CN108931648A

CN108931648A - 一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素c检测试剂盒

Info

Publication number: CN108931648A
Application number: CN201810788830.3A
Authority: CN
Inventors: 刘丽; 兰玉勇; 杨丽丽
Original assignee: Shenyang Medical Land Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenyang Medical Land Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2018-12-04

Abstract

本发明公开了一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2，试剂R1：缓冲液、无机盐、防腐剂、增乳剂、稳定剂，试剂R2：缓冲液、增乳剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、包被有胱抑素C抗体致敏的胶乳颗粒；所述致敏的胶乳颗粒为二次收敛聚合后的聚苯乙烯胶乳微球，减弱了线性范围高值灵敏度；所述增乳剂平衡了二次收敛聚合对低值灵敏度的影响，提高了抗原过剩检测范围，本试剂盒效地改善HOOK效应导致的被测物浓度被低估甚至出现假阴性结果，且其重复性和稳定性等性能不受影响，操作简单，具有广泛通用性。

Description

一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒。

背景技术

胱抑素C（CystatinC，简称Cys C）亦称半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，是一种由120个氨基酸组成，分子量为13kDa的低分子量、碱性非糖化蛋白质。编码Cys C的基因属于管家基因，能在所有的有核细胞内以恒定速度持续转录与表达，无组织特异性。Cys C存在于各种体液之中，尤以脑脊液和***中含量为高，亦可存在于血液、唾液中，尿液中最低，不受年龄、性别、体重、炎症等因素影响，研究表明Cys C自1岁后到60岁前在血液中浓度恒定。因Cys C分子量小，生理条件下带正电荷，能自由从肾小球滤过，完全被肾小管上皮细胞重吸收并于细胞内降解，不重新回到血液中；同时肾小管上皮细胞也不分泌至管腔内，使肾脏成为清除循环中Cys C的唯一场所。

临床评价肾脏疾病进展和严重程度，一般以肾功能为参考，肾功能一般以肾小球滤过率（GFR）反映。目前常用评价肾小球滤过功能的内源性标志物有血清肌酐（Scr）、尿素氮（Urea）、内生肌酐清除率（Ccr）等。但是这些指标会受到年龄、性别、身高、性别、肌肉量、膳食结构、机体疾病状况、药物及肾小管对肌酐的分泌等因素的影响，不能满足理想内源性标志物的要求。肾脏是清除循环中Cys C的唯一场所，肾小管不分泌Cys C，因而血清Cys C浓度主要由GFR决定，并且不受心别、年龄、炎症反应、肿瘤、肌肉活动、饮食摄入等因素的影响。Cys C灵敏度高，与GFR相关性好。许多临床观察证实，当肾功能轻度受损，Scr变化不明显时，血清Cys C已增高，无论是轻度、中度、重度肾功能降低，其对应的血清Cys C值都显示良好的灵敏度。Cys C是迄今基本满足理想内源性GFR标志物要求的内源性物质，是最新发展起来的评估肾功能的一种敏感性好、特异性高的指标。

胶乳免疫比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的免疫比浊方法。基本原理是将待测物质相应抗体以特定方式交联到胶乳颗粒表面，当交联有抗体的胶乳颗粒与抗原结合后，会迅速聚集产生一定的浊度，改变反应液的透光性能。反应液透光性能的改变与抗原浓度具有相关性，可以反映待测物质中的抗原浓度。此方法可应用于全自动生化分析仪，且用时短，适于临床检测。

但是目前市售检测试剂盒在临床应用过程中，反应体系中抗体浓度一定时，随着抗原浓度的增加，抗原抗体复合物沉淀量增加，逐渐达到平衡，当抗原浓度过高时，将出现沉淀解聚甚至不沉淀的情况，即HOOK效应或抗原过剩现象，在免疫检测体系中，该现象将导致被测物浓度被低估甚至出现假阴性结果出现，可能导致误诊或漏诊。本领域技术人员根据大量的试验研究的经验，采用提高试剂灵敏度、抗体用量、稀释法调整抗体与抗原比例等方法，在一定程度上在检测试剂中延迟出现HOOK效应，即扩大抗原过剩检测范围。但是单纯提高试剂灵敏度的同时降低了试剂检测线性范围；调整抗体用量或稀释法调整抗体与抗原比例需要的研发周期长、研发工作量大且成本过高。

CN107894509A公布了一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法，主要是采用多次错流过滤的方式，以氯化锂为调节剂，十二烷基苯磺酸钠（SDBS）为乳化剂，过硫化钾为引发剂，直接对胶乳颗粒进行了二次收敛聚合改进。但是该方法过程需要循环错流过滤，操作复杂。本发明是在对该方法进行改进的基础上，对本发明试剂盒进行优化，扩大试剂线性检测和抗原过剩范围，提高对高浓度样本检测的准确性，有效地改善HOOK效应导致的被测物浓度被低估甚至出现假阴性结果。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，该试剂盒组成简单，具有广泛通用性，可有效地改善HOOK效应，提高检测结果的准确性。

实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括无机盐0.1-120g/L、缓冲液20-200 mmol/L、增乳剂0.8mmol/L-4.2 mmol/L、防腐剂0.8-3.2g/L、稳定剂1-200g/L；所述试剂2包括缓冲液20-200 mmol/L、增乳剂0.8mmol/L-4.2mmol/L、表面活性剂1-20g/L、稳定剂1-200g/L、包被有胱抑素C抗体致敏的胶乳颗粒0.1-3g/L、防腐剂0.5-5g/L，余量为水，其中水为纯化水。

所述试剂R1中无机盐为按混合浓度为0.1-1.5g/L氯化镁和氯化钙或15-120g/L氯化钠，所选用的氯化镁与氯化钙的混合物或氯化钠能够有效抑制二次收敛聚合的胶乳微球发生溶胀，增强了试剂盒高值灵敏度钝化的稳定性。

所述缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液、磷酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种。

所述稳定剂为海藻糖、蔗糖、甘氨酸及brij-35中的一种或多种组合而成。所述增乳剂为PEG2000～PEG20000。

所述缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液；所述防腐剂为PC300；所述稳定剂为海藻糖。

所述增乳剂为PEG6000，所选的PEG6000的主要作用是提高试剂盒的灵敏度，平衡二次收敛聚合导致的低值灵敏度降低。

所述表面活性剂为吐温20、吐温60、吐温80及曲拉通100中的一种。

所述防腐剂为叠氮钠或PC300中的一种。

所述致敏的胶乳颗粒上包被的是动物抗人胱抑素C多克隆或单克隆抗体。

所述致敏的胶乳颗粒为二次收敛聚合后的聚苯乙烯胶乳微球，减弱了线性范围高值灵敏度，而低值灵敏度不受影响，提高了抗原过剩检测范围，不影响的重复性和稳定性等性能。

所述二次收敛聚合的胶乳微球制备方法包括以下步骤：

1）采用高速冷冻离心的方法将胶乳微球溶液置换为蒸馏水，置于反应釜；

2）加入复合型乳化剂和调节剂，通入N2置换O2后，加入引发剂，引发二次聚合；

3）加入胶乳试剂标记反应需要的缓冲液进行离心。

所述冷冻离心是在4℃条件下，以转速为20000r/min进行离心，时间为15分钟。

所述复合型乳化剂为按质量比为1：1SDS和NP-40；所述调节剂为十二烷基硫醇；所述引发剂为过硫化钾。

完成收敛聚合反应的胶乳微球粒径为未聚合时粒径的0.72倍。

本发明具有以下有益效果：

本发明采用胶乳微球二次收敛聚合的方法，在不影响与抗体结合性能的前提下，使该试剂盒对高值的灵敏度降低，扩大抗原过剩检测范围，减少了因HOOK效应导致的结果偏低或假阴性的可能性。采用增乳剂平衡了因二次收敛聚合带来的低值灵敏度降低，使该试剂盒的低值灵敏度不受影响。本发明试剂盒使用一定浓度的无机盐离子能够有效地防止发生收敛聚合的胶乳微球在溶液中发生溶胀，使其高值灵敏度降低性能保持稳定。本发明的试剂盒能够有效地扩大抗原过剩检测范围，操作简单且胶乳微球二次收敛聚合不会影响其精密度、稳定性等性能。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明保护的范围并非仅限于这些实例的范围。

实施例1 制备不含有增乳剂的本发明试剂盒

本发明试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中

试剂R1：

三羟甲基氨基缓冲液 100mmol/L

氯化镁 0.5g/L

氯化钙 0.5g/L

PC300 1.2g/L

海藻糖 5g/L

余量为纯化水

试剂R2：

三羟甲基氨基缓冲液 100mmol/L

甘氨酸 5g/L

吐温20 5g/L

PC300 1.2g/L

牛血清白蛋白 5g/L

抗人胱抑素C多克隆抗体致敏胶乳颗粒 5g/L

余量为纯化水。

所使用的胶乳微球具体制备过程：

首先，胶乳微球溶液的置换。将200ml质量浓度为10%的胶乳微球溶液

于冷冻离心机中，其中胶乳微球的粒径为141nm，以4℃、20000r/min的条件进行离心，时间为15分钟。将离心后的胶乳微球溶液弃去，加入蒸馏水，混合均匀；

其次，将置换蒸馏水后的胶乳微球溶液加入到规格为1L的反应釜内，加入0.6g的质量比为1：1的SDS和NP-40的复合型乳化剂及0.16g十二烷基硫醇，将反应釜的温度调节至50-60℃，温度恒定后，设置转速为300r/min搅拌20min。然后通入氮气去除溶液中的氧气3min后，加入0.08g过硫酸钾，引发胶乳微球的二次收敛聚合反应，以相同的温度和转速继续搅拌12h；

最后，将完成二次收敛聚合反应后的胶乳微球溶液以4℃、20000r/min的条件进行离心，时间为15分钟。将离心后的胶乳微球溶液弃去，加入50mM/L浓度、pH5.0的Tris溶液，混合均匀。

二次收敛聚合反应前胶乳溶液中胶乳微球的粒径为141nm，反应后胶乳的粒径为D2=0.72D=102nm。

实施例2 制备含有增乳剂的本发明试剂盒

试剂R1：

三羟甲基氨基缓冲液 200mmol/L

氯化镁 0.3g/L

氯化钙 0.3g/L

PC300 2.0g/L

海藻糖 5g/L

PEG6000 2.0mmol/L

余量为纯化水

试剂R2：

三羟甲基氨基缓冲液 200mmol/L

甘氨酸 5g/L

吐温20 5g/L

PC300 2.0g/L

牛血清白蛋白 5g/L

PEG6000 2.0mmol/L

抗人胱抑素C多克隆抗体致敏胶乳颗粒 5g/L

余量为纯化水。

所使用的胶乳微球具体制备过程：

二次收敛聚合反应前胶乳溶液中胶乳微球的粒径为141nm，反应后胶乳的粒径为102nm。

实施例3 未添加PEG6000试剂线性低值和高值灵敏度检测

采用上述实施例1配制试剂，对线性低值和高值浓度样本的灵敏度进行检测，并与目前市场上流通的未经过二次收敛聚合粒径为D=100nm的胱抑素C测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）（购自北京百奥泰康生物技术有限公司）作为对照进行对比。配制浓度为S=0.45，0.90，1.80，3.75，7.50mg/L的胱抑素C样本溶液，使用实施例1和对比试剂对各浓度样本溶液重复检测3次，检测结果见表1。

表1

由表1可以看出，采用二次收敛聚合后胶乳微球配制的本发明试剂盒在未添加PEG6000时，低值浓度测定值（S=0.45）比对比试剂测定值低10%。高值浓度值（S=7.50）测定时，比对比试剂测定值低33%。说明试剂不添加增乳剂时，低值灵敏度和高值灵敏度均处于钝化状态。

实施例4 添加PEG6000试剂线性低值和高值灵敏度检测

采用上述实施例2配制试剂，对线性低值和高值浓度样本的灵敏度进行检测，并与目前市场上流通的未经过二次收敛聚合粒径为D=100nm的胱抑素C测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）（购自北京百奥泰康生物技术有限公司）作为对照进行对比。配制浓度为S=0.45，0.90，1.80，3.75，7.50mg/L的胱抑素C样本溶液，使用实施例1和对比试剂对各浓度样本溶液重复检测3次，检测结果见表2。

表2

由表2可以看出，采用二次收敛聚合后胶乳微球配制的本发明试剂盒在添加PEG6000时，低值浓度测定值（S=0.45）与对比试剂测定值相差不大。高值浓度值（S=7.50）测定时，虽然有所增高，但是比对比试剂测定值仍低20%以上。说明在添加增乳剂PEG6000后，低值灵敏度平衡了二次收敛聚合的影响，而高值灵敏度仍然处于钝化状态。

实施例5 抗原过剩样本的检测

采用上述实施例2配制试剂，对抗原过剩样本进行检测，并与目前市场上流通的未经过二次收敛聚合粒径为D=100nm的胱抑素C测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）（购自北京百奥泰康生物技术有限公司）作为对照进行对比。配制浓度为S=7.50，15.00，30.00，60.00，100.00，200.00，400.00，800.00，1000.00，2000.0mg/L的胱抑素C样本溶液，使用实施例2和对比试剂对各浓度样本溶液重复检测3次，检测结果见表3。

表3

表3结果显示，本发明试剂，在线性范围不发生改变的基础上，抗原过剩检测范围得到了极大的提高。在样本浓度达到2000.00mg/L时检测值仍能超过线性范围，而对比试剂在样本浓度大于200.00mg/L时检测值处于线性范围内，并且随着样本浓度的增大，检测值逐渐减小，甚至处于参考值范围内。因此，本发明胱抑素C检测试剂盒能够满足抗原过剩范围达到2000.00mg/L的要求。

实施例6 重复性检测

采用上述实施例2配制试剂，对本发明试剂盒的重复性进行研究，并与目前市场上流通的胱抑素C测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）（购自北京百奥泰康生物技术有限公司）作为对照进行对比。校准品和质控品分别是朗道1206CY和1202CY，使用仪器为全自动生化分析仪TBA-40FR，参数设置如下，波长为546nm,反应方向为正方向，样本量：试剂1：试剂2（实施例2试剂或对照）=3μL：200μL：50μL。对实施例2和对比试剂各重复检测10次，分别计算测值的均值和标准差（SD），均值与标准差的比值即为批内变异系数（CV），结果见表4。

表4

表4结果表明，本发明试剂的批内变异系数CV均小于10%，与对比试剂的批内变异系数CV接近，符合一般诊断试剂的批内变异系数不大于10%的要求。由此说明本发明试剂的重复性良好，胶乳微球的二次收敛聚合不会影响试剂重复性。

实施例7 稳定性检测

采用上述实施例2配制试剂，对本发明试剂盒的稳定性进行研究，并与目前市场上流通的胱抑素C测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）（购自北京百奥泰康生物技术有限公司）作为对照进行对比。校准品和质控品分别是朗道1206CY和1202CY，使用仪器为全自动生化分析仪TBA-40FR，参数设置如下，波长为546nm,反应方向为正方向，样本量：试剂1：试剂2（实施例2试剂或对照）=3μL：200μL：50μL。将实施例2试剂以及对比试剂分别分为6瓶，每瓶为2L，于室温环境下分别放置0个月、3个月、6个月、9个月、12个月、15个月后进行检测，对朗道质控品重复检测3次，分别计算测值与质控品靶值的差值，差值与靶值的比值为其相对偏差（CV），结果如表5所示。

表5

计算其相对偏差，偏差越小则说明试剂稳定性越好。根据表5结果显示，本发明试剂于室温环境中放置15个月后，检测样本的准确度依然良好，说明本发明试剂的的稳定性优良，胶乳微球的二次收敛聚合不会影响试剂稳定性。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明的保护范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括无机盐0.1-120g/L、缓冲液20-200 mmol/L、增乳剂0.8mmol/L-4.2mmol/L、防腐剂0.8-3.2g/L、稳定剂1-200g/L；所述试剂2包括缓冲液20-200 mmol/L、增乳剂0.8mmol/L-4.2 mmol/L、表面活性剂1-20g/L、稳定剂1-200g/L、包被有胱抑素C抗体致敏的胶乳颗粒0.1-3g/L、防腐剂0.5-5g/L，余量为水。

2.根据权利要求1所述的一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中无机盐为按混合浓度为0.1-1.5g/L氯化镁和氯化钙或15-120g/L氯化钠。

3.根据权利要求1所述的一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液、磷酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种；所述防腐剂为叠氮钠或PC300中的一种；所述稳定剂为海藻糖、蔗糖、甘氨酸及brij-35中的一种或多种组合而成；所述增乳剂为PEG2000～PEG20000。

4.根据权利要求3所述的一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液；所述防腐剂为PC300；所述稳定剂为海藻糖；所述增乳剂为PEG6000。

5.根据权利要求1所述的一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂为吐温20、吐温60、吐温80及曲拉通100中的一种。

6.根据权利要求1所述的一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述致敏的胶乳颗粒上包被的是动物抗人胱抑素C多克隆或单克隆抗体。

7.根据权利要求1所述的一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述致敏的胶乳颗粒为二次收敛聚合后的聚苯乙烯胶乳微球。

8.根据权利要求7所述的一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述二次收敛聚合的胶乳微球制备方法包括以下步骤：

采用高速冷冻离心的方法将胶乳微球溶液置换为蒸馏水，置于反应釜；

加入复合型乳化剂和调节剂，通入N₂置换O₂后，加入引发剂，引发二次聚合；

加入胶乳试剂标记反应需要的缓冲液进行离心。

9.根据权利要求8所述的一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述复合型乳化剂为按质量比为1：1SDS和NP-40；所述调节剂为十二烷基硫醇；所述引发剂为过硫化钾。

10.根据权利要求8所述的一种基于胶乳免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：完成二次收敛聚合反应的胶乳微球粒径为未聚合时粒径的0.72倍。