CN109337821A - 一种产甾醇酯酶的枝孢菌及产酶方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株筛选获得的产甾醇酯酶的枝孢菌（Cladosporium sp.）DZ16，保藏号CCTCC M 2016685。本发明菌种菌落呈丝绒状，经第一步菌种保藏活化、第二步菌种平板涂布进行菌种活化。在发酵前期采用第一步低盐液态活化培养提高菌株生物量，后期借助于第二步多因子复合作用，诱导菌株分泌酶蛋白，提高酶活。本发明菌株发酵所产生的甾醇酯酶在医疗检测、食品、制浆造纸工业、环保等领域具有良好的应用潜力。

Description

一种产甾醇酯酶的枝孢菌及产酶方法
技术领域
本发明涉及一株筛选获得的产甾醇酯酶的枝孢菌株及产酶方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
甾醇类化合物是一种环氧烷多氢菲的衍生物，广泛分布于生物界中，在动植物体内发挥着多种多样的生理功能，在机体代谢过程中起着举足轻重的地位。胆甾醇是动物体内含量最为丰富的一种甾醇类化合物，多存在于肝、肾及肠等内脏器官及皮肤、脂肪组织中，是生物体五类甾体激素、维生素D、胆酸的前体物质。保证胆甾醇的供给，明确其具体含量，对于维持机体正常的生命活动是必需的，故而体内甾醇含量的测定在医学临床方面具有重要的指导意义。
医学临床上对于血液胆甾醇的检测方法主要有酶化学法、免疫化学分析法以及基于仪器分析原理的其他临床生化检验方法等。主要可以归为两大类，第一类为利用大、中型专业设备，采用光学吸收原理对血液样品进行检测，此类检测方法对于设备的要求较高，测定耗时较长，成本高；第二类为运用专用的医用手持检测仪进行检测，主要是借助于免疫方法、电化学方法以及部分光学方法等原理进行检测，同样具有操作耗时长、造价高等弊端。相对于现行的两种检测方法，以酶法为依据的检测方法具有操作简单、特异性好、结果稳定等优点，在越来越多的临床中逐渐得到普及和应用。
酯酶是指催化酯键的一种酶类，具有水解或合成的能力。发挥水解作用时，能够专一性的催化酯键产生相应的酸和醇；发挥合成作用时，可以把酸的羧基与醇的羟基缩合并脱水，产物为酯类及其它香味物质，在众多生物化工检测及药物合成方面具有良好应用。甾醇酯酶是具有水解作用的一种酯酶，能够水解胆甾醇类酯中的酯键，生成胆甾醇及相应的脂肪酸。相关研究表明，胆甾醇经胆固醇氧化酶和过氧化物酶作用可生成红素醌亚胺色原物质，其可在500nm处通过比色法检测，所得的吸光值与样品中的总胆甾醇含量具有对应的线性关系，可以通过预先制备的标准曲线计算出样品中的总胆甾醇含量。该方法不需要昂贵的大型设备，检测时间短，受干扰因素少，灵敏度高，是一种良好的甾醇含量检测方法，应用潜力巨大。
本发明公开了一株筛选获得的产甾醇酯酶的枝孢菌株及产酶方法。该菌株已保藏于中国•武汉•武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2016685。以此菌种为发酵对象，经第一步菌种保藏活化、第二步菌种平板涂布，结合后续的低盐液态活化培养基和多因子复合诱导培养基，提高菌体生长生物量及产酶活性，以期制备出相关甾醇酯酶酶制剂产品，增加其在医疗检测、食品、化工等领域的应用价值。
发明内容
本发明提供一株筛选获得的产甾醇酯酶的枝孢菌株及产酶方法。菌种命名为Cladosporium sp. DZ16，该菌种经两步活化，二阶式诱导发酵工艺，可高效生产甾醇酯酶。
本发明的具体技术方案：从甾醇类含量较高的动物肝脏中分离得到一株产甾醇酯酶的菌株，经鉴定为枝孢菌Cladosporium sp. DZ16，已于2016年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，位于中国•武汉•武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2016685。
Cladosporium sp. DZ16菌株在PDA平板培养基上培养，28℃倒置培养2-3d后，菌落呈丝绒状，边缘不整齐，菌落与菌丝均呈暗绿色，可产生分生孢子。以此菌种为主要发酵对象，经合理的发酵工艺，即可制备甾醇酯酶。具体产酶工艺步骤如下。
（1）菌种活化。
第一步菌种保藏活化，将菌种从-80℃冻藏的菌种保藏管中转接至PDA培养基中生长，28-32℃培养24-48h。
第二步菌种平板涂布，挑取生长旺盛的种液，稀释分离，并用涂布棒涂布于PDA固体培养基上，28-32℃培养48-72h，挑取生长良好的菌落，留存备用。
（2）发酵液培养。
第一步低盐液态活化培养，将平板涂布中生长良好的菌落接种到低盐液态活化培养基中进行培养，其培养基中含有0.1%-0.3%酵母膏，0.2%-0.5%蛋白胨，0.2%-0.5%磷酸二氢钾，0.1%-0.3%五水硫酸镁，培养条件为28-32℃，150-180rpm，24-48 h。
第二步多因子诱导产酶发酵，当Ⅰ步培养基中每1mL菌液含有105-106个菌株孢子时，以5.0%-10.0%（v/v）接种于多因子诱导产酶发酵培养基中发酵，其培养基中含有0.1%-0.2%酵母膏，0.5%-2.0%油酸豆甾醇酯，0.1%-0.5%油酸，0.05%-0.1% Triton X-100，0.001%-0.01%硼酸，0.7×10-4-2.5×10-4%钼酸钠，0.5×10-4-2.0×10-4%辅酶R，培养条件为28-32℃，150-180rpm，48-96h。
发酵过程中三角瓶体积为100-500mL，装液量20%-25%，原始pH。
甾醇酯酶酶活力的测定方法为以0.25mL 0.48mg/mL豆甾醇乙酸酯溶液为底物，添加4-AA苯酚工作液0.5mL，2U/mL胆固醇氧化酶0.25mL和12U/mL辣根过氧化物酶0.25mL，在40℃条件下预热5min后，添加25µL待测酶液，反应30min，用0.5mL 0.1mol/L的HCl终止反应，在OD500处测定吸光值，灭活酶液作为空白对照组。
该粗酶分子量约为59KDa，适宜反应温度30-35℃，最适作用pH 6.5-7.5，三价金属离子（Fe3+、Al3+）对酶活具有显著的抑制作用。该酶可有效降解豆甾醇乙酸酯为游离的豆甾固醇及乙酸，同时对其他种类的植物甾醇酯也具有一定的降解作用，在食品、化工等领域应用广泛。
本发明具有以下优势。
（1）发酵成本较低：在整体的发酵过程中，采用传统的真菌PDA培养基即可达到菌种的高密度活化，且在后期的发酵过程中，微量的营养因子可以达到较好的产酶效果，不需要复杂昂贵的药品或仪器设备。
（2）应用潜力巨大：由该自主筛选的菌株发酵生产的甾醇酯酶，具有良好的水解甾醇类酯的能力，在临床医学中血清总胆甾醇含量的测定、造纸工业中的树脂高质利用等方面具有较高的价值。
附图说明。
图1为Cladosporium sp. DZ16菌落图。
具体实施方式。
实施例1 甾醇酯酶Cladosporium sp. DZ16菌株的筛选及鉴定方法。
（1）初筛：选取甾醇类酯含量较高样品为筛选原料，取部分样品溶解于灭菌的生理盐水中，使得其组织分布均匀。经无菌操作将样品接种涂布于以甾醇类酯为主要碳源的初筛平板培养基上。28-30℃倒置培养2-3天，观察菌落形态与培养基透明圈情况。
（2）复筛：将初筛培养基中具有透明圈的菌株分类出来，进行液体摇瓶复筛，发酵条件为28-30℃，150-200rpm，培养1-2天，随后收集发酵液，测定酶活力。
（3）菌种鉴定：通过菌种基因组提取、扩增引物以及后续的PCR扩增进行菌种鉴定。通过ITS序列扩增对比，证明该菌株序列与枝孢菌属相似度为99%，最终命名为Cladosporium sp. DZ16。
实施例2 Cladosporium sp. DZ16菌株活化以及产酶培养。
（1）菌种活化。
第一步菌种保藏活化，将Cladosporium sp. DZ16菌种从-80℃冻藏的菌种保藏管中转接至100mL三角瓶的PDA培养基中生长，装液量20mL，28-32℃培养24-48h。
第二步菌种平板涂布，挑取生长旺盛的种液，稀释分离，并用涂布棒涂布于PDA固体培养基上，28-32℃培养48h，挑取生长良好的大菌落，留存备用。
（2）发酵液培养。
第一步低盐液态活化培养，将平板涂布中生长良好的大菌落接种到低盐液态活化培养基中进行培养，其培养基中含有0.2%酵母膏，0.3%蛋白胨，0.2%磷酸二氢钾，0.1%五水硫酸镁，培养条件为28℃，160rpm，48h。
第二步多因子诱导产酶发酵，当第一步培养基中每1mL菌液含有105个菌株孢子时，以5.0%（v/v）接种于多因子诱导产酶发酵培养基中发酵，其培养基中含有0.2%酵母膏，2.0%油酸豆甾醇酯，0.2%油酸，0.1% Triton X-100，0.005%硼酸，1.0×10-4%钼酸钠，1.0×10-4%辅酶R，培养条件为28℃，160rpm，96h；发酵过程中三角瓶体积为250mL，装液量50mL，原始pH。
实施例3 粗酶液酶活力测定。
以0.25mL 0.48mg/mL豆甾醇乙酸酯溶液为底物，添加4-AA苯酚工作液0.5 mL，2U/mL胆固醇氧化酶0.25mL和12U/mL辣根过氧化物酶0.25mL，在40℃条件下预热5min后，添加25µL待测酶液，反应30min，用0.5 mL 0.1mol/L的HCl终止反应，在OD500处测定吸光值，灭活酶液作为空白对照组，测得酶活力在0.5-0.8U/mL。

Claims (2)

1.一种产甾醇酯酶的枝孢菌及产酶方法，其特征在于：筛选的菌株，于2016年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，位于中国•武汉•武汉大学，菌种分类命名为Cladosporium sp. DZ16，保藏编号为CCTCC M 2016685，以Cladosporium sp. DZ16为菌株，经活化、有氧发酵、离心分离制备甾醇酯酶粗酶。
2.根据权利要求1所述的一种产甾醇酯酶的枝孢菌及产酶方法，其特征在于：活化与发酵的具体步骤为：
（1）菌种活化
第一步菌种保藏活化，即将菌种从菌种保藏管中转接于液体活化培养基中；
第二步菌种平板涂布，即将处于生长旺盛期的液体活化培养基稀释分离并涂布于固体培养基中，培养48-72h，挑取生长良好的菌落，留存备用；
（2）发酵液培养
第一步低盐液态活化培养，将生长良好的菌落接种到低盐液态活化培养基中进行培养，其培养基组分为0.1%-0.3%酵母膏，0.2%-0.5%蛋白胨，0.2%-0.5%磷酸二氢钾，0.1%-0.3%五水硫酸镁，提高菌株生物量，培养条件为28-32℃，150-200rpm，24-48h；
第二步多因子诱导产酶发酵，当第一步培养基中每1mL菌液含有105-106个菌株孢子时，以5.0%-10.0%（v/v）接种于多因子诱导产酶发酵培养基中发酵，其培养基组分为0.1%-0.2%酵母膏，0.5%-2.0%豆甾醇酯，0.1%-0.5%油酸，0.05%-0.1% Triton X-100，0.001%-0.01%硼酸，0.7×10-4-2.5×10-4%钼酸钠，0.5×10-4-2.0×10-4%辅酶R，培养条件为28-32℃，150-200rpm，48-96h。
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