CN106801091A - 检测人类egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒及反应体系 - Google Patents
检测人类egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒及反应体系 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒及反应体系,该试剂盒包括:上游引物、下游引物、检测外显子19缺失突变的荧光探针和检测扩增后总DNA的荧光探针。该试剂盒针对EGFR基因外显子19缺失突变设计了特定序列的引物对和特定序列的探针,在优化的反应体系中通过digital PCR平台的方法,实现对EGFR基因外显子19缺失突变的高灵敏度检测,另外该检测可以同时检测18种不同类型的EGFR基因外显子19缺失形式,大大提高了通用性,从而为EGFR靶向治疗提供参考;进一步的本申请中可检测的样本来源多样,既可以是肿瘤组织,也可以是ctDNA,扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测基因突变的试剂盒、反应体系及方法,特别涉及一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒、反应体系及方法。
背景技术
一直以来肺癌都位居全球癌症相关死亡的首位。世界卫生组织国际癌症研究署发布的癌症报告显示:全球肺癌新发病例预测约161万例,死亡约138万例,分别占恶性肿瘤新发病例及死亡病例的13%及18%,居恶性肿瘤第一位,其中非小细胞肺癌(Non-Small CellLung Cancer,NSCLC)占肺癌的80%以上。尽管肺癌的诊断方法和治疗手段不断提高,肺癌的死亡率仍未得到有效控制,患者的预后较差,5年生存率仍<20%。
人类表皮生长因子受体家族(epidermal growth factor receptor family,EGFR家族)属于酪氨酸激酶受体家族,是一种多功能糖蛋白,其广泛分布于人体各组织细胞膜上,是原癌基因的表达产物,其基因位于第七号染色体短臂上(7p12),由188.307K个碱基组成,共有28个外显子,EGFR具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)区,其是传递胞外信号到胞内的重要途经蛋白,并由外显子18.24编码。EGFR家族成员的结构相似,都包括胞外段、跨膜区和胞内段三部分。胞外段为受体与配体结合部,跨膜段为疏水部,将受体固定于细胞膜上,胞内区有典型的ATP结合位点和酪氨酸激酶区,其酪氨酸激酶活性在调节细胞增殖及分化中起着至关重要的作用。当配体与受体结合后,引起受体的二聚化作用,形成同型或异型二聚体,二聚化的受体发生交联磷酸化,即一个受体和另外一个受体上特定的酪氨酸残基磷酸化,激活胞内区的TK亚区,从而激发下一级信号传导。非小细胞肺癌EGFR突变85%以上发生在外显子19的缺失突变及外显子21的L858R点突变。
近年来,表皮细胞生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制物(TKIs)吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等被证明对具有EGFR激活突变的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者具有显著疗效,EGFR-TKI成为非小细胞肺癌治疗的里程碑。但同时,几乎所有初始时对EGFR-TKI反应良好的患者会在6-12个月内出现耐药、疾病进展,称为“获得性耐药”。
许多研究已证实EGFR的突变状态决定了肿瘤对EGFR-TKI的反应,研究表明EGFR-TKI药物对于EGFR L858R和EGFR外显子19缺失突变的患者作用显著,尤其是EGFR基因外显子19发生缺失突变的非小细胞肺癌患者对该类药物敏感,即受体酪氨酸激酶抑制剂药物对这些患者有疗效。因此EGFR外显子exon19缺失突变准确的检测,可以为筛选靶向治疗患者提供参考;同时可用于癌症患者,特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测,以及用药期间耐药性突变监测。但外显子19缺失突变主要是发生9、12、15、18、24个核苷酸的框内缺失突变,其缺失形式较多,为检测其缺失情况带来一定困难。
目前检测EGFR基因突变最常用的样本来源是肿瘤的病理组织或细胞学标本,但是组织取材均为有创操作,有时难以实施,且这些操作受肿瘤大小、部位、患者一般情况等影响,有时不能取得满意的组织或组织量太少不能进行基因突变检测。并且随着疾病的进展和EGFR-TKIs耐药性的出现,常常需要再次进行分子生物学检测,而组织取材为有创操作,不能便捷、反复进行。近些年血浆游离DNA(ctDNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放游离DNA进入外周血。ctDNA用于肿瘤突变检测优势在于:操作无创;在疾病的任一进程中都可获取;可以作为一种肿瘤标记物,实现实时检测和动态监测;克服肿瘤组织的异质性。因此,使用外周血游离DNA监测患者EGFR基因突变状态,探索患者EGFR-TKI耐药机制及预测预后成为一条可行的途径。然而,目前使用ctDNA检测EGFR基因突变仍有一些技术上的挑战。1)ctDNA含量因人而异,并且大多数人含量较低;2)ctDNA片段相对小,约为180bp:3)ctDNA中肿瘤相关的DNA所占比例不同人差别较大,并且常因比例小而难以测出;4)以前的研究显示,与肿瘤组织相比,ctDNA检测EGFR突变灵敏度仅为43-66%。因此,高灵敏度的ctDNA EGFR基因突变检测技术的发展十分重要。
综上所述,本领域迫切需要一种能够基于非肿瘤组织,高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中EGFR外显子19缺失突变的方法。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒、反应体系及方法,该试剂盒针对EGFR基因外显子19缺失突变设计了特定序列的引物对和特定序列的探针,在优化的反应体系中通过Thermo QuantStudio 3D digital PCR平台的方法,实现对EGFR基因外显子19缺失突变的高灵敏度检测;并且在检测EGFR基因外显子19缺失突变的阴阳性的同时还可以获得样本中EGFR基因外显子19缺失突变的比例;另外该检测可以同时检测18种不同类型的EGFR基因外显子19缺失形式,大大提高了通用性,从而为EGFR靶向治疗提供参考;进一步的本申请中可检测的样本来源多样,既可以是肿瘤组织,也可以是ctDNA,扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围。
本发明的具体技术方案如下:
一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒,包括:具有如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示序列的检测外显子19缺失突变的荧光探针和具有如SEQ ID NO:4所示序列的检测扩增后总DNA的荧光探针。上游引物SEQ ID NO:1的序列为GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT,下游引物SEQID NO:2的序列为AGCAGAAACTCACATCGAGG。检测外显子19缺失突变的荧光探针序列SEQ IDNO:3为TCCTTGTTGGCTTTC,检测扩增后总DNA的荧光探针序列SEQ ID NO:4为AGGAATTAAGAGAAGCAAC。检测外显子19缺失突变的荧光探针5’端连接有荧光报告基团,优选为VIC,检测外显子19缺失突变的荧光探针3’端连接有淬灭基团,优选为MGB;检测扩增后总DNA的荧光探针5’端连接有荧光报告基团,且该荧光报告基团不同于检测外显子19缺失突变的荧光探针中的荧光报告基团,优选为FAM,检测扩增后总DNA的荧光探针3’端连接有淬灭接团,优选为MGB。
上述试剂盒在另一种实现方式中,所述上游引物、下游引物、检测外显子19缺失突变的荧光探针和检测扩增后总DNA的荧光探针均以引物探针混合液的形式存在,即所述上游引物、下游引物、检测外显子19缺失突变的荧光探针和检测扩增后总DNA的荧光探针均溶解在同一TE缓冲液中,所述上游引物在引物探针混合液中的浓度为12μM,所述下游引物在引物探针混合液中的浓度为12μM,所述检测外显子19缺失突变的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为3μM,所述检测扩增后总DNA的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为3μM。
上述试剂盒在另一种实现方式中,还包括数字PCR反应预混液,优选QuantStudioTM3D Digital PCR Master Mix v2。
上述试剂盒在另一种实现方式中,还包括阳性质控品,所述阳性质控品通过以下方式制备获得:将EGFR外显子19缺失突变细胞系基因组DNA与野生型细胞系基因组DNA混合后使含EGFR基因外显子19缺失突变的DNA比例占总DNA的约1.0%,将所得混合DNA加到Covaris超声管中并进行超声处理,获得打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA。
上述试剂盒在另一种实现方式中,还包括阴性质控品,所述阴性质控品通过以下方式制备获得:将不含有EGFR外显子19缺失突变的EGFR野生型细胞系基因组DNA加到Covaris超声管中并进行超声处理,获得打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA。
一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的PCR反应体系,包括:
其中所述引物探针混合液中包括具有如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示序列的检测外显子19缺失突变的荧光探针、具有如SEQ ID NO:4所示序列的检测扩增后总DNA的荧光探针;上游引物、下游引物、检测外显子19缺失突变的荧光探针和检测扩增后总DNA的荧光探针在PCR反应体系的终浓度分别为800nM、800nM、200nM和200nM。
上述PCR反应体系在另一种实现方式中,所述DNA模板的来源为肿瘤组织中提取的DNA或血浆游离DNA,尤其是血浆游离DNA。
一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的芯片式数字PCR方法,包括以下步骤:
1.配制上述检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的反应体系;
2.把反应体系上样到数字PCR芯片中;
3.把数字PCR芯片放入专用PCR仪中,进行PCR扩增;
4.从专用PCR仪中取出芯片并放至室温后,将芯片放入芯片扫描仪中扫描荧光信号;
5.计算机根据荧光信号计算突变比例。
上述芯片式数字PCR方法在另一种实现方式中,所述PCR扩增的程序为:(1)96℃,10min;(2)继续进行39个循环,每个循环包括57℃进行2min,然后98℃进行30sec;(3)39个循环之后57℃进行2min;在10℃下保持不超过12小时。
常规芯片式数字PCR的检测原理如下:数字PCR芯片上含有2万个纳米级微孔,用Chip-Loader将混合好的PCR反应体系加样到数字PCR芯片上,混合液由于亲疏水作用进入芯片的微孔中并在专用PCR仪中进行PCR反应。微孔中的PCR反应体系包含DNA模板,PCR扩增结束后,野生型DNA和突变型DNA分别对应的荧光信号情况会反应在含有相应DNA模板的微孔中,PCR反应体系没有进入的微孔则没有扩增后的荧光信号产生。用芯片扫描仪扫描并读取这些荧光信号信息,再根据泊松分布原理可以计算出DNA模板的拷贝数。由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有无扩增,不依赖于Ct值,对PCR反应抑制剂的耐受能力大大提高,不需要参考品和标准曲线就可以精确定量。
本申请试剂盒中检测外显子19缺失的荧光探针的设计原理与常规芯片式数字PCR不同,检测外显子19缺失的荧光探针序列是与外显子19上易发生缺失的区域序列相对应。这种设计使得当外显子19上易发生缺失的区域出现任何一种形式的缺失及突变时,该探针无法结合,从而没有荧光信号。而检测扩增后总DNA的荧光探针被设计为与外显子19不发生缺失的区域结合,且与突变型探针没有区域交联,因此不管有没有发生外显子19的缺失突变,该探针都能与所有扩增所得DNA结合并发出荧光信号。
为了方便用户使用,使用本申请中试剂盒的方式仍按照常规芯片式数字PCR的操作方式进行,但为了使按照常规芯片式数字PCR的方法、根据荧光信号信息和泊松分布原理计算出的DNA模板拷贝数同样适用于本申请中的实际结果,需要控制以下内容:控制反应体系的DNA模版上样量使芯片上每个微孔中分布的模版量为1或0,同时出现2个拷贝的几率非常小。如果使用Thermo公司的3D Digital PCR System,控制反应体系的DNA模版上样量为20-40ng,可以保证按照常规芯片式数字PCR的方法、根据荧光信号信息和泊松分布原理计算出的DNA模板拷贝数与本申请中的实际结果的误差不大于5%。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1.本申请根据EGFR基因外显子19缺失位点设计了特异性的引物和探针,使得在Thermo QuantStudio 3D digital PCR平台上检测灵敏度达到万分之五~千分之一,与ARMS-PCR相比,灵敏度提高;并且在检测外显子19缺失突变的阴阳性的同时还可以获得样本中该突变的比例;另外该检测可以可在一张芯片上同时检测18种不同类型的EGFR基因外显子19缺失形式,大大提高了通用性;可以更好的进行靶向药物的选择,病情监测和预后评估等。
2.该数字PCR可以扩增小于100bp的片段,因此既可用于肿瘤组织提取的DNA,也可以用于ctDNA的扩增。
3.与液滴式数字PCR(digital droplet PCR)相比,芯片式数字PCR无需对PCR反应体系进行液滴化处理,因此整个检测过程时间较短且不存在液滴不均一的情况,理论上结果稳定;并且成本较液滴式数字PCR低,反应通量灵活(1~24个样本均可),液滴式数字PCR一次反应为8个。
4.与NGS Ctdna测序对比,时间短,速度快,准确性高。
附图说明
图1是本发明实施例3中EGFR基因外显子19缺失突变比例26%的样品的检测结果;
图2是本发明实施例3中EGFR基因外显子19缺失突变比例1.5%的样品的检测结果;
图3是本发明实施例3中EGFR基因外显子19缺失突变比例0.1%的样品的检测结果;
图4是本发明中EGFR基因无外显子19缺失突变的野生型样品进行检测的检测结果;
图1-图4中,显示的每个点对应芯片上的一个微孔,其中:既没有FAM荧光信号也没有VIC荧光信号的点代表该微孔没有进入反应体系,因此没有任何扩增信号(即:区域1);既有FAM荧光信号也有VIC荧光信号的点(即:区域2)代表该微孔只进入了仅含野生型模板的反应体系,有FAM扩增信号代表检测扩增后总DNA的荧光探针正常结合并且反应体系正常扩增,有VIC扩增信号代表外显子19未出现缺失突变,所以检测外显子19缺失突变的荧光探针能正常结合并且反应体系正常扩增;有FAM荧光信号但没有VIC荧光信号的点(即:区域3)代表该微孔只进入了仅含突变型模板的反应体系,有FAM扩增信号代表检测扩增后总DNA的荧光探针正常结合并且反应体系正常扩增,没有VIC扩增信号代表外显子19出现缺失突变,所以检测外显子19缺失突变的荧光探针不能正常结合。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒的组成
一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒,包括:引物探针混合液和数字PCR反应预混液,其中:引物探针混合液是在TE缓冲液中溶解有具有如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示序列的检测外显子19缺失突变的荧光探针和具有如SEQ ID NO:4所示序列的检测扩增后总DNA的荧光探针,检测外显子19缺失突变的荧光探针5’端连接有荧光报告基团,为VIC,检测外显子19缺失突变的荧光探针3’端连接有淬灭基团,为MGB;检测扩增后总DNA的荧光探针5’端连接有荧光报告基团,且该荧光报告基团不同于检测外显子19缺失突变的荧光探针中的荧光报告基团,为FAM,检测扩增后总DNA的荧光探针3’端连接有淬灭接团,为MGB。其中:上游引物和下游引物在引物探针混合液中的浓度均为12μM,检测外显子19缺失突变的荧光探针和检测扩增后总DNA的荧光探针在引物探针混合液中的浓度均为3μM,引物探针混合液的配制方法为:将上游引物、下游引物、检测外显子19缺失突变的荧光探针和检测扩增后总DNA的荧光探针四种成分的干粉分别用TE缓冲液稀释到30μM,然后按照上游引物:下游引物:检测外显子19缺失突变的荧光探针:检测扩增后总DNA的荧光探针=4:4:1:1体积比混合,混合后的产物即为引物探针混合液;数字PCR反应预混液为QuantStudioTM3D DigitalPCR Master Mix v2。
检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒还可以包括:阳性质控品和阴性质控品,阳性质控品通过以下方式制备获得:将EGFR外显子19缺失突变细胞系基因组DNA与野生型细胞系基因组DNA混合后使含EGFR基因外显子19缺失突变的DNA比例占总DNA的约1.0%,之后将所得混合DNA加到Covaris超声管中并进行超声处理,获得打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA;阴性质控品通过以下方式制备获得:将不含有EGFR外显子19缺失突变的EGFR野生型细胞系基因组DNA加到Covaris超声管中并进行超声处理,获得打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA。
实施例2检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的方法
1.采用实施例1所述试剂盒;
2.按下表配制PCR反应体系:
3.按照CHIP-LOADER的说明书,将步骤2配制好的PCR反应体系的混合液加样至数字PCR芯片中,并用矿物油覆盖芯片,密封好芯片并检查确保无泄露;
4.把芯片放入专用PCR仪中,按照以下扩增程序进行设置;
5.扩增结束后,从PCR仪中取出芯片,室温放置10min,加入芯片扫描仪中读取;
6.计算机根据荧光信号计算突变比例。
实施例3使用实施例2中的方法对标准品进行检测
将野生型标准品和突变比例分别为34%、1.5%和0.1%的EGFR基因外显子19c.2236_2250del p.E746_A750del缺失突变标准品用实施例2中的方法进行检测、计算后得出含EGFR基因外显子19c.2236_2250del p.E746_A750del缺失突变的标准品中突变比例分别为:34.02%、1.49%和0.09%。检测方法的准确性符合预期,其检测结果如图1-图3所示,野生型标准品的检测结果如图4所示。其中:含突变的标准品是通过以下方式获得的:将已知突变比例的EGFR突变型细胞系基因组DNA和野生型细胞系基因组DNA按照不同比例混合后再加到Covaris超声管中并进行超声处理,获得打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA。野生型标准品是通过以下方式获得的:将不含有EGFR外显子19缺失突变的EGFR野生型细胞系基因组DNA打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA。
从图3中可以看出使用本申请试剂盒和检测方法,检测EGFR基因外显子19缺失突变的灵敏度可达到0.1%。
将仅含有以下表1中特定一种EGFR外显子19缺失突变的标准品用上述同样的方法进行检测,所获得结果的准确性同样可以达到以上标准,灵敏度也可达到0.1%。另外,将各标准品混合获得同时含有以下18种EGFR外显子19缺失突变的混合标准品,用上述同样的方法进行检测,所获得结果的准确性同样可以达到以上标准,灵敏度也可达到0.1%。
表1
c.2235_2249del p.E746_A750del |
c.2236_2250del p.E746_A750del |
c.2236_2253del p.E746_T751del |
c.2237_2251del p.E746_T751>A |
c.2237_2254del p.E746_S752>A |
c.2238_2255del p.E746_S752>D |
c.2239_2247del p.L747_E749del |
c.2239_2253del p.L747_T751del |
c.2239_2256del p.L747_S752del |
c.2240_2251del p.L747_T751>S |
c.2240_2254del p.L747_T751del |
c.2240_2257del p.L747_P753>S |
c.2235_2252>AAT(complex)p.E746_T751>I |
c.2237_2250>T(complex)p.E746_S752>V |
c.2238_2248>GC(complex)p.L747_A750>P |
c.2238_2252>GCA(complex)p.L747_T751>Q |
c.2239_2248TTAAGAGAAG>C(complex)p.L747_A750>P |
c.2239_2251>C(complex):p.L747_T751>P |
表1中的标准品均可通过商业渠道购买获得
实施例4使用实施例2中的方法对实际样品进行检测
使用实施例2中的方法对20例临床为3~4期非小细胞肺癌病人的血样和与血样对应的组织样本进行检测。
一、血样中ctDNA的检测:
1.混匀保存在EDTA抗凝管中的全血样本10ml(样本采集不超过3小时)并转移到15ml离心管中,2000g、4℃离心10min,取澄清的血浆;
2.将血浆分装到1.5ml管中,放置于4℃离心机中设置转速为16000g离心15min,取澄清血浆;
3.用ctDNA提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司的MagMAXTMCell-FreeDNA Isolation Kit),按照说明书操作提取ctDNA;
4.ctDNA经质检及Qubit3.0定量后确认总量不少于20ng,按照实施例2中的检测方法进行检测。
二、组织样本中的基因组DNA的检测:
与血样对应的20例组织样本用EGFR突变检测试剂盒(ARMS法)做了检测,发现的阳性样本继续用sanger测序做了验证,结果一致。
三、检测结果如下:
结果显示,20例样本的组织检测与ctDNA检测结果完全一致,说明本试剂盒达到了非常好的效果。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式,并且很显然,根据上述教导,可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用,从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒,其特征在于,包括:具有如SEQID NO:1所示序列的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、具有如SEQ IDNO:3所示序列的检测外显子19缺失突变的荧光探针和具有如SEQ ID NO:4所示序列的检测扩增后总DNA的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述上游引物、下游引物、检测外显子19缺失突变的荧光探针和检测扩增后总DNA的荧光探针均存在于引物探针混合液中。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述上游引物在引物探针混合液中的浓度为12μM,所述下游引物在引物探针混合液中的浓度为12μM,所述检测外显子19缺失突变的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为3μM,所述检测扩增后总DNA的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为3μM。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,还包括数字PCR反应预混液,优选QuantStudioTM3D Digital PCR Master Mix v2。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,还包括阳性质控品,所述阳性质控品通过以下方式制备获得:将EGFR基因外显子19缺失突变细胞系基因组DNA与野生型细胞系基因组DNA混合后使含EGFR基因外显子19缺失突变的DNA比例占总DNA的约1.0%,将所得混合DNA加到Covaris超声管中并进行超声处理,获得打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,还包括阴性质控品,所述阴性质控品通过以下方式制备获得:将不含有EGFR外显子19缺失突变的EGFR野生型细胞系基因组DNA加到Covaris超声管中并进行超声处理,获得打断成为与ctDNA片段长度接近的180bp左右的片段化DNA。
7.一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的PCR反应体系,其特征在于,包括:
8.根据权利要求6所述的PCR反应体系,其特征在于,所述DNA模板的来源为肿瘤组织中提取的DNA或血浆游离DNA,尤其是血浆游离DNA。
9.一种检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的芯片式数字PCR方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)配制权利要求7所述检测人类EGFR基因外显子19缺失突变的PCR反应体系;
2)把反应体系上样到数字PCR芯片中;
3)把数字PCR芯片放入专用PCR仪中,进行PCR扩增;
4)从专用PCR仪中取出芯片并放至室温后,将芯片放入芯片扫描仪中扫描荧光信号;
5)计算机根据荧光信号计算突变比例。
10.根据权利要求9所述的芯片式数字PCR方法,其特征在于,所述PCR扩增的程序为:(1)96℃,10min;(2)继续进行39个循环,每个循环包括57℃进行2min,然后98℃进行30sec;(3)39个循环之后在57℃进行2min,之后10℃下保持不超过12小时。
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