CN109187840A - 一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，属于分析化学领域。其步骤为：(1)污染物提取；(2)浓缩与定容；(3)建库；(4)上机检测：通过高效液相色谱‑飞行时间质谱联用仪在一级质谱和二级质谱模式下分别进行全扫；(5)物质鉴定。本发明建立了针对血液中有机污染物高通量筛查的前处理方法，在降低基质干扰的条件下提取化合物种类全面，利用高效液相色谱‑飞行时间质谱仪，对少量血液样品能准确迅速的提取与净化，样本需求少，在单独的一次分析测定中对血液中有机污染物的一级、二级质谱谱图同时进行快速连续的扫描、筛查和鉴定，不依赖标准物质图谱，筛查出的有机污染物种类丰富、数量多，具有良好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于环境分析化学技术领域，具体是涉及一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法。
背景技术
近年来随着一些新合成的有机化合物日益增多，它们对环境造成的污染越来越严重，例如有机氯农药、药物和个人护理产品(PPCP)、内分泌干扰物(EDCs)等。它们普遍存在于环境介质中，可以通过呼吸、饮食、皮肤接触等各种方式进入人体内，对人体健康存有潜在影响。血液是了解人体受化学因素而导致人体污染情况的主要生物检材，因此鉴定血液中的有机污染物极其重要。
然而，由于有机污染物种类复杂，数量多，具有不同的物理化学性质，且常常以低浓度存在于生物血液样品中，同时血液样本基质比较复杂，采集量小，这对血液样品分析方法提出了巨大的挑战。目前已有专利的提取和纯化过程繁琐，成本高，耗时，难以处理大量的样品。
公开号为CN 102156173 A的现有技术中公开了一种评估血清持久性有机污染物水平的前处理方法，采用多种柱子联用，多类型有机溶液，操作繁琐，成本高；公开号为CN103901143 A的现有技术中公开了一种用于少量生物血清中四溴双酚A分析的前处理方法，采用多次萃取与反萃取，并仍需过柱富集，步骤繁琐。
此外，目前识别环境中化合物主要使用靶向分析这一传统方法，着重于检测和鉴定特定化合物或一类化合物，由于预选偏差，导致其可能遗漏大量未知的潜在风险化合物。公开号为CN 105699527 A的现有技术公开了一种血清中溴系阻燃剂和磷系阻燃剂含量的检测方法，公开号为CN 103592399 A的现有技术公开了同时测定人体血清中有机氯农药和合成麝香浓度的方法，即使其他危险化合物的浓度或毒性可能更大，该类方法都仅能分析检测部分有机污染物，忽略了其他的潜在危险化合物。因此，如何能够突破标准物质的局限，对血液进行准确而全面的评估需要新的分析检测技术。
为了解决靶向分析的局限性，可疑物筛查(suspect screening)和非靶向筛查(non-target screening)开始被提出和研究，从而解决环境中未知污染物的识别检测。然而，目前将此技术应用于血液中污染物分析鉴定的相关研究极其有限。
发明内容
1、要解决的问题
针对现有检测血液中有机污染物局限于标准物质种类以及血液样品前处理方法繁琐的技术问题，本发明提供一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，能准确、迅速、全面的提取与净化少量血液样品中的有机污染物，并且得到不限于标准样品种类的更多种污染物筛查结果。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，包括以下步骤：
(1)血液中污染物的提取：准确移取适量血液于离心管中，加入分散SPE和有机溶剂后进行涡旋混匀和超声提取，随后离心取上清液，重复溶剂提取步骤1～2次，将上清液合并；
(2)浓缩与定容：对合并后的提取液进行浓缩、定容；
(3)建库：根据SCI数据库及标准样品谱图建立由有机物的精确质量数、保留时间、同位素分布以及特征MS/MS谱图的二个碎片组成的信息库，确定精确质量数误差、预测保留时间误差、同位素分布以及特征MS/MS谱图的二个碎片信息误差范围；
(4)上机检测：通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪对步骤(2)得到的样品进行有机污染物的筛查分析检测；
(5)物质鉴定：将步骤(4)得到的检测结果与步骤(3)中建库结果进行比对，筛查是否存在常见的有机污染物。
优选地，步骤(3)中所述的建库为将收集的样品信息导入Peakview软件中建库。
优选地，步骤(5)中所述的物质鉴定具体为：首先通过一级质谱初步确定出含有的有机污染物种类，再通过二级质谱、保留时间识别确认有机污染物的具体名称。
优选地，步骤(4)所述高效液相色谱-飞行时间质谱条件为：
高效液相色谱仪：HPLC-Agilent1260；
色谱柱：Waters BEH C18柱(2.1mm×50mm,2.5μm,Waters,美国)
柱温：40℃；
流速：0.4mL/min；
梯度洗脱流动相：
正相：A：5％甲酸水溶液，B：甲醇
负相：A：2mM乙酸铵水溶液乙腈水溶液(体积比为，水:乙腈，95:5)，B：甲醇；
流动相梯度：
质谱仪：Triple TOF5600-AB SCIEX；
离子源：ESI；
电离模式：正离子模式+负离子模式；
TOF-MS扫描范围：100-1000m/z；
MS-MS扫描范围：50-800m/z；
离子源气压：55psi；
去簇电压：80V(正离子模式)，-80V(负离子模式)；
碰撞能量：35V(正离子模式)，-35V(负离子模式)；
离子源温度：550℃。
优选地，所述的方法适用的样品包括血液、血清。
优选地，步骤(1)所述的分散SPE为MgSO4-NaCl混合物，所用的有机提取溶剂为3倍血液体积的乙腈。
优选地，步骤(2)使用高纯氮气缓缓吹扫溶剂对提取液进行浓缩；所述定容为使用乙腈定容。
优选地，步骤(2)中定容后，当底部若存在少量白色固体MgSO4与NaCl时，需经过再次离心，将上清液转移至色谱瓶。
优选地，所述的步骤(4)中的筛查分析鉴定为采用Peakview软件的XIC manager对样品中提取出的有机污染物质的色谱峰、同位素分布、保留时间以及二级质谱图进行采集。
优选地，Peakview软件中功能参数设置为响应强度>1000，信躁比>10，一级质谱质荷比误差<5ppm，保留时间误差<1min。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明建立了针对血液中有机污染物高通量筛查方法的前处理方法，简化了现有技术中提取和纯化步骤，采用添加分散SPE的处理，无需过柱，仅采用一种有机试剂通过多次提取富集污染物，对少量血液样品能准确迅速的提取与净化，方法简单快捷，操作易行，样本需求少，具有良好的应用价值；此外，该前处理方法在降低基质干扰的条件下能有效提取包括极性和非极性在内的不同类别化合物，提取化合物种类全面，信息损失少。
(2)本发明与现有的技术不同之处在于，通过建库方法，将由各大数据库收集到的不同有机污染物的精确质量数、保留时间、同位素分布以及特征MS/MS谱图的二个碎片组成的信息加以整合，通过调整信噪比等参数，得到同时测定分析多类型的有机污染物(包括农药、药物等)的方法，与现有技术中依靠标准物质仅检测某类几个或是几类化合物的方法有较大区别，该方法不依赖于标准物质的标准图谱的局限，适用于更广泛的筛查检测工作，实现血液中有机污染物的快速、高通量筛查。
(3)本发明利用高效液相色谱-飞行时间质谱仪，在单独的一次分析测定中对血液中有机污染物的一级、二级质谱谱图同时进行快速连续的扫描、筛查和鉴定，具有精确质量数的全扫描数据可以存档和回顾性分析，减少分析的成本和时间，实现传统方法不能达到的筛查效果。
(4)本发明优化探索了高效液相色谱-飞行时间质谱条件，依据该仪器条件下检测速度快，准确度高。
附图说明
图1为本发明血液前处理流程图。
图2为本发明高通量筛查分析步骤流程图。
图3为实施例1中的样品中物质的色谱流出图。
图4为实施例1中的样品中解毒喹的色谱流出图。
图5为实施例1中的样品中解毒喹的一级、二级质谱图。
图6为实施例1中的解毒喹标准样品的二级质谱图。
图7为实施例1中的样品中替米沙坦的色谱流出图。
图8为实施例1中的样品中替米沙坦的一级、二级质谱图。
图9为实施例1中的替米沙坦标准样品的二级质谱图。
图10为实施例2中的样品中物质的色谱流出图。
图11为实施例2中的样品中敌草隆的色谱流出图。
图12为实施例2中的样品中敌草隆的一级、二级质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
为验证本发明采用的建库方法能否准确检出待检测有机污染物，实施例1中模拟受到污染的血液，采用向洁净的血液中添加特定计量的不同种类有机污染物，待通过本实验方法进行物质鉴定后，再采用标准物质图谱验证该方法的准确性。
本实施例中含有有机污染物的血液样品为：取3份0.5mL血液样品于15mL离心管，加入30种浓度为100ppb的有机污染物50μL，涡旋混匀后静置12h，30种有机污染物是广泛用于农药、医药、阻燃剂等行业的常见物质(表1)。
本发明的一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法：
(1)血液中污染物的提取：如图1所示，在上述0.5mL含有机污染物的血液中加入0.3gMgSO4-NaCl混合物(作为SPE使用)与1.5mL乙腈，在涡旋仪上混合30s(保证SPE材料浸润)，超声30min后离心；将上清液转移至另一干净离心管，将固体残余物用1.5mL乙腈重复上述提取步骤2次，合并上清液。
(2)浓缩与定容：对提取液进行浓缩用高纯氮气缓缓吹扫溶剂；所述的定容使用100ul乙腈定容，定容后底部若存在少量白色固体(在上清液转移过程中可能移入部分水相，其中溶有饱和MgSO4与NaCl)，需经过再次离心，最终将上清液转移到棕色进样小瓶中，保存在-20℃冰箱中待测。
(3)建库：如图2所示，根据SCI数据库及标准样品谱图建立由上述30种有机污染物的精确质量数、保留时间、同位素分布以及特征MS/MS谱图的二个碎片组成的信息库(即建立有机污染物信息清单)，将收集的样品信息导入Peakview软件中；
(4)上机检测：通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪对样品进行有机污染物的筛查分析鉴定，高效液相色谱-飞行时间质谱条件为：
高效液相色谱仪：HPLC-Agilent1260；
色谱柱：Waters BEH C18柱(2.1mm×50mm,2.5μm,Waters,美国)
柱温：40℃；
流速：0.4mL/min；
梯度洗脱流动相：
正相：A：5％甲酸水溶液，B：甲醇
负相：A：2mM乙酸铵水溶液乙腈水溶液(体积比为，水:乙腈，95:5)，B：甲醇；
流动相梯度：
质谱仪：Triple TOF5600-AB SCIEX；
离子源：ESI；
电离模式：正离子模式+负离子模式；
TOF-MS扫描范围：100-1000m/z；
MS-MS扫描范围：50-800m/z；
离子源气压：55psi；
去簇电压：80V(正离子模式)，-80V(负离子模式)；
碰撞能量：35V(正离子模式)，-35V(负离子模式)；
离子源温度：550℃；
得到样品中物质的色谱流出图(图3)以及各有机污染物的一级质谱图和二级质谱图；
(5)物质鉴定：Peakview1.2软件中功能参数设置为Intensity(响应强度)>1000，S:N(信躁比)>10，Mass error(一级质谱质荷比误差)<5ppm，保留时间误差<1min；将步骤(4)中得到的检测数据采用步骤(3)中Peakview软件的XIC manager中所建的库中数据(样品中有机污染物质的色谱峰，同位素分布，保留时间以及一级、二级质谱图)进行对比分析，经库详细比对精确质量数误差、预测保留时间误差、同位素分布以及特征MS/MS谱图的二个碎片，得到各有机污染物的一级质谱图和二级质谱图，可定性确定有机污染物的种类及名称谱图。
为验证本发明方法的准确性，本实施例中将上述方法得出的有机污染物的二级质谱图与已有30种外标的标准样品二级质谱图比对，通过吻合匹配度判断本方法的准确性。
以农药解毒喹为例，首先检测到336.13629的色谱峰(见图5a，其二级质谱图如图5b)，与解毒喹的精确质量数相比绝对误差仅为0.6ppm，检测到的该物质流出图如图4所示，预测保留时间误差为0.01min，且其两个特征碎片离子238/191.9(见图5b)与标准样品的解毒喹MS/MS谱图(见图6)对比能实现准确匹配，因此确定被筛查出的物质为解毒喹。
以药物替米沙坦为例，首先检测到235.18041的色谱峰(见图8a)，跟替米沙坦的精确质量数相比绝对误差仅为0.3ppm，检测到的该物质流出图如图7所示，预测保留时间误差为0.01min，且其两个特征碎片离子497.1/276(见图8b)与标准样品的替米沙坦MS/MS谱图(见图9)对比能实现准确匹配，因此确定被筛查出的物质为替米沙坦。
采用上述方法，添加的30种物质均能通过高通量筛查分析方法被成功筛查识别，实现100％的检出率，说明本发明具有良好的测量精度，提供较高的准确筛查识别率。
表1实施例1中添加的30种物质相关数据
实施例2
(1)血液中污染物的提取：取16份0.5mL鱼血样品于15mL离心管，加入0.3gMgSO4-NaCl混合物(作为SPE使用)与1.5mL乙腈，在涡旋仪上混合30s(保证SPE材料浸润)，超声30min后离心；将上清液转移至另一干净离心管，将固体残余物用1.5mL乙腈重复上述提取步骤2次，合并上清液。
(2)浓缩与定容：对提取液进行浓缩用高纯氮气缓缓吹扫溶剂；所述的定容使用100μL乙腈定容，定容后底部若存在少量白色固体(在上清液转移过程中可能移入部分水相，其中溶有饱和MgSO4与NaCl)，需经过再次离心，最终将上清液转移到棕色进样小瓶中，保存在-20℃冰箱中待测。
(3)建库：基于权威数据(SCI文献、授权专利或已有标准样品谱图)建立包括农药、药物、阻燃剂、塑化剂、表面活性剂和危险废物的3000多种有机污染物的精确质量数、保留时间、同位素分布以及特征MS/MS谱图的二个碎片组成的信息库，将收集的样品信息导入Peakview软件中；
(4)上机检测：通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪对样品进行有机污染物的筛查分析鉴定，高效液相色谱-飞行时间质谱条件同实施例1；
得到样品中物质的色谱流出图(图10)以及各有机污染物的一级质谱图和二级质谱图；
(5)物质鉴定：Peakview1.2软件中功能参数设置如表2所示，将步骤(4)得到的检测数据采用步骤(3)中Peakview软件的XIC manager中所建的库中数据(样品中有机污染物质的色谱峰，同位素分布，保留时间以及一级、二级质谱图)进行对比分析。
表2色谱峰提取功能参数设置
经库详细比对精确质量数误差、预测保留时间误差、同位素分布以及特征MS/MS谱图的二个碎片，得到各有机污染物的一级质谱图和二级质谱图，可定性确定有机污染物的种类及名称。最后识别鉴定出该血液样品中含有21种有机污染物(表3)，包括了3种氟化物，2种化工用品，9种农药，4种药物和3种有机磷阻燃剂，其中敌草隆的色谱流出图如图11所示，一级二级质谱如图12所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
表3实施例2中检出的21种有机污染物相关数据
Claims (10)
1.一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)血液中污染物的提取：准确移取适量血液于离心管中，加入分散SPE和有机溶剂后进行涡旋混匀和超声提取，随后离心取上清液，重复溶剂提取步骤1～2次，将上清液合并；
(2)浓缩与定容：对合并后的提取液进行浓缩、定容；
(3)建库：根据SCI数据库及标准样品谱图建立由有机物的精确质量数、保留时间、同位素分布以及特征MS/MS谱图的二个碎片组成的信息库；
(4)上机检测：通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪对步骤(2)得到的样品进行有机污染物的筛查分析检测；
(5)物质鉴定：将步骤(4)得到的检测结果与步骤(3)中建库结果进行比对，筛查是否存在库中的有机污染物。
2.根据权利要求1所述的一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，其特征在于，步骤(3)中所述的建库为将收集的样品信息导入Peakview软件中建库。
3.根据权利要求2所述的一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，其特征在于，步骤(5)中所述的物质鉴定具体为：首先通过一级质谱初步确定出含有的有机污染物，再通过二级质谱、保留时间识别确认有机污染物的具体名称。
4.根据权利要求1所述的一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，其特征在于，步骤(4)所述高效液相色谱-飞行时间质谱条件为：
高效液相色谱仪：HPLC-Agilent1260；
色谱柱：Waters BEH C18柱(2.1mm×50mm,2.5μm,Waters,美国)
柱温：40℃；
流速：0.4mL/min；
梯度洗脱流动相：
正相：A：5％甲酸水溶液，B：甲醇
负相：A：2mM乙酸铵水溶液乙腈水溶液(体积比为，水:乙腈，95:5)，B：甲醇；
流动相梯度：
质谱仪：Triple TOF5600-AB SCIEX；
离子源：ESI；
电离模式：正离子模式+负离子模式；
TOF-MS扫描范围：100-1000m/z；
MS-MS扫描范围：50-800m/z；
离子源气压：55psi；
去簇电压：80V(正离子模式)，-80V(负离子模式)；
碰撞能量：35V(正离子模式)，-35V(负离子模式)；
离子源温度：550℃。
5.根据权利要求1所述的一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，其特征在于，所述的方法适用的样品包括血液、血清。
6.根据权利要求1所述的一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，其特征在于，步骤(1)所述的分散SPE为MgSO4-NaCl混合物，所用的有机提取溶剂为3倍血液体积的乙腈。
7.根据权利要求1所述的一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，其特征在于，步骤(2)使用高纯氮气缓缓吹扫溶剂对提取液进行浓缩；所述定容为使用乙腈定容。
8.根据权利要求1所述的一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，其特征在于，步骤(2)中定容后，当底部若存在少量白色固体MgSO4与NaCl时，需经过再次离心，将上清液转移至色谱瓶。
9.根据权利要求2所述的一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的筛查分析鉴定为采用Peakview软件的XIC manager对样品中提取出的有机污染物质的色谱峰、同位素分布、保留时间以及二级质谱图进行采集。
10.根据权利要求9所述的一种血液中有机污染物的高通量筛查分析方法，其特征在于，所述Peakview软件中功能参数设置为响应强度>1000，信躁比>10，一级质谱质荷比误差<5ppm，保留时间误差<1min。
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