CN108913730A - 一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法 - Google Patents

一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，包括如下步骤：(1)将活化后的红曲菌菌种经过稀释和震荡，得到单孢子悬液，将所述单孢子悬液接种到PDB液体培养基中，并在30℃下培养12天，得到红曲菌悬液；(2)向PDB液体培养基中加入水杨酸或茉莉酸甲酯，再将所述红曲菌悬液接种到PDB液体培养基中，并在30℃、180r/min摇床培养12天。本发明向特定的培养基中加入水杨酸或茉莉酸甲酯，并在特定的条件下培养红曲菌，通过促进红曲菌菌丝生长或调节红曲菌的代谢过程，有效的提高了红曲菌的生物量，从而有效的提高了红曲菌代谢洛伐他汀的产量，本方法效率高、耗时短、操作简单且成本更低，具有极高的推广和应用价值。

Description

一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法。
背景技术
目前的降脂药物主要有四类：树脂类、烟酸类、贝特类、他汀类，其中以洛伐他汀为代表的他汀类药物是目前最重要的一类降脂药。洛伐他汀是内源性胆固醇合成的限速酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂，经临床验证，洛伐 他汀是高效、安全、低毒的治疗高血脂症的良好药物。自1987年美国Merck公司将洛 伐他汀系列开发推出新一代的降胆固醇药物以来，洛伐他汀作为新型的调整血脂药，深 受广大患者的欢迎。
目前，洛伐他汀的生产菌株主要为土曲菌和红曲菌。土曲菌发酵得到的纯品闭环洛 伐他汀，闭环洛伐他汀本身无活性，需经人体内的羟基酯酶水解，增加肝、肾负担。而 开环洛伐他汀可以被人体直接利用，一般只有在天然发酵的红曲菌中能够得到。红曲菌 发酵过程中能够产生多种具有生物活性的次级代谢产物，主要有红曲色素、酶类、γ-氨 基丁酸和洛伐他汀，虽然红曲菌发酵具有其独特的优势，但红曲菌的洛伐他汀产量较低。 由于我国对含洛伐他汀类药物在产率和提取得率上与发达国家有较大的差距，洛伐他汀 的产量与需求存在较大的缺口，提高红曲菌的洛伐他汀的产量对降脂产品的发展具有重 要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提出一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法， 解决现有红曲菌的洛伐他汀产量较低的技术问题。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，包括如下步骤：
S1.将活化后的红曲菌菌种经过稀释和震荡，得到单孢子悬液，将所述单孢子悬液接种到PDB液体培养基中，并在30℃下培养12天，得到红曲菌悬液；
S2.向PDB液体培养基中加入水杨酸或茉莉酸甲酯，再将所述红曲菌悬液接种到PDB液体培养基中，并在30℃、180r/min摇床培养12天。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
1.本发明将单孢子悬液在特定的条件下培养后，再用含有水杨酸或茉莉酸甲酯的培养基在特定的条件下培养，通过促进红曲菌菌丝生长或调节红曲菌相关的代谢过程， 有效的提高了培养基中红曲菌的生物量，从而有效的提高了红曲菌代谢洛伐他汀的产 量；
2.本方法与通过诱变红曲菌菌株提高洛伐他汀产量的方法相比，效率高、耗时短、操作简单且成本更低，具有极高的推广和应用价值。
附图说明
图1为不同浓度的水杨酸对红曲菌产洛伐他汀的影响；
图2为不同浓度的茉莉酸甲酯对红曲菌产洛伐他汀的影响；
图3为水杨酸和茉莉酸甲酯对红曲菌生物量的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中的试验材料和培养基的成分如下：
(1)试验材料：
红曲菌菌种：紫色红曲菌(Monascus purpureus)，购自微生物菌种保藏中心(BNCC189220)。
试剂：磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铁、氯化钠、氯化锌和氯化钙等均为分析纯。
(2)培养基：
CYA培养基的成分为：KH2PO4 0.3g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.002g， NaCl1.0g，ZnCl2 0.015g，CaCl2·2H2O 0.005g，琼脂20g，蒸馏水溶解定容1000mL，pH 6.5～7.0。
PDB液体培养基的成分为：马铃薯200g，无水葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1000mL，自然pH。
实施例1：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，包括如下步骤：
(1)红曲菌种的培养：将适量的红曲菌菌种用无菌水稀释至10-6倍，取稀释至10-6倍的菌液均匀的涂布在CYA培养基上，然后将CYA培养基放入恒温培养箱中，在30℃ 培养12天活化菌种，观察菌落外观，选择生长良好，活力较高的菌株，将挑选的菌株 用无菌水冲洗并刮下来，将带有菌株的液体倒入带有四层灭菌后的擦镜纸的无菌漏斗中 过滤，将过滤后得到的菌液注入到无菌、装有小玻璃珠的50mL的三角瓶中，重复3次 将培养基上的孢子全部冲洗干净，通过镜检计数，用无菌水将菌种稀释至10-6倍，再将 菌液在30℃，150r/min的条件下震荡10min，使菌液中的孢子充分分散，得到单孢子悬 液。将0.4mL单孢子悬液加入装有10mlPDB液体培养基的试管中，然后将试管放入恒 温培养箱中，在30℃下培养12天，在培养期间每隔2天取出观察一次，记录红曲霉菌 株的生长情况，排出被污染的样本，培养完后得到红曲菌悬液；
(2)红曲菌的发酵培养：向PDB液体培养基中加入水杨酸，使得每升PDB液体 培养基中水杨酸的量为800μmol，按照10％的接种量将步骤(1)中制备的红曲菌悬液 加入液体培养基中，在30℃、180r/min摇床培养12天。
采用紫外分光光度法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，具体采用如下方法测定：
建立洛伐他汀浓度的回归方程：用分光光度计扫描洛伐他汀标准溶液，显示在238nm处有最大吸收值，用分光光度计测定不同浓度的洛伐他汀标准溶液在238nm处 的吸光度；精密称取经干燥至恒重的洛伐他汀对照品，将洛伐他汀用浓度为95％的乙醇 配制成洛伐他汀浓度为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL、14μg/mL、 16μg/mL和18μg/mL的系列标准溶液，以洛伐他汀浓度为横坐标，以不同浓度的洛伐他 汀标准溶液在238nm处的吸光度为纵坐标，建立吸光值和洛伐他汀浓度的回归方程，得 到如下回归方程：y＝0.051x+0.003(R2＝0.997)；
发酵液中洛伐他汀浓度的测定：将本实施例中发酵培养后的红曲菌发酵液全部转入 离心管中，匀浆机搅碎后，向红曲菌发酵液中就加入10mL乙酸乙酯，完全混合后静置 分层，取上清液重复上述步骤，直至上清液无色，合并所有的上清液，用真空干燥仪在45℃浓缩至无溶剂，剩下的干燥物用少许苯溶解，待苯挥发后，剩下的溶质用浓度为95％ 的乙醇稀释，并用分光光度计测定该溶液在238nm处的吸光度，再通过上述建立的回归 方程得到红曲菌发酵液中洛伐他汀的浓度。
采用本实施例的方法，红曲菌产生的洛伐他汀的产量为10.304μg/mL。
红曲菌生长量采用如下方法测定：本实施例中的红曲菌悬液在发酵培养期间，每隔 2天取一次样品，转入离心管中，在10000r/min的条件下高速离心4min，过滤得到红 曲菌的菌体组织。称重记录其湿重再放入60℃的烘箱中烘干。每隔5h测一次净重，直 到重量不发生变化为止，此时的重量即为菌体的净重。
本实施例中红曲菌生物量的结果见图3，其持续到第8天后以平稳的速度增长，第12天的水杨酸组的生物量为48±2.4mg。
实施例2：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：每升PDB液体培养基中水杨酸的量为30μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为6.57μg/mL。
实施例3：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：每升PDB液体培养基中水杨酸的量为100μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为7.519μg/mL。
实施例4：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：每升PDB液体培养基中水杨酸的量为300μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为8.867μg/mL。
实施例5：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：每升PDB液体培养基中水杨酸的量为450μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为8.983μg/mL。
实施例6：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：每升PDB液体培养基中水杨酸的量为600μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为9.832μg/mL。
实施例7：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：每升PDB液体培养基中水杨酸的量为700μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为9.883μg/mL。
实施例8：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：每升PDB液体培养基中水杨酸的量为750μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为9.897μg/mL。
实施例9：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：每升PDB液体培养基中水杨酸的量为850μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为9.701μg/mL。
实施例10：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：每升PDB液体培养基中水杨酸的量为900μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为9.602μg/mL。
实施例11：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：向PDB液态培养基中加入茉莉酸甲酯，使得每升PDB液体培养基中 茉莉酸甲酯的量为20μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为7.115μg/mL。
实施例12：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：向PDB液态培养基中加入茉莉酸甲酯，使得每升PDB液体培养基中 茉莉酸甲酯的量为60μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为8.686μg/mL。
实施例13：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：向PDB液态培养基中加入茉莉酸甲酯，使得每升PDB液体培养基中 茉莉酸甲酯的量为80μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为9.602μg/mL。
实施例14：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：向PDB液态培养基中加入茉莉酸甲酯，使得每升PDB液体培养基中 茉莉酸甲酯的量为120μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为9.742μg/mL。
实施例15：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：向PDB液态培养基中加入茉莉酸甲酯，使得每升PDB液体培养基中 茉莉酸甲酯的量为150μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为10.214μg/mL。
采用与实施例1相同的方法测定本实施例中红曲菌的生物量，结果见图3，其在前期生物量增长较快，在第4天后，生长变缓。
实施例16：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：向PDB液态培养基中加入茉莉酸甲酯，使得每升PDB液体培养基中 茉莉酸甲酯的量为160μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为10.089μg/mL。
实施例17：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：向PDB液态培养基中加入茉莉酸甲酯，使得每升PDB液体培养基中 茉莉酸甲酯的量为170μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为9.821μg/mL。
实施例18：
本实施例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1 相同，区别在于：向PDB液态培养基中加入茉莉酸甲酯，使得每升PDB液体培养基中 茉莉酸甲酯的量为180μmol。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本实施例中红曲菌产生 的洛伐他汀的产量为9.627μg/mL。
比较例1：
本例提供了一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，具体的培养方法与实施例1相同， 区别在于：PDB液态培养基中不加任何物质。
采用与实施例1相同的方法测定发酵液中洛伐他汀的浓度，本例中红曲菌产生的洛 伐他汀的产量为6.217μg/mL。本例中红曲菌的生长量曲线见图3。
由实施例1～18、比较例1和图1可以看出，在培养基中加入浓度为30～900μmol/L的水杨酸，红曲菌产生的洛伐他汀的产量均比没有添加水杨酸的要高，当加入的水杨酸 的浓度为800μmol/L时，红曲菌产生的洛伐他汀的产量达到最大，相比于对照组1洛伐 他汀的产量增加了39.66％。
由实施例1～18、比较例1和图2可以看出，在培养基中加入浓度为20～180μmol/L的茉莉酸甲酯，红曲菌产生的洛伐他汀的产量均比没有添加茉莉酸甲酯的要高，当加入 的茉莉酸甲酯的浓度为150μmol/L时，红曲菌产生的洛伐他汀的产量达到最大，相比于 比较例1洛伐他汀的产量增加了39.13％。
由图3可以看出，比较例1在第12天的生物量为38±1.9mg，向培养基中加入浓度为800μmol/L的水杨酸后，红曲菌的生物量以较快的速度增长，发酵到第8天后以平稳 的速度增长，第12天其生物量为48±2.4mg，相比于比较例1生物量增加了26.3％；由 此可知，水杨酸提高红曲菌产生洛伐他汀的产量有部分原因是通过促进菌丝生长实现 的。向培养基中加入浓度为150μmol/L的茉莉酸甲酯后，在发酵前期生物量的增长较快， 而第4天后，生物量的增长变缓，与对照组的增长速度基本持平，由此可知，在发酵前 期茉莉酸甲酯促进菌体对营养物质的吸收，加速菌丝的生长，茉莉酸甲酯主要是以调节 红曲菌相关的代谢过程促进洛伐他汀的合成。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本 发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保 护范围内。

Claims (10)

1.一种红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将活化后的红曲菌菌种经过稀释和震荡，得到单孢子悬液，将所述单孢子悬液接种到PDB液体培养基中，并在30℃下培养12天，得到红曲菌悬液；
S2.向PDB液体培养基中加入水杨酸或茉莉酸甲酯，再将所述红曲菌悬液接种到PDB液体培养基中，并在30℃、180r/min摇床培养12天。
2.根据权利要求1所述的红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，其特征在于，步骤S2中每升所述PDB液体培养基中水杨酸的量为30～900μmol。
3.根据权利要求1所述的红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，其特征在于，步骤S2中每升所述PDB液体培养基中茉莉酸甲酯的量为20～180μmol。
4.根据权利要求2所述的红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，其特征在于，步骤S2中每升所述PDB液体培养基中水杨酸的量为800μmol。
5.根据权利要求3所述的红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，其特征在于，步骤S2中每升所述PDB液体培养基中茉莉酸甲酯的量为150μmol。
6.根据权利要求1～5任一项所述的红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，其特征在于，所述红曲菌为紫色红曲菌Monascuspurpureus。
7.根据权利要求1所述的红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，其特征在于，步骤S1中所述红曲菌菌种采用如下方法活化：将红曲菌菌种稀释后，涂布在CYA培养基上，并在30℃下培养12天；所述CYA培养基包括如下成分：KH2PO4 0.3g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O0.002g、NaCl 1.0g、ZnCl20.015g、CaCl2·2H2O 0.005g和琼脂20g，pH为6.5～7.0。
8.根据权利要求1所述的红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，其特征在于，步骤S1中将稀释后的红曲菌菌种在30℃，150r/min的条件下震荡10min。
9.根据权利要求1所述的红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，其特征在于，所述PDB液体培养基包括马铃薯200g和无水葡萄糖20g。
10.根据权利要求1所述的红曲菌高产洛伐他汀的培养方法，其特征在于，步骤S2中所述红曲菌悬液接种到PDB液体培养基中，接种量为10％。
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