CN108949840B - 一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用 - Google Patents

一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108949840B
CN108949840B CN201810352692.4A CN201810352692A CN108949840B CN 108949840 B CN108949840 B CN 108949840B CN 201810352692 A CN201810352692 A CN 201810352692A CN 108949840 B CN108949840 B CN 108949840B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
phenol
ncbi
escherichia coli
tyrosine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810352692.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108949840A (zh
Inventor
蔡宇杰
熊天真
蒋静
丁彦蕊
白亚军
郑晓晖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhuohong Chaoyuan Biotechnology Zhengzhou Co ltd
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201810352692.4A priority Critical patent/CN108949840B/zh
Publication of CN108949840A publication Critical patent/CN108949840A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108949840B publication Critical patent/CN108949840B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01001—NADH peroxidase (1.11.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/99—Other Carbon-Carbon Lyases (1.4.99)
    • C12Y401/99002—Tyrosine phenol-lyase (4.1.99.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01023—Tyrosine ammonia-lyase (4.3.1.23)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用，属于生物工程技术领域。本发明提供能低成本生产对羟基肉桂酸的重组菌；所述重组菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L‑乳酸脱氢酶、NADH氧化酶；进一步地，本发明的重组菌还敲除了酚类物质分解基因，强化表达了乳酸转运基因、苯酚转运基因、辅酶合成相关基因中的任意一种或多种。本发明实现了对羟基肉桂酸的高效生产，且方法过程简单、杂质少，具有重要的工业应用价值。

Description

一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用
技术领域
本发明涉及一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
对羟基肉桂酸(3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸，para-hydroxycinnamic acid)，是木质纤维素的主要成分。研究表明，其可以减少致癌物质亚硝胺的形成，具有抗癌的效果。
目前主要通过化学合成法合成对羟基肉桂酸(CN201110337186.6，JP200423154)，污染较大。也有通过水解生物质原料获得(WO/2017/170549)。
目前通过生物法合成对羟基肉桂酸是最热门的方向，如通过酪氨酸氨裂解酶转化酪氨酸生成对羟基肉桂酸的方法(US20170166936、US20080213846)、通过微生物转化肉桂酸生产对羟基肉桂酸(US 20030170834)、大肠杆菌工程菌利用葡萄糖为原料合成对羟基肉桂酸(EP1589112、WO/2002/090523)。这些方法都有待于改进，以降低成本和提高产品纯度。
发明内容
基于目前各种方法的缺陷，本发明提出了一种新型的对羟基肉桂酸的生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了对羟基肉桂酸的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能以廉价底物高效生产对羟基肉桂酸的重组菌，同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。
本发明的第一个目的是提供能低成本生产对羟基肉桂酸的重组菌；所述重组菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶。
在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶来自Lactococcus lactis ATCC 19257。
在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_003131075.1序列。
在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NZ_JXJZ01000017REGION:18532..19509的序列。
在一种实施方式中，所述NADH氧化酶来自Lactococcus lactis ATCC 19257。
在一种实施方式中，所述NADH氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_032950924.1序列。
在一种实施方式中，所述NADH氧化酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NZ_JXJZ01000002REGION:complement(39571..40911)。
在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来自于Erwinia herbicola ATCC214344。
在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为P31011.2。
在一种实施方式中，所述酪氨酸氨裂解酶为的来自Rhodobacter sphaeroidesATCC BAA-808。
在一种实施方式中，酪氨酸氨裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_011339422.1的序列。
在一种实施方式中，酪氨酸氨裂解酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NC_007494REGION:complement(668571..670142)。
在一种实施方式中，所述重组菌，包括将编码酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、NADH氧化酶和L-乳酸脱氢的酶的基因，连接到2个质粒上，然后将重组质粒转化宿主大肠杆菌，得到重组工程菌。
在一种实施方式中，所述NADH氧化酶基因和L-乳酸脱氢酶基因是连接到质粒pACYCDue-1后表达、酪氨酸氨裂解酶和酪氨酸酚裂解酶基因是连接到质粒pETDuet-1后表达。
在一种实施方式中，所述宿主菌为Escherichia coli BL21(DE3)。
在一种实施方式中，所述重组菌还敲除了酚类物质分解基因。
在一种实施方式中，所述敲除的酚类物质分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。
在一种实施方式中，所述酚类物质分解基因的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。
在一种实施方式中，所述重组菌还强化表达了乳酸转运基因、苯酚转运基因、辅酶合成相关基因中的任意一种或多种。
在一种实施方式中，所述强化表达是通过将Escherichia coli BL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。
在一种实施方式中，所述强化表达的基因为lldP(乳酸转运基因)、hpaX(苯酚转运基因)、mhpT(苯酚转运基因)、nadA(NAD合成基因)、pdxJ(磷酸吡多醛合成基因)中的任意一种或多种。
在一种实施方式中，所述lldP在NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:3646638..3648293；hpaX为；NC_012892REGION:complement(4502025..4503401)；mhpT为NC_012892REGION:344788..345999；nadA为NC_012892REGION:740487..741530；pdxJ为NC_012892REGION:complement(2567591..2568322)。
在一种实施方式中，所述重组菌是在敲除了hpaD和mhpB的大肠杆菌宿主的基础上，强化表达了lldP、hpaX、mhpT、nadA、pdxJ，并且同时表达了酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L-乳酸脱氢酶和NADH氧化酶。
本发明的第二个目的是提供一种生产对羟基肉桂酸的方法，所述方法是利用本发明的重组菌。
在一种实施方式中，所述生产对羟基肉桂酸，是进行全细胞转化生产。
在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重为1-200g/L，苯酚浓度为1-200g/L，L-乳酸浓度为1-200g/L，pH 6.0-9.0，氨根离子浓度1-30g/L；于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相色谱测定对羟基肉桂酸产量。
本发明的第三个目的是提供本发明重组菌或者本发明方法在化工、食品、医药等领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明构建了一种新型的四酶共表达基因工程菌，该菌可应用于对羟基肉桂酸的生产。该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。
具体实施方案
本发明的工程菌的功能核心在于可以同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、NADH氧化酶和L-乳酸脱氢酶。其原理为：在工程菌全细胞内，L-乳酸脱氢酶以菌体内的NAD为辅酶将L-乳酸脱氢生成丙酮酸和NADH；酪氨酸酚裂解酶催化丙酮酸、氨根离子、苯酚生成L-酪氨酸；L-酪氨酸则被酪氨酸氨裂解酶脱氨生成对羟基肉桂酸；NADH氧化酶将NADH脱氢实现了辅酶NAD的再生。同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相关基因促进底物的转运及减少酚类物质的分解。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
1.本发明所涉及的菌株及质粒
购自美国菌种保藏中心ATCC的Escherichia coli BL21(DE3)、Rhodobactersphaeroides ATCC BAA-808、Lactococcus lactis ATCC 19257、Erwinia herbicola ATCC214344。购自Novagen公司的pETDuet-1、pACYCDue-1质粒和Escherichia coli BL21(DE3)。pCasRed、pCRISPR-gDNA购自镇江爱必梦生物科技有限公司。
2.大肠杆菌中相关基因的敲除及组成型强化表达
(1)大肠杆菌酚类物质分解基因的敲除
本发明中的酚类物质都极易被大肠杆菌中的酶分解，根据文献(Biodegradationof Aromatic Compounds by Escherichia coli，Microbiol Mol Biol Rev.2001,65(4):523–569.)，将相关基因敲除，避免产物和底物的分解。选择的基因是hpaD和mhpB,NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。
(2)大肠杆菌乳酸、苯酚转运基因的组成型强化表达
在全细胞转化过程中，需把底物转运至细胞内才能进行，增强乳酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内底物的高浓度，有利于反应的进行。选择乳酸转运相关的基因是lldP，NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:3646638..3648293。苯酚转运相关的基因是hpaX和mhpT，NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(4502025..4503401)和NC_012892REGION:344788..345999。
(3)大肠杆菌辅酶合成相关重要基因的组成型强化表达
在NADH氧化酶还原过程中需要以NADH为辅酶，强化表达大肠杆菌NAD合成途径的关键酶，可以提高菌体内的NAD水平，从而有利于对羟基肉桂酸的生成。选择的基因有nadA。NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:740487..741530。
磷酸吡多醛(胺)是酪氨酸酚裂解酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的核心基因pdxJ,有利于L-酪氨酸的合成。NCBI上accession NO为：NC_012892REGION:complement(2567591..2568322)。
3.四酶偶联催化反应中酶的选择
(1)L-乳酸脱氢酶的选择
L-乳酸是最为廉价的有机酸，脱氢后成的丙酮酸具有较高的附加值。目前主要以L-乳酸氧化酶氧化L-乳酸生产丙酮酸，在此过程中产过氧化氢而进一步氧化丙酮酸及破坏菌体内的酶。通常来讲以NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶更趋向于以丙酮酸为底物合成乳酸，但当乳酸过量等情况下乳酸脱氢酶会脱掉乳酸的氢生成丙酮酸。本发明从Lactococcuslactis ATCC19257中得到L-乳酸脱氢酶基因llldh(氨基酸序列是WP_003131075.1)。
(2)酪氨酸酚裂解酶的选择
酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase,TPL,E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，酪氨酸酚裂解酶可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。该反应是可逆的，苯酚、丙酮酸和氨可在酪氨酸酚裂解酶催化下生L-酪氨酸。本发明从Erwiniaherbicola ATCC 214344中分别克隆得到酪氨酸酚裂解酶基因ehtpl，其氨基酸序列是P31011.2。
(3)酪氨酸氨裂解酶的选择
酪氨酸氨裂解酶(Tyrosine Ammonia Lyase)可将酪氨酸、多巴等通过非氧化脱氨生成相应的对羟基肉桂酸和对羟基肉桂酸。本发明选择了来源于Rhodobactersphaeroides ATCC BAA-808的酪氨酸氨裂解酶rstal(氨基酸序列是WP_011339422.1)。
(4)NADH氧化酶的选择
乳酸脱氢酶从乳酸上脱氢生成丙酮酸NADH。NADH需要被NADH氧化酶氧化重新生成NAD，从而实现反应的持续进行。NADH氧化酶有产水型和产过氧化氢型两种，产水型的NADH氧化酶不会产生过氧化氢毒性。本发明分别从Lactococcus lactis ATCC 19257中得到产水型NADH氧化酶基因llnox(氨基酸序列是WP_032950924.1)，表达产物用于NAD的再生。
4.共表达体系的构建及细胞的培养
将以上选择的酪氨酸氨裂解酶、酪氨酸酚裂解酶、L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶进行四酶共表达。
目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，每个基因后有一个T7终止子。理论上来讲因为每个基因前都有T7和RBS，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。采用pACYCDue-1和pETDuet-1两种质粒，每个质粒上包含两个基因，将构建好的质粒同时热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于双抗(Kan与Cm)的固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
4.全细胞转化生产对羟基肉桂酸
细胞转化生产的体系为：细胞湿重为1-200g/L，苯酚浓度为1-200g/L，L-乳酸浓度为1-200g/L，pH 6.0-9.0，氨根离子浓度1-30g/L；于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相色谱测定对羟基肉桂酸产量。对羟基肉桂酸溶解度较低，需用大量酸性溶液完全溶解后测定。
5.样品的检测分析
对羟基肉桂酸的定量分析：转化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，配紫外检测器。色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦Megres C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl、检测波长280nm。
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
根据文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法将Escherichia coli BL21(DE3)上的hpaD和mhpB进行单或双敲除。其中，本发明所用基因敲除的质粒为pCasRed与pCRISPR-gDNA(hpaD sgRNA)与同源臂(hpaDdonor)一起导入Escherichia coli BL21(DE3)上，Cas9/sgRNA诱发宿主在hpaD基因位点发生双链断裂，重组酶Red将hpaD donor整合到hpaD基因上，实现基因的敲除，并测序验证。hpaD sgRNA、hpaD donor、mhpB sgRNA、mhpBdonor分别如序列表SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示。mhpB以同样的方式敲除。
配置pH为8的溶液，苯酚或对羟基肉桂酸2g/L，湿菌体量100g/L，35℃放置10小时后测定浓度。表1中显示了反应体系中，苯酚和对羟基肉桂酸的剩余量。
表1不同菌株对底物和产物分解后的剩余浓度
菌株 苯酚g/L 对羟基肉桂酸g/L
Escherichia coli BL21(DE3) 1.1 0.8
Escherichia coli BL21(ΔhpaDΔmhpB,DE3) 1.8 1.9
Escherichia coli BL21(ΔhpaD,DE3) 1.4 1.5
Escherichia coli BL21(ΔmhpB,DE3) 1.5 1.4
很显然Escherichia coli BL21(ΔhpaDΔmhpB,DE3)效果最好，将之命名为Escherichia coli HM。
实施例2
重组大肠杆菌构建：首先将编码酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、NADH氧化酶和L-乳酸脱氢酶的基因，分别连接到pETDuet-1或pACYCDuet-1质粒上。得到两种双基因共表达重组质粒，将两种质粒转化大肠杆菌Escherichia coli HM，利用氯霉素和氨苄青霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。
诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为20g/L，苯酚浓度为10g/L，L-乳酸浓度为10g/L，pH 8.0，氨根离子浓度30g/L；于35℃反应，时间12小时。转化结束后液相色谱测定对羟基肉桂酸产量。
表2各种重组菌的比较
重组菌 对羟基肉桂酸g/L
Escherichia coli HM/pETDuet-1-ehtpl-llldh+pACYCDuet-1-rstal-llnox 6.7
Escherichia coli HM/pETDuet-1-ehtpl-rstal+pACYCDuet-1-llldh-llnox 6.9
Escherichia coli HM/pETDuet-1-ehtpl-llnox+pACYCDuet-1-rstal-llldh 8.1
Escherichia coli HM/pETDuet-1-rstal-llldh+pACYCDuet-1-ehtpl-llnox 5.0
Escherichia coli HM/pETDuet-1-rstal-llnox+pACYCDuet-1-ehtpl-llldh 6.6
Escherichia coli HM/pETDuet-1-llnox-llldh+pACYCDuet-1-rstal-ehtpl 6.1
实施例3
采用文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法，将Escherichia coli HM基因组上对应基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQ ID NO:9所示。
强化基因lldP表达时，以Escherichia coli HM基因组为模板，以引物lldP-FF/lldP-FR、lldP-gpdA-F/lldP-gpdA-R、lldP-RF/lldP-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以lldP-FF和lldP-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含lldP sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在lldP基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到lldP基因之前，并测序验证。
强化基因hpaX表达时，采用类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含hpaX sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在hpaX基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到hpaX基因之前，并测序验证
强化基因mhpT表达时，采用类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含mhpT sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在mhpT基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到mhpT之前，并测序验证
下表为引物名称与序列表序号的对应索引。
表3引物名称与序列表序号对照
名称 序列表中编号
lldP sgRNA SEQ ID NO:1
hpaX sgRNA SEQ ID NO:14
mhpT sgRNA SEQ ID NO:15
lldP-FF SEQ ID NO:3
lldP-FR SEQ ID NO:4
lldP-gpdA-F SEQ ID NO:5
lldP-gpdA-R SEQ ID NO:6
lldP-RF SEQ ID NO:7
lldP-RR SEQ ID NO:8
根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表4所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重10g/L，L-乳酸200g/L，苯酚10g/L，pH 8.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间12小时。
表4转化结果比较
Figure BDA0001633795760000081
将效果最好的Escherichia coli HM(PG-lldP,PG-hpaX,PG-mhpT)命名为Escherichia coli PXT。
实施例4
根据实施例3的方法将Escherichia coli PXT中nadA、pdxJ基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQ IDNO:9所示。然后再将质粒导入。
强化基因nadA表达时，采用实施例3中类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含nadA-gRNA)一起转入Escherichia coli PXT后，Cas9/sgRNA诱发宿主在nadA基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到nadA基因之前，并测序验证
强化基因pdxJ表达时，采用实施例3中类似强化基因lldP表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含pdxJ-gRNA)一起转入Escherichia coli PXT后，Cas9/sgRNA诱发宿主在pdxJ基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到pdxJ基因之前，并测序验证
下表为引物名称与序列表序号的对应索引。
表5引物名称与序列表序号对照
名称 序列表中编号
nadA sgRNA SEQ ID NO:2
pdxJ sgRNA SEQ ID NO:16
基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表6所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重为20g/L，L-乳酸200g/L，苯酚200g/L，pH 9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。
表6转化结果比较
Figure BDA0001633795760000091
将最好的Escherichia coli PXT(PG-nadA,PG-pdxJ)命名为Escherichia coliNJ。
实施例6
根据实施例2所述诱导表达方法，将Escherichia coli NJ/pETDuet-1-ehtpl-llnox+pACYCDuet-1-rstal-llldh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/L，L-乳酸1g/L，苯酚1g/L，pH 6.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测定结果，对羟基肉桂酸浓度为81mg/L。
实施例7
根据实施例2所述诱导表达方法，将表7中菌株诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重200g/L，L-乳酸200g/L，苯酚200g/L，pH 8.5，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间48小时。将沉淀全部稀释溶解后测定结果。
表7转化结果比较
菌株 对羟基肉桂酸g/L
Escherichia coli NJ/pETDuet-1-ehtpl-llldh+pACYCDuet-1-rstal-llnox 344.9
Escherichia coli NJ/pETDuet-1-ehtpl-rstal+pACYCDuet-1-llldh-llnox 338.3
Escherichia coli NJ/pETDuet-1-ehtpl-llnox+pACYCDuet-1-rstal-llldh 376.9
Escherichia coli NJ/pETDuet-1-rstal-llldh+pACYCDuet-1-ehtpl-llnox 337.4
Escherichia coli NJ/pETDuet-1-rstal-llnox+pACYCDuet-1-ehtpl-llldh 351.4
Escherichia coli NJ/pETDuet-1-llnox-llldh+pACYCDuet-1-rstal-ehtpl 346.3
以上所述的酶及其共表达基因工程菌的改造和构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，理论上来讲其它的细菌、丝状真菌、放线菌、动物细胞均可进行基因组的改造，并用于多基因共表达的全细胞催化。凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用
<130> 2018.3.15
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gattgccacc gtccacgagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttaacggcgt cggcttcggg 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaatacaatc tctgtaggtt cttct 25
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcggccactc atcaacatga ttcatgagtc tgttgctcat ctccttgtca 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgacaaggag atgagcaaca gactcatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgtagttttg ttgccagaga ttcatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgaa tctctggcaa caaaactacg 50
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
taacacctga cccgcagtgt aaccg 25
<210> 9
<211> 1100
<212> DNA
<213> Escherichia coli BL21(DE3)
<400> 9
atgaatcatg ttgatgagtg gccgatcgct acgtgggaag aaaccacgaa actccattgc 60
gcaatacgct gcgataacca gtaaaaagac cagccagtga atgctgattt gtaaccttga 120
atatttattt tccataacat ttcctgcttt aacataattt tccgttaaca taacgggctt 180
ttctcaaaat ttcattaaat attgttcacc cgttttcagg taatgactcc aacttattga 240
tagtgtttta tgttcagata atgcccgatg actttgtcat gcagctccac cgattttgag 300
aacgacagcg acttccgtcc cagccgtgcc aggtgctgcc tcagattcag gttatgccgc 360
tcaattcgct gcgtatatcg cttgctgatt acgtgcagct ttcccttcag gcgggattca 420
tacagcggcc agccatccgt catccatatc accacgtcaa agggtgacag caggctcata 480
agacgcccca gcgtcgccat agtgcgttca ccgaatacgt gcgcaacaac cgtcttccgg 540
agcctgtcat acgcgtaaaa cagccagcgc tggcgcgatt tagccccgac atagccccac 600
tgttcgtcca tttccgcgca gacgatgacg tcactgcccg gctgtatgcg cgaggttacc 660
gactgcggcc tgagtttttt aagtgacgta aaatcgtgtt gaggccaacg cccataatgc 720
gggcagttgc ccggcatcca acgccattca tggccatatc aatgattttc tggtgcgtac 780
cgggttgaga agcggtgtaa gtgaactgca gttgccatgt tttacggcag tgagagcaga 840
gatagcgctg atgtccggcg gtgcttttgc cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac 900
aggagggaca gctgatagaa acagaagcca ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac 960
taaatcagta agttggcagc atcaccccgt tttcagtacg ttacgtttca ctgtgagaat 1020
ggagattgcc catcccgcca tcctggtcta agcctggaaa ggatcaattt tcatccgaac 1080
gttcctgaca ggagaaaacc 1100
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tatgcccgtc gatcgcgccc 20
<210> 11
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccaagatcac gcacgtaccg tcgatgtatc tctctgaact gccagggaaa aaccacggtt 60
agatcagcaa gcgttgccgg gaaatgggcg tcgataccat tatcgttttc gacacccact 120
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcatcgagta cctcttgcgc 20
<210> 13
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tagcctgata tgcacgctta tcttcactgt ctttcccact cgccgctggt gggatatgtc 60
aatggcgtga ttgccagcgc ccgcgagcgt attgcggctt tctcccctga actggtggtg 120
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgaacagaaa gacgatcagg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gcgggatgaa gatgatgaag 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgtcgcggtc agtaatgtga 20

Claims (7)

1.一种生产对羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述方法是利用重组大肠杆菌以苯酚为底物进行生产；其中，所述重组大肠杆菌同时表达了外源酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类化合物分解相关的基因；所述酪氨酸酚裂解酶、L-乳酸脱氢酶是通过pETDuet-1载体共表达的；所述酪氨酸氨裂解酶、NADH氧化酶是通过pACYCDue-1载体共表达的；所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_003131075.1序列，所述NADH氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_032950924.1序列，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为P31011.2，所述酪氨酸氨裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_011339422.1的序列；所述酚类化合物分解相关的基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合；所述酚类化合物分解相关的基因hpaD、mhpB的核苷酸序列分别是NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION: 4505585..4506436和NC_012892 REGION:339806..340750。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌还强化表达了乳酸转运基因、苯酚转运基因、NAD合成基因、磷酸吡多醛合成基因一种或者多种；所述强化表达的基因为乳酸转运基因lldP、苯酚转运基因hpaX、苯酚转运基因mhpT、NAD合成基因nadA、磷酸吡多醛合成基因pdxJ中的任意一种或多种；所述lldP在NCBI上accession NO为：NC_012892REGION: 3646638..3648293；hpaX为；NC_012892 REGION: 4502025..4503401；mhpT为NC_012892 REGION: 344788..345999；nadA为NC_012892 REGION: 740487..741530；pdxJ为NC_012892 REGION:2567591..2568322。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述强化表达是通过将宿主大肠杆菌基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主大肠杆菌为Escherichia coliBL21(DE3)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生产是进行全细胞转化生产；所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重为1-200g/L，苯酚浓度为1-200g/L，L-乳酸浓度为1-200g/L，pH 6.0-9.0，氨根离子浓度1-30g/L；于15-40℃反应，时间1-48小时。
6.权利要求1-5任一所述方法在制备对羟基肉桂酸的应用。
7.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括：在敲除了hpaD和mhpB的大肠杆菌宿主的基础上，强化表达了乳酸转运基因lldP、苯酚转运基因hpaX、苯酚转运基因mhpT、NAD合成基因nadA、磷酸吡多醛合成基因pdxJ，并且同时表达了酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L-乳酸脱氢酶和NADH氧化酶；所述酪氨酸酚裂解酶、L-乳酸脱氢酶是通过pETDuet-1载体共表达的；所述酪氨酸氨裂解酶、NADH氧化酶是通过pACYCDue-1载体共表达的；所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_003131075.1序列，所述NADH氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_032950924.1序列，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为P31011.2，所述酪氨酸氨裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_011339422.1的序列；所述酚类物质分解基因hpaD、mhpB的核苷酸序列分别是NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:4505585..4506436和NC_012892 REGION:339806..340750；所述lldP在NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:3646638..3648293；hpaX为；NC_012892 REGION: 4502025..4503401；mhpT为NC_012892REGION: 344788..345999；nadA为NC_012892 REGION: 740487..741530；pdxJ为NC_012892REGION:2567591..2568322。
CN201810352692.4A 2018-04-19 2018-04-19 一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用 Active CN108949840B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810352692.4A CN108949840B (zh) 2018-04-19 2018-04-19 一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810352692.4A CN108949840B (zh) 2018-04-19 2018-04-19 一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108949840A CN108949840A (zh) 2018-12-07
CN108949840B true CN108949840B (zh) 2021-10-19

Family

ID=64499119

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810352692.4A Active CN108949840B (zh) 2018-04-19 2018-04-19 一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108949840B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110938579A (zh) * 2019-12-13 2020-03-31 杭州唯铂莱生物科技有限公司 酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5651991A (en) * 1979-10-04 1981-05-09 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-dihydroxyphenylalanine
CN1957087A (zh) * 2004-04-21 2007-05-02 荷兰应用科学研究会(Tno) 芳香酸的微生物生产
WO2008008181A2 (en) * 2006-07-11 2008-01-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method of production of para-hydroxycinnamic acid using a thermostable tal enzyme
CN102351689A (zh) * 2011-10-31 2012-02-15 滨州泓瑞医药科技有限公司 一种对羟基肉桂酸的制备工艺
WO2014045298A4 (en) * 2012-08-28 2014-07-10 Privi Biotechnologies Private Limited Microbial biotransformation of aromatic acids to their reduced carbon aromatic acids
WO2017170549A1 (ja) * 2016-03-29 2017-10-05 東レ株式会社 ヒドロキシ桂皮酸の製造方法
CN107586752A (zh) * 2017-08-04 2018-01-16 江南大学 一种工程菌及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6521748B2 (en) * 1999-08-06 2003-02-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polynucleotide encoding a mutant Rhodotorula glutinis tyrosine ammonia lyase polypeptide
EP2128262A1 (en) * 2008-05-28 2009-12-02 Università Degli Studi Di Milano - Bicocca Improved yeast strains for organic acid production
CN102220298A (zh) * 2011-04-20 2011-10-19 中国科学院微生物研究所 酚酸酯酶FaeI及其编码基因和应用
WO2016008886A1 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 Danmarks Tekniske Universitet Processes for the production of hydroxycinnamic acids using polypeptides having tyrosine ammonia lyase activity
JP6302073B2 (ja) * 2014-08-21 2018-03-28 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる有機化合物の製造方法
AT516155B1 (de) * 2015-03-10 2016-03-15 Universität Graz Biokatalytisches Verfahren zur Herstellung von p-Vinylphenolen

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5651991A (en) * 1979-10-04 1981-05-09 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-dihydroxyphenylalanine
CN1957087A (zh) * 2004-04-21 2007-05-02 荷兰应用科学研究会(Tno) 芳香酸的微生物生产
WO2008008181A2 (en) * 2006-07-11 2008-01-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method of production of para-hydroxycinnamic acid using a thermostable tal enzyme
CN102351689A (zh) * 2011-10-31 2012-02-15 滨州泓瑞医药科技有限公司 一种对羟基肉桂酸的制备工艺
WO2014045298A4 (en) * 2012-08-28 2014-07-10 Privi Biotechnologies Private Limited Microbial biotransformation of aromatic acids to their reduced carbon aromatic acids
WO2017170549A1 (ja) * 2016-03-29 2017-10-05 東レ株式会社 ヒドロキシ桂皮酸の製造方法
CN107586752A (zh) * 2017-08-04 2018-01-16 江南大学 一种工程菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rhodotorula glutinis Phenylalanine/Tyrosine Ammonia Lyase Enzyme Catalyzed Synthesis of the Methyl Ester of para-Hydroxycinnamic Acid and its Potential Antibacterial Activity;Marybeth C. MacDonald 等;《Front. Microbiol.》;20160308;第7卷;第281篇 *
对羟基肉桂酸的合成及工艺条件优化;王磊 等;《化学试剂》;20090228;第31卷(第2期);第131-134页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108949840A (zh) 2018-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kohlstedt et al. From lignin to nylon: cascaded chemical and biochemical conversion using metabolically engineered Pseudomonas putida
CN108949652B (zh) 一种工程菌及其生产咖啡酸的应用
CN109370967B (zh) 一种工程菌及其在酪醇生产中的应用
CN109295113A (zh) 一种生产羟基酪醇的方法
KR101645105B1 (ko) 테레프탈산칼륨염으로부터의 유용화학품의 제조법
Wang et al. Ameliorating end-product inhibition to improve cadaverine production in engineered Escherichia coli and its application in the synthesis of bio-based diisocyanates
CN108949649B (zh) 一种工程菌及其在生产左旋多巴中的应用
CN108949647B (zh) 一种工程菌及其在生产l-酪氨酸中的应用
CN112680484B (zh) 一种利用双菌共培养体系生产3,4-二羟基丁酸的方法
CN108949840B (zh) 一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用
CN108949650B (zh) 一种丹参素的生产方法及工程菌
CN108949648B (zh) 一种工程菌及其以廉价底物生产丹参素的应用
CN108949657B (zh) 一种工程菌及其在丹参素和α-酮戊二酸联产中的应用
CN108949654B (zh) 一种工程菌及其在生产α-酮戊二酸中的应用
CN108949656B (zh) 一种工程菌及其在生产丙酮酸中的应用
CN108949653B (zh) 一种工程菌及其在丹参素生产中的应用
KR102616750B1 (ko) 유전자 조작 박테리아 및 단삼소 생산에서 이의 응용
CN108949655B (zh) 一种工程菌及其在丹参素和丙酮酸联产中的应用
CN108949651B (zh) 一种工程菌及其以廉价底物生产对羟基苯乳酸的应用
CN110305823B (zh) 采用乳酸生产l-丙氨酸的方法及菌株
CN108949646B (zh) 一种可联产丹参素和丙氨酸的工程菌及其应用
CN108865960B (zh) 一种工程菌及其在丹参素和丙氨酸联产中的应用
JP7075505B2 (ja) 組換え大腸菌、及び組換え大腸菌を用いたサルビアノリン酸ａの生産方法
CN114276970B (zh) 一种产1,3-丙二醇的基因工程菌
CN117987439A (zh) 利用乳酸产丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230410

Address after: Floor 20, Unit 2, Building 1, Jinlan West Jingyuan, No. 56, Shinan Road, Science Avenue, High-tech Industrial Development Zone, Zhengzhou City, Henan Province, 450000

Patentee after: Zhuohong Chaoyuan Biotechnology (Zhengzhou) Co.,Ltd.

Address before: No. 1800 Lihu Avenue, Wuxi City, Jiangsu Province

Patentee before: Jiangnan University