CN103283482A - 蛹虫草、培养方法和分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，具体涉及蛹虫草拟青霉、培养方法和分离方法。蛹虫草（Cordycepes militaris）GZU-19，其保藏号为CCTCC NO:M2013056。一种蛹虫草的培养方法，包括：菌种活化，所述菌种活化包括将保藏的蛹虫草转接到萨氏培养基斜面进行活化培养；将活化后蛹虫草的点种到萨氏培养基平板进行形态鉴定的生长培养，得到气生菌丝。本发明提供的蛹虫草拟青霉、培养方法和分离方法，具有较强合成虫草菌素的能力，为高产虫草菌素的人工栽培子实体、高产虫草菌素的微生物发酵工业产业奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）、培养方法和分离方法。
蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19），保藏号为CCTCC NO:M2013056，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏时间为2013年2月4日。
背景技术
蛹虫草又称北虫草、北冬虫夏草。蛹虫草无性型是蛹虫草拟青霉，无性型在单饱子菌株水平上，菌落特征、有性子实体形成能力、产孢结构等方面差异较大。蛹虫草含有丰富的活性物质，如虫草菌素、多糖、核苷、类胡萝卜素等，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、抗氧化、免疫调节等广泛的生理活性。
虫草素是蛹虫草最重要的活性物质之一，是一种核苷类抗生素，具有一系列的药理活性，如免疫调节作用、抗肿瘤作用、抗菌抗病毒作用、抗炎作用、抗白血病等作用。作为白血病治疗药物在美国已经进入三期临床试验。还有研究表明，虫草素对HIV-I型病毒也有抑制活性。蛹虫草是药食两用的中药和食品，市场的需求量很大。作为食品其虫草菌素的含量要求不高，但作为药源或直接用药对虫草菌素的要求就非常高。但目前人工种植的蛹虫草子实体虫草菌素含量都不高，一般在0.5%（占子实体干重）以下，远远不能满足药 用的需求，也远不能满足市场的需要。因此，解决这一问题的关键在于获得高效生物合成虫草菌素的菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供蛹虫草拟青霉、培养方法和分离方法，以解决上述的问题。
在本发明的实施例中提供了蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19），其保藏号为CCTCC NO:M2013056。
在本发明的实施例中提供了一种所述蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）CCTCC NO:M2013056的培养方法，包括：
菌种活化，所述菌种活化包括将保藏的蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）CCTCC NO:M2013056转接到萨氏培养基斜面进行活化培养；
将活化后蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）CCTCC NO:M2013056的点种到萨氏培养基平板进行生长培养，得到气生菌丝。
优化的，所述萨氏培养基每升中含有：麦芽糖10-20克，葡萄糖10-30克，蛋白胨8-23克，酵母膏4-15克，琼脂15-20克，硫酸镁0.1-1克，硫酸亚铁0.1-1克，氯化钾0.5-2克。
优化的，所述萨氏培养基每升中含有：麦芽糖5克，葡萄糖20克，蛋白胨10克，酵母膏5克，琼脂15-20克，硫酸镁0.5克，硫酸亚铁0.5克，氯化钾1克。
优化的，所述菌种活化中活化培养温度为24℃-26℃，活化培养时间为5-7天。
优化的，所述生长培养中生长培养温度为25℃，生长培养时间为14天。
优化的，所述气生菌丝在萨氏培养基平板中的形态为：菌落圆形，直径34毫米，菌落中央***，其外有2或3个同心环，厚实为绒状，所述气生菌丝的产孢结构为拟青霉型。
优化的，所述气生菌丝呈橙黄色至铬黄色，边缘的气生菌丝为白色，菌落背面呈浅黄色。
优化的，所述方法还包括：蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）CCTCC NO:M2013056的rDNA转录；rDNA转录间区DNA序列片段为：
ACATGCTTAGGTTGGGCGTTTTACGGCGTGGCCACGTCGGGTTCCCGGTGCGAGTTGGAGTACTACGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTTCATTTCGGGGGCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACATCCCCCAGGGGACGTCGAGGGTTGAAATGAACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGGATTCAGAAAAACTGGTAGATACAGTGTTTGGGGCCCCCGACGGCCGCCGCCCAGGCCGGCGTCCAGGCGCTGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTATGTTCACAAAGGG TTGGGAGTTGGAAAACTCGTTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAAGGGAGACCTTGTTACGACTTTTTCTTCCAGGA。
本发明还提供了一种所述的蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）CCTCC NO:M2013056的分离方法，包括：
将采集得到的蛹虫草子实体用75%的乙醇进行表面消毒，然后用无菌解剖刀切开子座可孕部分，取一小块组织或带子囊壳的组织接种到萨氏平板上，24℃-26℃培养4-5天，转接萨氏斜面，24℃-26℃培养6-7天，取出4℃保存。
本发明上述实施例提供的蛹虫草拟青霉、培养方法和分离方法，蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19），其保藏号为CCTCC NO:M2013056，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，经过菌种活化和生长培养后，具备了一定的形态特征和rDNA转录区间序列特征，具有较强合成虫草菌素的能力，为高产虫草菌素的人工栽培子实体、高产虫草菌素的微生物发酵工业产业奠定基础。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。
本发明实施例中提供了蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19），其保藏号为CCTCC NO:M2013056，保藏在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC），保藏时间为2013年2月4日。
本发明实施例中提供了蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）CCTCC NO:M2013056的培养方法，包括：
菌种活化，所述菌种活化包括将保藏的蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）CCTCC NO:M2013056转接到萨氏培养基斜面进行活化培养；
将活化后蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）CCTCC NO:M2013056的点种到萨氏培养基平板进行生长培养，得到气生菌丝。
本发明还提供了一种所述的蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）CCTCC NO:M2013056的分离方法，包括：
将采集得到的蛹虫草子实体用75%的乙醇进行表面消毒，然后用无菌解剖刀切开子座可孕部分，取一小块组织或带子囊壳的组织接种到萨氏平板上，24℃-26℃培养4-5天，转接萨氏斜面，24℃-26℃培养6-7天，取出4℃保存。
经过菌种活化和生长培养后，具备了一定的形态特征和rDNA转录区间序列特征，具有较强合成虫草菌素的能力，为高产虫草菌素的人工栽培子实体、高产虫草菌素的微生物发酵工业产业奠定基础。
接下来，通过几个具体实施例来详细描述蛹虫草拟青霉的培养方法：
实施例一：
将采集得到的蛹虫草子实体用75%的乙醇进行表面消毒，然后用无菌解剖刀切开子座可孕部分，取一小块组织或带子囊壳的组织接种到萨氏平板上，24℃-26℃培养4-5天，转接萨氏斜面，24℃-26℃培养6-7天，取出4℃保存得到的蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）CCTCC NO:M2013056。
制备萨氏培养基，首先称取萨氏培养基的各种原料：麦芽糖5克，葡萄糖20克，蛋白胨10克，酵母膏5克，琼脂15克，硫酸镁0.5克，硫酸亚铁0.5克，氯化钾1克；然后将麦芽糖，葡萄糖，蛋白胨，酵母膏，琼脂，硫酸镁，硫酸亚铁，氯化钾依次添加到600ml的蒸馏水中制备混合溶液，将混混溶液定容到1000ml，在210℃下灭菌。
将保藏的蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19），其保藏号为CCTCC NO:M2013056转接到萨氏培养基斜面上进行活化培养，活化培养温度为24℃-26℃，活化培养时间为5-7天；
将活化后蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19）CCTCC NO:M2013056的点种到萨氏培养基平板进行生长培养，得到气生菌丝，生长培养温度为25℃，生长培养时间为14天。
经过上述生长培养后得到的气生菌丝的形态特征为：菌落圆形，直径34毫米，菌落中央***，中央***是微生物领域常用的形状描述方式，其外有2或3个同心环，厚实为绒状，绒状是微生物领域常用的形状描述语，本领域技术人员可以完全了解绒状的界定方式，所述气生菌丝的产孢结构为拟青霉型，将气生菌丝的颜色与链霉菌鉴定手册里的图谱相对比，所述气生菌丝呈橙黄色至铬黄色，边缘的气生菌丝为白色，菌落背面呈浅黄色。
接下来进行rDNA转录，具体步骤为：
（1）菌株的培养：将蛹虫草拟青霉孢子液（可从市面购入）涂布于覆盖一层玻璃纸的萨氏平板上，25±1℃培养2天，收集菌丝，转入离心管中，备用。
（2）基因组DNA的提取
a.在装有菌丝的离心管中加入少许石英砂，加入裂解溶液200μl，充分研磨成匀浆。
b.加入β-巯基乙醇2μl，蛋白酶K溶液20μl，震荡混匀，56℃水浴1h。
c.加入PE缓冲液100μl，充分混匀，-20℃冰箱放置5min。
d.室温10，000rpm离心5min，将上清液移到新的1.5ml离心管中。
e.加入BD缓冲液200μl，无水乙醇200μl，充分混匀，转入装在离心管中的吸附柱中。
f.静置2min，在10，000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
g.将吸附柱放回收集管，加入PW溶液500μl，10，000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
h.将吸附柱放回收集管，加入Wash溶液500μl，10，000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
i.取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入TE缓冲液50μl，静置3min，于12，000rpm室温离心2min，收集DNA溶液，-20℃保存备用。
蛹虫草拟青霉rDNA转录间区（internal transcribed spacer,ITS）DNA序列的PCR扩增
用引物ITS4与ITS5扩增菌株的rDNA ITS序列，引物序列如下：
ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATAGC。
扩增体系：PCR反应体系为20ul，包括：
扩增条件：
测序方法
采用PCR产物直接测序。运用Sanger酶学法进行测序。
rDNA转录间区DNA序列片段为：
ACATGCTTAGGTTGGGCGTTTTACGGCGTGGCCACGTCGGGTTCCCGGTGCGAGTTGGAGTACTACGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTTCATTTCGGGGGCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACATCCCCCAGGGGACGTCGAGGGTTGAAATGAACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGGATTCAGAAAAACTGGTAGATACAGTGTTTGGGGCCCCCGACGGCCGCCGCCCAGGCCGGCGTCCAGGCGCTGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTATGTTCACAAAGGGTTGGGAGTTGGAAAACTCGTTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAAGGGAGACCTTGTTACGACTTTTTCTTCCAGGA。
接下来提供该实施例的蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19），其保藏号为CCTCC NO:M2013056的分离方法：
将采集得到的蛹虫草子实体用75%的乙醇进行表面消毒，然后用无菌解剖刀切开子座可孕部分，取一小块组织或带子囊壳的组织接种到萨氏平板上，24℃-26℃培养4-5天，转接萨氏斜面，24℃-26℃培养6-7天，取出4℃保存。
为了进一步证明保存的蛹虫草GZU-19（Cordycepes militaris GZU-19），其保藏号为CCTCC NO:M2013056具备高产虫菌，采用下面的培养方法和测试，可以得到虫草菌素含量在1.3%：
一、斜面菌种培养
将蛹虫草菌种转接萨氏斜面，27℃±1℃培养7d。
二、孢子悬液的制备
用含有0.05%吐温80的无菌蒸馏水洗下斜面菌种孢子，转入带玻璃珠的50ml三角瓶中，振荡制备成均一的孢子悬液，终浓度为106cfu/ml。
三、虫草子实体栽培
1、培养基
大米30g，蛋白胨0.10g，磷酸二氢钾,0.030g，硫酸镁0.035g，葡萄糖0.1g，维生素B10.40mg，水3,5ml，PH値6，装入培养瓶中，聚丙烯薄膜封口。121℃高压灭菌60min。
2、接种
将孢子悬液按3ml/瓶接种到已灭菌带培养基的培养瓶中，搅拌混匀。
3、暗培养
将已接种的培养瓶放置到已消毒闭光房间里，温度22℃±2℃，湿度,65%左右培养1周，培养瓶长满菌丝。
5、菌丝转色培养
将长满菌丝的培养瓶子转置卫生、干净、通风的房间，温度22℃左右；湿度保持75%左右；每天通风3h，光照12h，培养7天，转色完成，开始在培养基表面形成小米状原基（又称为菌蕾）。
5、出子实体培养
当培养瓶中培养基表面形成小米状原基时，将温度调整为23℃左右，湿度调整为85%左右，每天通风3h，光照12h，培养5-7天， 原基伸长为子座（又称为子实体），这时在培养瓶封口薄膜扎5个孔。继续培养30天，采收子实体。
6、菌株M2013056用以上方法栽培得到的蛹虫草子实体呈金黄色，虫草菌素含量在1.3%。
实施例二：
与实施例一的区别点在于：萨氏培养基：麦芽糖10克，葡萄糖10克，蛋白胨8克，酵母膏4克，琼脂15克，硫酸镁0.1克，硫酸亚铁0.1克，氯化钾0.5克。
实施例三：
与实施例一的区别点在于：萨氏培养基：麦芽糖20克，葡萄糖30克，蛋白胨23克，酵母膏15克，琼脂20克，硫酸镁1克，硫酸亚铁1克，氯化钾2克。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>熊艳
<120>蛹虫草、培养方法和分离方法
<160>1
<210>1
<211>540
<212>DNA
<213>蛹虫草（Cordycepes militaris）
<400>1
ACATGCTTAGGTTGGGCGTTTTACGGCGTGGCCACGTCGGGTTCCCGGTGCGAGTTGGAGTACTACGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTTCATTTCGGGGGCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACATCCCCCAGGGGACGTCGAGGGTTGAAATGAACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGGATTCAGAAAAACTGGTAGATACAGTGTTTGGGGCCCCCGACGGCCGCCGCCCAGGCCGGCGTCCAGGCGCTGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTATGTTCACAAAGGGTTGGGAGTTGGAAAACTCGTTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAAGGGAGACCTTGTTACGACTTTTTCTTCCAGGA
Claims (10)
1.蛹虫草（Cordycepes militaris）GZU-19，其保藏号为CCTCC NO:M2013056。
2.一种权利要求1所述的蛹虫草（Cordycepes militaris）GZU-19CCTCC NO:M2013056的培养方法，其特征在于，包括：
菌种活化，所述菌种活化包括将保藏的蛹虫草（Cordycepes militaris）GZU-19CCTCC NO:M2013056转接到萨氏培养基斜面进行活化培养；
将活化后蛹虫草（Cordycepes militaris）GZU-19CCTCCNO:M2013056的点种到萨氏培养基平板进行形态鉴定的生长培养，得到气生菌丝。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，
所述萨氏培养基每升中含有：麦芽糖10-20克，葡萄糖10-30克，蛋白胨8-23克，酵母膏4-15克，琼脂15-20克，硫酸镁0.1-1克，硫酸亚铁0.1-1克，氯化钾0.5-2克。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，
所述萨氏培养基每升中含有：麦芽糖5克，葡萄糖20克，蛋白胨10克，酵母膏5克，琼脂15-20克，硫酸镁0.5克，硫酸亚铁0.5克，氯化钾1克。
5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述菌种活化中活化培养温度为24℃-26℃，活化培养时间为5-7天。
6.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述生长培养中生长培养温度为25℃，生长培养时间为14天。
7.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述气生菌丝在萨氏培养基平板中的形态为：菌落圆形，直径34毫米，菌落中央***，其外有2或3个同心环，厚实为绒状，所述气生菌丝的产孢结构为拟青霉型。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述气生菌丝呈橙黄色至铬黄色，边缘的气生菌丝为白色，菌落背面呈浅黄色。
9.权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述方法还包括：蛹虫草（Cordycepes militaris）GZU-19CCTCC NO:M2013056的rDNA转录；
rDNA转录间区DNA序列片段为：
ACATGCTTAGGTTGGGCGTTTTACGGCGTGGCCACGTCGGGTTCCCGGTGCGAGTTGGAGTACTACGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTTCATTTCGGGGGCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACATCCCCCAGGGGACGTCGAGGGTTGAAATGAACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGGATTCAGAAAAACTGGTAGATACAGTGTTTGGGGCCCCCGACGGCCGCCGCCCAGGCCGGCGTCCAGGCGCTGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTATGTTCACAAAGGGTTGGGAGTTGGAAAACTCGTTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAAGGGAGACCTTGTTACGACTTTTTCTTCCAGGA。
10.一种权利要求1所述的蛹虫草（Cordycepes militaris）GZU-19CCTCC NO:M2013056的分离方法，其特征在于，包括：
将采集得到的蛹虫草子实体用75%的乙醇进行表面消毒，然后用无菌解剖刀切开子座可孕部分，取一块组织或带子囊壳的组织接种到萨氏平板上，24℃-26℃培养4-5天，转接萨氏斜面，24℃-26℃培养6-7天，取出4℃保存。
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