C18或C8等键合相色谱柱，规格为50-150mm×1-4.6mm, 粒径为1.7-5μm。
更进一步的，液相色谱条件中，流动相A为5-10mmol/L的乙酸铵水溶液+0.1%甲酸，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的质量比为9-1:1-9。
进一步的，上述液质联用检测的质谱条件为：ESI离子源，正离子MRM扫描，雾化气流速为5-10L/min，气帘气流速为5-20L/min，离子源电压为2000-4500V，离子源温度为200-400°C。
进一步的，在电喷雾正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，目标物的离子对监测如下：E1(m/z 504.2—171.1); E2(m/z 506.2—171.1); 16α-OHE1(m/z520.2—171.1);E3(m/z 522.0—171.1); 16-ketoE2(m/z 520.2-171.1); 2-MeOE1(m/z534.2—171.1); 3-MeOE1(m/z 534.2—171.1); 4-MeOE1(m/z 534.2—171.1); 2-MeOE2(m/z 536.2—171.1); 4-MeOE2(m/z 536.2—171.1); 2-OHE1(m/z 753.3—170.1); 4-OHE1(m/z 753.3—170.1); 2-OHE2(m/z 755.3—170.1); 4-OHE2(m/z 755.3—170.1);Tanshinone IIA(m/z 295.2—277.2)。
与已有技术相比，本发明的优势在于以下3点。
1、 本发明提供的人体尿液中***及其代谢产物的检测方法将人体尿液与内标液混合后对混合液依次进行酶水解，有机溶剂萃取和反相介质固相萃取纯化，氮气吹干后化学衍生后进行液质联用的分析。优化的水解温度、时间，萃取的条件、时间，反相固相萃取柱的选择、化学衍生处理的条件优化等可以使得***和代谢产物成分充分溶出并可以提高检测效率，从而可以真实的反应待测样品中***及其代谢产物的种类和含量，使得检测结果的准确性、重复性和稳定性大大提高。
2、 本发明提供的人体尿液中***及其代谢产物的检测方法适用于所有***和代谢产物的同步批量检测。这些代谢产物结构非常相近，化学物理性质基本一致，同时进行快速分离鉴定具有很大的技术难度。本发明提供的液相分离及质谱检测的方法可以高效准确的对所有目标产物进行定性定量分析，满足大批量实验室检测的需要，具有较高的应用价值。
3、 本发明提供的人体尿液中***及其代谢产物的检测方法具有灵敏度高、精确度高、重复性好以及检测速度快的优点，适用于临床检测，为临床上评估乳腺癌发生风险以及***代谢水平提供了可靠的检测方法。
附图说明
图1 ：***及代谢物标准品检测结果总离子流图（从左到右依次为：16α-OHE1，IS，2-MeOE2, 4-MeOE2, E2, E3, 16keto-E2,3-MeOE1, 2-MeOE1, E1, 4-MeOE1, 4-OHE2,2-OHE2, 2-OHE1, 4-OHE1）。
图2：乳腺癌病人尿液的***及代谢物检测结果总离子流图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明，本领域的技术人员更容易理解。实施例所描述的内容仅用于说明本发明，但不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例都属于本发明保护的范围。
实施例1：检测方法建立与优化。
1.材料
方法学研究实验的样本来自于四川省华西医院内分泌科2018年5月至6月部分就诊患者的尿液样本。
仪器：岛津8050三重四级杆质谱仪（岛津公司）；岛津液相色谱***（配自动进样器）；十万分之一天平；色谱柱（C18）；氮吹仪；高速台式冷冻离心机；冻干机；固相萃取柱；可调移液器；玻璃仪器、烧杯、量筒等。
试剂耗材：色谱纯甲醇；乙腈；甲酸；乙酸铵；抗坏血酸；乙酸钠；水解酶Glucuronidase/Sulfatase；碳酸氢钠；氢氧化钠；丙酮；丹酰氯；冰醋酸；氢氧化钠；活性炭；磷酸。
标准品：Estrone(E1), Estradiol(E2), Estriol(E3), 16α-Hydroxyestrone(16α-OHE1), 4-Hydroxyestrone(4-OHE1), 2-Hydroxyestradiol(2-OHE2), 4-Hydroxyestradiol(4-OHE2), 16-Ketoestradiol(16-ketoE2), 2-Hydroxyestrone(2-OHE1), 2-Methoxyestradiol(2-MeOE2), 4-Methoxyestradiol(4-MeOE2), 2-Methoxyestrone(2-MeOE1), 4-Methoxyestrone(4-MeOE1), 2-Hydroxyestrone-3-methylether(3-MeOE1)购于Sigma-Aldrich；内标Tanshinone IIA购于中检院。
2.方法
色谱条件：流动相A：0.1%v/v 甲酸+0.2M乙酸铵水溶液；流动相Ｂ：０.１％ｖ／ｖ甲酸甲醇溶液。C18色谱柱，采用梯度洗脱方式。流速为０.3ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为4５°C，进样量为10μＬ。
质谱条件：电喷雾电离正离子检测模式，采用多反应监测的扫描模式。喷雾电压为4kV；碰撞气为；离子源雾化气为；加热辅助气为；去溶剂温度为。监测的目标物如下：E1(m/z504.2—171.1); E2(m/z 506.2—171.1); 16α-OHE1(m/z 520.2—171.1);E3(m/z522.0—171.1); 16-ketoE2(m/z 520.2-171.1); 2-MeOE1(m/z 534.2—171.1); 3-MeOE1(m/z 534.2—171.1); 4-MeOE1(m/z 534.2—171.1); 2-MeOE2(m/z 536.2—171.1); 4-MeOE2(m/z 536.2—171.1); 2-OHE1(m/z 753.3—170.1); 4-OHE1(m/z 753.3—170.1);2-OHE2(m/z 755.3—170.1); 4-OHE2(m/z 755.3—170.1); Tanshinone IIA(m/z295.2—277.2)。分别对各个目标的去簇电压，碰撞电压等条件进行***优化，以达到最佳的稳定性和灵敏度。
标准品配制：分别准确称取标准品各1mg，分别置于10mL的容量瓶中，加入含0.1%抗坏血酸的甲醇溶液，配制成浓度分别为100μg/mL的标准品母液；分别从以上标准品母液中移取用溶液定容，得到浓度为1μg/mL，然后用甲醇将浓度由逐级稀释；接着分别取浓度为加入到离心管中，再加入去离子水定容到，配制成混合标准液。
称取内标品，加入完全溶解得到浓度为1mg/mL的内标溶液。然后用甲醇将内标溶液的浓度稀释至50ng/mL，配制得到内标工作溶液。
样品处理：
500μL尿液中加入500μL水解液，55℃水解3小时后，加入500μL乙酸乙酯萃取，取上清液加入活化后的固相萃取小柱中，甲醇洗脱2次，每次1mL，共计2mL洗脱液，加热60℃的条件下用氮吹仪挥发干，加入100μLNaHCO3和100μL丹酰氯溶液，在60℃下衍生10min，0.22μm滤膜过滤后进样。
尿液样本检测总离子流图见附图2。
实施例2：方法验证。
1、方法专属性。
取0.5ml空白基质2份，分2组处理：
1. 保留空白；
2. 加入10μl含有14个EM的混标工作液（4ng/ml）,以及10μl内标溶液（50ng/ml）。
2组样品涡旋混匀10s，放置30min。之后进行固相萃取，氮吹和衍生。滤膜过滤后进样分析。
比较两组色谱图，分析尿液中内源性物质对被测化合物和内标的干扰。
专属性验证结果表明在标准品出峰位置，空白基质样品均未出现明显干扰峰。14种***及***代谢产物的标准品和尿液样品的峰型对称，在低浓度时基本没有杂峰干扰。可参见附图1。
2、基质标准曲线。
取系列浓度基质标准曲线样品，从低浓度到高浓度连续进样，每个浓度2次进样进行分析。以被测物EM浓度为横坐标，被测物与内标物峰面积比值为纵坐标，采用线性回归，得到回归方程和相关系数。
校准曲线采用内标定量法，利用软件以标准品与内标物的浓度比为Ｘ轴，标准品与内标物峰面积比为Ｙ轴，建立校准曲线，计算尿液中待测物的浓度。验证结果表明，14个***及其代谢物的标准曲线线性良好，拟合系数均大于0.99，线性范围在200ng/mL-0.01ng/mL间，满足定量的要求。各被测物标准曲线及拟合系数见下表。
3、最低定量限。
取空白基质0.5ml，加入一定量混标工作液（浓度为0.01ng/mL）和内标工作液各10μl，进行样本前处理。进样进行分析，同一浓度平行处理6份。
代入基质标准曲线，计算浓度的精密度小于20%，回收率在100±20%之间时，该浓度为最低定量限。
实验结果显示，回收率在82%-98%之间，精密度在6%-15%之间，满足方法验证需求。
4、基质效应。
分2组处理样品：
1.取甲醇0.5ml，按照质控样品的3个浓度，高中低分别加入混标工作液和内标工作液各10μl，进行样本前处理。进样进行分析；
2. 取空白基质0.5ml，按照质控样品的3个浓度，高中低分别加入混标工作液和内标工作液各10μl，进行样本前处理。进样进行分析。每个浓度选取3份不同来源空白基质。
计算：
将第2组得到的标准品峰面积分别除以第1组所得的相应标准品峰面积（×100%），即得各标准品的基质效应。
要求基质效应在80%-120%，且基质加标和甲醇溶液加标均应满足RSD＜15%。
实验结果表明，14个***及代谢物的基质效应范围为83%-117%，能够满足方法验证的要求。
5、准确度和精密度。
选质控高中低和最低定量限浓度进行准确度和精密度考察。样品采用空白基质配制。
同一天每一样品连续分析6次，测定准确度和批内精密度。
4个浓度样品每日连续进样2次，每次测完后放置于4℃冰箱中保存，连续3天测定，分析日间精密度。R标曲需同时进行测定。
精密度的RSD＜15%，准确度在100±15%范围内。最低定量限的准确度放宽到±20%，RSD≤20%。
实验结果表明，14个***及代谢物的准确度在87%-114%之间，批内精密度在3%-8%之间，日间精密度在5%-13%之间。最低定量限的准确度在82%-98%之间，批内精密度在6%-15%之间，日间精密度在＜16%之间。
6、 稳定性。
①日内稳定性。
室温放置24小时稳定性。
高中低浓度质控样品，前处理后，室温下放置24小时，0、4、8、24小时分别进样测定，每样每次测定2针。计算测得浓度的回收率和RSD值。
放置时间应超过单个批次样品分析所需时间。
要求RSD＜15%，准确度在100±15%范围内。
实验结果表明，被测的14种***及代谢物室温放置24小时是稳定的。其4次测定的准确度范围为88%-106%，RSD在2%-7%之间。
②日间稳定性。
高中低浓度质控样品，前处理后，日内稳定性样品在完成24小时测定后，转入4℃放置，24小时后再取出放入室温，按①中方法重新测定。每天控制在同一时间，保证相同的时间间隔下，连续考察3天内的日间稳定性。
计算测得浓度的回收率和RSD值。
要求RSD＜15%，准确度在100±15%范围内。
实验结果表明，被测的14种***及代谢物按照以上方法放置4天是稳定的。其4次测定的准确度范围为86%-112%，RSD在5%-11%之间。
实施例3：病人样本检测。
研究实验的样本来自于四川省华西医院乳腺外科就诊乳腺癌患者的尿液样本。
本实验中试剂和仪器设备同实施例1。
本实验中色谱条件和质谱检测条件同实施例1。
测定结果及数据统计见下表。

Claims (10)

1.一种人体尿液中***及其代谢产物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
1）将人体尿液与内标液混合后，对其依次进行酶水解、有机溶剂萃取和反相介质的固相萃取纯化，氮气吹干后进行化学衍生得到待测样本；
2）将上述待测样本通过液相色谱和质谱仪联用检测，同步对***及其代谢产物进行定性和定量的批量检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤中酶水解的时间为3-12小时、水解温度为37-50°C、水解液与样本的用量体积比为1:1-3:1。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤中萃取所用的有机溶剂包括乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和叔丁基甲醚，优选的有机萃取溶剂为乙酸乙酯。
4.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤中反相介质固相萃取的洗脱溶剂为甲醇或丙酮。
5.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤中化学衍生的试剂为丹酰氯或邻苯二甲醛、苯甲酰氯、荧光胺、对酞内酰胺苯璜酰氯等衍生试剂中的一种；所述的化学衍生法反应时间为5-30分钟，反应温度为50-70°C。
6.根据权利要求1-5项任一项所述的检测方法，其特征在于，所述步骤具体包括以下步骤：
步骤1）称取***及其代谢产物标准品，用甲醇溶解得到不同浓度的标准液；
步骤2）称取内标样品定容为内标液，随后加入步骤1）中的标准液，甲醇、丙酮或超纯水中任一种溶剂定容后离心，取上清液作为待测标准液；
步骤3）将步骤2）中得到的待测标准液和权利要求1中得到的待测样本通过液质联用检测，经过标准曲线计算得到尿液中***及其代谢产物的种类和含量。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3）中液质联用检测的液相色谱条件为：
色谱柱为键合相色谱柱，进样量为5-50μL，流动相A为纯水，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，乙腈与甲醇的质量比为（9-1）:（1-9）；流动相的流速为0.1-2.0mL/min；流动相的梯度（以体积百分比计）：
0-3min, A: 30-100%, B: 70-0%;
3.1-5min, A: 10-60%, B: 90-60%;
5.1-7min, A: 0-50%, B: 100-50%;
7.1-9min, A: 50-100%, B: 50-0%;
9.1min, A: 30-100%, B:70-0%。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述键合相色谱柱为C18或C8等键合相色谱柱，规格为（50-150mm）×（1-4.6mm），粒径为1.7-5μm。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3）中液质联用检测的质谱仪条件为：采用电喷雾（ESI）离子源，正离子MRM扫描方式，雾化气流速为5-10L/min，气帘气流速为5-20L/min，离子源电压为2000-4500V，离子源温度为200-400°C。
10.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述***及其代谢产物包括人体尿液中***及其代谢产物，采用多反应监测的质谱扫描模式，目标物的离子对监测如下：
E1(m/z 504.2—171.1); E2(m/z 506.2—171.1); 16α-OHE1(m/z 520.2—171.1);E3(m/z 522.0—171.1); 16-ketoE2(m/z 520.2-171.1); 2-MeOE1(m/z 534.2—171.1); 3-MeOE1(m/z 534.2—171.1); 4-MeOE1(m/z 534.2—171.1); 2-MeOE2(m/z 536.2—171.1); 4-MeOE2(m/z 536.2—171.1); 2-OHE1(m/z 753.3—170.1); 4-OHE1(m/z753.3—170.1); 2-OHE2(m/z 755.3—170.1); 4-OHE2(m/z 755.3—170.1); TanshinoneIIA(m/z 295.2—277.2)。
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