JP2002507723A - リウマチ様関節炎の診断のための方法および組成物 - Google Patents

リウマチ様関節炎の診断のための方法および組成物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＲＡのスクリーニング、診断及び予後のための、ＲＡ治療の有効性をモニターするための、ならびに薬剤の開発のための方法及び組成物を提供するものである。血清または血漿の２次元電気泳動によって検出可能である、ＲＡ診断特徴（ＲＡＤＦ）が記載される。本発明はさらに、関節液、血清または血漿中で検出可能であるＲＡ診断タンパク質イソ型（ＲＰＩ）、分離されたＲＰＩからなる調製物、ＲＰＩに免疫特異的である抗体、および前記からなるキットを提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 １．イントロダクション 本発明は、リウマチ様関節炎に関連するタンパク質およびタンパク質イソ型の
同定に関するものであり、ならびに、スクリーニング、診断、予後、治療および
薬剤開発のためのそれらの使用に関するものである。 【０００２】 ２．発明の背景 リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、免疫異常によって対称性関節性炎症、関節性び
らん、および関節外の合併症を特徴的に引き起こす複合系疾患である。これは最
も一般的な不自由にする自己免疫性関節炎であり、遺伝的感受性がよく定義され
ている。人口の約１〜３％がこれに罹患している。罹患率は年齢とともに増加す
るが、ピークは３０〜５５歳である。 【０００３】 リウマチ因子は、すなわち免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ断片に対する抗
体であり、ＲＡを罹患している患者の７５％に存在する。リウマチ因子はＩｇＭ
、ＩｇＧまたはＩｇＡでありうる。自然に生じるリウマチ因子は、外来抗原を対
外に除去することに関する役割を持つと考えられている。ＲＡにおいて、リウマ
チ因子は滑膜プラズマ細胞によって生産され、免疫複合体を形成し、補体を活性
化し、炎症性応答に関与する能力を持ち、それらがＲＡの病因に関与しているこ
とが示唆されている。ＲＡにおけるリウマチ因子および減少されたＩＧのガラク
トシル化が共存することによって、数種の病気が予想される。 【０００４】 滑膜組織は、ＲＡにおける炎症の主要巣であり、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、活性Ｂ
細胞、単核細胞および多核白血球の慢性滑膜の浸潤が起こる。ＨＬＡクラスIIの
発現は増加し、ほとんどすべての細胞型で見出され、それらが活性状態であるこ
とを示す。慢性疾患の特徴は、軟骨および骨のびらん、ならびに滑膜肥大である
。 【０００５】 ＲＡの診断は困難でありつづけている。既往症、病気の初期における検査およ
び調査から、病気のパターンがはっきりしないからである。ＲＡに対する診断テ
ストはないが、リウマチ学で有名なアメリカの大学がその分類に関する基準を定
義した（Medicine, ed. Axford, J., Blackwell Science, 1996, pp. 3.18-3.22
）。これらの基準は、単に観察用のランドマークであり、これは組み合わせてＲ
Ａを指示するためと思われる。 【０００６】 ＲＡをもつ成人の７５％は、ＩｇＭリウマチ因子陽性である。これは病気の初
期において見出されない。リウマチ因子のレベルは予後的に診断で使用されうる
が、その機能は病気のモニタリングの役には立たない。抗核の抗体が患者の３０
％に存在する。 【０００７】 ＩｇＭのリウマチ因子は通常、凝集テストによって測定される。これらは、Ｉ
ｇＧで被覆された粒子が凝集するラテックステスト（latex test）、羊赤血球が
凝集する羊赤血球凝集反応（ＳＣＡＴまたはローズ−ワーラーテスト（Rose-Waa
ler test））を含む。他の基準によって診断されたＲＡ患者の少なくとも７０％
は、リウマチ因子のラテックス凝集反応陽性である。リウマチ因子テストはまた
、他のリウマチ性疾患、ウイルス感染、慢性炎症性疾患、腫瘍または化学療法に
おいても陽性であり、深刻なことに４％の健康な個体も陽性である。 【０００８】 ＲＡの薬剤治療は、（１）痛みを緩和する（鎮痛剤）；（２）一度炎症が引き
起こされた炎症性事象を改変する（抗炎症性薬剤）；および（３）炎症を導く免
疫性事象を改変する（疾患−改変薬剤）を目的としている。 【０００９】 ３．発明の概要 本発明は、ＲＡのスクリーニング、診断ならびに予後のため、ＲＡ治療の有効
性をモニタリングするため、ＲＡの治療ならびに薬剤開発のための方法および化
合物を提供するものである。 【００１０】 １ 本発明の第一の観点において、ＲＡの診断のための方法を提供する。これはサ
ンプル（例えば、血漿、血清または関節液）を二次元電気泳動によって分析し、
少なくとも一のリウマチ様関節炎特徴（Rheumatoid Arthritis-Diagnostic Feat
ure (RADF)）のレベルを検出することを含み、例えばここで開示されるＲＡＤＦ
類の群から選択されたＲＡＤＦである。これらの方法はまた、スクリーニング、
予後、治療結果のモニタリングおよび薬剤開発に適している。 【００１１】 本発明の第二の観点において、ＲＡ診断のための方法を提供する。これはサン
プル（例えば血漿、血清または関節液）中の少なくとも一つのリウマチ様関節炎
診断タンパク質イソ型（Rheumatoid Arthritis-Diagnostic Protein Isoform （
RPI））を検出することを含み、例えばここで開示されるＲＰＩ類の群か選択さ れるＲＰＩである。これらの方法はまた、スクリーニング、予後、治療結果のモ
ニタリングおよび薬剤開発に適している。 【００１２】 本発明の第三の観点において、ＲＰＩに対して免疫特異的に結合することので
きるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を提供するものであり、例え
ばここで開示されるＲＰＩである。 【００１３】 本発明の第四の観点において、分離されたＲＰＩ、すなわち顕著に異なる等電
点または顕著に異なる見かけの分子量を持つタンパク質もしくはタンパク質イソ
型から分離したＲＰＩを含む製剤を提供する。 【００１４】 本発明の第五の観点において、ＲＡの治療または予防のための方法を提供する
。これは、ＲＡ患者の血清と比較してＲＡ患者の関節液において増加したレベル
で存在する、少なくとも一つのＲＡＤＦのレベルまたは少なくとも一つのＲＰＩ
のレベルまたは活性を減少させることができる化合物を投与することを含む。好
ましくは、投与される化合物は、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボ
ザイムまたはトリプレックス（triple helix）を形成できるオリゴヌクレオチド
である。 【００１５】 本発明の第六の観点において、ＲＡの治療または予防のための方法を提供する
。これは、ＲＡ患者の血清と比較してＲＡ患者の関節液において減少したレベル
で存在する、少なくとも一つのＲＡＤＦのレベルまたは少なくとも一つのＲＰＩ
のレベルもしくは活性を増加させることができる化合物を投与することを含む。
好ましくは、投与される該化合物は、ＲＰＩ、ＲＰＩをコードする核酸、（例え
ば、発現ベクターの一部である核酸）または一つまたはそれ以上のＲＰＩを発現
および分泌できる細胞である。 【００１６】 ５．発明の詳細な説明 以下に説明される本発明は、被検者におけるＲＡのスクリーニング、診断およ
び予後のための方法および組成物、ＲＡ治療結果のモニタリングの方法、薬剤開
発の方法、および、ＲＡ治療の方法を含む。好ましくは、該被検者は哺乳類であ
り、より好ましくはヒトであり、最も好ましくはヒト成人である。 【００１７】 限定することなく開示を明確するために、本発明は血清および関節液サンプル
の分析に関して記載されている。しかしながら、当業者にとって明らかなように
、ここで記載された分析および技術は、体液（例えば、血漿、尿、脳席髄液、関
節吸引液）、組織サンプルまたはそれらのホモジネートを含む、他のタイプの患
者のサンプルにも適用することができる。 【００１８】 ５．１ リウマチ様関節炎診断特徴（ＲＡＤＦ） 本発明の一つの観点において、二次元電気泳動は、ＲＡのスクリーニングまた
は診断のために一つまたはそれ以上のリウマチ様関節炎特徴（Rheumatoid Arthr
itis-Diagnostic Features（ＲＡＤＦ））の発生量を測定するため、ＲＡ患者の
予後を測定するため、ＲＡ治療の有効性をモニターするため、被検者からの血清
を分析するため、または、薬剤開発のために用いられる。ここで用いられている
ように、「二次元電気泳動」（２Ｄ電気泳動）は、変性電気泳動によってなされ
る等電点電気泳動を含む技術を意味し、これにより複数の分離されたタンパク質
を含む二次元ゲル（２Ｄゲル）を得る。好ましくは、変性電気泳動の段階におい
て、ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）が使用される。特に好ましくは、米国特許出願第０８／９８０，５７４号
に記載されている非常に正確な自動方法およびその装置（「好ましい技術（the
Preferred Technology）」）であり、ここにその全体を参照させることによって
引用する。簡潔にいうと、該好ましい技術とは、生物学的サンプル中において生
物学的分子を選択し特徴づけるために、有効なコンピューター支援による方法お
よび装置を提供するものである。二次元アレイ（two-dimensional array）は、 電気泳動移動度および等電点に従って二次元ゲル上で生物学的分子を分離するこ
とによって生じる。該アレイのコンピューターによるデジタルプロファイルが作
成され、これは二次元アレイ中に検出された多数の生物学的分子の同一性、見か
けの分子量、等電点および相対発生量を表現するものであり、それによって複数
の生物学的サンプルからのプロファイルをコンピューターが媒介して比較するこ
と、および興味深い分離されたタンパク質をコンピューターの補助により切り出
すことが可能である。 【００１９】 ここで用いられているように、「リウマチ様関節炎特徴（Rheumatoid Arthrit
is-Diagnostic Feature（ＲＡＤＦ））」とは、生物学的サンプルの２Ｄ電気泳 動によって検出された特徴（例えば、２Ｄゲル上のスポット）であり、すなわち
他の関連するタンパク質と比較してあるサンプル中に差別的に存在するものであ
り、例えば（１）ＲＡを持たない被検者の血清と比較した、ＲＡを持つ被検者の
血清において、または、（２）ＲＡを持つ被検者の血清と比較した、ＲＡを持つ
被検者の関節液においてである。 【００２０】 ここで用いられているように、特徴（またはタンパク質イソ型）とは、第二サ
ンプルに対して第一サンプル中に「差別的に存在する」ものであり、その場合、
その特徴またはイソ型を検出する方法（例えば２Ｄゲル電気泳動またはイムノア
ッセイ）によって、その特徴（またはタンパク質イソ型）が第二サンプルと比較
して第一サンプル中に異なる相対的な発生量で存在することは明白である。第一
サンプルにおいて測定された特徴が第二サンプルにおいてより高い相対的な発生
量で存在する場合、該特徴またはイソ型は第二サンプルに対して第一サンプルに
おいて「増加」しており、逆に第一サンプルにおいて測定された特徴が、第二サ
ンプルにおいてより低い相対的な発生量で存在する場合、該特徴またはイソ型は
第二サンプルに対して第一サンプルにおいて「減少」している。 【００２１】 好ましくは、二つのサンプルにおける特徴の相対的な発生量は、二つの段階で
決定される。第一に、サンプル中で検出された特徴について得られたシグナルは
、例えば分析されたサンプル中における総タンパク質（例えば、ゲルにローディ
ングした総タンパク質）に対する適切なバックグラウンドパラメータ、不変の特
徴、すなわち比較されるサンプル中でその発生量が類似していることがわかって
いる特徴（例えば、ここで開示されているＥＲＦ等の、一つまたはそれ以上の発
現参照特徴（Expression Reference Features（ＥＲＦ））、または、サンプル 中のすべてのタンパク質から検出された総シグナルを参照することによって基準
化（normalized）する。 【００２２】 第二に、一つまたはそれ以上のサンプルセット中の特徴に関して基準化された
シグナルは、他のサンプルまたはサンプルセット中の同じ特徴に関して基準化さ
れたシグナルと比較される。これは、第二サンプルに関して、第一サンプル（ま
たはサンプルセット）中に「差別的に存在する」特徴を同定するためである。 【００２３】 ここで開示されたＲＡＤＦとは、一つまたはそれ以上のサンプルを比較するこ
とによって同定されている。ＲＡＤＦの第一グループは、（ａ）ＲＡを持つ被検
者の血清と比較してＲＡを持つ被検者の関節液中に差別的に存在する、および（
ｂ）ＲＡを持たない被検者の血清と比較してＲＡを持たない被検者の関節液中に
差別的に存在しない特徴のことである。ＲＡを持たない被検者は、既知の病気ま
たは症状を持たない正常な被検者、または、通風、変形性関節炎または滑膜炎（
例えば外傷性滑膜炎）を含むＲＡ以外の関節の病気または症状を持つ被検者を含
みうる。ＲＡＤＦの第二グループは、ＲＡを持たない被検者の血清と比較してＲ
Ａを持つ被検者の血清中で差別的に存在する特徴のことである。 【００２４】 ＲＡＤＦの四のグループは、該好ましい技術の方法および装置によって同定さ
れている。第一グループは、ＲＡを持つ被検者の関節液中で増加しているが、Ｒ
Ａを持たない被検者中の血清中に対して関節液中で増加していないようなＲＡＤ
Ｆを含む。これらのＲＡＤＦは見かけの分子量（ＭＷ）および等電点（ｐＩ）に
よって下記のように記載されうる。 【００２５】 【表１】 【００２６】 第二グループは、ＲＡを持つ被検者の血清中に対して関節液中で減少している
が、ＲＡを持たない被検者の血清に対して関節液中で減少していないようなＲＡ
ＤＦを含む。これらのＲＡＤＦは見かけの分子量（ＭＷ）および等電点（ｐＩ）
によって下記のように記載されうる。 【００２７】 【表２】 【００２８】 第三グループは、ＲＡを持たない被検者の血清と比較してＲＡを持つ被検者の
血清において増加しているようなＲＡＤＦを含む。これらのＲＡＤＦは見かけの
分子量（ＭＷ）および等電点（ｐＩ）によって下記のように記載されうる。 【００２９】 【表３】 【００３０】 第四グループは、ＲＡを持たない被検者の血清と比較してＲＡを持つ被検者の
血清で減少しているようなＲＡＤＦを含む。これらのＲＡＤＦは見かけの分子量
（ＭＷ）および等電点（ｐＩ）によって下記のように記載されうる。 【００３１】 【表４】 【００３２】 第一および第二グループにおける任意の目的のＲＡＤＦに関して、ＲＡを持つ
被検者の血清中で測定されたシグナルに対して、ＲＡを持つ被検者の関節液中で
測定されたシグナルを比較して得られた比率は、用いた特別な分析方法および検
出技術に依存するだろう。従って本発明は、第一および第二グループ中のそれぞ
れのＲＡＤＦにおいて、実験室が、従来の診断技術としての分析方法および検出
技術に従って、ＲＡを含むおよび含まない被検者の血清に対する関節液中の各Ｒ
ＡＤＦの比率に関する参照範囲を確立することを実現しうる。好ましくは、ＲＡ
を持つことが知られている被検者の関節液および血清サンプルの少なくとも一つ
の対照対（control pair）、または、ＲＡを持つことがわかっていない被検者の
関節液および血清サンプルの少なくとも一つの対照対（およびより好ましくは，
このような対照対の少なくともいずれか一つ）は、分析されるテストサンプルの
それぞれのバッチとともに含まれる。 【００３３】 同様に、第三および第四グループの任意の目的とするＲＡＤＦにおいて、ＲＡ
を持たない被検者の血清中で測定されたシグナルに対して、ＲＡを持つ被検者の
血清中で測定されたシグナルを比較して得られた比率は、用いられた特別な分析
方法および検出技術に依存するだろう。従って、本発明は、それぞれの実験室が
従来の診断技術としての分析方法および検出技術に従って、ＲＡを含むおよび含
まない被検者の第三および第四グループ中の各ＲＡＤＦの比率に関する参照範囲
を確立することを実現しうる。好ましくは、ＲＡを持つことが知られている被検
者の少なくとも一つの陽性対照血清サンプル、または、ＲＡを持つことが知られ
ていない被検者の少なくとも一つの陰性対照血清サンプルは、分析されたテスト
サンプルのそれぞれのバッチとともに含まれる。 【００３４】 好ましい実施形態において、ＲＡＤＦと関連するシグナルは、同じ２Ｄゲルで
検出された一つまたはそれ以上のの発現参照特徴（ＥＲＦ）を参照して基準に合
わせられる。当業者にとって明白なように、このようなＥＲＦは好ましい技術 （Preferred Technology）を用いて異なるサンプルを比較することにより容易に
決定されうる。この目的に対して適切なＥＲＦは、これらに限定されないが、以
下の表に示されるものを含む。 【００３５】 【表５】 【００３６】 表IVは、実施例により、ＥＲＦ−１およびＥＲＦ−３に対して基準化された、
表Ｉおよび表IIで同定されたＲＡＤＦのレベルを示している。当業者であれば、
ＲＡＤＦのレベルは任意の望ましいＥＲＦに関して基準化されうることがわかる
であろう。表VIで示された値は、問題のＥＲＦに関する各ＲＡＤＦの比率であり
、ここで陽性の比率はＥＲＦに関するＲＡＤＦの増強されたレベルを示しており
、陰性の比率はＥＲＦに関するＲＡＤＦの減少されたレベルを示している。当業
者にとって明白なように、このＲＡＤＦ／ＥＲＦ比率はそれら自身の本来の状態
における診断パラメータとして与えられる。 【００３７】 【表６】 【００３８】 同様に、表VIIはＥＲＦ−１およびＥＲＦ−３に対して基準化された、表IIIお
よびIVで同定されたＲＡＤＦのレベルを示している。当業者であれば、ＲＡＤＦ
のレベルは任意の望ましいＥＲＦに関して発現され、このＲＡＤＦ／ＥＲＦ比率
はそれら自身の本来の状態における診断パラメータとして与えられることがわか
るであろう。 【００３９】 【表７】 【００４０】 熟練した当業者が認識しているように、目的の特徴またはタンパク質イソ型の
測定されたＭＷおよびｐＩは、２Ｄ電気泳動のそれぞれの段階、および、ランド
マークマッチングで用いられる方法の正確さに依存して、ある程度変化しうる。
ここで用いられているように、「ＭＷ」および「ｐＩ」という用語は、それぞれ
、以下のセクション６に記載の実験方法（「参照方法」）に正確にしたがって測
定された特徴またはタンパク質イソ型の見かけの分子量および等電点を意味する
と定義される。該参照方法が用いられ、サンプルは二連（duplicate）またはそ れ以上の反復で実験される場合、測定されたＲＡＤＦまたはＲＰＩのｐＩ平均の
変動は概して±１％以下であり、測定されたＲＡＤＦまたはＲＰＩのＭＷ平均の
変動は概して±５％以下である。熟練した当業者が参照方法から逸脱する場合、
（ａ）参照方法によって、および（ｂ）逸脱した方法によって検出されるＲＡＤ
Ｆまたはタンパク質イソ型それぞれに対するＭＷおよびｐＩを比較することで検
定実験を行うべきである。 【００４１】 ＲＡＤＦは検出、予後、診断もしくはＲＡのモニタリングまたは薬剤開発に有
用である。本発明の一つの実施形態において、被検者の関節液および血清は２Ｄ
電気泳動によって、ＲＡＤＦ−１〜ＲＡＤＦ−１２からなる群より選択される一
つまたはそれ以上のＲＡＤＦの定量的な検出に関して分析される。ここで、血漿
に対して関節液で増加したＲＡＤＦの発生量は、ＲＡの存在を示している。 【００４２】 本発明の他の実施形態において、被検者の関節液および血清は、２Ｄ電気泳動
によって、ＲＡＤＦ−１３〜ＲＡＤＦ−２２からなる群より選択される一つまた
はそれ以上のＲＡＤＦの定量的な検出に関して分析される。ここで血清に対する
関節液中の減少したＲＡＤＦの発生量はＲＡの存在を示している。 【００４３】 本発明の他の実施形態は、被検者の関節液は、２Ｄ電気泳動によって、ＲＡＤ
Ｆ−１〜ＲＡＤＦ−２２からなる群より選択される一つまたはそれ以上のＲＡＤ
Ｆの定量的な検出に関して分析される。ここで発現参照特徴（ＥＲＦ）に対する
一つまたはそれ以上のＲＡＤＦの比率は、ＲＡの存在を示しており、ＥＲＦ−１
およびＥＲＦ−３がこの目的においては好ましい。 【００４４】 本発明のさらに他の実施形態において、ＲＡを持つ被検者の血清は、２Ｄ電気
泳動によって、ＲＡＤＦ−１３、ＲＡＤＦ−１６およびＲＡＤＦ−２２〜ＲＡＤ
Ｆ−３１からなる群より選択される一つまたはそれ以上のＲＡＤＦの定量的な検
出に関して分析される。ここで被検者またはＲＡを持たない被検者の血清に関連
した被検者の血清中で増加したＲＡＤＦの発生量（例えば対照サンプルまたは前
もって決定された参照範囲）は、ＲＡの存在を示している。 【００４５】 本発明の他の実施形態において、被検者からの血清は、２Ｄ電気泳動によって
、ＲＡＤＦ−３２〜ＲＡＤＦ−４０からなる群より選択される一つまたはそれ以
上のＲＡＤＦの定量的な検出に関して分析される。ここで被検者またはらを持た
ない被検者の血清に関連した被検者の血清中で減少したＲＡＤＦの発生量（例え
ば対照サンプルまたは前もって決定された参照範囲）はＲＡの存在を示している
。 【００４６】 本発明の他の実施形態において、被検者からの関節液は、２Ｄ電気泳動によっ
て、ＲＡＤＦ−１３、ＲＡＤＦ−１６、ＲＡＤＦ−２２〜ＲＡＤＦ−４０からな
る群より選択される一つまたはそれ以上のＲＡＤＦの定量的な検出に関して分析
される。ここでＥＲＦに関連する一つまたはそれ以上のＲＡＤＦの比率はＲＡの
存在を示しており、ＥＲＦ−１およびＥＲＦ−３はこの目的に適したＥＲＦであ
る。 【００４７】 ５．２ リウマチ様関節炎診断 タンパク質イソ型（ＲＰＩ） 本発明の他の観点において、被検者からの血清は、ＲＡのスクリーニングもし
くは診断のために、ＲＡ患者の予後を決定するために、もしくは、ＲＡ治療の有
効性をモニターするために、または、薬剤開発のために、一つまたはそれ以上の
リウマチ様関節炎診断タンパク質イソ型（ＲＰＩ）の定量的な検出のために分析
される。ここで用いられているように、「リウマチ様関節炎診断タンパク質イソ
型」は、（１）ＲＡを持たない被検者の血清と比較してＲＡを持つ被検者の血清
において差別的に存在するタンパク質イソ型、および（２）（ａ）ＲＡを持つ被
検者の血清と比較してＲＡを持つ被検者の関節液中に差別的に存在する、および
（ｂ）ＲＡを持たない被検者の血清と比較して関節液中で差別的に存在する、タ
ンパク質イソ型を含む。当業界では周知のように、単一遺伝子のタンパク質生産
物は、異なる翻訳後改変の結果として異なる変異体として発現され（例えば、糖
付加、リン酸化、アシル化等）、そのために同一なアミノ酸配列のタンパク質で
もそれらのｐＩ、ＭＷまたはその両方において異なり、および／または、それら
のアミノ酸組成において異なる（例えばそれにかわるスプライシングまたは制限
タンパク質分解の結果としてである）。それは、タンパク質イソ型が差別的に存
在することは、問題のタンパク質をコードしている遺伝子が差別的に発現される
ことを必要としない、ということを裏付けている。 【００４８】 ＲＰＩの四つのグループは、ＲＡＤＦの部分的なアミノ酸配列によって、好ま
しい技術の方法および装置を用いて同定されている。第一グループは、ＲＡを持
つ被検者の血清に対して関節液中で増加しているが、ＲＡを持たない被検者の血
清に対して関節液中で増加していないようなＲＰＩを含む。これらのＲＰＩのＭ
Ｗ、ｐＩ，および部分的アミノ酸配列は、下記の表VIIIに示される。 【００４９】 【表８】 【００５０】 【表９】 【００５１】 【表１０】 【００５２】 第二グループは、ＲＡを持つ被検者の血清に対して関節液中で減少しているが
、ＲＡを持たない被検者の血清に対して関節液中で減少していないようなＲＰＩ
を含む。これらのＲＰＩのＭＷ、ｐＩおよび部分的アミノ酸配列は、以下の表IX
に示される。 【００５３】 【表１１】 【００５４】 【表１２】 【００５５】 【表１３】 【００５６】 【表１４】 【００５７】 第三グループは、ＲＡを持たない被検者の血清で比較したＲＡを持つ被検者の
血清中で増加しているようなＲＰＩを含む。これらのＲＰＩのＭＷ、ｐＩおよび
部分的アミノ酸配列は以下の表Ｘに示される。 【００５８】 【表１５】 【００５９】 【表１６】 【００６０】 【表１７】 【００６１】 第四グループは、ＲＡを持たない被検者の血清と比較したＲＡを持つ被検者の
血清中で減少しているようなＲＰＩを含む。これらのＲＰＩのＭＷ、ｐＩ、およ
び部分的アミノ酸配列は、以下の表XIに示される。 【００６２】 【表１８】 【００６３】 本発明の一つの実施形態において、被検者の関節液および血清は、ＲＰＩ−１
〜ＲＰＩ−１１からなる群より選択された一つまたはそれ以上のＲＰＩの定量的
な検出に関して分析され、ここで、血清に相対して関節液中で増加した一つまた
はそれ以上の上記ＲＰＩの発生量はＲＡの存在を示している。本発明の更なる実
施形態において、被検者の関節液および血清は、ＲＰＩ−１２〜ＲＰＩ−２４か
らなる群より選択される一つまたはそれ以上のＲＰＩの定量的な検出に関して分
析される。ここで血清に関連する関節液中で減少した一つまたはそれ以上の上記
ＲＰＩの発生量は、ＲＡの存在を示す。 【００６４】 本発明の他の実施形態において、被検者の血清は、ＲＰＩ−１２、ＲＰＩ−１ ６、ＲＰＩ−１７およびＲＰＩ−２４〜ＲＰＩ−３２からなる群より選択される
一つまたはそれ以上のＲＰＩの定量的な検出に関して分析される。ここで被検者
の血清中で増加した一つまたはそれ以上の上記ＲＰＩの発生量は、ＲＡの存在を
示している。本発明の他の実施形態において、被検者の血清は、ＲＰＩ−３３〜
ＲＰＩ−３８からなる群より選択される一つまたはそれ以上のＲＰＩの定量的な
検出に関して分析される。ここで、被検者の血清中で減少する一つまたはそれ以
上のＲＰＩ発生量は、ＲＡの存在を示している。 【００６５】 好ましくは、ＲＰＩの発生量は発現参照タンパク質（ＥＲＰＩ）に対し基準化
される。ＥＲＰＩは上述したＥＲＦの部分的アミノ酸配列によって好ましい技術
の方法の技術を用いて同定されたものである。これらのＥＲＰＩの部分的アミノ
酸配列および相同な既知のタンパク質は表XIｂに示される。 【００６６】 【表１９】 【００６７】 上述したように、ここで記載されたＲＰＩは、そのイソ型がＲＡに関連するこ
とがまだ知られていない既知のタンパク質、および、未知のタンパク質を含む。
さらに本発明は、それぞれのＲＰＩに関して、分離されたＲＰＩまたはそれらの
断片、および、前期ＲＰＩまたは前期断片に結合する抗体を含む。ここで用いら
れているように、「分離された」ＲＰＩは、２Ｄ電気泳動によって決定されたよ
うに、ＲＰＩのものと顕著に異なるｐＩまたはＭＷをもつタンパク質またはタン
パク質イソ型から遊離したＲＰＩである。ここで用いられているように、「顕著
に異なる」ｐＩまたはＭＷは、参照方法にしたがって実施される２Ｄ電気泳動上
で、混在するタンパク質イソ型をＲＰＩから分析することができるものである。 【００６８】 一つの実施形態において、分離されたタンパク質は、ＲＰＩに関する表VIII、
IX、ＸまたはXIで同定されたアミノ酸配列を持つペプチドを含む前期タンパク質
、ＲＰＩに関する表VIII、IX、ＸまたはXIで同定された値の１０％以内（好まし
くは５％以内、さらに好ましくは１％以内）のｐＩおよびＭＷを持つ前期タンパ
ク質を含む。 【００６９】 本発明のＲＰＩは、当業界で周知の方法によって分析される。一つの実施形態
において、ＲＰＩは、それらのＭＷおよびｐＩによって２Ｄゲル上で分離されて
おり、ゲル染色によって可視化される。 【００７０】 あるいは、ＲＰＩは、ＲＡの検出、予後、診断もしくはモニタリングのために
、または、薬剤開発のために例えばイムノアッセイのような分析によって検出さ
れうる。一つの実施形態において、イムノアッセイは、テストされる被検者から
得られたサンプルを、免疫特異的な結合が起こりうる条件下で、抗ＲＰＩ抗体と
接触させ、抗体に結合している任意の免疫特異的結合の量を検出または測定する
ことによって実行される。好ましくは、該抗ＲＰＩ抗体は、同じタンパク質の他
のイソ型ではなくむしろ優先的にＲＰＩと結合する。好ましい実施形態において
、該抗ＲＰＩ抗体は、前期同じタンパク質の他のイソ型に比べて、少なくとも２
倍大きい親和性、より好ましくは少なくとも５倍大きい親和性、さらにより好ま
しくは１０倍大きい親和性でＲＰＩと結合する。 【００７１】 他の実施形態において、イムノアッセイは、免疫特異的結合が起こりうる条件
下で、例えばテストされる被検者から得られたサンプルを、抗ＲＰＩ抗体の複数
と接触させ、同時に、複数の抗体による複数のＲＰＩへの任意の免疫特異的結合
の量を検出または測定することによって行われる。好ましくは、それぞれの抗Ｒ
ＰＩ抗体は異なるＲＰＩに結合し、かつ任意に固体の支持体（solid support） に固定される。例えば、抗体は二次元アレイ中に固定され、ここでそれぞれの配
列の位置は、単一のＲＰＩに特異的に結合している抗体によって占有されており
、その配列は一つまたはそれ以上のＲＰＩに対して特異的な抗体を有している。
好ましくは、それぞれの抗ＲＰＩ抗体は、同じタンパク質の他のイソ型よりむし
ろ、ＲＰＩに優先的に結合する。好ましい実施形態において、該抗ＲＰＩ抗体は
、前期同じタンパク質の他のイソ型に比べて、少なくとも２倍大きい親和性、よ
り好ましくは少なくとも５倍大きい親和性、さらにより好ましくは少なくとも１
０倍大きい親和性ででＲＰＩと結合する。 【００７２】 一つの実施形態において、組織部位における抗体の結合は、異所的なＲＰＩ局
在またはＲＰＩの異所的な（例えば高い、低い、存在しない）レベルを検出する
のに用いられうる。特殊な実施形態において、ＲＰＩに対する抗体は、ＲＰＩの
存在に関して、患者の組織または血清サンプルを分析することに用いることがで
き、ここで異所的なレベルのＲＰＩはＲＡを示している。ここで用いられている
ように、「異所的なレベル」とは、その存在に関連して、または、体の一部また
はＲＡを持たない被検者の類似サンプルにおいてその存在をあらわす標準的なレ
ベル二関連して、増加または減少しているレベルを意味する。 【００７３】 使用されうるイムノアッセイは、これらに限定されないが、例えばウェスタン
ブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent
assay；酵素様免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降法、 ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集法、補体結合法、プロティンＡイムノアッ
セイ等の技術を用いた、競合的および非競合的な分析システム分析を含む。 【００７４】 必要に応じて、ＲＰＩは二段階のサンドイッチ分析を用いて検出される。ＲＰ
Ｉがタンパク質の特殊なグリコフォーム（glycoform）を意味する場合、第一段 階において、抗ＲＰＩ抗体（これは必要に応じて固相上に固定されうる）はＲＰ
Ｉを補足するために使用されうる。第二段階において、直接または間接的に標識
したレクチンが、補足されたＲＰＩを検出するのに用いられる。（ａ）ＲＰＩと
同じ核タンパク質を持つ他のグリコフォームまたは（ｂ）抗体によって認識され
た抗原決定基を共有している他のイソ型よりも、ＲＰＩに優先的に結合するよう
な任意のレクチンがこの目的のために使用される。好ましい実施形態において、
選択されたレクチンは、前期ＲＰＩと同じ核タンパク質を持つ他のイソ型に比べ
て、少なくとも２倍の大きさの親和性、より好ましくは５倍の大きさの親和性、
さらにより好ましくは１０倍の大きさの親和性でＲＰＩに結合する。目的のＲＰ
Ｉを検出するのに適したレクチンは、当業界で周知の方法で容易に同定でき、例
えば、Sumar等, Lectins as Indicators of Disease-Associated Glycoforms, I
n: Gabius H-JおよびGabius S (eds.), 1993, Lectins and Glycobiology, 第15
8〜174頁（ここに参照することによってその全体を引用させる）の、第158〜159
頁に記載の表１で列挙されている一つまたはそれ以上のレクチンを試験すること
である。 【００７５】 必要に応じて、ＲＰＩをコード化した遺伝子、関連した遺伝子ならびに関連し
た核酸配列およびサブ配列（subsequences）は、相補的配列も含み、ハイブリダ
イゼーション分析にも用いられうる。少なくとも約８ヌクレオチドを含むＲＰＩ
をコード化したヌクレオチドもしくはそれらのサブ配列、または、前述の相補物
は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用されうる。ハイブリダイゼーシ
ョン分析は、特にＲＡもしくは治療後のＲＡの再発におけるＲＰＩ遺伝子発現の
異常な変化に関して、検出、予後、診断、または、症状、障害もしくは病気の状
態のモニタリングに使用されうる。特に、このようなハイブリダイゼーション分
析は、ＲＰＩをコードしているＤＮＡまたはＲＮＡと、ハイブリダイゼーション
できる核酸プローブを持つ核酸を含むサンプルを、ハイブリダイゼーションしう
る条件下で接触させ、結果生じた任意のハイブリッドを検出または測定すること
を含む方法によって行われる。 【００７６】 本発明はまた、診断キットを提供するものであり、このキットは一つまたはそ
れ以上の抗ＲＰＩ抗体のコンテナを含む。加えて、このようなキットは任意の一
つまたはそれ以上の（１）診断、予後、治療、モニタリング、薬剤開発、または
任意のこれら用途の組み合わせに関する説明書、（２）医薬もしくは生物的製剤
の製造、使用または販売を制御する政府機関（governmental agency）によって 処方された形態において、ヒトへの投与のための製造、使用または販売機関によ
る認可を反映することを通知する通知書、（３）標識された、抗体へ結合するパ
ートナー、および（４）抗ＲＰＩ抗体が固定されている固相（solid phase）（ 例えば試薬片（reagent strip））を任意に含む。標識された、抗体に結合する パートナーがない場合は、抗ＲＰＩ抗体それ自身を、例えば化学発光、酵素、蛍
光、検出または放射活性成分等のマーカーで標識することができる。 【００７７】 本発明はまた、一つまたはそれ以上のコンテナ中に、種類の異なるＲＰＩをコ
ード化したＲＮＡにハイブリダイゼーションできる核酸プローブを含むキットを
提供する。特殊な実施形態において、キットは、一つまたはそれ以上のコンテナ
中にプライマー対を含み（例えば、それぞれ６〜３０ヌクレオチドの範囲のサイ
ズであり、より好ましくは１０〜２０である）、これらは、例えば、ＲＰＩをコ
ード化した核酸の少なくとも一部分に対して、適切な反応条件下でポリメラーゼ
チェーンリアクション（例えばInnis等, 1990, PCR Protocols, Academic Press
, Inc., San Diego, CAを参照）、Ｑ（登録商標）レプリカーゼを用いたリガー ゼチェーンリアクション（欧州特許第３２０，３０８号参照）、サイクリックプ
ローブリアクションまたは当業界で周知の方法を用いて、増幅反応を仕込むこと
ができる。 【００７８】 キットはまた、ＲＰＩの複数またはＲＰＩをそれぞれコードする複数の核酸を
検出することも可能である。キットはさらに、例えば標準または対照として使用
するために、分離したＲＰＩタンパク質またはＲＰＩをコード化した核酸の、予
め決められた量を必要に応じて含みうる。 【００７９】 ５．３ 臨床研究における使用 本発明の診断方法および組成物は、例えばＲＡの治療のための薬剤をテストす
るために、臨床研究のモニターを支援することができる。ひとつの実施形態にお
いて、ＲＡを罹患している患者におけるＲＡＤＦまたはＲＰＩのレベルを、ＲＡ
を罹患していない被検者で見出されたレベルに復活させる、または、治療された
患者において、ＲＡＤＦもしくはＲＰＩレベルを非ＲＡもしくは血清の値、もし
くはその付近に維持する能力に関して、候補分子をテストする。一つまたはそれ
以上のＲＡＤＦまたはＲＰＩのレベルが分析される。 【００８０】 他の実施形態において、本発明の方法および組成物は、臨床研究のための候補
をスクリーニングする場合に、ＲＡを持つそれぞれの個体を同定するために使用
され、次にこのような個体は研究を続行もしくは遮断され、または、治療もしく
は分析のために別々の集団におかれうる。 【００８１】 ５．４ ＲＰＩの精製 特別な観点において、本発明は、これらは抗原決定基（すなわち抗体によって
認識されうるもの）を含む、または、機能的に活性な、分離されたＲＰＩ、好ま
しくはヒトＲＰＩならびにその断片ならびに誘導体、および、前述のものをコー
ドする核酸配列を提供する。ここで用いられる「機能的に活性な」ＲＰＩとは、
全長（野生型）ＲＰＩと関連する、例えばＲＰＩ基質またはＲＰＩ結合パートナ
ーへの結合、抗原性（抗ターゲット抗体への結合）、免疫原性等の一つまたはそ
れ以上の既知の機能活性を表示する物質のことを言う。 【００８２】 特殊な実施形態において、本発明は、少なくとも６個のアミノ酸、１０個のア
ミノ酸、５０個のアミノ酸、または、少なくとも７５個のアミノ酸の断片を提供
する。ＲＰＩのいくつかまたはすべての領域が欠損している断片からなる断片ま
たはタンパク質もまた提供される。前述のものをコード化した核酸が提供される
。 【００８３】 ＲＰＩ遺伝子配列を含む組換え核酸が同定されると、その遺伝子生産物を分析
することができる。これは、その生産物の物理的または機能的特性を基礎として
分析することによって達成され、ゲル電気泳動、イムノアッセイ等による生産物
の放射活性標識を含む。 【００８４】 ＲＰＩが同定されると、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニテ
ィーおよびサイズ分画カラムクロマトグラフィー（sizing column chromatograp
hy））、遠心分離、異なる溶解度による方法（differential solubility）、ま たは、タンパク質を精製する他の任意の標準的な技術を含む標準的な方法によっ
て分離精製される。 【００８５】 あるいは、一度組換え核酸によって生産されたＲＰＩが同定されると、ＲＰＩ
の全体のアミノ酸配列を、組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列
から類推することができる。結果として、そのタンパク質は、当業界で周知の標
準的な化学的方法（例えば、Hunkapille等, M., 1984, Nature 310:105-111参照
）によって合成されうる。 【００８６】 他の代替の実施形態において、野生型ＲＰＩは、上述したような標準的な方法
によって天然のソースから精製することができる（例えば、免疫親和性精製（im
munoaffinity purification））。 【００８７】 好ましい実施形態において、ＲＰＩは、米国特許出願番号第０８／９８０，５
７４号（ここに参照させることによって引用させる）において説明されている好
ましい方法によって分離される。調整用スケールの実施（preparative-scale ru
ns）に関して、WestermeierのElectrophoresis in Practice (pp. 197-209, 199
3、VCH, Weinheim, Germany)（ここに参照させることによってその全体を参照さ
せる）において説明されている方法に従って、２ｐＨまたはそれ以下の範囲のｐ
Ｈを持つ、狭い範囲の「ズームゲル」が、等電点段階において好ましい。この改
変により、大量のターゲットタンパク質をゲルにローディングさせることが可能
になり、それによって当該ゲルから見出されうる分離ＲＰＩの量が増えた。調整
用スケールの実施においてこの方法を用いる場合、該好ましい技術は、分離され
たＲＰＩを、１回の実施で一般的に１００ｎｇまで供給し、また１０００ｎｇま
でも供給可能である。当業界の技術において、ゲル等電点電気泳動を用いる任意
の分離方法において、ズームゲルが用いられることが認められるであろう。 【００８８】 本発明の特殊な実施形態において、このようなＲＰＩは、組換えＤＮＡ技術ま
たは化学合成方法または天然タンパク質の精製によって生産された場合、これら
に限定されないが、ＲＰＩのアミノ酸配列の全部または一部を含むもの、同様に
それらの断片、他の誘導体および類似体を含み、それらに対するタンパク質相同
体も含む。 【００８９】 ５．５ ＲＰＩに対する抗体の生産 本発明に従って、ＲＰＩ、その断片または他の誘導体、もしくは、それらの類
似体は、免疫抗原として使用され、このような免疫抗原に免疫特異的に結合する
抗体を生産する。このようなタンパク質、断片、誘導体または類似体は、この出
願で上述したセクションにおいて記載された方法を含む任意の従来法によって分
離することができる。生産された抗体は、これらに限定されないが、ポリクロー
ナル、モノクローナル、キメラ、単鎖（single chain）、Ｆａｂ断片、および、
Ｆａｂ発現ライブラリを含む。特殊な実施形態において、ヒトＲＰＩに対する抗
体が生産される。他の実施形態において、ＲＰＩのドメインに対する抗体が生産
される。特殊な実施形態において、ＲＰＩの親水性断片が抗体生産のための免疫
抗原として使用される。 【００９０】 １．１ 当業界で周知の多様な方法が、ＲＰＩまたは誘導体または類似体に対するポリ
クローナル抗体の生産に用いられうる。特殊な実施形態において、ＲＰＩのエピ
トープに対するウサギポリクローナル抗体、または、それらのサブ配列が得られ
る。抗体の生産に関して、天然ＲＰＩまたはそれらの合成物もしくは誘導体（例
えば断片）を注射することによって、多様な宿主動物が免疫化され、これらに限
定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ウマ、ヤギ等である。多様なアジュバ
ント（adjuvant）が免疫的反応を高めるために使用され、これは宿主種により、
これらに限定されないが、完全または不完全のフロイントのアジュバント、例え
ば水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、例えばリゾレクチン、プルロニックポ
リオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペッ
トヘモシアニン、ジニトロフェノール等の表面活性化物質、ならびに例えばＢＣ
Ｇ（カルメット−ゲラン杆菌）等の潜在的に有効なヒトアジュバント、ならびに
コリネバクテリウム−パルバムを含む。 【００９１】 ＲＰＩ配列またはそれらの類似体に対するモノクローナル抗体の調整に関して
、培養における連続した細胞株による抗体分子生産に必要な任意の技術が用いら
れ得る。例えば、Kohlerおよび Milstein (1975, Nature 256:495-497)によって
最初に開発されたハイブリドーマ技術、および、トリオーマ（trioma）技術、ヒ
トＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor 等., 1983, Immunology Today 4:72）、 および、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術
(Cole等, 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss
, Inc., pp. 77-96)等である（それぞれの外国の参考文献を、ここにそれぞれを
参照させることによって引用させる）。本発明の追加の実施形態において、モノ
クローナル抗体は、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５（ここに参照させることによ
って引用させる）で説明したように、無菌動物中で生産され得る。 【００９２】 ５．３ 臨床研究における使用 本発明の診断方法および組成物は、臨床研究、例えばＲＡ治療のための薬剤の
テスト、をモニターする際に補助することができる。ある実施形態においては、
候補分子は、ＲＡに冒されている患者におけるＲＡＤＦまたはＲＰＩレベルを、
ＲＡに冒されていない被験者において確認されるレベル、または、非ＲＡまたは
血清におけるＲＡＤＦまたはＲＦＩのレベルかそれに近しい値に維持されるよう
に治療が施された患者において確認されるレベルにまで回復させる能力が試験さ
れる。１もしくはそれ以上のＲＡＤＦまたはＲＰＩのレベルを分析してもよい。
他の実施形態においては、本発明の方法および組成物は、臨床研究のために候補
をスクリーニングする時に、ＲＡを有する個体を同定するために用いられる。こ
のような個体は、その後研究に含んでもよく、除外してもよく、または、治療も
しくは分析のために別のコホートに配置されてもよい。 【００９３】 ５．４ ＲＰＩの精製 特殊な観点においては、本発明は抗原性の決定因子（すなわち、抗体によって
認識されうる）からなる、または前記のものをコード化すると同時に機能的に活
性な、分離されたＲＰＩ、好ましくは、ヒトのＲＰＩおよび断片ならびにその誘
導体を提供する。ここで用いられる機能的に活性なＲＰＩとは、フルレング（野
生型）ＲＰＩに付随した、１または２以上の公知の機能的な活性を示す物質をい
い、例えば、ＲＰＩ基質もしくはＲＰＩ結合パートナーへの結合、（アンチター
ゲット抗体に結合した）抗原性、または免疫抗原性などがある。 【００９４】 特殊な実施形態においては、本発明は、少なくとも６アミノ酸、１０アミノ酸
、５０アミノ酸、または少なくとも７５アミノ酸からなるＲＰＩの断片を提供す
る。ＲＰＩの領域が部分的にまたはすべてが欠如している断片または断片を含ん
でなるタンパク質も提供される。前記のものをコード化する核酸が提供される。
ＲＰＩ遺伝子配列を発現する組換え核酸が同定されると、その遺伝子生成物は分
析されうる。これは生成物の物理的なまたは機能的な特性に基づく分析によって
成され、ゲル電気泳動、イムノアッセイなどによる分析を伴う生成物の放射性標
識が含まれる。ＲＰＩが同定されると、クロマトグラフィー（例えば、イオン交
換、アフィニティー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心沈殿
法、異なる溶解度による方法（differential solubility）、またはタンパク質 の精製に用いられる通常の他のすべての技術を含む一般的な方法により分離され
、精製されうる。その他に、組換え核酸によって生成されたＲＰＩが同定された
とき、組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列からＲＰＩのアミノ
酸配列全体を推測することができる。結果として、タンパク質は技術的に公知の
一般的な化学的方法によって合成されうる（例えば、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅら，
Ｍ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３１０１０５−１１１参照）。他のかわりの実施
形態においては、上記記載の一般的な方法（例えば、イムノアフィニティー精製
）によって天然型ＲＰＩが天然のソースから精製されうる。好ましい実施形態に
おいては、参照としてここに組み込まれる米国出願第０８／９８０，５７４号に
記載の「好ましい技術」によってＲＰＩは分離される。調整段階での実施のため
には、Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，１９９３，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ｐｐ
．１９７−２０９（全体が参照としてここに組み込まれる）に記載の方法にした
がって、等電点電気泳動段階において２ｐＨ単位またはそれ以下のｐＨ範囲を有
する狭い範囲のズームゲルを使用することが好ましい。この変はより大量のター
ゲットタンパク質がゲル上にローディングされることを可能にし、それによって
ゲルから取り出される分離ＲＰＩの量も増加する。調整段階での実施のためにこ
の方法が用いられたときは、「好ましい技術」は、一回の実施で一般的には１０
０ｎｇにまで及ぶ分離ＲＰＩを提供し、１０００ｎｇにまで及ぶ量を提供しうる
。当該技術に精通したものであれば、ズームゲルは、ゲル等電収束法を用いたい
かなる分離戦略においても使用されうるものであることを認識するであろう。本
発明の特殊な実施形態においては、そのうようなＲＰＩは、組換えＤＮＡ技術に
よって製造されたものであれ、化学的な合成方法によるものであれ、天然タンパ
ク質の精製によるものであれ、断片および他の誘導体ならびにそれらの類似体に
加えて、ＲＰＩのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含んでなるものからなる（
しかし、これに限られるものではない）。また、ホモローグなタンパク質を含む
。 【００９５】５．５ ＲＰＩに対する抗体の製造 本発明にしたがって、ＲＰＩ、その断片、および他の誘導体、並びにそれらの
類似体が、免疫特異的にイムノゲンに結合する抗体を生成するイムノゲンとして
使用されうる。そのようなタンパク質、断片、誘導体、および類似体は、いかな
る慣用の方法によって分離してもよく、本願の以前のセクションに記載された方
法を含む。生成される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一重
鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーを含むがこれらに限られるもの
ではない。特殊な実施形態においては、ヒトＲＰＩに対する抗体が製造される。
他の実施形態においては、ＲＰＩのドメインに対する抗体が製造されうる。特殊
な実施形態においては、抗体製造のためのイムノゲンとしてＲＰＩの親水性断片
が使用される。 【００９６】 １．１ ＲＰＩもしくは誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体の製造のため
に、技術的に公知の種々の手法が使用されうる。特殊な実施形態においては、Ｒ
ＰＩのエピトープに対するウサギポリクローナル抗体またはその配列が得られる
。抗体の製造のために、天然のＲＰＩもしくは合成型またはその誘導体（例えば
、断片）の注入によってさまざまなホスト動物、ウサギ、マウス、ラット、ウマ
、ヤギ、などが含まれるがこれらに限られるものではない、が免疫される。種々
のアジュバントが免疫学的反応を増加させるために使用されうる。それらはホス
ト種に依存し、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、
水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンなどの表面活性化物質、
プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールカサ
ガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａ
ｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム パルバムのような潜
在的に有用なヒトアジュバントが含まれるがこれらに限定されるものではない。
ＲＰＩ配列およびその類似体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養
中の連続した細胞株による抗体分子の製造のためのいかなる技術を用いてもよい
。例えば、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，
１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ４７２）、およびヒトモノクロー
ナル抗体を製造するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，
ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）に加
えて、元来ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ２５ ６ ４９５−４９７）によって開発されたハイブリドーマ技術がある。（前記文献
はそれぞれ参照としてここに組み込まれる） 本発明の付加的な実施形態においては、ここに参照として組み込まれるＰＣＴ
／ＵＳ９０／０２５４５に記載されるように、無菌動物中にてモノクローナル抗
体は製造されうる。本発明にしたがってヒト抗体は使用され、また、ヒトハイブ
リドーマを用いて（Ｃｏｔｅら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８０２０２６−２０３０）、またはヒトＢ細胞をインビトロにおい
てＥＢＶウイルスで形質転換することによって（Ｃｏｌｅら，１９８５，ｉｎ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐｐ．７７−９６）、得ることができる。
実際、本発明次第では、好ましい生物学的に活性なヒト抗体分子から得た遺伝子
に付随するＲＰＩに特異的なマウス抗体分子から得た遺伝子のスプライシングに
よるキメラ抗体の製造のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１６８５１−６８５５；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３１２６０４−６０８；Ｔａｋｅ
ｄａら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４４５２−４５４）を用いることができる
。このような抗体は、本発明の範囲に属するものである。（前記文献はそれぞれ
参照としてここに組み込まれる） 本発明次第では、一重鎖抗体の製造のための技術(参照としてここに組み込ま れる米国特許第４，９４６，７７８号）が、ＲＰＩ特異的な一重鎖抗体を製造す
るために用いられうる。本発明の付加的な実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリー
の構築のために記載された技術（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６ １２７５−１２８１）を利用し、迅速かつ容易なＲＰＩ、誘導体、または類似体
に望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の同定を可能にする。分子
のイディオタイプを含む抗体断片は公知の技術によって生成されうる。例えば、
そのような断片としては、抗体分子のペプシン処理によって製造されうるＦ（ａ
ｂ´）2断片、Ｆ（ａｂ´）2断片のジスルフィド架橋を還元することによって 製造されるＦａｂ’断片、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによ
って製造されるＦａｂ断片、Ｆｖ断片、が含まれるがこられに限られるものでは
ない。抗体の製造に際しては、所望の抗体のためのスクリーニングは、例えば、
ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓ
ｓａｙ）などの公知技術によって遂行される。例えば、ＲＰＩの特定のドメイン
を認識する抗体を選択するためには、そのようなドメインを含むＲＰＩ断片に結
合する生成物のために、製造されたハイブリドーマを分析することができる。第
一ＰＲＩホモローグに特異的に結合するが、異なるＲＰＩホモローグには特異的
に結合しない抗体の選択のためには、第一ＲＰＩホモローグへの能動的な結合お
よび第二ＲＰＩホモローグへの結合の欠如に基づいて選択することができる。同
様に、ＲＰＩに特異的に結合するが、同一のタンパク質（例えば、ＲＰＩと同一
のコアペプチドを有する、異なるグリコフォーム）の異なるイソ型には特異的に
結合しない抗体の選択は、ＲＰＩへの能動的な結合および異なるイソ型（例えば
、グリコフォーム）への結合の欠如に基づいて選択することができる。ＲＰＩの
ドメインに特異的な抗体も提供される。前記抗体は、本発明のＲＰＩの位置およ
び活性に関する技術的に公知の方法、例えば、これらのタンパク質のイメージ化
、好適な生理学的なサンプルにおけるそれらのレベルの測定、診断方法などにお
いて用いられる。 【００９７】 加えて、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに、適切な抗
原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによってなさ
れる「キメラ抗体」の製造に関して開発された技術 (Morrison等,1984,Proc.Nat
l.Acad.Sci.,81,6851-6855；Neuberger等,1984,Nature 312,604-608；Takeda等,
1985, Nature,314,452-454)が、使用されうる。キメラ抗体は分子であり、それ において例えばマウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンコンスタント領域から誘
導された可変領域を持つもの等の異なるタンパク質が、異なる動物種から誘導さ
れる（例えばCabilly等,米国特許第4,816,567号；およびBoss等の米国特許第4,8
16397号をここに参照させることによって引用する）。 【００９８】 加えて、ヒト化された交代の製造に関して技術が開発されている（例えばQuee
nの米国特許第5,585,089号およびWinterの米国特許第5,225,539号をここに参照 させることによって引用する）。免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変領域は、
三つの超可変領域によって断続される「フレームワーク」領域からなり、相補決
定領域（complementarity determining region（ＣＤＲ））として言及される。
フレームワーク領域およびＣＤＲの伸張は、正確に定義されている（"Sequences
of Proteins of Immunological Interest", Kabat E.等, U.S.Department of H
ealth and Human Services(1983）を参照）。手短に言うと，ヒト化された抗体 は、非ヒト種からの一つまたはそれ以上のＣＤＲおよびヒト免疫グロブリン分子
からのフレームワーク領域を持つ、非ヒト種からの抗体分子である。 【００９９】 あるいは、単鎖の抗体の製造に関して説明された技術（米国特許第4,946,778 号；Bird,1988,Science 242, 423-426；Huston等, 1988, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 85,5879-5883；およびWard等 1989, Nature 334, 544-546を参照）が使 用されうる。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖と軽鎖とをアミノ酸架橋によって結合
させ、単鎖ポリペプチドを得るることによって形成される。 【０１００】 特異的なエピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって製造され得る
。例えば，このような断片は、これらに限定されないが，抗体分子のペプシン消
化によって生産され得るＦ（ａｂ’）２断片、および、Ｆ（ａｂ’）２断片のジ
スルフィド架橋を還元ことによって生じるＦａｂ断片である。 【０１０１】 あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリが構築され（Huse等,1989, Science, 246, 1
275-1281）、望ましい特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片の迅速で簡便な同
定が可能である。 【０１０２】 抗体の標識およびそれらの使用 一つまたはそれ以上のＲＰＩエピトープまたはＲＰＩの保存された可変もしく
はペプチド断片を特異的に認識することのできる検出可能な標識分子に関する方
法がここで説明される。ここで用いられる標識分子および検出方法は、例えば、
HarlowおよびLane（Harlow,E.およびLane,D., 1988, "Antibodies: A Laborator
y Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York）において説明されているものであり、これをその全体を参照させることに
よってここに引用される。 【０１０３】 ＲＰＩ特異的抗体またはペプチド類似体（ｍｉｍｅｔｉｃ）が標識され得る一
つの方法は、これを酵素に結合させることによってなされ、例えばＥＬＩＳＡ（
酵素様免疫吸着法）のような酵素イムノアッセイにおいて使用されうる。抗体に
結合した酵素は適切な基質と反応し、例えば蛍光分光分析法、蛍光定量法または
ウイルスを用いた方法によって検出され得るキメラ部位を生産するこのような方
法において、好ましくは色素を生産する基質（chromogenic substrate）である 。抗体、それらの誘導体および類似体ならびにペプチドを検出可能に標識するた
めに用いられる酵素は、これらに限定されないが、リンゴ酸脱水素酵素、スタフ
ィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、イーストア
ルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロホスフェート、脱水素酵素、トリオー
スフォスフェートイソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラ
クトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−
ホスフェート−脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラー
ゼである。検出は、該酵素に対する比色基質を用いた比色法によって行われ得る
。検出はまた、同様に調整されたスタンダードと比較した気質の酵素反応の程度
を可視的に比較することによっても行われる。 【０１０４】 検出方法における使用のために、分子は放射線同位体で標識することが好まし
く、１２５Ｉ、１３１Ｉ、または９０ｍＴｃが含まれるがこれらに限定されるも
のではない。このようなペプチドおよび抗体は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ
）またはラジオプローブを用いてインビボ分析において検出することができる。
放射性活性な同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの
使用のような方法やオートラジオグラフィーによって検出することができる。抗
体、その誘導体、類似体、およびペプチドを蛍光物質で標識することが可能であ
る。蛍光的に標識されたペプチドは好適な波長の光にさらされ、蛍光によってそ
の存在を確認することができる。最も一般的に使用される蛍光標識が付された化
合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、
フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデハイド（ｏ−ｐｈｔｈａｌ
ｄｅｈｙｄｅ）、およびフルオレセスアミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）で
ある。 【０１０５】 抗体、その誘導体および類似体ならびにペプチドを、ビオチンで標識すること
も可能である。ビオチンで標識されたペプチドは、アビジンに共有結合した蛍光
標識のようなアビジンと結合した検出可能なマーカーにさらされうる。 【０１０６】 抗体、その誘導体および類似体、並びにペプチドは、１５２Ｅｕや他のランタ
ニド種のような蛍光発光金属を用いて検出可能なように標識が付されうる。これ
らの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン
テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート群を用いて、抗体、その類似体、
およびペプチドに結合させうる。 【０１０７】 抗体、その誘導体および類似体、並びにペプチドは、化学発光化合物にカップ
リングすることによって検出可能なように標識することもできる。その後、化学
発光で標識された化合物の存在は、化学反応の過程中に生じる蛍光の存在を検出
することによって確認される。特に有用な化学発光標識化合物の例としては、ル
ミノール、イソルミノール、サロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒ
ｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジ
ニウム塩、およびシュウ酸エステルが挙げられる。 【０１０８】 同様に、本発明の抗体、その誘導体および類似体、並びにペプチドに標識する
ために生物発光化合物を用いることもできる。生物発光は、生物学的システム中
に見出される化学発光の一種であり、触媒作用をするタンパクにより化学発光反
応の効率が増加する。生物発光タンパクの存在は、蛍光の存在を検出することに
より確認される。標識の目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、
ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。 【０１０９】 多様な生物学的サンプルにおけるＲＰＩの存在を検出するために、ＲＰＩに特
異的に結合するようにされた標識された抗体を用いることができ、生物学的サン
プルとしては、体液（例えば、血漿、尿、髄液、関節吸引液）、組織サンプル、
またはそのホモジネートが含まれる。そのような標識された抗体は、個体細胞内
または個体細胞上のＲＰＩの位置を可視化するために用いることもできる。 【０１１０】 ＲＰＩに特異的に結合するようにされた、標識された抗体を、ＲＰＩの存在を
検出するための診断上の有効量、患者に投与することができる。診断上の有効量
とは、技術的に一般的に入手可能な方法を用いて細胞を検出できるように、その
表面にＲＰＩを含んでなる細胞を診断のターゲットとするのに十分な分子の量を
いう。 【０１１１】 ５．６ ＲＰＩをコード化するＤＮＡの分離 ＲＰＩ遺伝子のクローニングのための特殊な実施形態を以下に例を用いて述べ
るが、これに限定されるものではない。ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、ＲＰＩもし
くは断片またはその類似体をコード化する配列からなる本発明のヌクレオチド配
列は、慣用的な化学的アプローチまたは重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ
チェーンリアクション（ＰＣＲ）増幅などの技術的に公知の方法を用いて合成さ
れうる。配列はいかなる種のＲＰＩ遺伝子の同定およびクローニングも提供し、
例えば、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノミックライブラリー、または発現ライブラ
リーのスクリーニングが挙げられる。本発明のＲＰＩをコード化する配列からな
るヌクレオチド配列は、他のタンパク遺伝子の相補的な伸長と選択的に二重鎖分
子を形成する能力において有用である。応用形態によるが、さまざまな配列同定
を遂行するために種々のハイブリダイゼーション条件が採用されうる。選択性の
度合いを高めるためには、塩が少なく温度が高い条件などの比較的緊縮した条件
が二重鎖を形成するために使用される。ここで使用されている「高度に緊縮した
条件」とは、６５℃の０．５Ｍ ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中において濾過器に結合されたＤＮＡへハイブリダ
イゼーションし、６８℃の０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄することを意
味する（全体が参照としてここに組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら，ｅ
ｄｓ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．，ニューヨーク，ｐ．２．１０．３）。いくつかの応用にあたっては、緊
縮度合いがより少ないハイブリダイゼーション条件が必要とされる。ここで用い
られる「適度に緊縮した条件」とは、４２℃の０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
で洗浄することを意味する（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９，上記文献）。ハイブ
リダイゼーション条件は、ハイブリッド二重鎖を不安定化させるために、ホルム
アミドの量を増加することによってより緊縮したものとすることもできる。この
ように、特定のハイブリダイゼーション条件は容易に操作されるものであり、一
般的には所望する結果に応じて選択される。例えば、５０％のホルムアミド存在
下における慣用的なハイブリダイゼーション温度は、ＲＰＩ遺伝子断片に対して
９５〜１００％ホモローグであるプローブに対しては４２℃であり、９０〜９５
％ホモローグの時は３７℃、７０〜９０％ホモローグの時は３２℃である。ゲノ
ミックライブラリーの調製にあたっては、その一部がＲＰＩの一部または全体を
コード化するＤＮＡ断片が製造される。ＤＮＡは種々の制限酵素を用いて特定の
サイトで開裂することもできる。かわりに、ＤＮＡを断片化するためにマンガン
存在下においてＤＮアーゼを用いることもでき、または、例えば、超音波処理に
よってＤＮＡを物理的にせん断することもできる。ＤＮＡ断片は、その後、一般
的な技術によって大きさに従って分離される。方法としては、アガロースおよび
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、並びにショ糖勾
配遠心法が含まれるがこれらに限定されるものではない。ＤＡＮ断片はその後好
適なベクター、プラスミド、コスミド、バクテリアファージラムダもしくはＴ４
、およびイースト人工クロモソーム（ＹＡＣ）が含まれるが限定されるものでは
ない、に挿入される。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅ
ｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク；Ｇｌｏｖｅｒ，
Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．），１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，イギ
リス国 Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら，ｅｄｓ．，１９８９
，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨ
ーク参照）。ゲノミックライブラリーは、標識されたプローブへの核酸ハイブリ
ダイゼーションによってスクリーニングすることもできる（Ｂｅｎｔｏｎ ａｎ
ｄ Ｄａｖｉｓ，１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９６１８０；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ
ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ，１９７５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ７２３９６１）。ゲノミックライブラリーは、技術的に公知の最適なア
プローチを用いて、ＲＰＩのいかなるペプチドのアミノ酸配列も対応する標識さ
れた改変オリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングすることもできる。
用いられるプローブは、１０ヌクレオチドまたはそれ以上であることが好ましく
、１５ヌクレオチドまたはそれ以上であることがより好ましい。上記表８〜１１
に示されるように、ここで開示されるいくつかのＲＰＩは、その配列が公知であ
る遺伝子によってコード化された、以前に同定されたタンパクに対応するもので
ある。そのような遺伝子をスクリーニングするために、その遺伝子またはその補
体に相補的ないかなるプローブを用いてもよい。プローブは１０ヌクレオチドま
たはそれ以上であることが好ましく、１５ヌクレオチドまたはそれ以上であるこ
とがより好ましい。ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
でアクセス可能なＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）に保持されているＥｎｔｒｅ
ｚデータベースは、以下の受け入れ番号によりこれらのＲＰＩに対応する遺伝子
配列を提供する。また、それぞれの配列はここに組み込まれる。 【０１１２】 【表２０】 【０１１３】 【表２１】 【０１１４】 ＲＰＩ−１０、ＲＰＩ−１７、およびＲＰＩ−２０のそれぞれに関しては、以
下のような変質した一連のプローブが提供される。 （ａ） ＲＰＩ−１０に対するプローブ 【０１１５】 【化１】 【０１１６】 （ｂ） ＲＰＩ−１７に対するプローブ 【０１１７】 【化２】 【０１１８】 （ｃ） ＲＰＩ−２０に対するプローブ 【０１１９】 【化３】 【０１２０】 ＲＰＩまたはその断片をコード化する挿入ＤＮＡを有するライブラリーのクロ
ーンは、１またはそれ以上の改変オリゴヌクレオチドプローブ（またはそれらの
相補体）にハイブリダイゼーションする。そのようなオリゴヌクレオチドプロー
ブのゲノミックライブラリーへのハイブリダイゼーションは、技術的に公知の方
法を用いて実施される。例えば、上述した一連の改変したオリゴヌクレオチドプ
ローブもしくはそれらの相補体と（または、そのような一連のものもしくは相補
体の１つと）のハイブリダイゼーションは、前記高度に緊縮した条件、または適
度に緊縮した条件下において実施される。または、５５℃の２Ｘ ＳＳＣ、１．
０％ＳＤＳ中で実施し、同条件で洗浄する。さらに他の観点においては、ＲＰＩ
もしくはＲＰＩ誘導ポリペプチドの一部または全体をコード化するヌクレオチド
配列のクローンを、発現ライブラリーのスクリーニングによって得ることもでき
る。例えば、ベクターが導入されるホストセルによってベクター内に挿入された
配列が発現しうるように、関連するソースからのＤＮＡが分離され、ランダム断
片が調製され、発現ベクター中（例えば、バクテリオファージ、プラスミド、フ
ァージミド、またはコスミド）にライゲーションされる。種々のスクリーニング
分析がその後、発現したＲＰＩまたはＲＰＩ誘導ポリペプチドに対する選択のた
めに使用されうる。ある実施形態においては、本発明の種々のアンチＲＰＩ抗体
は、技術的に公知の方法を用いて、所望のクローンを同定するために使用されう
る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，ＮＹ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＶ参照。ライブラリーからのクローンまたは
プラークは、結合するそれらのクローンを同定するために抗体と接触するように
される。ある実施形態においては、ＲＰＩもしくはＲＰＩ誘導ポリペプチドをコ
ード化するＤＮＡを含んでなるクローンまたはプラークは、ここに参照として組
み込まれるＯｌｓｖｉｃｋら，２９ｔｈ ＩＣＡＡＣ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ
．１９８９に従い、ＤＹＮＡビーズを用いて検出することができる。アンチＲＰ
Ｉ抗体はトシル化されたＤＹＮＡビーズＭ２８０に架橋され、その後、これらの
抗体を含むビーズは、ＲＰＩもしくはＲＰＩ誘導ポリペプチドを発現するクロー
ンまたはプラークに吸着するために使用される。ＲＰＩもしくはＲＰＩ誘導ポリ
ペプチドを発現するクローンまたはプラークは、ビーズに結合するこれらのいず
れかとして同定される。かわりに、アンチＲＰＩ抗体は、シリカやＣｅｌｉｔｅ
（登録商標）樹脂のような好適な単体に非特異的に固定されうる。その後、この
物質は、前節に記載したように、ＲＰＩタンパクまたはＲＰＩ誘導ポリペプチド
を発現する細菌性コロニーに吸着するために使用される。他の観点においては、
ＰＣＲ増幅が、ゲノミックＤＮＡからのＲＰＩの一部または全体をコード化する
十分に純粋なＤＮＡを製造するために使用されうる。公知のＲＰＩ配列に対応す
るオリゴヌクレオチドプライマー、変質物、その他のものは、プライマーとして
使用されうる。例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ｔｈｅｒｍａｌ
ｃｙｃｌｅｒ ａｎｄ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ（
登録商標））によって、ＰＣＲは実施されうる。ＰＣＲ反応において使用するた
めに、数種の異なる改変プライマーを合成することを選択することができる。変
質プライマーとＤＮＡ中の対応する配列とのヌクレオチド配列類似性の度合いを
向上または減少させるために、ＰＣＲ反応のプライミングの際に用いられるハイ
ブリダイゼーション条件の緊縮度を変化させることも可能である。ＲＰＩをコー
ド化する配列のセグメントの連続した増幅後、セグメントは分子的にクローニン
グ、および配列され、完全なゲノミッククローンを分離するためプローブとして
利用される。前記文献に記載したように、これにより、遺伝子の完全なヌクレオ
チド配列、その発現の分析、および機能的な分析のためのそのタンパク生成物の
製造が順番に可能となる。ＲＰＩ遺伝子はインビトロ翻訳を伴う核酸ハイブリダ
イゼーションによるｍＲＮＡ選択によっても同定することができる。この手法に
おいては、断片はハイブリダイゼーションによる相補性ｍＲＮＡを分離するため
に使用される。そのようなＤＮＡ断片は、入手可能な他の種（例えば、マウス、
ヒト）の精製ＲＰＩ ＤＮＡを再現することができる。分離されたｍＲＮＡの分
離生成物のインビトロ翻訳生成物の免疫沈降分析または機能分析（例えば、イン
ビトロでの凝集能力、レセプターへの結合）によりｍＲＮＡが同定され、したが
って所望の配列を含む相補性ＤＮＡ断片が同定される。さらに、ＲＰＩに対して
特異的な固定された抗体への、細胞から分離されたポリソームの吸着によって特
異的ｍＲＮＡを選択することができる。放射線標識されたＲＰＩ ｃＤＮＡは、
テンプレートとして選択された（吸着ポリソームからの）ｍＲＮＡを用いて合成
することができる。放射線標識されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、その後、他の
ゲノミックＤＮＡ断片中からＲＰＩ ＤＮＡ断片を同定するためにプローブとし
て使用することができる。分離されたＲＰＩゲノミックＤＮＡの代用としては、
公知の配列からの遺伝子配列そのものの化学合成、またはＲＰＩをコード化する
ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡの調製が含まれるがこられに限定されるものではない
。例えば、ＲＰＩ遺伝子ｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡは、ＲＰＩを発現
する細胞から分離することができる。他の方法も可能であり、本発明の範囲に含
まれるものである。 【０１２１】 いずれの真核生物細胞も、潜在的にＲＰＩ遺伝子の分子クローニングのための
核酸ソースとして作用しうる。ＲＰＩをコード化する核酸配列は、霊長類ソース
、昆虫、植物などに加えて、脊椎動物、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ
、ウマ、イヌ、から分離することができる。ＤＮＡは、化学合成によって、ｃＤ
ＮＡクローニングによって、またはゲノミックＤＮＡもしくはその断片のクロー
ニングによってクローンＤＮＡ（例えば、ＤＮＡライブラリー）から技術的に一
般的な公知の手法によって得ることができ、所望の細胞から精製される（例えば
、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．），１９８５
，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，イギリス国Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ．参照
）ゲノミックＤＮＡから誘導されたクローンは、コード化領域に加えて調節およ
びイントロン領域を含んでいてもよく、ｃＤＮＡから誘導されたクローンはエク
ソン配列のみを含むものである。ソースが何であれ、ＲＰＩ遺伝子は、調製のた
めに好適なベクター内に分子的にクローンされるべきである。同定され分離され
た遺伝子またはｃＤＮＡは、その後、好適なクローニングベクター内に挿入され
うる。技術的に公知の多数のベクター−ホスト系を使用することが可能である。
可能なベクターとしては、プラスミド、改変ウイルスが含まれるがこれらに限ら
れるものではない。しかし、ベクター系は使用されるホスト細胞に適合するもの
でなければならない。そのようなベクターとしては、ラムダ誘導体のようなバク
テリオファージ、ＰＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体またはＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなプラスミドが含まれる
がこれらに限られるものではない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、
相補的な相補末端を有するクローニングベクターへのＤＮＡ断片のライゲーショ
ンによって実施することができる。しかし、もしＤＮＡを断片化するために用い
られる相補的な制限サイトがクローニングベクターには存在しなければ、ＤＮＡ
分子の末端を酵素的に修飾することができる。かわりに，所望のいかなるサイト
をＤＮＡ末端へのヌクレオチド配列（リンカー）のライゲーションによって作製
することもでき、これらのライゲーションされるリンカーは、制限エンドヌクレ
アーゼ認識配列をコード化する化学合成された特異的なオリゴヌクレオチドを含
んでいてもよい。代用方法においては、開裂したベクターおよびＲＰＩ遺伝子は
、ホモポリマー性テーリングによって修飾されてもよい。遺伝子配列の多数のコ
ピーを生成するために、組換え分子を形質転換、形質移入、感染、エレクトロポ
レーションなどによってホスト細胞中に導入することができる。特殊な実施形態
においては、分離されたＲＰＩ遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ分子を組み
込んだ組換えＤＮＡ分子でのホスト細胞の形質転換により、遺伝子の多様なコピ
ーの製造が可能になる。このように、遺伝子は形質転換物を成長させ、形質転換
物から組換えＤＮＡ分子を分離し、必要とあれば分離組換えＤＮＡから挿入され
た遺伝子を検索することによって大量に得ることができる。 【０１２２】 本発明によって提供されるＲＰＩ配列は、天然ＲＰＩにおいて確認されるもの
と実質的に同一であるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列、および機
能的に同等なアミノ酸を有するアミノ酸配列をコード化した配列、それに、他の
ターゲット誘導体およびその類似体をコード化する配列を含むがこれらに限られ
るものではない。 【０１２３】 ５．７ ＲＰＩをコード化するＤＡＮの発現 ＲＰＩもしくは機能的に活性な類似体もしくはその断片または誘導体をコード
化するヌクレオチド配列は、好適な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパ
ク質コード化配列の転写および翻訳のために必要な要素を含むベクター、中に挿
入することができる。必要な転写のおよび翻訳のシグナルは、天然ＲＰＩ遺伝子
またはその側面領域によって供給することができる。種々のホスト−ベクター系
を、タンパク質コード化配列を発現させるために利用することができる。これら
としては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感
染した哺乳類細胞株、ウイルス（バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞株、イ
ーストベクターを含むイーストにような微生物、またはバクテリオファージ、Ｄ
ＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換されたバクテリア
が含まれるがこれらに限定されるものではない。ベクターの発現要素は、強度お
よび特異性において異なる。利用されるホスト−ベクター系によって、いくつか
の好適な転写および翻訳要素の一つが使用されうる。特殊な実施形態においては
、ヒトＲＰＩ遺伝子、またはヒトＲＰＩの機能的に活性な部分をコード化する配
列が発現される。さらに他の実施形態においては、ＲＰＩのドメインを含んでな
るターゲットの断片が発現される。 【０１２４】 １．１ １．１ 好適な転写および翻訳制御シグナル並びにタンパク質コード化配列からなるキ
メラ遺伝子を含んでなる発現ベクターを構築するために、ベクター内へのＤＮＡ
断片の挿入に関して以前に記載されたいかなる方法を用いることもできる。これ
らの方法はインビトロ組換えＤＮＡおよび合成方法並びにインビボ組換え体（遺
伝学的組換え）を含む。ＲＰＩおよびペプチド断片をコード化する核酸配列の発
現は、第２核酸配列によって調節され、組換えＤＮＡ分子で形質転換されたホス
トにおいてＲＰＩまたはペプチドが発現する。例えば、ＲＰＩの発現は、技術的
に公知のいかなるプロモーターまたはエンハンサー要素によっても制御すること
ができる。ＲＰＩ遺伝子発現を制御するために用いられるプロモーターとしては
、ＳＶ４０早期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１
９８１，Ｎａｔｕｒｅ２９０３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末
端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ２２ ７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，
１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８１４４１−１４
４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９８２
，Ｎａｔｕｒｅ２９６３９−４２）、β−ラクタマーゼプロモーターのような原
核細胞発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５３７２７−３７３１）、またはｔａｃ
プロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８０２１−２５）が含まれるがこれらに限られるものではない。Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２７４−９４記載の組
換えバクテリアから得られた有用なタンパク；ノパリンシンセターゼプロモータ
ー領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら，Ｎａｔｕｒｅ３０３２０９−２
１３）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Ｇａ
ｒｄｎｅｒら，１９８１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９２８７１）および
光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒ
ｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３１０１１５−１２０
）からなる植物発現ベクター；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（ａｌｃｏｈｏｌ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）プロモーター、ＰＧＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙ
ｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｓｅ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモータ
ー、および組織特異性を示し、膵腺房細胞において活性なトランスジェニック動
物エラスターゼＩ遺伝子制御領域において活用される以下の動物転写制御領域、
のようなイーストもしくは他の菌類から得たプロモーター要素（Ｓｗｉｆｔら，
１９８４，Ｃｅｌｌ３８６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０３９９
−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７４２５−５
１５）；膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ
，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５１１５−１２２）、リンパ球において活性なイ
ムノグロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８ ６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら， １９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１８５３３
−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７ １４３６−１４４４）、精巣、胸部、リンパ球、および肥満細胞において活性な
マウス***腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ４５４８
５−４９５）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ
ら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１２６８−２７６）、肝臓に
おいて活性なアルファフェトタンパク遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１
９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら
，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５５３−５８）；肝臓において活性なアルファ
１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ
ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１１６１−１７１）、脊髄細胞において活性なベータグ
ロビン遺伝子領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５３３８−３
４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ４６８９−９４）；脳の乏突起膠
細胞において活性なミエリン塩基性タンパク遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ
ら，１９８７，Ｃｅｌｌ４８７０３−７１２）；骨格筋において活性なミオシン
軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４２８３−２
８６）、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制
御領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４１３７２−１３７８）
も参照される。 【０１２５】 特殊な実施形態においては、操作可能なようにＲＰＩコード化核酸に結合した
プロモーター、１またはそれ以上の複写源、および、場合によっては１またはそ
れ以上の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質抵抗性の遺伝子）からなるベク
ターが使用される。 【０１２６】 特殊な実施形態においては、発現構成は、３つのｐＧＥＸベクター（グルタチ
オンＳ−トランスフェラーゼ発現ベクター；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，
１９８８，Ｇｅｎｅ７３１−４０）それぞれのＥｃｏＲＩ制限サイトに、ＲＰＩ
をコードする配列をサブクローニングすることによって成される。これにより、
正しいリーディングフレームにおいてサブクローンからのＲＰＩ生成物の発現が
可能になる。 【０１２７】 ＲＰＩ遺伝子挿入を含んでなる発現ベクターは３つの一般的なアプローチ、（
ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）マーカー遺伝子機能の存在または欠如
、および（ｃ）挿入された配列の発現、によって同定されうる。第一のアプロー
チにおいては、発現ベクターに挿入されたＲＰＩ遺伝子の存在は、挿入されたＲ
ＰＩ遺伝子にホモローグである配列を含んでなるプローブを用いた核酸ハイブリ
ダイゼーションによって検出することができる。第２のアプローチにおいては、
組換えベクター／ホスト系は、ベクター中のＲＰＩ遺伝子の挿入によって引き起
こされる、あるマーカー遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質
抵抗性、形質転換フェノタイプ、バキュロウイルスにおける吸蔵体形成（occlus
ion body formation）など）の存在または欠如に基づいて同定され、選択される
。例えば、ＲＰＩ遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、
ＲＰＩ遺伝子挿入を含んでなる組換え体はマーカー遺伝子機能の欠如によって同
定することができる。第３のアプローチにおいては、組換え発現ベクターは組換
え体によって発現されるＲＰＩ遺伝子生成物を分析することによって同定するこ
とができる。そのような分析は、例えば、インビトロ分析システムにおけるＲＰ
Ｉの物理的または機能的な特性、例えば、アンチＲＰＩ抗体との結合に基づくも
のでありうる。 【０１２８】 特定の組換えＤＮＡ分子が同定および分離されると、技術的に公知の数種の方
法がそれを増殖させるために用いられうる。好適なホストシステムおよび成長条
件が設定されると、組換え発現ベクターは増殖され、大量に調製される。前記説
明したように、使用されうる発現ベクターとしては、いくつかの例を挙げると、
以下のベクターおよびその誘導体、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスの
ようなヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；イー
ストベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、並びにプラス
ミドおよびコスミドＤＮＡベクター、が含まれるがこられに限られるものではな
い。 【０１２９】 加えて、挿入された配列の発現を調節する、または所望の特殊な方法で遺伝子
生成物を改変し加工するホスト細胞株を選択することができる。あるプロモータ
ーからの発現は、ある誘導物質の存在下において上昇させることができる。この
ように遺伝子工学的に加工されたＲＰＩの発現を制御しうる。さらに、異なるホ
スト細胞は、翻訳中のおよび翻訳後の加工および改変（例えば、タンパクの糖付
加、リン酸エステル化）に関する固有で特異的なメカニズムを有する。発現され
た外来タンパクに所望の改変および加工を確保するために、好適な細胞株または
ホストシステムを選択することができる。例えば、糖付加されていないコアタン
パク生成物を製造するために、細菌性システムにおける発現を用いることができ
る。イーストにおける発現により糖付加生成物が製造される。哺乳類細胞におけ
る発現は、ヘテロローグタンパクの天然糖付加を確実にするために使用されうる
。さらに、ベクター／ホスト発現系が異なると、加工反応への影響も異なるもの
となりうる。 【０１３０】 組換えタンパクの長期間、高収率生成のためには安定した発現が好ましい。例
えば、差別的に発現されたまたは経路遺伝子タンパク（pathway gene protein）
を安定的に発現する細胞株が設計されてもよい。複写のウイルス起源を含む発現
ベクターを使用するよりも、好適な発現制御要素（例えば、プロモーター、エン
ハンサー、シーケンサー、転写ターミネーター、ポリアデニレーションサイトな
ど）および選択可能なマーカーによって制御されたＤＮＡで、ホスト細胞を形質
転換する方が好ましい。外来ＤＮＡの導入に続いて、設計された細胞を１〜２日
間強化培地において成長させ、その後選択性の培地に切り替えることができる。
組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に抵抗力を与え、細胞が安定的
にプラスミドをクロモソームと結合させ、成長して、順にクローニングされ細胞
株内に展開されるフォーカスを形成することを可能にする。この方法は、差別的
に発現されたまたは経路遺伝子タンパクを発現する細胞株を設計するために好適
に使用されうる。そのような設計された細胞株は、差別的に発現されたまたは経
路遺伝子タンパクの内因性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評
価において特に有用でありうる。 【０１３１】 多数の選択システムを使用することができ、単純ヘルペスウイルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら，１９７７，Ｃｅｌｌ１１２２３）、ヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌ
ｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８２０２
６）、およびアデニンフォスフォリボシールトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，
１９８０，Ｃｅｌｌ２２８１７）遺伝子が、それぞれｔｋ-，ｈｇｐｒｔ-または
ａｐｒｔ-細胞において採用されうるがこれらに限られるものではない。また、 アンチメタボライト耐性が、耐性をメトトレキセートに付与するｄｈｆｒ（Ｗｉ
ｇｌｅｒら，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７３５６７；Ｏ
´Ｈａｒｅら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７ ８ １５２７）、マイコフェノル酸に耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆
Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８２０
７２）、アミノグリコシドＧ−４１８に耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒ
ｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０１）、ヒグロ
マイシンに耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，１９８４，Ｇｅｎ
ｅ３０１４７）遺伝子に対する選別の基礎として用いられうる。 【０１３２】 他の特殊な実施形態においては、ＲＰＩ、断片、類似体、および誘導体が、（
（異なるタンパクの）ヘテロローグタンパク配列に結合したペプチドを解して結
合したタンパク、断片、類似体、または誘導体からなる）融合体またはキメラタ
ンパク生成物として発現されうる。そのようなキメラ生成物は、所望のアミノ酸
配列をコード化する好適な核酸配列を、技術的に公知の方法を用いて適切なコー
ディングフレームにおいて互いにライゲーションし、技術的に一般的に知られた
方法によってキメラ生成物を発現することによって成される。かわりに、そのよ
うなキメラ生成物はタンパク合成技術によって、例えば、ペプチド合成機の使用
によって成すこともできる。ｃＤＮＡおよびゲノミック配列の双方がクローニン
グされ、発現しうる。 【０１３３】 ５．８ ＲＰＩの治療上の使用 本発明は治療上の化合物の投与による種々の疾病および疾患の治療並びに予防
を提供する。そのような化合物としては、ＲＰＩおよび類似体並びに（断片を含
む）それらの誘導体（例えば、ここに記載したようなもの）；その抗体（ここに
記載）；ＲＰＩ、類似体、または誘導体（ここに記載）をコード化する核酸；Ｒ
ＰＩ遺伝子アンチセンス核酸並びにＲＰＩ遺伝子作動薬および拮抗剤が含まれる
がこれらに限られるものではない。ここに記載されたように、本発明の重要な特
性は、リウマチ様関節炎に含まれるＲＰＩ遺伝子の同定である。関節炎は、ＲＡ
患者の血清に対して関節液において減少するＲＰＩの機能もしくは発現を促進す
る、治療上の化合物を投与することによって治療または予防されうる。関節炎は
、ＲＡ患者の血清に対して関節液において増加するＲＰＩの機能または発現を低
下させる治療上の化合物の投与によっても治療または予防されうる。一般的に、
種の起源または（抗体の場合には）種の反応性が患者の化合物と同じ種である化
合物を投与することが好ましい。このように、好ましい実施形態においては、治
療または予防のために、ヒトＲＰＩ、誘導体、もしくは類似体、もしくは核酸、
またはヒトＲＰＩに対する抗体がヒト患者に投与される。 【０１３４】 ５．８．１ リウマチ様関節炎の治療および予防 リウマチ様関節炎は、ＲＡを有する被験者の血清に対して関節液において減少
する１もしくはそれ以上のＲＰＩのレベルもしくは機能、または１もしくはそれ
以上のＲＡＤＦのレベルを促進する（すなわち、増加または供給する）化合物の
投与によって、治療または予防される。そのような化合物の例としては、機能的
に活性で、特にインビトロ分析または動物モデルにおいて活性であることが証明
されるＲＰＩ、誘導体、または断片、並びにＲＰＩもしくは機能的に活性な誘導
体またはその断片（例えば、遺伝子治療においての使用のため）をコード化する
核酸が含まれるがこれに限られるものではない。使用されうる他の化合物、例え
ばＲＰＩ作動薬は、インビボ分析を用いて同定されうる。 【０１３５】 リウマチ様関節炎は、ＲＡを有する被験者の血清に対して関節液において増加
量を示す１もしくはそれ以上のＥＰＩのレベルもしくは機能、または１もしくは
それ以上のＲＡＤＦのレベルを阻害する（すなわち減少する）化合物の投与によ
っても治療されまたは予防される。そのような化合物の例としては、ＲＰＩアン
チセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはＲＰＩに対して検出される抗
体が含まれるがこれらに限られるものではない。使用されうる他の化合物、例え
ば、ＲＰＩ拮抗薬は、インビトロ分析を用いて同定できる。 【０１３６】 特殊な実施形態において、１もしくはそれ以上のＲＰＩのレベルもしくは機能
、または１もしくはそれ以上のＲＡＤＦのレベルを促進する化合物は、治療的に
（ＲＰＩレベルもしくは機能、またはＲＡＤＦレベルの欠如や減少（通常のまた
は好ましいものと比較して）が、ＲＡ患者の血清と比較してＲＡ患者の関節液に
おいて同定されたときは予防的にも）投与される。他の実施形態においては、Ｒ
ＰＩのレベルもしくは機能、またはＲＡＤＦのレベルを阻害する化合物が治療的
に（ＲＰＩレベルもしくは機能、またはＲＡＤＦレベルの増加（通常のまたは好
ましいものと比較して）が、ＲＡ患者の血清と比較してＲＡ患者の関節液におい
て同定されたときは予防的に）投与される。そのような化合物の投与によるＲＰ
Ｉ機能もしくはレベルまたはＲＡＤＦレベルの変化は、例えば、患者の組織サン
プルを得て（例えば、生検で）、インビトロにおいてＲＮＡもしくはタンパクレ
ベルまたは表現されたＲＰＩ ＲＮＡもしくはタンパクの活性を分析することに
よって容易に同定することができる。「好ましい技術」も、化合物投与の前後に
おいてＲＰＩまたはＲＡＤＦのレベルを検出するために使用されうる。技術的に
一般的な多種の方法がこのように用いられ、キナーゼ分析、ＲＰＩを検出および
／または視覚化するためのイムノアッセイ（例えば、ウェスタン法、ドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を伴う免疫沈降、免疫細胞化学な
ど）、および／またはＲＰＩをコード化するｍＲＮＡをそれぞれ検出および／ま
たは視覚化することによってＲＰＩ表現を検出するためのハイブリダイゼーショ
ン分析（例えば、ノーザン法、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼー
ション、など）、などが含まれるがこれらに限られるものではない。 【０１３７】 本発明の化合物としては、例えば、その化合物が非ステロイドの炎症剤（ＮＳ
ＡＩＤ）（例えば、プレドニゾン、イブプロフェン、フェノプロフェン、ケトプ
ロフェン、フルルブプロフェン、インドメタシン、スリンダク、アスピリン、サ
リチルサリチル酸、ジフルニサル、ナプロキセン、ピロキシカム、テノキシカム
、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン）ではない条件の下で、ＲＡ ＲＰ
ＩまたはＲＡＤＦプロフィールを通常にまで回復させる小さな有機分子、タンパ
ク、ペプチド、抗体、核酸など、金塩、Ｄ−ペニシラミン、ヒドロキシクロロキ
ン、またはサルファサルアジンのような抗マラリア薬、アザチオプリン、シクロ
ホスファミド、クロランブシル、メトトレキセート、コルチコステロイド、アン
チ−ＣＤ４モノクローナル抗体、並びにアンチ−ＣＤｗ５２抗体が含まれるがこ
れらのいずれいも限られるものではない。 【０１３８】 ５．８．２ 遺伝子治療 特殊な実施形態において、ＲＰＩまたはそれらの機能的な誘導体をコード化し
た配列を含む核酸は、ＲＰＩ機能を促進するために遺伝子治療の手法によって投
与される。遺伝子治療は、発現された、または、発現可能な核酸物質を投与する
ことによって行われる治療のことである。本発明のこの実施形態において、該核
酸は、ＲＰＩ機能を促進することによって治療的効果を仲介する、コードされた
タンパク質を生産する。 【０１３９】 当業界で使用され得る遺伝子治療の任意の方法が、本発明に従って使用され得
る。模範的な方法を以下に記載する。 【０１４０】 遺伝子治療方法の一般的な報告として、Goldspiel等, 1993, Clinical Pharma
cy 12488-505； WuおよびWu, 1991, Biotherapy 387-95； Tolstoshev, 1993, A nn. Rev. Pharmacol. Toxicol . 32573-596；Mulligan, 1993, Science 260926-9
32；ならびに、MorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62191-217 ； May, 1993, TIBTECH 11(5)155-215)が参照される。当業界で周知の、使用さ れる組換えＤＮＡ技術の方法は、Ausubel等，(eds.), 1993, Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；および Kriegler, 1990, Gen
e Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYで説明
されている。 【０１４１】 好ましい観点において、その化合物は、ＲＰＩをコード化した核酸、好ましい
宿主中でＲＰＩまたはそれらの断片もしくはキメラタンパク質を発現する発現ベ
クターの部分である前記核酸を含む。特に、このような核酸は、ＲＰＩコード領
域に操作可能に（operably）結合したプロモーター、誘導性または構成性および
任意に組織特異的な前記プロモーターを有している。他の特別な実施形態におい
て、核酸分子が用いられ、その際、ＲＰＩコード配列および他の任意の望ましい
配列が、ゲノム中の望ましい部位における相同性組換えを促進するような領域の
側に配置され、このようにしてＲＰＩ核酸の染色体内発現に供給される（Koller
およびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 868932-8935； Zijlstra 等, 1989, Nature 342435-438）。 【０１４２】 核酸の患者への運搬が、直接的であれば、患者は直接的に該核酸または核酸を
含むベクターにさらされ、または、直接的であれば、細胞は最初にインビトロで
核酸により形質転換され、次に患者中に移植される。これら二つのアプローチが
、それぞれ、インビボまたはインビトロの遺伝子治療として知られている。 【０１４３】 特別な実施形態において、該核酸は直接的にインビボで投与され、発現されて
コード化した生産物を生産する。これは任意の当業界で周知の膨大な方法によっ
て行われ、例えばそれを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内に
するためにそれを投与する、例えば欠損もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他
のウイルスベクターを用いた感染（例えば、米国特許第4,980,286号）、もしく は、裸のＤＮＡの直接注射、もしくは、マイクロパーティクル照射（microparti
cle bombardment）(例えば、a gene gun；Biolistic, Dupont）、もしくは、脂 質または細胞表面受容体またはトランスフェクション因子（transfecting agent
s）、リポゾーム、マイクロパーティクル（microparticles）もしくはマイクロ カプセル（microcapsules）によるカプセル封入によるコーティング、または、 核に入ることが知られているペプチドへの結合における投与、受容体仲介エンド
サイトーシスを受けるリガンドへの結合における投与（例えばWuおよびWu, 1987
, J. Biol. Chem. 2624429-4432）（これらは特異的に受容体を発現するターゲ ット細胞に対して使用される）等によって行われる。他の実施形態において、核
酸−リガンド複合体が形成され、該リガンドは紡錘状（fusogenic）のウイルス ペプチドを含み、これによりエンドゾームを破砕させ、核酸がリソソーム性分解
を受けないようにする。さらに他の実施形態において、該核酸はインビボで、特
異的な受容体をターゲットにすることによって細胞の特異的な取り込みおよび発
現に関してターゲットにされる（例えば１９９２年４月１５日のＰＣＴ出願ＷＯ
９２／０６１８０（Wu等)；１９９２年１２月２３日のＷＯ９２／２２６３５（W
ilson等）；１９９２年１１月２６日のＷＯ９２／２０３１６（Findeis等）；１
９９３年７月２２日のＷＯ９３／１４１８８（Clarke等）,１９９３年１０月１ ４日のＷＯ９３／２０２２１（Young）を参照）。あるいは、該核酸は、細胞内 に導入され、宿主細胞の発現のためのＤＮＡと相同組換えによって結合する（Ko
llerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 868932-8935； Zijls
tra等, 1989, Nature 342435-438）。 【０１４４】 他の実施形態において、ＲＰＩをコードする核酸を含むウイルスベクターが使
用される（Miller等, 1993, Meth. Enzymol. 217581-599）。これらのレトロウ イルスは、ウイルスゲノムのパッケージングや宿主細胞ＤＮＡへの統合に必要な
いレトロウイルス配列を削除することによって改変されてある。遺伝子治療で使
用されるＲＰＩをコード化した核酸はベクターにクローニングされ、これは患者
への遺伝子運搬を促進する。レトロウイルスベクターに関するより詳細なことは
、Boesen等, 1994, Biotherapy 6291-302で見出され、これはｍｄｒ１遺伝子を 造血幹細胞に運搬して該幹細胞を化学療法に対して体制を持たせるために、レト
ロウイルスベクターを使用することが説明されている。遺伝子治療におけるレト
ロウイルスの使用を説明した他の参考文献として、Clowes等, 1994, J. Clin. I
nvest. 93644-651； Kiem等, 1994, Blood 831467-1473；Salmons and Gunzberg
, 1993, Human Gene Therapy 4129-141； and GrossmanおよびWilson, 1993, Cu
rr. Opin. in Genetics and Devel. 3110-114が挙げられる。 【０１４５】 アデノウイルスは、遺伝子治療に用いられる他のウイルスベクターである。ア
デノウイルスは、呼吸肺細胞に遺伝子を運搬するための特に有効な運搬体（vehi
cles）である。一般的に、アデノウイルスは呼吸肺細胞に感染し、軽い病気を引
き起こす。アデノウイルス−ベースの運搬システムに関する他のターゲットは、
肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは非***細胞に
観戦することができる利点を持つ。KozarskyおよびWilson, 1993, Current Opin
ion in Genetics and Development 3499-503において、アデノウイルス−ベース
の遺伝子治療の報告がなされている。Bout等, 1994, Human Gene Therapy 53-10
において、アカゲザルの呼吸肺細胞へ遺伝子を輸送するためにアデノウイルスを
使用することが示されている。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例として、 Rosenfeld等, 1991, Science 252431-434； Rosenfeld等, 1992, Ce
ll 68143-155； Mastrangeli等, 1993, J. Clin. Invest. 91225-234； PCT公報
WO94/12649；およびWang等, 1995, Gene Therapy 2775-783等が見出されている 。 【０１４６】 アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
いる（Walsh等, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204289-300； 米国特許番 号第5,436,146号）。 【０１４７】 遺伝子治療に関する他のアプローチは、例えばエレクトロポレーション（elec
troporation）、リポフェクション（lipofection）、リン酸カルシウム仲介トラ
ンスフェクション（calcium phosphate mediated transfection）またはウイル ス感染の方法によって組織培養中に細胞に遺伝子をトランスファーさせることを
含む。通常、トランスファー方法は、選択可能なマーカーを細胞にトランスファ
ーすることを含む。該細胞は次に選択され、トランスファーされた遺伝子を取り
込み発現している細胞を分離する。これらの細胞は次に患者に適用される。 【０１４８】 この実施形態において、生じた組換え細胞をインビボで投与する前に、この核
酸が細胞に導入される。このような導入は、これらに限定されないが、例えばト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核
酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターの注入、マイクロセル
仲介遺伝子トランスファー（microcell-mediated gene transfer）、スフェロプ
ラスト融合（spheroplast fusion）等の当業界で周知の任意の方法によって行わ
れる。外来遺伝子を細胞に導入する膨大な技術が当業界で周知であり（例えばLo
efflerおよびBehr, 1993, Meth. Enzymol. 217599-618； Cohenおよび, 1993, M
eth. Enzymol. 217618-644； Cline, 1985, Pharmac. Ther. 296992を参照）、 本発明により使用され、受容細胞の必要な開発的、物理的機能が失われない。該
技術は、細胞への核酸の安定したトランスファーを提供し、そのために該核酸は
該細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝的であり、その細胞の後代によ
って発現可能である。 【０１４９】 生じた組換え細胞は、当業界で周知のさまざまな方法によって患者に輸送され
る。好ましい実施形態において、上皮細胞が、例えば皮下注射によって注入され
る。他の実施形態において、組換え皮膚細胞は患者への皮膚移植として適用でき
る。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞、前駆細胞）は、好ましくは静脈注射
によって投与される。使用を考えた細胞の量は、望ましい効果、患者の状態等に
依存しており、当業者によって決定される。 【０１５０】 遺伝子治療の目的で核酸が導入された細胞は、任意の望ましい、使用可能な細
胞型を含み、これらに限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、線維芽
細胞、筋肉細胞、肝細胞；例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファー
ジ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等の血液細胞；さまざまな幹細胞または前
駆細胞、特に造血肝または前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血（umbilical cord blo
od）、末梢血液、胎児肝等である。 【０１５１】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に用いられる細胞は、患者に対して事
故由来である。 【０１５２】 組換え細胞が遺伝子治療において使用される実施形態において、ＲＰＩをコー
ド化した核酸は細胞に導入され、該細胞またはそれらの前駆対によって発現され
、組換え細胞は次に治療効果のためにインビボで投与される。特殊な実施形態に
おいて、肝細胞または前駆細胞が使用される。分離されインビトロで維持されう
る任意の肝細胞および／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在
的に使用され得る（例えば、１９９４年４月２８日のＰＣＴ公開番号ＷＯ94/085
98号； Stemple and Anderson, 1992, Cell 71973-985； Rheinwald, 1980, Met
h. Cell Bio. 21A229；ならびにPittelkowおよびScott, 1986, Mayo Clinic Pro
c. 61771を参照）。 【０１５３】 特異的な実施形態において、遺伝子治療の目的のために導入された核酸は、例
えば核酸の発現が、適切な転写のインデューサーの存在または非存在を制御する
ことによって制御されるような、コード化した領域に手術的に結合できる誘導性
プロモーター（inducible promoter）を含む。 【０１５４】 ５．８．３． リウマチ様関節炎を治療するためのＲＰＩの阻害 １．１．１ 本発明の一の実施形態においては、ＲＡに悩む患者の血清に比べて関節液にお
いて増加するＲＰＩのレベルまたは／およびＲＰＩの機能を中和（阻害）する化
合物の投与によって、ＲＡは治療または予防される。使用されうる化合物はアン
チＲＰＩ抗体（および、断片、並びにその結合部位を含むその誘導体）、ＲＰＩ
アンチセンスもしくはリボザイム核酸、およびホモローグ組換えによって内因性
のＲＰＩ機能を「ノックアウト」するのに用いられる機能不全ＲＰＩをコード化
する核酸（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２
８８−１２９２参照）が含まれるが、これらに限られるものではない。本発明の
特殊な実施形態においては、ＲＰＩ側面をコード化するヌクレオチドが（５’お
よび３’の双方へ）異なる遺伝子配列であるＲＰＩ遺伝子の一部を含む核酸が、
ＲＰＩ拮抗物質としてホモローグ組換えによるＲＰＩ不活性化を促進するため用
いられる（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら
，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５−４３８も参照）。ＲＰＩ機能を阻
害する他の化合物は、遺伝子分析を採用してもよいが、公知の有用なインビトロ
分析を用いて、例えば、他のタンパクへのＲＰＩの結合を阻害する性能または公
知のＲＰＩ機能を阻害する性能に基づいて同定され、好ましくはインビトロもし
くは細胞培養中で分析される。該化合物の投与前および投与後のＲＰＩのレベル
を検出するために「好ましい技術」を用いることも有用である。 【０１５５】 適切なインビトロまたはインビボ分析が、特定の化合物の効果、およびその投
与を冒された組織の治療に適用できるかを決定するために使用されることが好ま
しい。 【０１５６】 特殊な実施形態においては、ＲＰＩ機能を阻害する化合物は、ＲＡに悩む患者
の血清と比べて関節液においてＲＰＩのレベルまたはＲＰＩ機能の増加が検出さ
れたとき（例えば、通常レベルまたは望ましいレベルより増加したとき）、治療
的（予防的を含む）に投与される。ＲＰＩまたは機能のレベルの増加は、例えば
、タンパクおよび／またはＲＮＡの量を測定することによって、患者の関節液お
よび血清サンプルを得てＲＮＡもしくはタンパクレベル、ＲＰＩコード化する表
現されたＲＮＡの構造または／および活性、またはＲＰＩそのものに関してそれ
らをインビトロで分析することによって容易に検出されうる。技術的に標準的な
多数の方法がこのように採用され、キナーゼ分析、ＲＰＩを検出および／または
視覚化するためのイムノアッセイ（例えば、ウェスタン法、ドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を伴う免疫沈降、免疫細胞化学など）、お
よび／またはＲＰＩをコード化するｍＲＮＡをそれぞれ検出および／または視覚
化することによってＲＰＩ表現を検出するためのハイブリダイゼーション分析（
例えば、ノーザン法、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、
など）などが含まれるがこれらに限られるものではない。 【０１５７】 ５．８．４． ＲＰＩのアンチセンス調節 １．１．１ 特殊な実施形態においては、ＲＰＩアンチセンス核酸の使用によってＰＲＩの
機能が抑制される。本発明は、ＲＰＩもしくはその一部をコード化する遺伝子ま
たはｃＤＮＡにアンチセンスである少なくとも６つのヌクレオチドからなる核酸
の、治療的なまたは予防的な使用を提供するものである。ここで使用されている
ＲＰＩ「アンチセンス」核酸とは、ある程度の配列相補性によってＲＰＩ（好ま
しくはｍＲＮＡ）をコード化するＲＮＡの一部にハイブリダイゼーション可能な
核酸をいう。アンチセンス核酸は、ＲＰＩをコード化するｍＲＮＡのコーディン
グ領域および／または非コーティング領域に相補的であってもよい。そのような
アンチセンス核酸は、ＲＰＩ機能を阻害する化合物として利便性を有し、リウマ
チ様関節炎の治療または予防に用いられうる。 【０１５８】 本発明のアンチセンス核酸は、一重鎖または二重鎖のオリゴヌクレオチドであ
りうる。また、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはこれらの変態もしくは誘導体であり
うる。細胞に直接投与することができ、外因性の導入された配列の転写によって
細胞内で製造することもできる。 【０１５９】 本発明は、以下に記載するが、製薬上許容できる担体中に本発明のＲＰＩアン
チセンス核酸の有効量を含んでなる薬剤組成物を提供するものでもある。 【０１６０】 他の実施形態においては、本発明は原核細胞または真核細胞中においてＲＰＩ
核酸配列の表現を阻害する方法に用いられ、細胞に本発明のＲＰＩアンチセンス
核酸を含んでなる組成物の有効量を供与することが含まれる。 【０１６１】 ＲＰＩアンチセンス核酸およびその使用を以下に詳細に説明する。 【０１６２】 ＲＰＩアンチセンス核酸 ＲＰＩアンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドを有し、好ましくはオ
リゴヌクレオチド（６〜約５０オリゴヌクレオチド）である。特定の形態におい
ては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌ
クレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、または少なくとも２００ヌクレオ
チドである。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物ま
たは誘導体またはこれらの修飾形態であってもよく、１本鎖であってもまたは２
本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、塩基部分で、糖部分で、またはホ
スフェート主鎖(phosphate backbone)で修飾されてもよい。オリゴヌクレオチド
としては、ペプチド等の他の付随する基(appending group)、または細胞膜での 輸送を容易にする物質（例えば、Letsinger 等., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 86, 6553-6556； Lemaitre 等., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 648
-652； １９８８年１２月１５日に公開された、ＰＣＴ公報番号ＷＯ８８／０９ ８１０号を参照）、または血液−脳バリアー（例えば、１９８８年４月２５日に
公開された、ＰＣＴ公報番号ＷＯ ８９／１０１３４号を参照）、ハイブリダイ
ゼーションを開始させる切断物質(hybridization-triggered cleavage agent)（
例えば、Krol 等., 1988, BioTechniques 6, 958-976を参照）またはインターカ
レーション物質(intercalating agent)（例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5, 5
39-549を参照）が挙げられる。 【０１６３】 本発明の好ましい形態において、ＲＰＩアンチセンスオリゴヌクレオチドが、
好ましくは１本鎖のＤＮＡで提供される。オリゴヌクレオチドは、当該分野にお
いて通常既知である置換基でその構造物のいずれかの位置で修飾されてもよい。
ＲＰＩアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下に制限されないが、５−フルオ
ロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロ
キシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン
、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガ
ラクトシルクエオシン(betaD-galactosylqueosine)、イノシン、Ｎ６−イソペン
テニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル
グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５
−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメ
チルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノ
シルクエオシン(beta-D-mannosylqueosine)、５’−メトキシカルボキシメチル ウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ウイブトキソシン(wybutoxosine)、シ
ュードウラシル(pseudouracil)、クエオシン(queosine)、２−チオシトシン、５
−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチ
ルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ
酢酸（Ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−
カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリン
を含む群より選ばれる少なくとも一の修飾塩基部分を有していてもよい。 【０１６４】 他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一の修飾される糖
部分、例えば、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およ
びヘキソースからなる群より選ばれる糖部分からなる。 【０１６５】 さらなる他の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエー
ト(phosphorothioate)、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホル
アミドチオエート(phosphoramidothioate)、ホスホルアミデート(phosphoramida
te)、ホスホルジアミデート(phosphordiamidate)、メチルホスホネート、アルキ
ルホスホトリエステル、及びこれらのホルムアセタールまたは類似体からなる群
より選ばれる少なくとも一の修飾されるホスフェート主鎖からなる。 【０１６６】 さらなる他の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリ
ゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、一般的なβ−単位
とは逆に、ストランドが相互に平行に走る相補的ＲＮＡとの特定の２本鎖のハイ
ブリッドを形成する（Gautier 等., 1987, Nucl. Acids Res. 15, 6625-6641） 。 【０１６７】 オリゴヌクレオチドは、他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショ
ンを開始させる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションを開始させる切断物質
などに共役してもよい。 【０１６８】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野における既知の標準的な方法によっ
て、例えば、自動ＤＮＡ合成器（バイオサーチ(Biosearch)、アプライドバイオ システムズ(Applied Biosystems)などから市販されるものなど）の使用によって
、合成されてもよい。例としては、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはス
テイン(Stein)らの方法(1988, Nucl. Acids Res. 16, 3209)によって合成されて
もよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御された細孔ガラスポリマ
ー支持体を用いることによって調製できる(Sarin等, 1988, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85, 7448-7451)。 【０１６９】 特定の実施形態において、本発明のＲＰＩアンチセンス核酸は、外来の配列
からの転写によって細胞内で製造される。例えばベクターは、細胞内に吸収され
るようにインビボで導入されてもよく、この細胞内でベクターまたはこの一部が
転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）が産生される。このようなベク
ターは、ＲＰＩアンチセンス核酸をコード化する配列を含む。このようなベクタ
ーは、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写できる限り、エピソーム
であり続けてもあるいは染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、
当該分野における標準的な組換ＤＮＡ技術方法によって構築できる。ベクターは
、哺乳動物細胞における複製や発現に使用される、プラスミド、ウィルス性、ま
たは当該分野において既知の他のものであってもよい。ＲＰＩアンチセンスＲＮ
Ａをコード化する配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト、の細胞において作
用することが当該分野において既知であるプロモーターによってできる。このよ
うなプロモーターは、誘導性であっても構成性であってもよい。このようなプロ
モーターとしては、以下に制限されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Ber
noist and Chambon, 1981, Nature 290, 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの３’ の長い末端繰り返し中に含まれるプロモーター(Yamamoto 等., 1980, Cell 22,
787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner 等., 1981, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 78, 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Bri
nster 等., 1982, Nature 296, 39-42)などが挙げられる。 【０１７０】 本発明のアンチセンスは核酸は、ＲＰＩ遺伝子、好ましくはヒトのＲＰＩ遺伝
子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に相補的な配列を有する。しかしながら、
好ましいものの、完全な相補性は必要ではない。本明細書中で引用される、ＲＮ
Ａの少なくとも一部分に相補的な配列は、ＲＮＡとハイブリッド形成して安定な
デュプレックスを形成できるのに十分な相補性を有する配列を意味する；ゆえに
、２本鎖のＲＰＩアンチセンス核酸の場合では、デュプレックスＤＮＡの１本鎖
を試験してもよい、あるいはトリプレックスの形成を分析してもよい。ハイブリ
ッド形成能は、相補性の度合いやアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。
通常、ハイブリッド形成する核酸が長ければ長いほど、ＲＰＩをコード化するＲ
ＮＡとの塩基のミスマッチ数が多くなるが安定なデュプレックス（または、場合
によってはトリプレックス）を形成する。当業者はハイブリッド形成した複合体
の融点を測定する標準的な方法の使用によってミスマッチの許容できる程度を確
認できる。 【０１７１】 ５．８．５ ＲＰＩの治療への使用 アンチセンス核酸 ＲＰＩアンチセンス核酸は、有益なＲＰＩをリウマチ様関節炎を患っている患
者の関節液中で過剰に発現させて、リウマチ様関節炎を治療（または予防）する
のに使用できる。好ましい実施形態においては、１本鎖のＤＮＡのアンチセンス
ＲＰＩオリゴヌクレオチドを使用する。 【０１７２】 ＲＰＩをコード化するＲＮＡを発現または過剰に発現する細胞のタイプは当該
分野において既知の様々な方法によって同定できる。このような細胞のタイプと
しては、以下に制限されるものではないが、白血球（例えば、好中球、マクロフ
ァージ、単球）及びレジデント細胞（例えば、滑膜細胞）が挙げられる。このよ
うな方法としては、以下に制限されるものではないが、ＲＰＩに特異的な核酸と
のハイブリッド形成（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロッ
トハイブリダイゼーション、インサイチュ(in situ)ハイブリダイゼーション） 、ある細胞タイプ由来のＲＮＡのインビトロでのＲＰＩへの翻訳能を考察する、
イムノアッセイなどが挙げられる。好ましい形態において、患者からの１次組織
を、例えば、免疫細胞化学またはin situハイブリダイゼーションによって、治 療前のＲＰＩの発現について分析できる。 【０１７３】 製薬上許容できる担体中に有効量のＲＰＩアンチセンス核酸を含む、本発明の
薬剤組成物は、リウマチ様関節炎を有する患者に投与できる。 【０１７４】 ＲＡの治療に有効であろうＲＰＩアンチセンス核酸の量は、標準的な臨床テク
ニックによって決定されうる。可能である場合には、インビトロで、さらにはヒ
トに試験及び使用される前に有用な動物モデルシステムにおいて、治療される腫
瘍のタイプのアンチセンス細胞毒性を測定することが望ましい。 【０１７５】 特定の実施形態において、ＲＰＩアンチセンス核酸を含む薬剤組成物は、リポ
ソーム、微粒子、またはマイクロカプセルを介して投与される。本発明の様々な
実施形態において、このような組成物を用いてＲＰＩアンチセンス核酸の一様の
放出を達成することは有用である。特定の実施形態においては、特定の同定可能
な腫瘍抗原に対する抗体を介してターゲットにされるリポソームを利用すること
が望ましい(Leonetti等, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2448-2451；
Renneisen 等, 1990, J. Biol. Chem. 265, 16337-16342)。 【０１７６】 ５．８．６ 阻害リボザイム及びトリプレックスアプローチ 他の実施形態においては、ＲＡの症状は、ＲＰＩ遺伝子配列を既知の遺伝子ノ
ックアウト、リボザイムおよび／またはトリプレックス方法を組合わせて使用し
て、ＲＰＩ遺伝子の発現レベルを減少することによって、ＲＰＩ遺伝子の発現レ
ベルおよび／またはＲＰＩ遺伝子産物の活性を減少することによって、改善され
てもよい。ＲＡの症状を改善する能力を含む、ＲＰＩ遺伝子の活性、発現または
合成を調節する能力を発揮する化合物の中には、リボザイム及びトリプレックス
分子がある。このような分子は、損なわれていない、または適切である場合には
、変異型ターゲット遺伝子活性のいずれかを減少するまたは阻害するように設計
されてもよい。このような分子の製造及び使用に関する技術は、当業者にはよく
知られている。 【０１７７】 ＲＰＩ遺伝子ｍＲＮＡ転写産物を触媒により切断するように設計されるリボザ
イム分子を用いて、ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの翻訳及び、ゆえにＲＰＩ遺伝子
産物の発現を防止できる。（例えば、１９９０年１０月４日に公開された、ＰＣ
Ｔ国際公開 ＷＯ９０／１１３６４号；Sarver 等., 1990, Science 247, 1222-
1225）。 【０１７８】 リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。
（書評では、Rossi, 1994, Current Biology 4, 469-471を参照）。リボザイム 作用のメカニズムは、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム作用分子の配列特
異的なハイブリダイゼーション、さらにはエンドヌクレアーゼによる切断事象(e
ndonucleolytic cleavage event)を含む。リボザイム分子の組成物は、ターゲッ
ト遺伝子ｍＲＮＡに対して相補的な一以上の配列を含むものでなければならず、
また、ｍＲＮＡ切断に応答性のある既知の触媒配列を含むものでなければならな
い。この配列に関しては、例えば、その全体を参考のために本明細書中に引用さ
れる、米国特許第５，０９３，２４６号を参照。 【０１７９】 部位特異的な認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムをＲＰＩをコード化す
るｍＲＮＡを破壊するのに使用できるものの、シュモクザメのリボザイム(hamme
rhead ribozyme)の使用が好ましい。シュモクザメのリボザイムは、ターゲット ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって規定される位置
でｍＲＮＡを切断する。ターゲットｍＲＮＡが下記２塩基配列：５’−ＵＧ−３
’を有することが唯一の必要条件である。シュモクザメのリボザイムの構築及び
製造は、当該分野において既知であり、その全体を参考のために本明細書中に引
用される、Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology A Comprehensi
ve Desk Reference, VCH Publishers, New York（特に８３３頁、図４を参照） およびHaseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334, 585-591により詳しき記載さ
れる。 【０１８０】 好ましくは、リボザイムは、切断認識部位がＲＰＩをコード化するｍＲＮＡの
５’末端付近に位置する、即ち、効率を上げかつ非機能性ｍＲＮＡ転写産物の細
胞内蓄積を最小限にするように操作される。 【０１８１】 本発明のリボザイムとしてはまた、テトラヒメナ サーモフィラ(Tetrahymena
thermophila)中に天然に生じ（ＩＶＳ、またはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとし て既知である）、Thomas Cech及び協力者らによって広範に記載されたもの（Zau
g, 等., 1984, Science, 224, 574-578； Zaug and Cech, 1986, Science, 231,
470-475； Zaug, 等., 1986, Nature, 324, 429-433； ユニヴァーシティー パテンツ インコーポレイテッド(University Patents Inc.)による公開国際特 許出願番号ＷＯ ８８／０４３００号 ； Been and Cech, 1986, Cell, 47, 207
-216）などのＲＮＡエンドヌクレアーゼ（以降、Ｃｅｃｈタイプリボザイム）が
挙げられる。Ｃｅｃｈタイプリボザイムは、後にターゲットＲＮＡの切断が行わ
れるターゲットＲＮＡ配列とハイブリッド形成する８塩基対活性部位を有する。
本発明は、ＲＰＩをコード化する遺伝子中に存在する８塩基対活性部位配列をタ
ーゲットとするこれらのＣｅｃｈタイプリボザイムを包含する。 【０１８２】 アンチセンスアプローチにおいて、リボザイムは、（例えば、改善された安定
性、ターゲッティングなどを目的として）修飾されたオリゴヌクレオチドから構
成されることができ，インビボでＲＰＩを発現する細胞に輸送されなければなら
ない。好ましい輸送方法は、トランスフェクトされた細胞がＲＰＩをコード化す
る内因性のｍＲＮＡを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生
するように、強力な構成性ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制
御下でのリボザイムをコード化するＤＮＡ構築物を用いることを含む。リボザイ
ムは、アンチセンス分子と異なり、触媒性であるので、低細胞内濃度が効率のた
めに必要である。 【０１８３】 内因性のＲＰＩ発現はまた、ターゲットされた相同的組換を用いてＲＰＩ遺伝
子またはそのプロモーターを不活性化またはノックアウトすることによって減少
できる（例えば、Smithies, 等., 1985, Nature 317, 230-234； Thomas and Ca
pecchi, 1987, Cell 51, 503-512； Thompson 等., 1989, Cell 5, 313-321を参
照；これらのそれぞれは、その全体を参考のために本明細書中に引用される）。
例えば、内因性ＲＰＩ遺伝子（ＲＰＩをコード化する遺伝子のコーディング領域
または調節領域のいずれか）に相同するＤＮＡに隣接する変異型の、非機能性Ｒ
ＰＩ遺伝子（または全く関連のないＤＮＡ配列）を、インビボでターゲット遺伝
子を発現する細胞をトランスフェクトするために、選択マーカーおよび／または
ネガティブな選択マーカーと一緒にまたはを用いずに、使用できる。ターゲット
された相同的組換を介した、ＤＮＡ構築物の挿入によって、ターゲット遺伝子が
不活性化される。このようなアプローチは、ＥＳ（胚幹）細胞への修飾が不活性
ターゲット遺伝子を有する動物子孫を発生するのに使用できる農業分野に特に適
する（例えば、Thomas and Capecchi, 1987 and Thompson, 1989, 上記を参照）
。しかしながら、このアプローチは、組換ＤＮＡ構築物を適当なウィルスベクタ
ーを用いてインビボで必要な部位に直接投与するまたはターゲットされる場合に
はヒトへの使用に適用されうる。 【０１８４】 または、内因性のＲＰＩ遺伝子の発現は、ＲＰＩ遺伝子の調節領域（即ち、Ｒ
ＰＩ遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補性のあるデオキシ
リボヌクレオチド配列をターゲットとして体内のターゲット細胞におけるＲＰＩ
遺伝子の転写を防止するトリプレックス構造物を形成することによって抑制され
うる。（通常、Helene, 1991, Anticancer Drug Des., 6(6), 569-584； Helene
, 等., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660, 27-36； and Maher, 1992, Bioassa
ys 14(12), 807-815を参照）。 【０１８５】 転写の阻害を目的とするトリプレックス形成に使用される核酸分子は、１本鎖
であり、デオキシヌクレオチドから構成されなければならない。これらのオリゴ
ヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対原則によるトリプレック
ス形成を促進するように設計されなければならず、これは、通常、プリンまたは
ピリミジンのいずれかの相当の大きさのストレッチがデュプレックスの１本鎖に
存在する必要がある。ヌクレオチド配列はピリミジンを基礎としてもよく、これ
により、得られるトリプレックスの３つの会合するストランドにＴＡＴ及びＧＣ
Ｃ+のトリプレットが生じるであろう。ピリミジンリッチな分子は、１本鎖に平 行な方向にデュプレックスのその１本鎖のプリンリッチな領域に対する塩基の相
補性が提供される。加えて、プリンリッチである、例えば、Ｇ残基のストレッチ
を含む、核酸分子が選択されてもよい。これらの分子は、大多数のプリン残基が
、トリプレックスの３ストランドにＧＧＣトリプレットを生じる、ターゲットに
されるデュプレックスの１本鎖上に位置する、ＧＣ対リッチなＤＮＡデュプレッ
クスとトリプレックスを形成するであろう。 【０１８６】 または、３重螺旋の形成のためにターゲットされうる潜在的な配列をいわゆる
スイッチバック核酸分子を作製することによって増やしてもよい。スイッチバッ
ク分子は、デュプレックスの最初の一ストランドと次に他方と塩基対を形成して
、プリンまたはピリミジンのいずれかの相当の大きさがデュプレックスの１スト
ランドに存在する必要性を排除するように、交互の５’−３’、３’−５’様式
で合成される。 【０１８７】 本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイム、および／またはトリプレッ
クス分子を利用して変異型遺伝子発現を阻害する場合には、その技術が、存在す
る正常なＲＰＩ遺伝子産物の濃度が正常な表現型に必要であるより低い可能性が
生じるくらい、非常に効果的に正常なＲＰＩ遺伝子アレルによって産生されるｍ
ＲＮＡの転写（トリプレックス）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイ
ム）を抑制または阻害することが可能である。したがって、このような場合には
、ＲＰＩ遺伝子活性の実質的に正常なレベルを確実に維持するために、正常なＲ
ＰＩ遺伝子活性を発揮するＲＰＩ遺伝子ポリペプチドをコード化、発現する核酸
分子を、アンチセンス、リボザイム、またはトリプレックス治療が利用されてい
るどんなものにも感受性のある配列を含まない遺伝子療法を介して細胞中に導入
してもよい。または、ＲＰＩ遺伝子が細胞外タンパク質をコード化する場合には
、ターゲット遺伝子活性の必要なレベルを維持するために正常なＲＰＩ遺伝子タ
ンパク質を同時に投与する(co-administer)ことが好ましい。 【０１８８】 本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ、リボザイム、ならびにトリプレック
ス分子は、上記したように、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の合成に関する当該分野にお
ける既知の方法によって調製されてもよい。これらとしては、例えば、固相ホス
ホルアミダイト(phosphoramidite)化学合成などの当該分野で既知のオリゴデオ キシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するに技術が
挙げられる。または、ＲＮＡ分子を、アンチセンスＲＮＡ分子をコード化するＤ
ＮＡ配列のインビトロ及びインビボ転写によって得てもよい。このようなＤＮＡ
配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適当なＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーターが取り込まれた広範な様々なベクター中に導入されてもよい
。または、使用されるプロモーターによって、構成により(constitutively)また
は誘導により(inducibly)アンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ 構築物を細胞株に安定して導入してもよい。 【０１８９】 ５．９ 治療または予防のための利用のデモンストレーション 本発明の化合物は、ヒトに使用される前に、所望の治療または予防活性に関し
てインビトロ、次にインビボで試験されることが好ましい。例えば、特定の化合
物の投与が必要であるかどうかを決定するのに使用できるインビトロ分析として
は、患者の組織サンプルを培養液中で成育させ、化合物に晒すあるいは化合物を
投与して、このような化合物の組織サンプルへの効果を観察するインビトロの培
養分析が挙げられる。 【０１９０】 テスト化合物は、ＲＡを患っている患者のＲＡＤＦまたはＲＰＩレベルがＲＡ
を患っていない被検者中で見出されるレベルにまで戻るまたはＲＡの実験動物モ
デル（例えば、ラットのアジュバント関節炎）における同様の変化を作製するこ
とができるかについて試験されうる。上記レベルを回復できる化合物を、さらな
る薬剤発見を目的としたリード化合物(lead compound)として使用できる、また は治療に使用できる。 【０１９１】 ＲＡＤＦ及びＲＰＩの発現は、好ましい技術、イムノアッセイ、ゲル電気泳動
後可視化、または他の当業者に既知の方法によって分析できる。このような分析
は、ＲＡＤＦまたはＲＰＩの発現量が臨床的病気の代用マーカーとして機能でき
る際には、候補薬剤をスクリーニングするためにまたは臨床的なモニタリング若
しくは薬剤の開発に使用できる。 【０１９２】 様々な特定の実施形態において、インビトロ分析は、患者の疾患にかかわる細
胞型の代表的な細胞を用いて行なわれ、化合物がこのような細胞型に目的とする
効果を有するかどうかを決定できる。 【０１９３】 治療に使用される化合物は、以下に限られないが、ラット、マウス、ニワトリ
、ウシ、サル、ウサギなどの適当な動物モデルシステムでヒトでの試験の前に試
験されうる。インビボ試験に関しては、ヒトへの投与前に、当該分野において既
知のいずれかの動物モデルシステムを使用してもよい。 【０１９４】 ５．１０ 治療／予防のための投与及び組成物 本発明は、有効量の本発明の化合物び被検者への投与による治療（及び予防）
方法を提供するものである。好ましい形態においては、化合物は実質的に純粋で
ある（例えば、その効果を制限するあるいは望ましくない副作用を産する物質を
実質的に含まない）。被検者は、好ましくは、以下に限られないが、ウシ、ブタ
、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物を含む、動物であり、好ましくは哺乳動
物であり、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態においては、非ヒト哺乳
動物が被検者である。 【０１９５】 化合物が核酸からなる際に使用できる配合物及び投与方法は上記と同様である
；さらなる適当な配合物及び投与経路は、下記したものから選択できる。 【０１９６】 様々な輸送システムが知られており、本発明の化合物を投与するのに使用でき
、例えば、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現でき
る組換細胞、レセプターが介するエンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu, 198
7, J. Biol. Chem. 262，4429-4432を参照）、レトロウィルスまたは他のベクタ
ーの一部としての核酸の構築などがある。導入方法としては、以下に限られない
が、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙
げられる。化合物は、いずれかの簡便な経路によって、例えば、輸液または大量
注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、経口、粘膜、直腸及び腸粘膜
など）による吸収によって投与されてもよく、また、他の生物学的に活性のある
薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は全身または局所であってもよい。加えて
、脳室内及び髄腔内などの、適当な経路によって中枢神経系中に本発明の薬剤組
成物を導入することが望ましい；脳室内注射は例えば、オマヤレザバー等の、レ
ザバーに取り付けられる、脳室内カテーテルによって容易になる。肺への投与も
また、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアゾール投与剤(aerosolizin
g agent)との配合によって、使用されうる。 【０１９７】 特定の実施形態においては、治療を必要とする領域に局所的に本発明の薬剤組
成物を投与することが望ましい；これは、例えば、以下に限定されるわけではな
いが、外科手術中の局所的な輸液、例えば、外科手術後に創傷被覆剤と組み合わ
せた、局所的な塗布、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、また
はインプラントによって、達成されてもよいが、上記インプラントは、多孔性、
非多孔性、またはゼラチン製材料からなり、シアラスティック膜(sialastic mem
brane)等の膜、または繊維などが挙げられる。一実施形態においては、投与は、
悪性腫瘍または新生物性の若しくは新生物発生前の組織のある部位（または前の
部位）に直接注射することによってもよい。 【０１９８】 他の実施形態においては、化合物が、ベシクル、特にリポソーム中に輸送され
てもよい（Langer, Science 249, 1527-1533 (1990)； Treat 等., in Liposome
s in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and F
idler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)； Lopez-Berestein, ibid
., pp. 317-327を参照；同書を参照）。 【０１９９】 さらなる実施形態においては、化合物が、制御された放出システム中に輸送さ
れてもよい。一実施形態においては、ポンプを使用してもよい（Langer、上記；
Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14, 201 (1987)； Buchwald 等., Surge
ry 88, 507 (1980)； Saudek 等., N. Engl. J. Med. 321, 574 (1989)を参照）
。他の実施形態においては、高分子材料を使用してもよい（Medical Applicatio
ns of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton,
Florida (1974)； Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design a
nd Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)； Ranger
and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23, 61 (1983)を参照；
また、Levy 等., Science 228, 190 (1985)； During 等., Ann. Neurol. 25, 3
51 (1989)； Howard 等., J. Neurosurg. 71, 105 (1989)を参照）。さらなる他
の実施形態においては、制御された放出システムを、全身性の投薬量のフラクシ
ョンのみを必要とする、治療のターゲット、即ち、脳の付近に置かれてもよい（
例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, v
ol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照）。 【０２００】 他の制御された放出システムは、Langer (Science 249, 1527-1533 (1990))の
書評で討論される。 【０２０１】 本発明の化合物がタンパク質をコード化する核酸である特殊な実施形態におい
ては、核酸が、例えば、レトロウィルスベクター（米国特許第４，９８０，２８
６号を参照）の使用によって、核酸を適当な核酸の発現ベクターの一部として構
築し細胞内になるように投与することによって、または直接注射によって、また
は微粒子の衝撃（例えば、遺伝子ガン；Biolistic, Dupont）の使用によって、 または脂質若しくは細胞表面レセプター若しくはトランスフェクション剤(trans
fecting agent)による被覆によって、または核に入ることが知られているホメオ
ボックス様ペプチド（例えば、Joliot 等., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88, 1864-1868を参照）に結合する核酸を投与することなどによって、インビボ
で投与されてコード化されたタンパク質の発現を促進してもよい。または、核酸
を、細胞内に導入して、相同的組換によって、発現用の宿主細胞ＤＮＡ内に取り
込んでもよい。 【０２０２】 本発明はまた、薬剤組成物を提供するものである。このような組成物は治療上
有効な量の化合物及び製薬上許容できる担体からなる。特殊な実施形態において
は、「製薬上許容できる」ということばは、連邦管理局(regulatory agency of
the Federal)、若しくは州政府によって認可されていること、または米国薬局方
もしくは動物、特にヒトへの使用に関して一般的に認知されている他の薬局方に
リストとして挙げられていることを意味する。「担体」ということばは、治療剤
が一緒に投与される希釈液、アジュバント、賦形剤、またはベヒクルを意味する
。このような製薬上の担体は、水ならびに、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ
油等の、石油、動物、植物若しくは合成由来のものなどの、油等の滅菌液体であ
りうる。水は、薬剤組成物を静脈内で投与される場合には好ましい担体である。
食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液もまた、特に注射可能な
溶液用に、液状担体として使用できる。適当な製薬上の賦形剤としては、デンプ
ン、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、
チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレー
ト、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、
グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。本組成物は、必要であれば、少
量の湿潤若しくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は
、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性配合物などの形
態がとられる。組成物は、伝統的な結合剤及びトリグリセリド等の担体を用いて
、坐剤として配合されてもよい。経口用の配合物は、薬剤グレードのマンニトー
ル、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム
(sodium saccharine)、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含 みうる。適当な製薬上の担体の例は、E.W. MartinによるRemington's Pharmaceu
tical Sciencesに記載される。このような組成物は、患者に適当に投与するため
の形態を提供できるように適当な量の担体と共に、好ましくは純粋な形態の、治
療上有効な量の本化合物を含むであろう。配合物は、投与の形態に適するもので
なければならない。 【０２０３】 好ましい実施形態においては、本組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適用
される薬剤組成物として定常的な方法に従って配合される。具体的には、静脈内
投与用の組成物は、滅菌等張水性緩衝液における溶液である。必要であれば、組
成物はまた、可溶化剤及び注射部位での痛みを和らげるためのリドカイン等の局
所麻酔剤を含んでもよい。通常、成分は、例えば、一定量の活性物質を表示する
アンプル若しくは小袋(sachette)等の密閉容器における乾燥凍結乾燥粉末若しく
は水分のない濃縮液として、単位服用量形態(unit dosage form)で別々にまたは
一緒に混合してのいずれかで供給される。組成物を輸液によって投与しようとす
る際には、組成物を滅菌した薬剤グレードの水または食塩水を含む輸液用ボトル
で調剤されうる。本組成物を注射によって投与する際には、注射用の滅菌水また
は食塩水のアンプルを、投与前に成分を混合するように提供できる。 【０２０４】 本発明の組成物は、中性または塩形態として配合されてもよい。製薬上許容で
きる塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の塩などの遊離
アミノ基を用いて形成される塩、ならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム
、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エ
チルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の塩などの遊離カルボキ
シル基を用いて形成される塩が挙げられる。 【０２０５】 ＲＡの治療に有効であろう本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術によって
決定できる。加えて、インビトロ分析を必要であれば最適な投与範囲を同定する
のを補助するのに使用してもよい。配合物に用いられる正確な投与量はまた、投
与経路、及び病気または疾患の重篤度によって異なり、開業医や各患者の環境の
判断に従って決定されなければならない。しかしながら、静脈内投与に関する適
当な投与量の範囲は、通常、約２０〜５００ｍｇの活性化合物／ｋｇ体重である
。鼻腔内投与に関する適当な投与量の範囲は、通常、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重
〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効な投与量は、インビトロまたは動物モデル試験
システムから派生される線量効果曲線から外挿されてもよい。 【０２０６】 坐剤は、通常、０．５質量％〜１０質量％の範囲の活性成分を含む；経口用配
合物は、好ましくは、１０％〜９５％の活性成分を含む。 【０２０７】 本発明はまた、本発明の薬剤組成物の一以上の成分を充填する一以上の容器か
らなる薬剤パックまたはキットを提供するものである。必要であれば、製剤また
は生物学的製品の製造、使用または販売を調節する政府の機関(governmental ag
ency)によって規定される形態の通知をこのような容器につけてもよく、この通 知はヒトへの投与のための製造、使用及び販売の政府機関(agency of manufactu
re, use or sale)による認可を反映するものである。 【０２０８】 ６ 実施例：ＲＡによる患者の血清及び関節液由来のタンパク質 下記の参考プロトコルを用いて、リウマチ様関節炎（ＲＡ）の患者からのまた
はＲＡでない患者（即ち、痛風、変形性関節症、または外傷性の滑膜炎の患者）
からの血清及び関節液中のタンパク質を、等電点電気泳動さらにはＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分離し、比較した。各サンプルは２連で流した。 【０２０９】 ６．１ サンプル調製 １．１ タンパク質の分析を、受け取ったままのサンプルで行なった(Pierce BCA Cat
# 23225)。３００μｇの全タンパク質に相当する容積の血清を分取し、等容の１
０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ(Fluka 71729)、２．３％（ｗ／ｖ）のジチオトレイトー ル(BDH 443852A)を添加した。このサンプルを９５℃で５分間加熱した後、２０ ℃に冷却した。次に、１２５μｌの以下の緩衝液をサンプルに加えた： ８Ｍ 尿素(BDH 452043w) ４％ ＣＨＡＰＳ(Sigma C3023) ６５ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ） ２％（ｖ／ｖ） リゾライト(Resolytes) ３．５−１０(BDH 44338 2x)。 【０２１０】 この混合物をボルテックスして、１５℃で１３０００ｒｐｍで５分間、遠心し
、上清を等電点電気泳動によって分析した。 【０２１１】 ６．２ 等電点電気泳動 臨床研究における使用 本発明の診断方法および組成物は、臨床研究、例えばＲＡ治療のための薬剤の
テスト、をモニターする際に補助することができる。ある実施形態においては、
候補分子は、ＲＡに冒されている患者におけるＲＡＤＦまたはＲＰＩレベルを、
ＲＡに冒されていない被験者において確認されるレベル、または、非ＲＡまたは
血清におけるＲＡＤＦまたはＲＦＩのレベルかそれに近しい値に維持されるよう
に治療が施された患者において確認されるレベルにまで回復させる能力が試験さ
れる。１もしくはそれ以上のＲＡＤＦまたはＲＰＩのレベルを分析してもよい。
他の実施形態においては、本発明の方法および組成物は、臨床研究のために候補
をスクリーニングする時に、ＲＡを有する個体を同定するために用いられる。こ
のような個体は、その後研究に含んでもよく、除外してもよく、または、治療も
しくは分析のために別のコホートに配置されてもよい。 【０２１２】 ＲＰＩの精製 特殊な観点においては、本発明は抗原性の決定因子（すなわち、抗体によって
認識されうる）からなる、または前記のものをコード化すると同時に機能的に活
性な、分離されたＲＰＩ、好ましくは、ヒトのＲＰＩおよび断片ならびにその誘
導体を提供する。ここで用いられる機能的に活性なＲＰＩとは、フルレング（野
生型）ＲＰＩに付随した、１または２以上の公知の機能的な活性を示す物質をい
い、例えば、ＲＰＩ基質もしくはＲＰＩ結合パートナーへの結合、（アンチター
ゲット抗体に結合した）抗原性、または免疫抗原性などがある。 【０２１３】 特殊な実施形態においては、本発明は、少なくとも６アミノ酸、１０アミノ酸
、５０アミノ酸、または少なくとも７５アミノ酸からなるＲＰＩの断片を提供す
る。ＲＰＩの領域が部分的にまたはすべてが欠如している断片または断片を含ん
でなるタンパクも提供される。前記のものをコード化する核酸が提供される。Ｒ
ＰＩ遺伝子配列を発現する組換え核酸が同定されると、その遺伝子生成物は分析
されうる。これは生成物の物理的なまたは機能的な特性に基づく分析によって成
され、ゲル電気泳動、イムノアッセイなどによる分析を伴う生成物の放射性標識
が含まれる。ＲＰＩが同定されると、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換
、アフィニティー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心沈殿法
、異なる溶解度による方法（differential solubility）、またはタンパクの精 製に用いられる通常の他のすべての技術を含む一般的な方法により分離され、精
製されうる。その他に、組換え核酸によって生成されたＲＰＩが同定されたとき
、組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列からＲＰＩのアミノ酸配
列全体を推測することができる。結果として、タンパクは技術的に公知の一般的
な化学的方法によって合成されうる（例えば、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅ等，Ｍ．，
１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１０ １０５−１１１参照）。他のかわりの実施形
態においては、上記記載の一般的な方法（例えば、イムノアフィニティー精製）
によって天然型ＲＰＩが天然のソースから精製されうる。好ましい実施形態にお
いては、参照としてここに組み込まれる米国出願第０８／９８０，５７４号に記
載の「好ましい技術」によってＲＰＩは分離される。調整段階での実施のために
は、Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，１９９３，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉ
ｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ｐｐ．
１９７−２０９（全体が参照としてここに組み込まれる）に記載の方法にしたが
って、等電段階において２ｐＨまたはそれ以下のｐＨ範囲を有する狭い範囲のズ
ームゲルを使用することが好ましい。この改変によって、より大量のターゲット
タンパク質がゲル上にローディングされることを可能にし、それによってゲルか
ら取り出される分離ＲＰＩの量も増加する。調整段階での実施のためにこの方法
が用いられたときは、「好ましい技術」は、一回の実施で一般的には１００ｎｇ
にまで及ぶ分離ＲＰＩを提供し、１０００ｎｇにまで及ぶ量を提供しうる。当該
技術に精通したものであれば、ズームゲルは、ゲル等電収束法を用いたいかなる
分離戦略においても使用されうるものであることを認識するであろう。本発明の
特殊な実施形態においては、そのうようなＲＰＩは、組換えＤＮＡ技術によって
製造されたものであれ、化学的な合成方法によるものであれ、天然タンパクの精
製によるものであれ、断片および他の誘導体ならびにそれらの類似体に加えて、
ＲＰＩのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含んでなるものからなる（しかし、
これに限られるものではない）。また、ホモローグなタンパクを含む。 【０２１４】 ＲＰＩに対する抗体の製造 本発明にしたがって、ＲＰＩ、その断片、および他の誘導体、並びにそれらの
類似体が、免疫特異的にイムノゲンに結合する抗体を生成するイムノゲンとして
使用されうる。そのようなタンパク、断片、誘導体、および類似体は、いかなる
慣用の方法によって分離してもよく、本願の以前のセクションに記載された方法
を含む。生成される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一重鎖
、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーを含むがこれらに限られるもので
はない。特殊な実施形態においては、ヒトＲＰＩに対する抗体が製造される。他
の実施形態においては、ＲＰＩのドメインに対する抗体が製造されうる。特殊な
実施形態においては、抗体製造のためのイムノゲンとしてＲＰＩの親水性断片が
使用される。ＲＰＩもしくは誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体の
製造のために、技術的に公知の種々の手法が使用されうる。特殊な実施形態にお
いては、ＲＰＩのエピトープに対するウサギポリクローナル抗体またはその配列
が得られる。抗体の製造のために、天然のＲＰＩもしくは合成型またはその誘導
体（例えば、断片）の注入によってさまざまなホスト動物、ウサギ、マウス、ラ
ット、ウマ、ヤギ、などが含まれるがこれらに限られるものではない、が免疫さ
れる。種々のアジュバントが免疫学的反応を増加させるために使用されうる。そ
れらはホスト種に依存し、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジ
ュバント、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンなどの表面活
性化物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キー
ホールカサガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（Ｂａｃｉｌ
ｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム パルバム
のような潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるがこれらに限定されるもの
ではない。ＲＰＩ配列およびその類似体に対するモノクローナル抗体の調製のた
めに、培養中の連続した細胞株による抗体分子の製造のためのいかなる技術を用
いてもよい。例えば、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚ
ｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ４７２）、およびヒト
モノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，
１９８５，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−
９６）に加えて、元来ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔ
ｕｒｅ２５６４９５−４９７）によって開発されたハイブリドーマ技術がある。
（前記文献はそれぞれ参照としてここに組み込まれる） 本発明の付加的な実施形態においては、ここに参照として組み込まれるＰＣＴ
／ＵＳ９０／０２５４５に記載されるように、無菌動物中にてモノクローナル抗
体は製造されうる。本発明にしたがってヒト抗体は使用され、また、ヒトハイブ
リドーマを用いて（Ｃｏｔｅら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８０２０２６−２０３０）、またはヒトＢ細胞をインビトロにおい
てＥＢＶウイルスで形質転換することによって（Ｃｏｌｅら，１９８５，ｉｎ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐｐ．７７−９６）、得ることができる。
実際、本発明次第では、好ましい生物学的に活性なヒト抗体分子から得た遺伝子
に付随するＲＰＩに特異的なマウス抗体分子から得た遺伝子のスプライシングに
よるキメラ抗体の製造のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１６８５１−６８５５；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３１２６０４−６０８；Ｔａｋｅ
ｄａら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４４５２−４５４）を用いることができる
。このような抗体は、本発明の範囲に属するものである。（前記文献はそれぞれ
参照としてここに組み込まれる） 本発明次第では、一重鎖抗体の製造のための技術(参照としてここに組み込ま れる米国特許第４，９４６，７７８号）が、ＲＰＩ特異的な一重鎖抗体を製造す
るために用いられうる。本発明の付加的な実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリー
の構築のために記載された技術（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６ １２７５−１２８１）を利用し、迅速かつ容易なＲＰＩ、誘導体、または類似体
に望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の同定を可能にする。分子
のイディオタイプを含む抗体断片は公知の技術によって生成されうる。例えば、
そのような断片としては、抗体分子のペプシン処理によって製造されうるＦ（ａ
ｂ’）2断片、Ｆ（ａｂ’）2断片のジスルフィド架橋を還元することによって製
造されるＦａｂ’断片、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによっ
て製造されるＦａｂ断片、Ｆｖ断片、が含まれるがこられに限られるものではな
い。抗体の製造に際しては、所望の抗体のためのスクリーニングは、例えば、Ｅ
ＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）などの公知技術によって遂行 される。例えば、ＲＰＩの特定のドメインを認識する抗体を選択するためには、
そのようなドメインを含むＲＰＩ断片に結合する生成物のために、製造されたハ
イブリドーマを分析することができる。第一ＰＲＩホモローグに特異的に結合す
るが、異なるＲＰＩホモローグには特異的に結合しない抗体の選択のためには、
第一ＲＰＩホモローグへの能動的な結合および第二ＲＰＩホモローグへの結合の
欠如に基づいて選択することができる。同様に、ＲＰＩに特異的に結合するが、
同一のタンパク（例えば、ＲＰＩと同一のコアペプチドを有する、異なるグリコ
フォーム）の異なるイソ型には特異的に結合しない抗体の選択は、ＲＰＩへの能
動的な結合および異なるイソ型（例えば、グリコフォーム）への結合の欠如に基
づいて選択することができる。ＲＰＩのドメインに特異的な抗体も提供される。
前記抗体は、本発明のＲＰＩの位置および活性に関する技術的に公知の方法、例
えば、これらのタンパクのイメージ化、好適な生理学的なサンプルにおけるそれ
らのレベルの測定、診断方法などにおいて用いられる。 【０２１５】 ＲＰＩをコード化するＤＮＡの分離 ＲＰＩ遺伝子のクローニングのための特殊な実施形態を以下に例を用いて述べ
るが、これに限定されるものではない。ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、ＲＰＩもし
くは断片またはその類似体をコード化する配列からなる本発明のヌクレオチド配
列は、慣用的な化学的アプローチまたは重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ
チェーンリアクション（ＰＣＲ）増幅などの技術的に公知の方法を用いて合成さ
れうる。配列はいかなる種のＲＰＩ遺伝子の同定およびクローニングも提供し、
例えば、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノミックライブラリー、または発現ライブラ
リーのスクリーニングが挙げられる。本発明のＲＰＩをコード化する配列からな
るヌクレオチド配列は、他のタンパク遺伝子の相補的な伸長と選択的に二重鎖分
子を形成する能力において有用である。応用形態によるが、さまざまな配列同定
を遂行するために種々のハイブリダイゼーション条件が採用されうる。選択性の
度合いを高めるためには、塩が少なく温度が高い条件などの比較的緊縮した条件
が二重鎖を形成するために使用される。ここで使用されている「高度に緊縮した
条件（highlystringentconditions）」とは、６５℃の０．５Ｍ ＮａＨＰＯ4、
７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中において濾過器に
結合されたＤＮＡへハイブリダイゼーションし、６８℃の０．１ｘＳＳＣ／０．
１％ＳＤＳで洗浄することを意味する（全体が参照としてここに組み込まれるＡ
ｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．等，ｅｄｓ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅ
ｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク，ｐ．２．１０．３）。い
くつかの応用にあたっては、緊縮度合いがより少ないハイブリダイゼーション条
件が必要とされる。ここで用いられる「適度に緊縮した条件（moderatelystring
entconditions）」とは、４２℃の０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄する ことを意味する（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９，上記文献）。ハイブリダイゼー
ション条件は、ハイブリッド二重鎖を不安定化させるために、ホルムアミドの量
を増加することによってより緊縮したものとすることもできる。このように、特
定のハイブリダイゼーション条件は容易に操作されるものであり、一般的には所
望する結果に応じて選択される。例えば、５０％のホルムアミド存在下における
慣用的なハイブリダイゼーション温度は、ＲＰＩ遺伝子断片に対して９５〜１０
０％ホモローグであるプローブに対しては４２℃であり、９０〜９５％ホモロー
グの時は３７℃、７０〜９０％ホモローグの時は３２℃である。ゲノミックライ
ブラリーの調製にあたっては、その一部がＲＰＩの一部または全体をコード化す
るＤＮＡ断片が製造される。ＤＮＡは種々の制限酵素を用いて特定のサイトで開
裂することもできる。かわりに、ＤＮＡを断片化するためにマンガン存在下にお
いてＤＮアーゼを用いることもでき、または、例えば、超音波処理によってＤＮ
Ａを物理的にせん断することもできる。ＤＮＡ断片は、その後、一般的な技術に
よって大きさに従って分離される。方法としては、アガロースおよびポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、並びにショ糖勾配遠心法が
含まれるがこれらに限定されるものではない。ＤＡＮ断片はその後好適なベクタ
ー、プラスミド、コスミド、バクテリアファージラムダもしくはＴ４、およびイ
ースト人工クロモソーム（ＹＡＣ）が含まれるが限定されるものではない、に挿
入される。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（
ｅｄ．），１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，イギリス国 Ｖ
ｏｌ．Ｉ，ＩＩ；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら，ｅｄｓ．，１９８９，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ
．，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク参照）
。ゲノミックライブラリーは、標識されたプローブへの核酸ハイブリダイゼーシ
ョンによってスクリーニングすることもできる（Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖ
ｉｓ，１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９６ １８０；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ
Ｈｏｇｎｅｓｓ，１９７５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２ ３９６１）。ゲノミックライブラリーは、技術的に公知の最適なアプローチ
を用いて、ＲＰＩのいかなるペプチドのアミノ酸配列も対応する標識された変性
オリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングすることもできる。用いられ
るプローブは、１０ヌクレオチドまたはそれ以上であることが好ましく、１５ヌ
クレオチドまたはそれ以上であることがより好ましい。上記表VIII〜XIに示され
るように、ここで開示されるいくつかのＲＰＩは、その配列が公知である遺伝子
によってコード化された、以前に同定されたタンパクに対応するものである。そ
のような遺伝子をスクリーニングするために、その遺伝子またはその補体に相補
的ないかなるプローブを用いてもよい。プローブは１０ヌクレオチドまたはそれ
以上であることが好ましく、１５ヌクレオチドまたはそれ以上であることがより
好ましい。ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／でアクセ
ス可能なＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）に保持されているＥｎｔｒｅｚデータ
ベースは、以下の受け入れ番号によりこれらのＲＰＩに対応する遺伝子配列を提
供する。また、それぞれの配列はここに組み込まれる。 【０２１６】 表XII ＲＰＩ関連タンパクの遺伝子配列 ＲＡＤＦ ＃ＲＰＩ 受け入れ番号 ＲＡＤＦ−１ ＲＰＩ−１ Ｔ４００９０，Ｔ４００６８ ＲＡＤＦ−３ ＲＰＩ−３ ＡＡ５５１９２７，ＡＡ２６０５３１，Ｗ９７７
４１，Ｎ９９３６６，Ｔ７０５２６，Ｔ４０１７７，Ｔ４００６０，Ｔ４００３
４，Ｔ３９９１０，Ｔ３９８９４ ＲＡＤＦ−４ ＲＰＩ−４ Ｔ４１０１０，Ｔ４０１０２，Ｔ４００５８，Ｔ
３９９５４ ＲＡＤＦ−６ ＲＰＩ−５ ＡＡ２６９８７４ ＲＡＤＦ−８ ＲＰＩ−６ Ｚ２０８５８，ＡＡ５０３７６６，Ｈ５１３０８
，Ｈ０３３６５ ＲＡＤＦ−９ ＲＰＩ−７ Ｚ２０８５８，ＡＡ５０３７６６，Ｈ５１３０８
，Ｈ０３３６５ ＲＡＤＦ−１０ ＲＰＩ−８ Ｚ２１０２２，Ｚ１９９４７ ＲＡＤＦ−１１ ＲＰＩ−９ Ｔ４１０６３，Ｔ４１０２０，Ｔ４１００５，
Ｔ４０８８１，Ｔ４０１９０，Ｔ４０１３９，Ｔ４０１２５，Ｔ４０１１４，Ｔ
４００９６，Ｔ３９９０８ ＲＡＤＦ−１２ ＲＰＩ−１１ Ｔ４００９０，Ｔ４００６８ ＲＡＤＦ−１３ ＲＰＩ−１２ ＡＡ５５１９２７，ＡＡ２６０５３１，Ｗ９７
７４１，Ｎ９９３６６，Ｔ７０５２６，Ｔ４０１７７，Ｔ４００６０，Ｔ４００
３４，Ｔ３９９１０，Ｔ３９８９４ ＲＡＤＦ−１４ ＲＰＩ−１３ Ｔ４００９０，Ｔ４００６８ ＲＡＤＦ−１５ ＲＰＩ−１５ Ｔ４０９４０，Ｔ４０００２ ＲＡＤＦ−１６ ＲＰＩ−１６ Ｔ７３２４４，Ｔ７１０４３，Ｔ７１０３２，
Ｔ４０１８１，Ｔ４０１１６ ＲＡＤＦ−１８ ＲＰＩ−２１ Ｎ９９６４１，Ｎ９９４４５，Ｎ９９５２８，
Ｚ２０４８５，Ｚ２０４６５ ＲＡＤＦ−１９ ＲＰＩ−２２ ＡＡ２６９８７４ ＲＡＤＦ−２０ ＲＰＩ−２３ Ｚ２０８５８，ＡＡ５０３７６６，Ｈ５１３０
８，Ｈ０３３６５ ＲＡＤＦ−２２ ＲＰＩ−２４ Ｔ１９５２，Ｈ７３９３９，Ｚ２０８９４，Ｔ
４０１８２，Ｔ４０１６７，Ｔ４０１５８ ＲＡＤＦ−２３ ＲＰＩ−２５ ＡＡ６１４６８４，ＡＡ５２３３７７，ＡＡ７
１５９０７，ＡＡ５８０４２９，ＡＡ６３０２５４，ＡＡ６１７８５４，ＡＡ５
８０３５６ ＲＡＤＦ−２４ ＲＰＩ−２６ ＡＡ２６８２０１，Ｔ６４４１６，Ｔ６２１４
９，Ｔ４０１８６ ＲＡＤＦ−２５ ＲＰＩ−２７ Ｚ２１０１７，Ｚ２０８８８，Ｚ１９９８４，
Ｚ１９９７１，Ｔ４１０５６，Ｔ４０１０８ ＲＡＤＦ−２６ ＲＰＩ−２８ Ｔ１９５２，Ｈ７３９３９，Ｚ２０８９４，Ｔ
４０１８２，Ｔ４０１６７，Ｔ４０１５８ ＲＡＤＦ−２６ ＲＰＩ−２９ Ｚ２１０１７，Ｚ２０８８８，Ｚ１９９８４，
Ｚ１９９７１，Ｔ４１０５６，Ｔ４０１０８ ＲＡＤＦ−２６ ＲＰＩ−３０ Ｔ６４７０７ ＲＡＤＦ−２７ ＲＰＩ−３１ Ｚ２０８５８，ＡＡ５０３７６６，Ｈ５１３０
８，Ｈ０３３６５ ＲＡＤＦ−３２ ＲＰＩ−３３ Ｔ４００９０，Ｔ４００６８ ＲＡＤＦ−３３ ＲＰＩ−３４ Ｔ４００９０，Ｔ４００６８ ＲＡＤＦ−３５ ＲＰＩ−３６ Ｚ２１０２２，Ｚ１９９４７ ＲＡＤＦ−３６ ＲＰＩ−３７ Ｚ２０８５８，ＡＡ５０３７６６，Ｈ５１３０
８，Ｈ０３３６５ ＲＰＩ−１０、ＲＰＩ−１７、およびＲＰＩ−２０のそれぞれに関しては、以
下のような変質した一連のプローブが提供される。 （ａ） ＲＰＩ−１０に対するプローブ 【０２１７】 【化４】 【０２１８】 （ｂ） ＲＰＩ−１７に対するプローブ 【０２１９】 【化５】 【０２２０】 （ｃ） ＲＰＩ−２０に対するプローブ 【０２２１】 【化６】 【０２２２】 ＲＰＩまたはその断片をコード化する挿入ＤＮＡを有するライブラリーのクロ
ーンは、１またはそれ以上の変性オリゴヌクレオチドプローブ（またはそれらの
相補体）にハイブリダイゼーションする。そのようなオリゴヌクレオチドプロー
ブのゲノミックライブラリーへのハイブリダイゼーションは、技術的に公知の方
法を用いて実施される。例えば、上述した一連の変性したオリゴヌクレオチドプ
ローブもしくはそれらの相補体と（または、そのような一連のものもしくは相補
体の１つと）のハイブリダイゼーションは、前記高度に緊縮した条件、または適
度に緊縮した条件下において実施される。または、５５℃の２Ｘ ＳＳＣ、１．
０％ＳＤＳ中で実施し、同条件で洗浄する。さらに他の観点においては、ＲＰＩ
もしくはＲＰＩ誘導ポリペプチドの一部または全体をコード化するヌクレオチド
配列のクローンを、発現ライブラリーのスクリーニングによって得ることもでき
る。例えば、ベクターが導入されるホストセルによってベクター内に挿入された
配列が発現しうるように、関連するソースからのＤＮＡが分離され、ランダム断
片が調製され、発現ベクター中（例えば、バクテリオファージ、プラスミド、フ
ァージミド、またはコスミド）にライゲーションされる。種々のスクリーニング
分析がその後、発現したＲＰＩまたはＲＰＩ誘導ポリペプチドに対する選択のた
めに使用されうる。ある実施形態においては、本発明の種々のアンチＲＰＩ抗体
は、技術的に公知の方法を用いて、所望のクローンを同定するために使用されう
る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，ＮＹ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＶ参照。ライブラリーからのクローンまたは
プラークは、結合するそれらのクローンを同定するために抗体と接触するように
される。ある実施形態においては、ＲＰＩもしくはＲＰＩ誘導ポリペプチドをコ
ード化するＤＮＡを含んでなるクローンまたはプラークは、ここに参照として組
み込まれるＯｌｓｖｉｃｋら，２９ｔｈ ＩＣＡＡＣ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ
．１９８９に従い、ＤＹＮＡビーズを用いて検出することができる。アンチＲＰ
Ｉ抗体はトシル化されたＤＹＮＡビーズＭ２８０に架橋され、その後、これらの
抗体を含むビーズは、ＲＰＩもしくはＲＰＩ誘導ポリペプチドを発現するクロー
ンまたはプラークに吸着するために使用される。ＲＰＩもしくはＲＰＩ誘導ポリ
ペプチドを発現するクローンまたはプラークは、ビーズに結合するこれらのいず
れかとして同定される。かわりに、アンチＲＰＩ抗体は、シリカやＣｅｌｉｔｅ
（登録商標）樹脂のような好適な単体に非特異的に固定されうる。その後、この
物質は、前節に記載したように、ＲＰＩタンパクまたはＲＰＩ誘導ポリペプチド
を発現する細菌性コロニーに吸着するために使用される。他の観点においては、
ＰＣＲ増幅が、ゲノミックＤＮＡからのＲＰＩの一部または全体をコード化する
十分に純粋なＤＮＡを製造するために使用されうる。公知のＲＰＩ配列に対応す
るオリゴヌクレオチドプライマー、変質物、その他のものは、プライマーとして
使用されうる。例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ｔｈｅｒｍａｌ
ｃｙｃｌｅｒ ａｎｄ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ（
登録商標））によって、ＰＣＲは実施されうる。ＰＣＲ反応において使用するた
めに、数種の異なる変性プライマーを合成することを選択することができる。変
質プライマーとＤＮＡ中の対応する配列とのヌクレオチド配列類似性の度合いを
向上または減少させるために、ＰＣＲ反応のプライミングの際に用いられるハイ
ブリダイゼーション条件の緊縮度を変化させることも可能である。ＲＰＩをコー
ド化する配列のセグメントの連続した増幅後、セグメントは分子的にクローニン
グ、および配列され、完全なゲノミッククローンを分離するためプローブとして
利用される。前記文献に記載したように、これにより、遺伝子の完全なヌクレオ
チド配列、その発現の分析、および機能的な分析のためのそのタンパク生成物の
製造が順番に可能となる。ＲＰＩ遺伝子はインビトロ翻訳を伴う核酸ハイブリダ
イゼーションによるｍＲＮＡ選択によっても同定することができる。この手法に
おいては、断片はハイブリダイゼーションによる相補性ｍＲＮＡを分離するため
に使用される。そのようなＤＮＡ断片は、入手可能な他の種（例えば、マウス、
ヒト）の精製ＲＰＩ ＤＮＡを再現することができる。分離されたｍＲＮＡの分
離生成物のインビトロ翻訳生成物の免疫沈降分析または機能分析（例えば、イン
ビトロでの凝集能力、レセプターへの結合）によりｍＲＮＡが同定され、したが
って所望の配列を含む相補性ＤＮＡ断片が同定される。さらに、ＲＰＩに対して
特異的な固定された抗体への、細胞から分離されたポリソームの吸着によって特
異的ｍＲＮＡを選択することができる。放射線標識されたＲＰＩ ｃＤＮＡは、
テンプレートとして選択された（吸着ポリソームからの）ｍＲＮＡを用いて合成
することができる。放射線標識されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、その後、他の
ゲノミックＤＮＡ断片中からＲＰＩ ＤＮＡ断片を同定するためにプローブとし
て使用することができる。分離されたＲＰＩゲノミックＤＮＡの代用としては、
公知の配列からの遺伝子配列そのものの化学合成、またはＲＰＩをコード化する
ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡの調製が含まれるがこられに限定されるものではない
。例えば、ＲＰＩ遺伝子ｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡは、ＲＰＩを発現
する細胞から分離することができる。他の方法も可能であり、本発明の範囲に含
まれるものである。 【０２２３】 いずれの真核生物細胞も、潜在的にＲＰＩ遺伝子の分子クローニングのための
核酸ソースとして作用しうる。ＲＰＩをコード化する核酸配列は、霊長類ソース
、昆虫、植物などに加えて、脊椎動物、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ
、ウマ、イヌ、から分離することができる。ＤＮＡは、化学合成によって、ｃＤ
ＮＡクローニングによって、またはゲノミックＤＮＡもしくはその断片のクロー
ニングによってクローンＤＮＡ（例えば、ＤＮＡライブラリ）から技術的に一般
的な公知の手法によって得ることができ、所望の細胞から精製される（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．），１９８５，
ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，イギリス国Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ．参照）
ゲノミックＤＮＡから誘導されたクローンは、コード化領域に加えて調節および
イントロン領域を含んでいてもよく、ｃＤＮＡから誘導されたクローンはエクソ
ン配列のみを含むものである。ソースが何であれ、ＲＰＩ遺伝子は、調製のため
に好適なベクター内に分子的にクローンされるべきである。同定され分離された
遺伝子またはｃＤＮＡは、その後、好適なクローニングベクター内に挿入されう
る。技術的に公知の多数のベクター−ホスト系を使用することが可能である。可
能なベクターとしては、プラスミド、変性ウイルスが含まれるがこれらに限られ
るものではない。しかし、ベクター系は使用されるホスト細胞に適合するもので
なければならない。そのようなベクターとしては、ラムダ誘導体のようなバクテ
リオファージ、ＰＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体またはＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなプラスミドが含まれるが
これらに限られるものではない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相
補的な相補末端を有するクローニングベクターへのＤＮＡ断片のライゲーション
によって実施することができる。しかし、もしＤＮＡを断片化するために用いら
れる相補的な制限サイトがクローニングベクターには存在しなければ、ＤＮＡ分
子の末端を酵素的に変性することができる。かわりに，所望のいかなるサイトを
ＤＮＡ末端へのヌクレオチド配列（リンカー）のライゲーションによって作製す
ることもでき、これらのライゲーションされるリンカーは、制限エンドヌクレア
ーゼ認識配列をコード化する化学合成された特異的なオリゴヌクレオチドを含ん
でいてもよい。代用方法においては、開裂したベクターおよびＲＰＩ遺伝子は、
ホモポリマー性テーリングによって変性されてもよい。遺伝子配列の多数のコピ
ーを生成するために、組換え分子を形質転換、形質移入、感染、エレクトロポレ
ーションなどによってホスト細胞中に導入することができる。特殊な実施形態に
おいては、分離されたＲＰＩ遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ分子を組み込
んだ組換えＤＮＡ分子でのホスト細胞の形質転換により、遺伝子の多様なコピー
の製造が可能になる。このように、遺伝子は形質転換物を成長させ、形質転換物
から組換えＤＮＡ分子を分離し、必要とあれば分離組換えＤＮＡから挿入された
遺伝子を検索することによって大量に得ることができる。本発明によって提供さ
れるＲＰＩ配列は、天然ＲＰＩにおいて確認されるものとほぼ同一であるアミノ
酸配列をコード化するヌクレオチド配列、および機能的に同等なアミノ酸を有す
るアミノ酸配列をコード化した配列、それに、他のターゲット誘導体およびその
類似体をコード化する配列を含むがこれらに限られるものではない。 【０２２４】 ＲＰＩをコード化するＤＡＮの発現 ＲＰＩもしくは機能的に活性な類似体もしくはその断片または誘導体をコード
化するヌクレオチド配列は、好適な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパ
ク質コード化配列の転写および翻訳のために必要な要素を含むベクター、中に挿
入することができる。必要な転写のおよび翻訳のシグナルは、天然ＲＰＩ遺伝子
またはその側面領域によって供給することができる。種々のホスト−ベクター系
を、タンパク質コード化配列を発現させるために利用することができる。これら
としては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感
染した哺乳類細胞株、ウイルス（バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞株、イ
ーストベクターを含むイーストにような微生物、またはバクテリオファージ、Ｄ
ＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換されたバクテリア
が含まれるがこれらに限定されるものではない。ベクターの発現要素は、強度お
よび特異性において異なる。利用されるホスト−ベクター系によって、いくつか
の好適な転写および翻訳要素の一つが使用されうる。特殊な実施形態においては
、ヒトＲＰＩ遺伝子、またはヒトＲＰＩの機能的に活性な部分をコード化する配
列が発現される。さらに他の実施形態においては、ＲＰＩのドメインを含んでな
るターゲットの断片が発現される。 【０２２５】 好適な転写および翻訳制御シグナル並びにタンパク質コード化配列からなるキ
メラ遺伝子を含んでなる発現ベクターを構築するために、ベクター内へのＤＮＡ
断片の挿入に関して以前に記載されたいかなる方法を用いることもできる。これ
らの方法はインビトロ組換えＤＮＡおよび合成方法並びにインビボ組換え体（遺
伝学的組換え）を含む。ＲＰＩおよびペプチド断片をコード化する核酸配列の発
現は、第２核酸配列によって調節され、組換えＤＮＡ分子で形質転換されたホス
トにおいてＲＰＩまたはペプチドが発現する。例えば、ＲＰＩの発現は、技術的
に公知のいかなるプロモーターまたはエンハンサー要素によっても制御すること
ができる。ＲＰＩ遺伝子発現を制御するために用いられるプロモーターとしては
、ＳＶ４０早期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１
９８１，Ｎａｔｕｒｅ２９０３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末
端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ２２ ７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，
１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８１４４１−１４
４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９８２
，Ｎａｔｕｒｅ２９６３９−４２）、β−ラクタマーゼプロモーターのような原
核細胞発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５３７２７−３７３１）、またはｔａｃ
プロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８０２１−２５）が含まれるがこれらに限られるものではない。Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２７４−９４記載の組
換えバクテリアから得られた有用なタンパク；ノパリンシンセターゼプロモータ
ー領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら，Ｎａｔｕｒｅ３０３２０９−２
１３）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Ｇａ
ｒｄｎｅｒら，１９８１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９２８７１）および
光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒ
ｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３１０１１５−１２０
）からなる植物発現ベクター；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（ａｌｃｏｈｏｌ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）プロモーター、ＰＧＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙ
ｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｓｅ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモータ
ー、および組織特異性を示し、膵腺房細胞において活性なトランスジェニック動
物エラスターゼＩ遺伝子制御領域において活用される以下の動物転写制御領域、
のようなイーストもしくは他の菌類から得たプロモーター要素（Ｓｗｉｆｔら，
１９８４，Ｃｅｌｌ３８６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０３９９
−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７４２５−５
１５）；膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ
，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５１１５−１２２）、リンパ球において活性なイ
ムノグロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８ ６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら， １９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１８５３３
−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７ １４３６−１４４４）、精巣、胸部、リンパ球、および肥満細胞において活性な
マウス***腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ４５４８
５−４９５）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ
ら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１２６８−２７６）、肝臓に
おいて活性なアルファフェトタンパク遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１
９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら
，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５５３−５８）；肝臓において活性なアルファ
１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ
ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１１６１−１７１）、脊髄細胞において活性なベータグ
ロビン遺伝子領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５３３８−３
４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ４６８９−９４）；脳の乏突起膠
細胞において活性なミエリン塩基性タンパク遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ
ら，１９８７，Ｃｅｌｌ４８７０３−７１２）；骨格筋において活性なミオシン
軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４２８３−２
８６）、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制
御領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４１３７２−１３７８）
も参照される。特殊な実施形態においては、操作可能なようにＲＰＩコード化核
酸に結合したプロモーター、１またはそれ以上の複写源、および、場合によって
は１またはそれ以上の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質抵抗性の遺伝子）
からなるベクターが使用される。特殊な実施形態においては、発現構成は、３つ
のｐＧＥＸベクター（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ発現ベクター；Ｓｍ
ｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，１９８８，Ｇｅｎｅ７３１−４０）それぞれのＥ
ｃｏＲＩ制限サイトに、ＲＰＩをコードする配列をサブクローニングすることに
よって成される。これにより、正しいリーディングフレームにおいてサブクロー
ンからのＲＰＩ生成物の発現が可能になる。ＲＰＩ遺伝子挿入を含んでなる発現
ベクターは３つの一般的なアプローチ、（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（
ｂ）マーカー遺伝子機能の存在または欠如、および（ｃ）挿入された配列の発現
、によって同定されうる。第一のアプローチにおいては、発現ベクターに挿入さ
れたＲＰＩ遺伝子の存在は、挿入されたＲＰＩ遺伝子にホモローグである配列を
含んでなるプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出すること
ができる。第２のアプローチにおいては、組換えベクター／ホスト系は、ベクタ
ー中のＲＰＩ遺伝子の挿入によって引き起こされる、あるマーカー遺伝子機能（
例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質抵抗性、形質転換フェノタイプ、バキ
ュロウイルスにおけるオクルージョン体形成など）の存在または欠如に基づいて
同定され、選択される。例えば、もしＲＰＩ遺伝子がベクターのマーカー遺伝子
配列内に挿入されれば、ＲＰＩ遺伝子挿入を含んでなる組換え体はマーカー遺伝
子機能の欠如によって同定することができる。第３のアプローチにおいては、組
換え発現ベクターは組換え体によって発現されるＲＰＩ遺伝子生成物を分析する
ことによって同定することができる。そのような分析は、例えば、インビトロ分
析システムにおけるＲＰＩの物理的または機能的な特性、例えば、アンチＲＰＩ
抗体との結合に基づくものでありうる。特定の組換えＤＮＡ分子が同定および分
離されると、技術的に公知の数種の方法がそれを増殖させるために用いられうる
。好適なホストシステムおよび成長条件が設定されると、組換え発現ベクターは
増殖され、大量に調製される。前記説明したように、使用されうる発現ベクター
としては、いくつかの例を挙げると、以下のベクターおよびその誘導体、ワクシ
ニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス；バキュロ
ウイルスのような昆虫ウイルス；イーストベクター；バクテリオファージベクタ
ー（例えば、ラムダ）、並びにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター、が含
まれるがこられに限られるものではない。加えて、挿入された配列の発現を調節
する、または所望の特殊な方法で遺伝子生成物を変性し加工するホスト細胞株を
選択することができる。あるプロモーターからの発現は、ある誘導物質の存在下
において上昇させることができる。このように遺伝子工学的に加工されたＲＰＩ
の発現を制御しうる。さらに、異なるホスト細胞は、翻訳中のおよび翻訳後の加
工および変性（例えば、タンパクの糖付加、リン酸エステル化）に関する固有で
特異的なメカニズムを有する。発現された外来タンパクに所望の変性および加工
を確保するために、好適な細胞株またはホストシステムを選択することができる
。例えば、糖付加されていないコアタンパク生成物を製造するために、細菌性シ
ステムにおける発現を用いることができる。イーストにおける発現により糖付加
生成物が製造される。哺乳類細胞における発現は、ヘテロローグタンパクの天然
糖付加を確実にするために使用されうる。さらに、ベクター／ホスト発現系が異
なると、加工反応への影響も異なるものとなりうる。組換えタンパクの長期間、
高収率生成のためには安定した発現が好ましい。例えば、差別的に発現されたま
たは経路遺伝子タンパクを安定的に発現する細胞株が設計されてもよい。複写の
ウイルス起源を含む発現ベクターを使用するよりも、好適な発現制御要素（例え
ば、プロモーター、エンハンサー、シーケンサー、転写ターミネーター、ポリア
デニレーションサイトなど）および選択可能なマーカーによって制御されたＤＮ
Ａで、ホスト細胞を形質転換する方が好ましい。外来ＤＮＡの導入に続いて、設
計された細胞を１〜２日間強化培地において成長させ、その後選択性の培地に切
り替えることができる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に抵抗
力を与え、細胞が安定的にプラスミドをクロモソームと結合させ、成長して、順
にクローニングされ細胞株内に展開されるフォーカスを形成することを可能にす
る。この方法は、差別的に発現されたまたは経路遺伝子タンパクを発現する細胞
株を設計するために好適に使用されうる。そのような設計された細胞株は、差別
的に発現されたまたは経路遺伝子タンパクの内因性活性に影響を及ぼす化合物の
スクリーニングおよび評価において特に有用でありうる。多数の選択システムを
使用することができ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら
，１９７７，Ｃｅｌｌ１１２２３）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８２０２６）、およびアデニンフ
ォスフォリボシールトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，１９８０，Ｃｅｌｌ２２ ８１７）遺伝子が、それぞれｔｋ-，ｈｇｐｒｔ-またはａｐｒｔ-細胞において 採用されうるがこれらに限られるものではない。また、アンチメタボライト耐性
が、耐性をメトトレキセートに付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら，１９８０，
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７３５６７；Ｏ´Ｈａｒｅら，１９８ １，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８１５２７）、マイコフ
ェノル酸に耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８２０７２）、アミノグリコシ
ドＧ−４１８に耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，
１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０１）、ヒグロマイシンに耐性を付与す
るｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，１９８４，Ｇｅｎｅ３０１４７）遺伝子に
対する選別の基礎として用いられうる。他の特殊な実施形態においては、ＲＰＩ
、断片、類似体、および誘導体が、（（異なるタンパクの）ヘテロローグタンパ
ク配列に結合したペプチドを解して結合したタンパク、断片、類似体、または誘
導体からなる）融合体またはキメラタンパク生成物として発現されうる。そのよ
うなキメラ生成物は、所望のアミノ酸配列をコード化する好適な核酸配列を、技
術的に公知の方法を用いて適切なコーディングフレームにおいて互いにライゲー
ションし、技術的に一般的に知られた方法によってキメラ生成物を発現すること
によって成される。かわりに、そのようなキメラ生成物はタンパク合成技術によ
って、例えば、ペプチド合成機の使用によって成すこともできる。ｃＤＮＡおよ
びゲノミック配列の双方がクローニングされ、発現しうる。 【０２２６】 ＲＰＩの治療上の使用 本発明は治療上の化合物の投与による種々の疾病および疾患の治療並びに予防
を提供する。そのような化合物としては、ＲＰＩおよび類似体並びに（断片を含
む）それらの誘導体（例えば、ここに記載したようなもの）；その抗体（ここに
記載）；ＲＰＩ、類似体、または誘導体（ここに記載）をコード化する核酸；Ｒ
ＰＩ遺伝子アンチセンス核酸並びにＲＰＩ遺伝子作動薬および拮抗剤が含まれる
がこれらに限られるものではない。ここに記載されたように、本発明の重要な特
性は、リウマチ様関節炎に含まれるＲＰＩ遺伝子の同定である。関節炎は、ＲＡ
患者の血清に対して関節液において減少するＲＰＩの機能もしくは発現を促進す
る、治療上の化合物を投与することによって治療または予防されうる。関節炎は
、ＲＡ患者の血清に対して関節液において増加するＲＰＩの機能または発現を低
下させる治療上の化合物の投与によっても治療または予防されうる。一般的に、
種の起源または（抗体の場合には）種の反応性が患者の化合物と同じ種である化
合物を投与することが好ましい。このように、好ましい実施形態においては、治
療または予防のために、ヒトＲＰＩ、誘導体、もしくは類似体、もしくは核酸、
またはヒトＲＰＩに対する抗体がヒト患者に投与される。 【０２２７】 リウマチ様関節炎の治療および予防 リウマチ様関節炎は、ＲＡを有する被験者の血清に対して関節液において減少
する１もしくはそれ以上のＲＰＩのレベルもしくは機能、または１もしくはそれ
以上のＲＡＤＦのレベルを促進する（すなわち、増加または供給する）化合物の
投与によって、治療または予防される。そのような化合物の例としては、機能的
に活性で、特にインビトロ分析または動物モデルにおいて活性であることが証明
されるＲＰＩ、誘導体、または断片、並びにＲＰＩもしくは機能的に活性な誘導
体またはその断片（例えば、遺伝子治療においての使用のため）をコード化する
核酸が含まれるがこれに限られるものではない。使用されうる他の化合物、例え
ばＲＰＩ作動薬は、インビボ分析を用いて同定されうる。リウマチ様関節炎は、
ＲＡを有する被験者の血清に対して関節液において増加量を示す１もしくはそれ
以上のＥＰＩのレベルもしくは機能、または１もしくはそれ以上のＲＡＤＦのレ
ベルを阻害する（すなわち減少する）化合物の投与によっても治療されまたは予
防される。そのような化合物の例としては、ＲＰＩアンチセンスオリゴヌクレオ
チド、リボザイム、またはＲＰＩに対して検出される抗体が含まれるがこれらに
限られるものではない。使用されうる他の化合物、例えば、ＲＰＩ拮抗薬は、イ
ンビトロ分析を用いて同定できる。特殊な実施形態において、１もしくはそれ以
上のＲＰＩのレベルもしくは機能、または１もしくはそれ以上のＲＡＤＦのレベ
ルを促進する化合物は、治療的に（ＲＰＩレベルもしくは機能、またはＲＡＤＦ
レベルの欠如や減少（通常のまたは好ましいものと比較して）が、ＲＡ患者の血
清と比較してＲＡ患者の関節液において同定されたときは予防的にも）投与され
る。他の実施形態においては、ＲＰＩのレベルもしくは機能、またはＲＡＤＦの
レベルを阻害する化合物が治療的に（ＲＰＩレベルもしくは機能、またはＲＡＤ
Ｆレベルの増加（通常のまたは好ましいものと比較して）が、ＲＡ患者の血清と
比較してＲＡ患者の関節液において同定されたときは予防的に）投与される。そ
のような化合物の投与によるＲＰＩ機能もしくはレベルまたはＲＡＤＦレベルの
変化は、例えば、患者の組織サンプルを得て（例えば、生検で）、インビトロに
おいてＲＮＡもしくはタンパクレベルまたは表現されたＲＰＩ ＲＮＡもしくは
タンパクの活性を分析することによって容易に同定することができる。「好まし
い技術」も、化合物投与の前後においてＲＰＩまたはＲＡＤＦのレベルを検出す
るために使用されうる。技術的に一般的な多種の方法がこのように用いられ、キ
ナーゼ分析、ＲＰＩを検出および／または視覚化するためのイムノアッセイ（例
えば、ウェスタン法、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
を伴う免疫沈降、免疫細胞化学など）、および／またはＲＰＩをコード化するｍ
ＲＮＡをそれぞれ検出および／または視覚化することによってＲＰＩ表現を検出
するためのハイブリダイゼーション分析（例えば、ノーザン法、ドットブロット
、インサイチュハイブリダイゼーション、など）、などが含まれるがこれらに限
られるものではない。本発明の化合物としては、例えば、その化合物が非ステロ
イドの炎症剤（ＮＳＡＩＤ）（例えば、プレドニゾン、イブプロフェン、フェノ
プロフェン、ケトプロフェン、フルルブプロフェン、インドメタシン、スリンダ
ク、アスピリン、サリチルサリチル酸、ジフルニサル、ナプロキセン、ピロキシ
カム、テノキシカム、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン）ではない条件
の下で、ＲＡ ＲＰＩまたはＲＡＤＦプロフィールを通常にまで回復させる小さ
な有機分子、タンパク、ペプチド、抗体、核酸など、金塩、Ｄ−ペニシラミン、
ヒドロキシクロロキン、またはサルファサルアジンのような抗マラリア薬、アザ
チオプリン、シクロホスファミド、クロランブシル、メトトレキセート、コルチ
コステロイド、アンチ−ＣＤ４モノクローナル抗体、並びにアンチ−ＣＤｗ５２
抗体が含まれるがこれらのいずれいも限られるものではない。 【０２２８】 遺伝子治療 特殊な実施形態において、ＲＰＩまたはそれらの機能的な誘導体をコード化し
た配列を含む核酸は、ＲＰＩ機能を促進するために遺伝子治療の手法によって投
与される。遺伝子治療は、発現された、または、発現可能な核酸物質を投与する
ことによって行われる治療のことである。本発明のこの実施形態において、該核
酸は、ＲＰＩ機能を促進することによって治療的効果を仲介する、コードされた
タンパク質を生産する。当業界で使用され得る遺伝子治療の任意の方法が、本発
明に従って使用され得る。模範的な方法を以下に記載する。遺伝子治療方法の一
般的な報告として、Goldspiel等, 1993, Clinical Pharmacy 12488-505； Wuお よびWu, 1991, Biotherapy 387-95； Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol . 32573-596；Mulligan, 1993, Science 260926-932；ならびに、Morga
nおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62191-217； May, 1993, TIBTEC
H 11(5)155-215)が参照される。当業界で周知の使用される組換えＤＮＡ技術の 方法は、Ausubel等，(eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, NY；および Kriegler, 1990, Gene Transfer and Express
ion, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYで説明されている。好ましい観
点において、その化合物は、ＲＰＩをコード化した核酸、好ましい宿主中でＲＰ
Ｉまたはそれらの断片もしくはキメラタンパク質を発現する発現ベクターの部分
である前記核酸を含む。特に、このような核酸は、ＲＰＩコード領域に操作可能
に（operably）結合したプロモーター、誘導性または構成性および任意に組織特
異的な前記プロモーターを有している。他の特別な実施形態において、核酸分子
が用いられ、その際、ＲＰＩコード配列および他の任意の望ましい配列が、ゲノ
ム中の望ましい部位における相同性組換えを促進するような領域の側に配置され
、このようにしてＲＰＩ核酸の染色体内発現に供給される（KollerおよびSmithi
es, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 868932-8935； Zijlstra等, 1989, Nat
ure 342435-438）。核酸の患者への運搬が、直接的であれば、患者は直接的に該
核酸または核酸を含むベクターにさらされ、または、間接的であれば、細胞は最
初にインビトロで核酸により形質転換され、次に患者中に移植される。これら二
つのアプローチが、それぞれインビボまたはインビトロの遺伝子治療として知ら
れている。特別な実施形態において、該核酸は直接的にインビボで投与され、発
現され、コード化した生産物を生産する。このような核酸は任意の当業界で周知
の膨大な方法によって行われ、例えばそれを適切な核酸発現ベクターの一部とし
て構築し、細胞内に導入するためにそれを投与する、例えば欠損もしくは弱毒化
レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染（例えば、米国特許第
４，９８０，２８６号）、もしくは、裸のＤＮＡの直接注射、もしくは、マイク
ロバーティクル照射（microparticle bombardment）(例えば、a gene gun； Bio
listic, Dupont）、もしくは、脂質または細胞表面受容体またはトランスフェク
ション因子（transfecting agents）、リポゾーム、マイクロパーティクル（mic
roparticles）もしくはマイクロカプセル（microcapsules）によるカプセル封入
によるコーティング、または、核に入ることが知られているペプチドへの結合に
おける投与、受容体仲介エンドサイトーシスを受けるリガンドへの結合における
投与（例えばWuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 2624429-4432）（これらは特 異的に受容体を発現するターゲット細胞に対して使用される）等によって行われ
る。他の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され、該リガンドは紡
錘状（fusogenic）のウイルスペプチドを含み、これによりエンドゾームを破砕 させ、核酸がリソソーム性分解を受けないようにする。さらに他の実施形態にお
いて、該核酸はインビボで、特異的な受容体をターゲットにすることによって細
胞の特異的な取り込みおよび発現に関してターゲットにされる（例えば１９９２
年４月１５日のＰＣＴ出願ＷＯ９２／０６１８０（Wu等)；１９９２年１２月２ ３日のＷＯ９２／２２６３５（Wilson等）；１９９２年１１月２６日のＷＯ９２
／２０３１６（Findeis等）；１９９３年７月２２日のＷＯ９３／１４１８８（C
larke等）,１９９３年１０月１４日のＷＯ９３／２０２２１（Young）を参照） 。あるいは、該核酸は、細胞内に導入され、宿主細胞の発現のためのＤＮＡと相
同組換えによって結合する（KollerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 868932-8935； Zijlstra等, 1989, Nature 342435-438）。他の実施形
態において、ＲＰＩをコードする核酸を含むウイルスベクターが使用される（Mi
ller等, 1993, Meth. Enzymol. 217581-599）。これらのレトロウイルスは、ウ イルスゲノムのパッケージングや宿主細胞ＤＮＡへの統合に必要ないレトロウイ
ルス配列を削除することによって改変されてある。遺伝子治療で使用されるＲＰ
Ｉをコード化した核酸はベクターにクローニングされ、これは患者への遺伝子運
搬を促進する。レトロウイルスベクターに関するより詳細なことは、Boesen等,
1994, Biotherapy 6291-302で見出され、これはｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に 運搬して該幹細胞を化学療法に対して体制を持たせるために、レトロウイルスベ
クターを使用することが説明されている。遺伝子治療におけるレトロウイルスの
使用を説明した他の参考文献として、Clowes等, 1994, J. Clin. Invest. 93644
-651； Kiem等, 1994, Blood 831467-1473；Salmons and Gunzberg, 1993, Huma
n Gene Therapy 4129-141； and GrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. in
Genetics and Devel. 3110-114が挙げられる。アデノウイルスは、呼吸肺細胞 に遺伝子を運搬するための特に有効なベヒクル（vehicles）である。一般的に、
アデノウイルスは呼吸肺細胞に感染し、軽い病気を引き起こす。アデノウイルス
−ベースの運搬システムに関する他のターゲットは、肝臓、中枢神経系、内皮細
胞および筋肉である。アデノウイルスは非***細胞に感染することができる利点
を持つ。KozarskyおよびWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Deve
lopment 3499-503において、アデノウイルス−ベースの遺伝子治療の報告がなさ
れている。Bout等, 1994, Human Gene Therapy 53-10において、アカゲザルの呼
吸肺細胞へ遺伝子を輸送するためにアデノウイルスを使用することが示されてい
る。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例として、 Rosenfeld等,
1991, Science 252431-434； Rosenfeld等, 1992, Cell 68143-155； Mastrange
li等, 1993, J. Clin. Invest. 91225-234； ＰＣＴ公報WO94/12649；およびWan
g等, 1995, Gene Therapy 2775-783等が見出されている。アデノ関連ウイルス（
ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されている（Walsh等, 1993, P
roc. Soc. Exp. Biol. Med. 204289-300； U.S. Patent No. 5,436,146）。遺伝
子治療に関する他のアプローチは、例えばエレクトロポレーション（electropor
ation）、リポフェクション（lipofection）、リン酸カルシウム仲介トランスフ
ェクション（calcium phosphate mediated transfection）またはウイルス感染 の方法によって組織培養中に細胞に遺伝子をトランスファーさせることを含む。
通常、トランスファー方法は、選択可能なマーカーを細胞にトランスファーする
ことを含む。該細胞は次に選択され、トランスファーされた遺伝子を取り込み発
現している細胞を分離する。これらの細胞は次に患者に適用される。この実施形
態において、生じた組換え細胞をインビボで投与する前に、この核酸が細胞に導
入される。このような導入は、これらに限定されないが、例えばトランスフェク
ション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含む
ウイルスまたはバクテリオファージベクターの注入、マイクロセル仲介遺伝子ト
ランスファー（microcell-mediated gene transfer）、スフェロプラスト融合（
spheroplast fusion）等の当業界で周知の任意の方法によって行われる。外来遺
伝子を細胞に導入する膨大な技術が当業界で周知であり（例えばLoefflerおよび
Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217599-618； Cohenおよび, 1993, Meth. Enzymol
. 217618-644； Cline, 1985, Pharmac. Ther. 296992を参照）、本発明により 使用され、受容細胞の必要な開発的、物理的機能が失われない。該技術は、細胞
への核酸の安定したトランスファーを提供し、そのために該核酸は該細胞によっ
て発現可能であり、好ましくは遺伝的であり、その細胞の後代によって発現可能
である。生じた組換え細胞は、当業界で周知のさまざまな方法によって患者に輸
送される。好ましい実施形態において、上皮細胞が、例えば皮下注射によって注
入される。他の実施形態において、組換え皮膚細胞は患者への皮膚移植として適
用できる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞、前駆細胞）は、好ましくは静
脈注射によって投与される。使用を考えた細胞の量は、望ましい効果、患者の状
態等に依存しており、当業者によって決定される。遺伝子治療の目的で核酸が導
入された細胞は、任意の望ましい、使用可能な細胞型を含み、これらに限定され
ないが、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；例え
ばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、
顆粒球等の血液細胞；さまざまな幹細胞または前駆細胞、特に造血肝または前駆
細胞、例えば骨髄、臍帯血（umbilical cord blood）、末梢血液、胎児肝等であ
る。好ましい実施形態において、遺伝子治療に用いられる細胞は、患者に対して
事故由来である。組換え細胞が遺伝子治療において使用される実施形態において
、ＲＰＩをコード化した核酸は細胞に導入され、該細胞またはそれらの前駆対に
よって発現され、組換え細胞は次に治療効果のためにインビボで投与される。特
殊な実施形態において、肝細胞または前駆細胞が使用される。分離されインビト
ロで維持されうる任意の肝細胞および／または前駆細胞は、本発明のこの実施形
態に従って潜在的に使用され得る（例えば、１９９４年４月２８日のＰＣＴ公開
番号ＷＯ94/08598号； Stemple and Anderson, 1992, Cell 71973-985； Rheinw
ald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A229；ならびにPittelkowおよびScott, 1986, M
ayo Clinic Proc. 61771を参照）。特異的な実施形態において、遺伝子治療の目
的のために導入された核酸は、例えば核酸の発現が、適切な転写のインデューサ
ーの存在または非存在を制御することによって制御されるような、コード化した
領域に手術的に結合できる誘導性プロモーター（inducible promoter）を含む。 【０２２９】 ＲＰＩアンチセンス核酸 ＲＰＩアンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドを有し、好ましくはオ
リゴヌクレオチド（６〜約５０オリゴヌクレオチド）である。特定の形態におい
ては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌ
クレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、または少なくとも２００ヌクレオ
チドである。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物ま
たは誘導体またはこれらの修飾形態であってもよく、１本鎖であってもまたは２
本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、塩基部分で、糖部分で、またはホ
スフェート主鎖(phosphate backbone)で修飾されてもよい。 【０２３０】 オリゴヌクレオチドとしては、ペプチド等の他の付随する基(appending group
)、または細胞膜での輸送を容易にする物質（例えば、Letsinger 等., 1989, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553-6556； Lemaitre 等., 1987, Proc. Natl.
Acad. Sci. 84, 648-652； １９８８年１２月１５日に公開された、ＰＣＴ公報
番号ＷＯ ８８／０９８１０号を参照）または血液脳関門（例えば、１９８８年
４月２５日に公開された、ＰＣＴ公報番号ＷＯ ８９／１０１３４号を参照）、
ハイブリダイゼーションを開始させる切断物質(hybridization-triggered cleav
age agent)（例えば、Krol 等., 1988, BioTechniques 6, 958-976を参照）また
はインターカレーション物質(intercalating agent)（例えば、 Zon, 1988, Pha
rm. Res. 5, 539-549を参照）が挙げられる。 【０２３１】 本発明の好ましい形態において、ＲＰＩアンチセンスオリゴヌクレオチドが、
好ましくは１本鎖のＤＮＡで提供される。オリゴヌクレオチドは、当該分野にお
いて通常既知である置換基でその構造物のいずれかの位置で修飾されてもよい。
ＲＰＩアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下に制限されないが、５−フルオ
ロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロ
キシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン
、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガ
ラクトシルクエオシン(betaD-galactosylqueosine)、イノシン、Ｎ６−イソペン
テニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル
グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５
−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメ
チルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノ
シルクエオシン(beta-D-mannosylqueosine)、５’−メトキシカルボキシメチル ウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ウイブトキソシン(wybutoxosine)、シ
ュードウラシル(pseudouracil)、クエオシン(queosine)、２−チオシトシン、５
−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチ
ルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ
酢酸（Ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−
カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリン
を含む群より選ばれる少なくとも一の修飾塩基部分を有していてもよい。 【０２３２】 他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一の修飾される糖
部分、例えば、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およ
びヘキソースからなる群より選ばれる糖部分からなる。さらなる他の実施形態に
おいては、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート(phosphorothioate)、ホ
スホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホルアミドチオエート(phospho
ramidothioate)、ホスホルアミデート(phosphoramidate)、ホスホルジアミデー ト(phosphordiamidate)、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、 及びこれらのホルムアセタールまたは類似体からなる群より選ばれる少なくとも
一の修飾されるホスフェート主鎖からなる。さらなる他の実施形態においては、
オリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマー
オリゴヌクレオチドは、一般的なβ−単位とは逆に、ストランドが相互に平行に
走る相補的ＲＮＡとの特定の２本鎖のハイブリッドを形成する（Gautier 等., 1
987, Nucl. Acids Res. 15, 6625-6641）。 【０２３３】 オリゴヌクレオチドは、他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショ
ンを開始させる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションを開始させる切断物質
などに共役してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野における既知
の標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成器（バイオサーチ(Biosearch
)、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)などから市販されるもの など）の使用によって、合成されてもよい。例としては、ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドはステイン(Stein)らの方法(1988, Nucl. Acids Res. 16, 320
9)によって合成されてもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御さ
れた細孔ガラスポリマー支持体を用いることによって調製できる(Sarin 等., 19
88, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451)。 【０２３４】 特定の実施形態において、本発明のＲＰＩアンチセンス核酸は、外来の配列か
らの転写によって細胞内で製造される。例えばベクターは、細胞内に吸収される
ようにインビボで導入されてもよく、この細胞内でベクターまたはこの一部が転
写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）が産生される。このようなベクタ
ーは、ＲＰＩアンチセンス核酸をコード化する配列を含む。このようなベクター
は、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写できる限り、エピソームで
あり続けてもあるいは染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当
該分野における標準的な組換ＤＮＡ技術方法によって構築できる。ベクターは、
哺乳動物細胞における複製や発現に使用される、プラスミド、ウィルス性、また
は当該分野において既知の他のものであってもよい。ＲＰＩアンチセンスＲＮＡ
をコード化する配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト、の細胞において作用
することが当該分野において既知であるプロモーターによってできる。このよう
なプロモーターは、誘導性であっても構成性であってもよい。このようなプロモ
ーターとしては、以下に制限されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Berno
ist and Chambon, 1981, Nature 290, 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの３’の 長い末端繰り返し中に含まれるプロモーター(Yamamoto 等., 1980, Cell 22, 78
7-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner 等., 1981, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 78, 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brins
ter 等., 1982, Nature 296, 39-42)などが挙げられる。 【０２３５】 本発明のアンチセンスは核酸は、ＲＰＩ遺伝子、好ましくはヒトのＲＰＩ遺伝
子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に相補的な配列を有する。しかしながら、
好ましいものの、完全な相補性は必要ではない。本明細書中で引用される、ＲＮ
Ａの少なくとも一部分に相補的な配列は、ＲＮＡとハイブリッド形成して安定な
デュプレックスを形成できるのに十分な相補性を有する配列を意味する；ゆえに
、２本鎖のＲＰＩアンチセンス核酸の場合では、デュプレックスＤＮＡの１本鎖
を試験してもよい、あるいはトリプレックスの形成を分析してもよい。ハイブリ
ッド形成能は、相補性の度合いやアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。
通常、ハイブリッド形成する核酸が長ければ長いほど、ＲＰＩをコード化するＲ
ＮＡとの塩基のミスマッチ数が多くなるが安定なデュプレックス（または、場合
によってはトリプレックス）を形成する。当業者はハイブリッド形成した複合体
の融点を測定する標準的な方法の使用によってミスマッチの許容できる程度を確
認できる。 【０２３６】 ＲＰＩの治療への使用 アンチセンス核酸 ＲＰＩアンチセンス核酸は、有益なＲＰＩをリウマチ様関節炎を患っている患
者の関節液中で過剰に発現させて、リウマチ様関節炎を治療（または予防）する
のに使用できる。好ましい実施形態においては、１本鎖のＤＮＡのアンチセンス
ＲＰＩオリゴヌクレオチドを使用する。ＲＰＩをコード化するＲＮＡを発現また
は過剰に発現する細胞のタイプは当該分野において既知の様々な方法によって同
定できる。このような細胞のタイプとしては、以下に制限されるものではないが
、白血球（例えば、好中球、マクロファージ、単球）及びレジデント細胞（例え
ば、滑膜細胞）が挙げられる。このような方法としては、以下に制限されるもの
ではないが、ＲＰＩに特異的な核酸とのハイブリッド形成（例えば、ノーザンハ
イブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、インサイチュ
(in situ)ハイブリダイゼーション）、ある細胞タイプ由来のＲＮＡのインビト ロでのＲＰＩへの翻訳能を考察する、イムノアッセイなどが挙げられる。好まし
い形態において、患者からの１次組織を、例えば、免疫細胞化学またはin situ ハイブリダイゼーションによって、治療前のＲＰＩの発現について分析できる。 【０２３７】 製薬上許容できる担体中に有効量のＲＰＩアンチセンス核酸を含む、本発明の
薬剤組成物は、リウマチ様関節炎を有する患者に投与できる。ＲＡの治療に有効
であろうＲＰＩアンチセンス核酸の量は、標準的な臨床テクニックによって決定
されうる。可能である場合には、インビトロで、さらにはヒトに試験及び使用さ
れる前に有用な動物モデルシステムにおいて、治療される腫瘍のタイプのアンチ
センス細胞毒性を測定することが望ましい。特定の実施形態において、ＲＰＩア
ンチセンス核酸を含む薬剤組成物は、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプ
セルを介して投与される。本発明の様々な実施形態において、このような組成物
を用いてＲＰＩアンチセンス核酸の一様の放出を達成することは有用である。特
定の実施形態においては、特定の同定可能な腫瘍抗原に対する抗体を介してター
ゲットにされるリポソームを利用することが望ましい(Leonetti 等., 1990, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2448-2451； Renneisen 等., 1990, J. Biol. Ch
em. 265, 16337-16342)。 【０２３８】 阻害リボザイム及びトリプレックスアプローチ 他の実施形態においては、ＲＡの症状は、ＲＰＩ遺伝子配列を既知の遺伝子ノ
ックアウト、リボザイムおよび／またはトリプレックス方法を組合わせて使用し
て、ＲＰＩ遺伝子の発現レベルを減少することによって、ＲＰＩ遺伝子の発現レ
ベルおよび／またはＲＰＩ遺伝子産物の活性を減少することによって、改善され
てもよい。ＲＡの症状を改善する能力を含む、ＲＰＩ遺伝子の活性、発現または
合成を調節する能力を発揮する化合物の中には、リボザイム及びトリプレックス
分子がある。このような分子は、損なわれていない、または適切である場合には
、変異型ターゲット遺伝子活性のいずれかを減少するまたは阻害するように設計
されてもよい。このような分子の製造及び使用に関する技術は、当業者にはよく
知られている。ＲＰＩ遺伝子ｍＲＮＡ転写産物を触媒により切断するように設計
されるリボザイム分子を用いて、ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの翻訳及び、ゆえに
ＲＰＩ遺伝子産物の発現を防止できる。（例えば、１９９０年１０月４日に公開
された、ＰＣＴ国際公開 ＷＯ９０／１１３６４号；Sarver 等., 1990, Scienc
e 247, 1222-1225）。 【０２３９】 リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。
（書評では、Rossi, 1994, Current Biology 4, 469-471を参照）。リボザイム 作用のメカニズムは、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム作用分子の配列特
異的なハイブリダイゼーション、さらにはエンドヌクレアーゼによる切断事象(e
ndonucleolytic cleavage event)を含む。リボザイム分子の組成物は、ターゲッ
ト遺伝子ｍＲＮＡに対して相補的な一以上の配列を含むものでなければならず、
また、ｍＲＮＡ切断に応答性のある既知の触媒配列を含むものでなければならな
い。この配列に関しては、例えば、その全体を参考のために本明細書中に引用さ
れる、米国特許第５，０９３，２４６号を参照。部位特異的な認識配列でｍＲＮ
Ａを切断するリボザイムをＲＰＩをコード化するｍＲＮＡを破壊するのに使用で
きるものの、シュモクザメのリボザイム(hammerhead ribozyme)の使用が好まし い。シュモクザメのリボザイムは、ターゲットｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成
するフランキング領域によって規定される位置でｍＲＮＡを切断する。ターゲッ
トｍＲＮＡが下記２塩基配列：５’−ＵＧ−３’を有することが唯一の必要条件
である。シュモクザメのリボザイムの構築及び製造は、当該分野において既知で
あり、その全体を参考のために本明細書中に引用される、Myers, 1995, Molecul
ar Biology and Biotechnology A Comprehensive Desk Reference, VCH Publish
ers, New York（特に８３３頁、図４を参照）およびHaseloff and Gerlach, 198
8, Nature, 334, 585-591により詳しき記載される。好ましくは、リボザイムは 、切断認識部位がＲＰＩをコード化するｍＲＮＡの５’末端付近に位置する、即
ち、効率を上げかつ非機能性ｍＲＮＡ転写産物の細胞内蓄積を最小限にするよう
に操作される。本発明のリボザイムとしてはまた、テトラヒメナ サーモフィラ
(Tetrahymena thermophila)中に天然に生じ（ＩＶＳ、またはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして既知である）、Thomas Cech及び協力者らによって広範に記載さ れたもの（Zaug, 等., 1984, Science, 224, 574-578； Zaug and Cech, 1986,
Science, 231, 470-475； Zaug, 等., 1986, Nature, 324, 429-433； ユニヴァ
ーシティー パテンツ インコーポレイテッド(University Patents Inc.)によ る公開国際特許出願番号ＷＯ ８８／０４３００号 ； Been and Cech, 1986, C
ell, 47, 207-216）などのＲＮＡエンドヌクレアーゼ（以降、Ｃｅｃｈタイプリ
ボザイム）が挙げられる。 【０２４０】 Ｃｅｃｈタイプリボザイムは、後にターゲットＲＮＡの切断が行われるターゲ
ットＲＮＡ配列とハイブリッド形成する８塩基対活性部位を有する。本発明は、
ＲＰＩをコード化する遺伝子中に存在する８塩基対活性部位配列をターゲットと
するこれらのＣｅｃｈタイプリボザイムを包含する。アンチセンスアプローチに
おいて、リボザイムは、（例えば、改善された安定性、ターゲッティングなどを
目的として）修飾されたオリゴヌクレオチドから構成されることができ，インビ
ボでＲＰＩを発現する細胞に輸送されなければならない。好ましい輸送方法は、
トランスフェクトされた細胞がＲＰＩをコード化する内因性のｍＲＮＡを破壊し
、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するように、強力な構成性ｐ
ｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下でのリボザイムをコード
化するＤＮＡ構築物を用いることを含む。リボザイムは、アンチセンス分子と異
なり、触媒性であるので、低細胞内濃度が効率のために必要である。内因性のＲ
ＰＩ発現はまた、ターゲットされた相同的組換を用いてＲＰＩ遺伝子またはその
プロモーターを不活性化またはノックアウトすることによって減少できる（例え
ば、Smithies, 等., 1985, Nature 317, 230-234； Thomas and Capecchi, 1987
, Cell 51, 503-512； Thompson 等., 1989, Cell 5, 313-321を参照；これらの
それぞれは、その全体を参考のために本明細書中に引用される）。例えば、内因
性ＲＰＩ遺伝子（ＲＰＩをコード化する遺伝子のコーディング領域または調節領
域のいずれか）に相同するＤＮＡに隣接する変異型の、非機能性ＲＰＩ遺伝子（
または全く関連のないＤＮＡ配列）を、インビボでターゲット遺伝子を発現する
細胞をトランスフェクトするために、選択マーカーおよび／またはネガティブな
選択マーカーと一緒にまたはを用いずに、使用できる。ターゲットされた相同的
組換を介した、ＤＮＡ構築物の挿入によって、ターゲット遺伝子が不活性化され
る。このようなアプローチは、ＥＳ（胚幹）細胞への修飾が不活性ターゲット遺
伝子を有する動物子孫を発生するのに使用できる農業分野に特に適する（例えば
、Thomas and Capecchi, 1987 and Thompson, 1989, 上記を参照）。 【０２４１】 しかしながら、このアプローチは、組換ＤＮＡ構築物を適当なウィルスベクタ
ーを用いてインビボで必要な部位に直接投与するまたはターゲットされる場合に
はヒトへの使用に適用されうる。または、内因性のＲＰＩ遺伝子の発現は、ＲＰ
Ｉ遺伝子の調節領域（即ち、ＲＰＩ遺伝子プロモーターおよび／またはエンハン
サー）に相補性のあるデオキシリボヌクレオチド配列をターゲットとして体内の
ターゲット細胞におけるＲＰＩ遺伝子の転写を防止するトリプレックス構造物を
形成することによって抑制されうる。（通常、Helene, 1991, Anticancer Drug
Des., 6(6), 569-584； Helene, 等., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660, 27-3
6； and Maher, 1992, Bioassays 14(12), 807-815を参照）。 【０２４２】 転写の阻害を目的とするトリプレックス形成に使用される核酸分子は、１本鎖
であり、デオキシヌクレオチドから構成されなければならない。これらのオリゴ
ヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対原則によるトリプレック
ス形成を促進するように設計されなければならず、これは、通常、プリンまたは
ピリミジンのいずれかの相当の大きさのストレッチがデュプレックスの１本鎖に
存在する必要がある。ヌクレオチド配列はピリミジンを基礎としてもよく、これ
により、得られるトリプレックスの３つの会合するストランドにＴＡＴ及びＧＣ
Ｃ+のトリプレットが生じるであろう。ピリミジンリッチな分子は、１本鎖に平 行な方向にデュプレックスのその１本鎖のプリンリッチな領域に対する塩基の相
補性が提供される。加えて、プリンリッチである、例えば、Ｇ残基のストレッチ
を含む、核酸分子が選択されてもよい。これらの分子は、大多数のプリン残基が
、トリプレックスの３ストランドにＧＧＣトリプレットを生じる、ターゲットに
されるデュプレックスの１本鎖上に位置する、ＧＣ対リッチなＤＮＡデュプレッ
クスとトリプレックスを形成するであろう。 【０２４３】 または、３重螺旋の形成のためにターゲットされうる潜在的な配列をいわゆる
スイッチバック核酸分子を作製することによって増やしてもよい。スイッチバッ
ク分子は、デュプレックスの最初の一ストランドと次に他方と塩基対を形成して
、プリンまたはピリミジンのいずれかの相当の大きさがデュプレックスの１スト
ランドに存在する必要性を排除するように、交互の５’−３’、３’−５’様式
で合成される。本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイム、および／また
はトリプレックス分子を利用して変異型遺伝子発現を阻害する場合には、その技
術が、存在する正常なＲＰＩ遺伝子産物の濃度が正常な表現型に必要であるより
低い可能性が生じるくらい、非常に効果的に正常なＲＰＩ遺伝子アレルによって
産生されるｍＲＮＡの転写（トリプレックス）および／または翻訳（アンチセン
ス、リボザイム）を抑制または阻害することが可能である。したがって、このよ
うな場合には、ＲＰＩ遺伝子活性の実質的に正常なレベルを確実に維持するため
に、正常なＲＰＩ遺伝子活性を発揮するＲＰＩ遺伝子ポリペプチドをコード化、
発現する核酸分子を、アンチセンス、リボザイム、またはトリプレックス治療が
利用されているどんなものにも感受性のある配列を含まない遺伝子療法を介して
細胞中に導入してもよい。または、ＲＰＩ遺伝子が細胞外タンパク質をコード化
する場合には、ターゲット遺伝子活性の必要なレベルを維持するために正常なＲ
ＰＩ遺伝子タンパク質を同時に投与する(co-administer)ことが好ましい。 【０２４４】 本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ、リボザイム、ならびにトリプレック
ス分子は、上記したように、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の合成に関する当該分野にお
ける既知の方法によって調製されてもよい。これらとしては、例えば、固相ホス
ホルアミダイト(phosphoramidite)化学合成などの当該分野で既知のオリゴデオ キシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するに技術が
挙げられる。または、ＲＮＡ分子を、アンチセンスＲＮＡ分子をコード化するＤ
ＮＡ配列のインビトロ及びインビボ転写によって得てもよい。このようなＤＮＡ
配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適当なＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーターが取り込まれた広範な様々なベクター中に導入されてもよい
。または、使用されるプロモーターによって、構成により(constitutively)また
は誘導により(inducibly)アンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ 構築物を細胞株に安定して導入してもよい。 【０２４５】 治療または予防のための利用のデモンストレーション 本発明の化合物は、ヒトに使用される前に、所望の治療または予防活性に関し
てインビトロ、次にインビボで試験されることが好ましい。例えば、特定の化合
物の投与が必要であるかどうかを決定するのに使用できるインビトロ分析として
は、患者の組織サンプルを培養液中で成育させ、化合物に晒すあるいは化合物を
投与して、このような化合物の組織サンプルへの効果を観察するインビトロの培
養分析が挙げられる。テスト化合物は、ＲＡを患っている患者のＲＡＤＦまたは
ＲＰＩレベルがＲＡを患っていない被検者中で見出されるレベルにまで戻るまた
はＲＡの実験動物モデル（例えば、ラットのアジュバント関節炎）における同様
の変化を作製することができるかについて試験されうる。上記レベルを回復でき
る化合物を、さらなる薬剤発見を目的としたリード化合物(lead compound)とし て使用できる、または治療に使用できる。 【０２４６】 ＲＡＤＦ及びＲＰＩの発現は、好ましい技術、イムノアッセイ、ゲル電気泳動
後可視化、または他の当業者に既知の方法によって分析できる。このような分析
は、ＲＡＤＦまたはＲＰＩの発現量が臨床的病気の代用マーカーとして機能でき
る際には、候補薬剤をスクリーニングするためにまたは臨床的なモニタリング若
しくは薬剤の開発に使用できる。様々な特定の実施形態において、インビトロ分
析は、患者の疾患にかかわる細胞型の代表的な細胞を用いて行なわれ、化合物が
このような細胞型に目的とする効果を有するかどうかを決定できる。治療に使用
される化合物は、以下に限られないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル
、ウサギなどの適当な動物モデルシステムでヒトでの試験の前に試験されうる。
インビボ試験に関しては、ヒトへの投与前に、当該分野において既知のいずれか
の動物モデルシステムを使用してもよい。 【０２４７】 治療／予防のための投与及び組成物 本発明は、有効量の本発明の化合物び被検者への投与による治療（及び予防）
方法を提供するものである。好ましい形態においては、化合物は実質的に純粋で
ある（例えば、その効果を制限するあるいは望ましくない副作用を産する物質を
実質的に含まない）。被検者は、好ましくは、以下に限られないが、ウシ、ブタ
、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物を含む、動物であり、好ましくは哺乳動
物であり、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態においては、非ヒト哺乳
動物が被検者である。 【０２４８】 化合物が核酸からなる際に使用できる配合物及び投与方法は上記と同様である
；さらなる適当な配合物及び投与経路は、下記したものから選択できる。様々な
輸送システムが知られており、本発明の化合物を投与するのに使用でき、例えば
、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現できる組換細
胞、レセプターが介するエンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Bi
ol. Chem. 262，4429-4432を参照）、レトロウィルスまたは他のベクターの一部
としての核酸の構築などがある。導入方法としては、以下に限られないが、皮内
、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられる
。化合物は、いずれかの簡便な経路によって、例えば、輸液または大量注射によ
って、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、経口、粘膜、直腸及び腸粘膜など）に
よる吸収によって投与されてもよく、また、他の生物学的に活性のある薬剤と一
緒に投与されてもよい。投与は全身または局所であってもよい。 【０２４９】 加えて、脳室内及び髄腔内などの、適当な経路によって中枢神経系中に本発明
の薬剤組成物を導入することが望ましい；脳室内注射は例えば、オマヤレザバー
等の、レザバーに取り付けられる、脳室内カテーテルによって容易になる。肺へ
の投与もまた、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアゾール投与剤(aer
osolizing agent)との配合によって、使用されうる。特定の実施形態においては
、治療を必要とする領域に局所的に本発明の薬剤組成物を投与することが望まし
い；これは、例えば、以下に限定されるわけではないが、外科手術中の局所的な
輸液、例えば、外科手術後に創傷被覆剤と組み合わせた、局所的な塗布、注射に
よって、カテーテルによって、坐剤によって、またはインプラントによって、達
成されてもよいが、上記インプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン製
材料からなり、シアラスティック膜(sialastic membrane)等の膜、または繊維な
どが挙げられる。一実施形態においては、投与は、悪性腫瘍または新生物性の若
しくは新生物発生前の組織のある部位（または前の部位）に直接注射することに
よってもよい。他の実施形態においては、化合物が、ベシクル、特にリポソーム
中に輸送されてもよい（Langer, Science 249, 1527-1533 (1990)； Treat 等.,
in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Ber
estein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)； Lopez-Ber
estein, ibid., pp. 317-327を参照；同書を参照）。さらなる実施形態において
は、化合物が、制御された放出システム中に輸送されてもよい。一実施形態にお
いては、ポンプを使用してもよい（Langer、上記；Sefton, CRC Crit. Ref. Bio
med. Eng. 14, 201 (1987)； Buchwald 等., Surgery 88, 507 (1980)； Saudek
等., N. Engl. J. Med. 321, 574 (1989)を参照）。他の実施形態においては、
高分子材料を使用してもよい（Medical Applications of Controlled Release,
Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)； Controll
ed Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and
Ball (eds.), Wiley, New York (1984)； Ranger and Peppas, J. Macromol. S
ci. Rev. Macromol. Chem. 23, 61 (1983)を参照；また、Levy 等., Science 22
8, 190 (1985)； During 等., Ann. Neurol. 25, 351 (1989)； Howard 等., J.
Neurosurg. 71, 105 (1989)を参照）。さらなる他の実施形態においては、制御
された放出システムを、全身性の投薬量のフラクションのみを必要とする、治療
のターゲット、即ち、脳の付近に置かれてもよい（例えば、Goodson, in Medica
l Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) を参照）。他の制御された放出システムは、Langer (Science 249, 1527-1533 (
1990))の書評で討論される。 【０２５０】 本発明の化合物がタンパク質をコード化する核酸である特殊な実施形態におい
ては、核酸が、例えば、レトロウィルスベクター（米国特許第４，９８０，２８
６号を参照）の使用によって、核酸を適当な核酸の発現ベクターの一部として構
築し細胞内になるように投与することによって、または直接注射によって、また
は微粒子の衝撃（例えば、遺伝子ガン；Biolistic, Dupont）の使用によって、 または脂質若しくは細胞表面レセプター若しくはトランスフェクション剤(trans
fecting agent)による被覆によって、または核に入ることが知られているホメオ
ボックス様ペプチド（例えば、Joliot 等., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88, 1864-1868を参照）に結合する核酸を投与することなどによって、インビボ
で投与されてコード化されたタンパク質の発現を促進してもよい。または、核酸
を、細胞内に導入して、相同的組換によって、発現用の宿主細胞ＤＮＡ内に取り
込んでもよい。 【０２５１】 本発明はまた、薬剤組成物を提供するものである。このような組成物は治療上
有効な量の化合物及び製薬上許容できる担体からなる。特殊な実施形態において
は、「製薬上許容できる」ということばは、連邦管理局(regulatory agency of
the Federal)、若しくは州政府によって認可されていること、または米国薬局方
もしくは動物、特にヒトへの使用に関して一般的に認知されている他の薬局方に
リストとして挙げられていることを意味する。「担体」ということばは、治療剤
が一緒に投与される希釈液、アジュバント、賦形剤、またはベヒクルを意味する
。このような製薬上の担体は、水ならびに、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ
油等の、石油、動物、植物若しくは合成由来のものなどの、油等の滅菌液体であ
りうる。水は、薬剤組成物を静脈内で投与される場合には好ましい担体である。
食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液もまた、特に注射可能な
溶液用に、液状担体として使用できる。適当な製薬上の賦形剤としては、デンプ
ン、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、
チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレー
ト、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、
グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。 【０２５２】 本組成物は、必要であれば、少量の湿潤若しくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を
含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセ
ル、粉末、徐放性配合物などの形態がとられる。組成物は、伝統的な結合剤及び
トリグリセリド等の担体を用いて、坐剤として配合されてもよい。経口用の配合
物は、薬剤グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグ
ネシウム、サッカリンナトリウム(sodium saccharine)、セルロース、炭酸マグ ネシウムなどの標準的な担体を含みうる。適当な製薬上の担体の例は、E.W. Mar
tinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載される。このような組成
物は、患者に適当に投与するための形態を提供できるように適当な量の担体と共
に、好ましくは純粋な形態の、治療上有効な量の本化合物を含むであろう。 【０２５３】 配合物は、投与の形態に適するものでなければならない。好ましい実施形態に
おいては、本組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適用される薬剤組成物とし
て定常的な方法に従って配合される。具体的には、静脈内投与用の組成物は、滅
菌等張水性緩衝液における溶液である。必要であれば、組成物はまた、可溶化剤
及び注射部位での痛みを和らげるためのリドカイン等の局所麻酔剤を含んでもよ
い。通常、成分は、例えば、一定量の活性物質を表示するアンプル若しくは小袋
(sachette)等の密閉容器における乾燥凍結乾燥粉末若しくは水分のない濃縮液と
して、単位服用量形態(unit dosage form)で別々にまたは一緒に混合してのいず
れかで供給される。組成物を輸液によって投与しようとする際には、組成物を滅
菌した薬剤グレードの水または食塩水を含む輸液用ボトルで調剤されうる。本組
成物を注射によって投与する際には、注射用の滅菌水または食塩水のアンプルを
、投与前に成分を混合するように提供できる。 【０２５４】 本発明の組成物は、中性または塩形態として配合されてもよい。製薬上許容で
きる塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の塩などの遊離
アミノ基を用いて形成される塩、ならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム
、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エ
チルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の塩などの遊離カルボキ
シル基を用いて形成される塩が挙げられる。 【０２５５】 ＲＡの治療に有効であろう本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術によって
決定できる。加えて、インビトロ分析を必要であれば最適な投与範囲を同定する
のを補助するのに使用してもよい。配合物に用いられる正確な投与量はまた、投
与経路、及び病気または疾患の重篤度によって異なり、開業医や各患者の環境の
判断に従って決定されなければならない。しかしながら、静脈内投与に関する適
当な投与量の範囲は、通常、約２０〜５００ｍｇの活性化合物／ｋｇ体重である
。鼻腔内投与に関する適当な投与量の範囲は、通常、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重
〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効な投与量は、インビトロまたは動物モデル試験
システムから派生される線量効果曲線から外挿されてもよい。坐剤は、通常、０
．５質量％〜１０質量％の範囲の活性成分を含む；経口用配合物は、好ましくは
、１０％〜９５％の活性成分を含む。 【０２５６】 本発明はまた、本発明の薬剤組成物の一以上の成分を充填する一以上の容器か
らなる薬剤パックまたはキットを提供するものである。必要であれば、製剤また
は生物学的製品の製造、使用または販売を調節する政府の機関(governmental ag
ency)によって規定される形態の通知をこのような容器につけてもよく、この通 知はヒトへの投与のための製造、使用及び販売の政府機関(agency of manufactu
re, use or sale)による認可を反映するものである。 【０２５７】 実施例 ＲＡによる患者の血清及び関節液由来のタンパク質 下記の参考プロトコルを用いて、リウマチ様関節炎（ＲＡ）の患者からのまた
はＲＡでない患者（即ち、痛風、変形性関節症、または外傷性の滑膜炎の患者）
からの血清及び関節液中のタンパク質を、等電点電気泳動さらにはＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分離し、比較した。各サンプルは２連で流した。 【０２５８】 サンプル調製 タンパク質の分析を、受け取ったままのサンプルで行なった(Pierce BCA Cat
# 23225)。３００μｇの全タンパク質に相当する容積の血清を分取し、等容の１
０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ(Fluka 71729)、２．３％（ｗ／ｖ）のジチオトレイトー ル(BDH 443852A)を添加した。このサンプルを９５℃で５分間加熱した後、２０ ℃に冷却した。次に、１２５μｌの以下の緩衝液をサンプルに加えた：８Ｍ 尿
素(BDH 452043w)、４％ ＣＨＡＰＳ(Sigma C3023)、６５ｍＭ ジチオトレイト
ール（ＤＴＴ）、２％（ｖ／ｖ） リゾライト(Resolytes) ３．５−１０(BDH
44338 2x)。この混合物をボルテックスして、１５℃で１３０００ｒｐｍで５分 間、遠心し、上清を等電点電気泳動によって分析した。 【０２５９】 等電点電気泳動 等電点電気泳動（ＩＥＦ）を、製造社の指示に記載される方法に従って、イム
ノビリン（登録）ドライストリップキット(Immobiline DryStrip Kit)(Pharmaci
a BioTech)を用いて行なった、Instructions for Immobiline DryStrip Kit, Ph
armacia, # 18-1038-63, Edition AB（その全体を参考のために本明細書中に引 用される）を参照。固定化ｐＨグラジエント（ＩＰＧ）ストリップ（１８ｃｍ、
ｐＨ ３〜１０ 非線形ストリップ；Pharmacia Cat. # 17-1235-01）を、イン モビリンドライストリップユーザーズマニュアル(Immobiline DryStrip Users M
anual)に記載されるようにして、８Ｍ 尿素、２％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ、１
０ｍＭ ＤＴＴ、２％（ｖ／ｖ） リゾライト(Resolytes) ３．５−１０(BDH
44338 2x)の溶液中に２０℃で一晩、再度水和させた。ＩＥＦに関しては、５０ μｌの上清（上記と同様にして調製）をストリップにのせて、カップ−ローディ
ング単位(cup-loading unit)をストリップの塩基性末端に置いた。次に、のせら
れたゲルを鉱油(Pharmacia 17-3335-01)で被覆して、電圧を、ファルマシアＥＰ
Ｓ３５００ＸＬパワーサプライ(Pharmacia EPS3500XL power supply)(Cat 19-35
00-01)を用いて、即座に下記プロフィールに従ってストリップにかけた： 初期電圧＝３００Ｖで２時間、 ３００Ｖ〜３５００Ｖの直線ランプを３時間、 ３５００Ｖで１９時間維持。 【０２６０】 このプロセスのすべての段階で、電流制限は１２ゲルで１０ｍＡに設定し、ワ
ット数の制限は５Ｗにセットした。温度は泳動中２０℃に維持した。 【０２６１】 ６．３ ゲル平衡及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ ゲル平衡及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ １．１ 最終の１９時間の段階の後、ストリップを即座に取り出し、下記組成の第一の
溶液中に２０℃で１０分間浸漬した：６Ｍ 尿素；２％（ｗ／ｖ） ＤＴＴ；２
％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ；３０％（ｖ／ｖ） グリセロール(Fluka 49767)；０． ０５Ｍ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．８(Sigma Cat T-1503)。これらのストリップ
を第一の溶液から取り出し、下記組成の第二の溶液中に２０℃で１０分間浸漬し
た：６Ｍ 尿素；２％（ｗ／ｖ） ヨードアセトアミド(Sigma I-6125)；２％（
ｗ／ｖ） ＳＤＳ；３０％（ｖ／ｖ） グリセロール(Fluka 49767)；０．０５ Ｍ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．８。第二の溶液から取り出した後、ストリップを
、以下に詳述するように修飾した、Hochstrasser 等., 1988, Analytical Bioch
emistry 173:412-423（その全体を参考のために本明細書中に引用される）に従 ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の支持ゲルにのせた。 【０２６２】 ６．４ 支持ゲルの調製 支持ゲルの調製 ゲルを、下記寸法の２枚のガラス板間に注いだ：２３ｃｍ幅×２４ｃｍ長（後
ろの板）；中央の１９ｃｍに２ｃｍ深さのノッチを有する２３ｃｍ幅×２４ｃｍ
長（前の板）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの共有結合を促進するために、後ろの板を
エタノールにおける０．４％ γ−メタクリル−オキシプロピルトリメトキシシ
ラン溶液(バインドシラン（商標）(BindSilaneTM)； Pharmacia Cat. # 17-1330
-01)で処理した。前の板を、ゲルの付着を抑制するために、レペルシラン（商標
）(RepelSilaneTM)(Pharmacia Cat. # 17-1332-01)で処理した。過剰の試薬を水
で洗浄することによって除去し、板を乾燥させた。この段階で、ゲルに関する同
定として、および板の被覆面を同定するマーカーとして、粘着性のバーコードを
ゲルマトリックスと接触しないような位置に後ろの板につけた。 【０２６３】 乾燥させた板を１３ゲルサンドイッチの収容能力のあるキャスティングボック
ス中に集めた。各サンドイッチの上部と下部の板を１ｍｍ厚で２．５ｃｍ幅のス
ペーサーによって間隔をあけた。ゲル重合後にサンドイッチを分離しやすくする
ために、これらのサンドイッチにアセテートシートを挟み込んだ。次に、Hochst
rasser 等.、前掲に従って、キャスティングを行なった。 【０２６４】 ９〜１６％の直線のポリアクリルアミド勾配を、アンゲリクグラジエントキャ
スティングシステム(Angelique gradient casting system)(Large Scale Biolog
y)を用いて、前の板のノッチのレベルから２ｃｍ下の点まで伸ばすように、キャ
ストした。ストック溶液は下記のとおりであった。アクリルアミド（水において
４０％）は、セルヴァ(Serva)(Cat. # 10677)からであった。架橋剤は、全出発 モノマー含量の２．６％（ｗ／ｗ）の濃度の、ＰＤＡ(BioRad 161-0202)であっ た。ゲルバッファーは、０．３７５Ｍ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．８であった。
重合触媒は０．０５％（ｖ／ｖ） ＴＥＭＥＤ(BioRad 161-0801)であり、開始 剤は０．１％（ｗ／ｖ） ＡＰＳ(BioRad 161-0700)であった。ＳＤＳはゲル中 には含ませず、積重ねゲルは使用しなかった。キャストゲルを２０℃で一晩、重
合させた後、６ｍｌのゲルバッファーの入った密閉ポリエチレンバッグ中に４℃
で貯蔵し、４週間以内に使用した。 【０２６５】 ６．５ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ １．１ ０．５％（ｗ／ｖ） アガロース(Fluka Cat 05075)の溶液を泳動用バッファ ー（０．０２５Ｍ トリス、０．１９８Ｍ グリシン(Fluka 50050)、１％（ｗ ／ｖ） ＳＤＳ、微量のブロモフェノールブルーを補足）中で調製した。このア
ガロース懸濁液を、アガロースが溶解するまで、攪拌しながら７０℃に加熱した
。支持された第二のＤゲルの上部をアガロース溶液で満たし、平衡化したストリ
ップをアガロース中に置き、ゲルが第二のＤゲルとよく接触するまでパレットナ
イフでゆるやかに軽くたたいた。ゲルを、Amess 等., 1995, Electrophoresis 1
6:1255-1267（その全体を参考のために本明細書中に引用される）によって記載 されるのと同様にして、第二のＤ泳動タンクに置いた。タンクを、活性ゲル領域
を効率的に冷却できるように、バッファーのレベルがポリアクリルアミドを含む
第二のＤゲルの領域の上部よりちょうど高くなるまで、泳動用バッファー（上記
と同様）で満たした。泳動用バッファーをゲルによって形成される上部のバッフ
ァーコンパートメントに加えた後、コンソートＥ−８３３パワーサプライ(Conso
rt E-833 power supply)を用いて電圧をゲルに即座にかけた。１時間、ゲルを２
０ｍＡ／ゲルで泳動した。ワット数の制限は、６ゲルを含むタンクで１５０Ｗに
設定し、電圧の制限は６００Ｖに設定した。次に、１時間後、ゲルを、ブロモフ
ェノールブルーのラインがゲルの低部から０．５ｃｍになるまで、前記と同様の
電圧及びワット数の制限にして、４０ｍＡ／ゲルで泳動した。温度は、泳動中１
０℃に維持された。 【０２６６】 ６．６ 染色 染色 電気泳動の泳動(run)が完了したら、ゲルを即座に固定用のタンクから取り出 した。ゲルカセットの上板を注意深く取り除き、ゲルを底板にくっつかせたまま
にした。次に、このゲルのついた底板を、１２ゲルを収容できる、染色装置中に
置いた。ゲルを、４０％（ｖ／ｖ） エタノール(BDH 28719)、１０％（ｖ／ｖ ） 酢酸(BDH 100016X)、５０％（ｖ／ｖ） 水(MilliQ-Millipore)の固定用溶 液中に完全に浸漬し、この溶液をゲル上で連続して循環させた。一晩インキュベ
ーション後、固定用溶液をタンクから抜き、ゲルを、７．５％（ｖ／ｖ） 酢酸
、０．０５％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、９２．５％（ｖ／ｖ） 水中に３０分間、浸
漬することによって下塗した(prime)。さらに、下塗用溶液を抜き、ゲルを染色 用溶液に４時間完全に浸漬することによって染色した。蛍光染料の溶液は、製造
社の指示に従って希釈用シプロレッド(Sypro Red)(Molecular Probes, Inc., Eu
gene, Oregon)によって調製した；この希釈溶液を０．４μｍフィルターで真空 下で濾過した。 【０２６７】 ６．７ ゲルのイメージング 電気泳動の泳動(run)が完了したら、ゲルを即座に固定用のタンクから取り出 した。ゲルカセットの上板を注意深く取り除き、ゲルを底板にくっつかせたまま
にした。次に、このゲルのついた底板を、１２ゲルを収容できる、染色装置中に
置いた。ゲルを、４０％（ｖ／ｖ） エタノール(BDH 28719)、１０％（ｖ／ｖ ） 酢酸(BDH 100016X)、５０％（ｖ／ｖ） 水(MilliQ-Millipore)の固定用溶 液中に完全に浸漬し、この溶液をゲル上で連続して循環させた。一晩インキュベ
ーション後、固定用溶液をタンクから抜き、ゲルを、７．５％（ｖ／ｖ） 酢酸
、０．０５％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、９２．５％（ｖ／ｖ） 水中に３０分間、浸
漬することによって下塗した(prime)。さらに、下塗用溶液を抜き、ゲルを染色 用溶液に４時間完全に浸漬することによって染色した。蛍光染料の溶液は、製造
社の指示に従って希釈用シプロレッド(Sypro Red)(Molecular Probes, Inc., Eu
gene, Oregon)によって調製した；この希釈溶液を０．４μｍフィルターで真空 下で濾過した。 【０２６８】 ゲルのイメージング １．１ コンピューターで解読可能な出力を、以下のような修飾を加えて、製造社の指
示に従って、ストームスキャナー(Storm scanner)(Molecular Dynamics, Sunnyv
ale, California)で蛍光で染色されたゲルを撮影する(imaging)ことによって作 った（その全体を参考のために本明細書中に引用される、Storm User's Guide,
1995, Version 4.0, Part No. 149-355を参照）。ゲルを染色液から取り出して 、水で簡単に洗浄し、１０００ＶのＰＭＴセッティングで、及び２００μｍの解
像度で、レッドフルオレセンスモード(Red Fluorescence mode)で、ストームス キャナー(Storm scanner)で撮影した。ゲルはガラス板に強固に結合したので、 ゲルを撮影中にスキャナーベッドに接触させ続けた。ゲルとスキャナーベッドと
の間の不均一な接触から生じる干渉パターンを防止するために、水のフィルムを
ゲルの下に導入して、エアーポケットができないように注意した。さらに、ゲル
を、ゲル中で検出される他の特徴のＸ、Ｙ座標を決定するための参照ポイント（
Ｍ１及びＭ２と称する）を提供するためにゲルと一緒に撮影される２個の蛍光ボ
タンを備えたフレーム中に置いた。マッチしたフレームを、ゲルの正確な配列を
保存するためにロボットゲル切出し器に置いた。撮影後、ゲルを少量の染色用溶
液を含むポリエチレンバッグ中に密閉した後、４℃で貯蔵した。 【０２６９】 ６．８ データのデジタル解析 データを、下記により詳細に記載されるように、米国特許出願番号０８／９８
０，５７４号、セクション５．４及び５．５（その全体を参考のために本明細書
中に引用される）に記載されるのと同様にして処理した。 【０２７０】 ６．８．１ ディテクター出力のコンピューター解析 データのデジタル解析 データを、下記により詳細に記載されるように、米国特許出願番号０８／９８
０，５７４号、セクション５．４及び５．５（その全体を参考のために本明細書
中に引用される）に記載されるのと同様にして処理した。 【０２７１】 ディテクター出力のコンピューター解析 スキャナーからの出力をまず、メラニー（登録）ＩＩ ２Ｄ ＰＡＧＥ分析プ
ログラム(MELANIE II 2D PAGE analysis program)(Release 2.2, 1997, BioRad
Laboratories, Hercules, California, Cat. # 170-7566)を用いて処理すること
によって、登録ポイントＭ１及びＭ２を自動的に検出し；イメージを自動的に縁
を切り落とし（即ち、ゲルの境界、例えば、参照フレームの外側にあるスキャン
されたイメージの領域由来のシグナルを除去する）；ダストによるアーチファク
トをフィルターで取り除き(filter out)；特徴を検出、定量し；さらにＧＩＦフ
ォーマットでイメージファイルを作製した。特徴を以下のパラメーターで検出し
た。 【０２７２】 なめらかさ(Smooths)＝２、 ラプラシアン閾値(Laplacian threshold) ５０、 部分閾値(Partials threshold) １、 飽和度＝１００、 とがり(Peakedness)＝０、 最小周界(Minimum Perimeter)＝１０。 【０２７３】 ６．９ ｐＩ及びＭＷ値の割り当て(Assignment) ｐＩ及びＭＷ値の割り当て イメージを、グロス異常を有する、またはローディング若しくは全体のイメー
ジ強度(image intensity)が低すぎる、または解像度が低すぎる、または２連が 類似していない場合のイメージを却下するために評価した。２連のうちの一方の
イメージが却下された場合、２連に属する他方のイメージもまたイメージの質に
かかわらず却下された。却下されたサンプルを繰り返し分析のために予定表に組
み込まれた(scheduled)。 【０２７４】 ランドマーク同定を用いて、イメージ中に検出された特徴のｐＩ及びＭＷ値を
測定した。このプロセスは、所定の生物学的なサンプル中に発見されることが期
待される特定のタンパク質の同定に係るものである。これらの共通のタンパク質
はサンプル毎に等しい等電点及び分子量を発揮するため、これらを標準として使
用できる；このプロセスはまた、可能性のあるゲルの変動またはゆがみを修正す
る。 【０２７５】 正常な血清ゲルのデータセットから、ゲルを第一のマスターゲル(Primary Mas
ter Gel)として任意に選んだ。次に、ランドマーク特徴を、この第一のマスター
ゲル中に検出される特徴を正常なヒトの血清の２次元電気泳動ですでに同定され
た特徴と比較することによって同定した。（Bjellqvist 等., 1993, Electropho
resis 14:1357-1365を参照；その全体を参考のために本明細書中に引用される）
。 【０２７６】 ＰＬ１〜ＰＬ１２及びＰＬ１５〜ｐＬ１６と称する、１４個のランドマーク特
徴が第一のマスターゲルで同定された。これらのランドマーク特徴を図１に示し
、表ＸＩＩに示されるｐＩおよび／またはＭＷ値を割り当てた。 【０２７７】 【表２２】 【０２７８】 可能な限り多くのこれらのランドマークを、データセットの各ゲルイメージで
同定した。 【０２７９】 次に、マスターゲルのすべての特徴は、すでにｐＩ値を割り当てられた２種の
最も近いランドマークに対する（メラニー ＩＩ ソフトウェア(MELANIE II so
ftware)を用いた）直線的な内挿／外挿によってｐＩ値を割り当てられ、すでに ＭＷ値を割り当てられた２種の最も近いランドマークのＭＷに対する（メラニー
ＩＩ ソフトウェア(MELANIE II software)を用いた）直線的な内挿／外挿に よってＭＷ値を割り当てられた。これらの特徴はまた、モレキュラークラスター
インデックス（またはＭＣＩ）として既知の独特の数で標識された。 【０２８０】 第二のマスターゲル(Secondary Master gel)を、ＲＡの血清及びＲＡの関節液
双方のゲルについて選んだ。これらのゲルの特徴を、メラニー ＩＩ ２Ｄ Ｐ
ＡＧＥ(MELANIE II 2D PAGE)(Release 2.2)ユーザーマニュアル(The Melanie Gr
oup, Geneva, Switzerland)のセクションＡ、頁８〜１０に記載されるのと同様 にして、メラニー ＩＩ ソフトウェアと共に供給されるアルゴリズムを用いて
、マスターゲルの共通する特徴と対にした。すでに対になった特徴を相当するＭ
ＣＩに、ゆえに関連するｐＩ及びＭＷ値に結び付ける。これらの第二のマスター
ゲルに存在する対をなさなかった特徴は、ランドマークのｐＩ及びＭＷに関して
（メラニー ＩＩ ソフトウェア(MELANIE II software)を用いた直線的な内挿 ／外挿によってｐＩ及びＭＷ値を割り当てられた。次に、さらなる独特な項目を
、これらの特徴に関するＭＣＩで作製した。 【０２８１】 ６．９．１ プロフィールの構築 プロフィールの構築 データセットのすべてのゲルをここで第一の及び第二のマスターゲルに，マッ
チさせ、対の特徴をモレキュラークラスターインデックスの相当する項目に結び
つけた。 【０２８２】 次に、２連のゲルをランドマークにより並べ、マッチングプロセスを２連のゲ
ルにおける同じスポットの対になるように行なった。これにより、対のスポット
が分離の再現性を示し、また、アーチファクトをフィルターで取り除く(filter
out)ので、次に測定される等電点及び分子量が正確であるという保証が増大した
。 【０２８３】 各タンパク質スポットの強度の測定結果を採取し、保存した。各タンパク質ス
ポットは、同定コードが割り当てられ、マスターゲルでのスポットにマッチさせ
た。 【０２８４】 分析のこの概念の結果、各同定されたスポットについて：１）独特な任意の同
定コード、２）Ｘ、Ｙ座標、３）等電点、４）分子量、５）シグナル値、６）各
前記測定結果に関する標準偏差、及び７）このスポットがマッチするマスターゲ
ルでのスポットのＭＣＩに対するポインターを含むデジタルプロフィールが、単
一の血清または関節液サンプルに代表されるゲルの各２連セットに関して、得ら
れた。ラボラトリーインフォーメーションマネージメントシステム(Laboratory
Information Management System)（ＬＩＭＳ）によって、このプロフィールは、
ゲルプロフィールのデータベースのコンピューター分析によって同定されるタン
パク質が検索できるように、そこから生じた実際の保存されたゲルにまでトレー
ス可能であった。このＬＩＭＳによって、プロフィールをオリジナルのサンプル
または患者にまでトレースすることもできた。 【０２８５】 ６．９．２ サンプル間の交差試験 １．１．１ プロフィールが得られたら、分析を、興味のあるタンパク質の選択に向けた。
プロフィールにおけるそれぞれの有意な特徴にインデックス、すべてのゲルにお
ける特徴を同定し、特徴の上記（１）〜（７）のパラメーターに対するポインタ
ーとして機能する「モレキュラークラスターインデックス」（ＭＣＩ）を割り当
てた。分子クラスターテーブルを各サンプルタイプ（例えば、ＲＡ血清及びＲＡ
関節液）に関するマスターゲルから得た。同じタイプのすべての他のサンプルか
らのゲルを関連する第一及び第二のマスターゲルとマッチさせた。次に、各サン
プルに関するデジタルプロフィールに、各マッチした特徴について、マスタープ
ロフィールの上記特徴に割り当てられたＭＣＩを加えることによって、注釈をつ
けた。 【０２８６】 ６．９．３ プロフィールの示差分析 各サンプルセット（関節液または血清）内で、プロフィールを分析して、少な
くとも５０％のプロフィールで存在するこれらの特徴を同定、選択した。次に、
これらの選択された特徴を、関節液の特徴のセット及び血清の特徴のセットで集
めた。さらに、各特徴セットのマッチング特徴を比較して、関節液及び血清間で
平均強度で少なくとも２倍の差を示すこれらの特徴を同定した。続いて、同様の
特徴をＲＡを持たない被検者からの関節液及び血清サンプルで試験した。ＲＡの
関節液サンプルと比べてＲＡ血清では差別的に存在するが非ＲＡの関節液サンプ
ルと比べると非ＲＡ血清とは異ならずに存在する特徴を、リウマチ様関節炎−診
断特徴(Rheumatoid Arthritis-Diagnostic Feature)（ＲＡＤＦ）として同定し た。 【０２８７】 ６．１０ 選択されたタンパク質の回収及び分析 選択されたタンパク質の回収及び分析 ＲＡＤＦのタンパク質をロボットで切出して、処理することによって、トリプ
シンペプチドを得た；これらのペプチドの部分的なアミノ酸配列を、de novoシ ークエンシング(de novo sequencing)を用いて、質量分析によって決定した。 【０２８８】 ６．１１ 結果 結果 １．１ これらの初期実験によって、ＲＡの患者からの血清に対して関節液中で増大す
る１２種の特徴及び減少する１０種の特徴が同定された。各ＲＡＤＦは、ＲＡの
被検者からの血清に対して関節液においてのみ差別的に存在するが、ＲＡを持た
ない被検者からの血清に対して関節液では異ならずに存在した。 【０２８９】 部分的なアミノ酸配列をこれらのＲＡＤＦで差別的に存在するＲＰＩについて
決定した。公的なデータベースのコンピューター分析によって、これらの部分的
に配列が決定されたタンパク質のうち２１種が当該分野において既知であり、５
種は試験された公的なデータベースには記載されていなかったことが分かった。
表ＶＩＩＩから、数種のＲＰＩは同じタンパク質のイソ型であることが示される
。例えば、ＲＰＩ−１及びＲＰＩ−１１はトランスフェリンのイソ型である。こ
れらのイソ型は、翻訳後プロセッシング（例えば、グリコシレーション、リン酸
化、アシル化または最小タンパク質分解(minimal proteolysis)）における相違 から生じると考えられる。 【０２９０】 ７． 実施例： ＲＡを有する及び有さない患者の血清由来のタンパク質 リウマチ様関節炎（ＲＡ）を有する患者からの及びＲＡを有さない患者からの
血清におけるタンパク質を等電点電気泳動さらにはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分
離し、比較した。 【０２９１】 分析は、実施例７の比較をＲＡ患者からの血清及び非ＲＡ患者からの血清の間
で行なった以外は、実施例６に記載されるのと同様にして行なった。 【０２９２】 ７．１ 結果 これらの初期実験によって、非ＲＡの患者からの血清と比較してＲＡの患者か
らの血清で増大する１２種の特徴及び減少する９種の特徴が同定された。これら
のＲＡＤＦの詳細は表ＩＩＩ及びＩＶに記載される。各ＲＡＤＦは、非ＲＡの血
清に対してＲＡの血清中で差別的に存在した。 【０２９３】 部分的なアミノ酸配列をこれらのＲＡＤＦで差別的に存在するＲＰＩについて
決定した。公的なデータベースのコンピューター分析によって、これらの部分的
に配列が決定されたタンパク質のうち１７種が当該分野において既知であり、４
種は試験された公的なデータベースには記載されていなかったことが分かった。
表ＸＩから、数種のＲＰＩは同じタンパク質のイソ型であることが示される。例
えば、ＲＰＩ−４４及びＲＰＩ−４５はトランスフェリンのイソ型である。これ
らのイソ型は、翻訳後プロセッシング（例えば、グリコシレーション、リン酸化
、アシル化または最小タンパク質分解(minimal proteolysis)）における相違か ら生じると考えられる。 【０２９４】 さらに、表ＶＩＩＩ〜ＸＩから、ＲＰＩ−２、ＲＰＩ−６、ＲＰＩ−７、ＲＰ
Ｉ−１４、ＲＰＩ−２３、ＲＰＩ−２５、ＲＰＩ−３１、及びＲＰＩ−３７は免
疫グロブリンイソ型の代表であることが示される。特にＲＰＩ−２は、ＩｇＧ軽
鎖のイソ型の代表である。換言すると、好ましい技術を用いて、ＲＡと特に関連
し、この病気と関連するオリゴクローナルな体液性免疫反応(oligoclonal humor
al immune response)に反映すると考えられる免疫グロブリンのイソ型の規定さ れるサブセットを同定した。これらの免疫グロブリンのイソ型（及びこの断片や
これに対する抗体など）は診断、予後、治療のためのモニタリング及び薬剤の開
発に有用である。 【０２９５】 本発明は、具体的に記載された実施形態によって概念を限定されるものではな
く、本発明の一概念の詳細な説明と解する。真に、本明細書中に示され記載され
たものに加えて本発明の様々な修飾が前記説明および添付図面から当業者に明ら
かになるであろう。このような修飾は、添付の特許請求の範囲の概念に含まれる
ものである。 【０２９６】 本明細書において引用されたすべての公報は、その全体を参考のために本明細
書中に引用される。 【図面の簡単な説明】 【図１】 図１は、正常ヒト血清の二次元電気泳動から得られたイメージであり、これは
ＰＬ１〜ＰＬ１６をデザインした、１４個のランドマーク特徴を同定したことを
付記する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/68 33/68 Ａ６１Ｋ 37/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ｗ (72)発明者 パレク，ラジェシュ，ビクー イギリス国，オキソン オーエックス14 ３ワイエス，アビンドン，アビンドン サ イエンス パーク，バートン レイン，ザ クアッドラント 10，オックスフォード グリコサイエンセス （ユーケー） リ ミテッド (72)発明者 パテル，ザコルブハイ，パーショタンブハ イ イギリス国，オキソン オーエックス14 ３ワイエス，アビンドン，アビンドン サ イエンス パーク，バートン レイン，ザ クアッドラント 10，オックスフォード グリコサイエンセス （ユーケー） リ ミテッド (72)発明者 タウンセンド，ロバート，レイド イギリス国，オキソン オーエックス14 ３ワイエス，アビンドン，アビンドン サ イエンス パーク，バートン レイン，ザ クアッドラント 10，オックスフォード グリコサイエンセス （ユーケー） リ ミテッド Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CA25 CA26 DA36 DA77 FB03 FB05 JA01 4C084 AA02 BA03 CA25 DC50 NA14 ZA962 ZB152 ZB262 4C085 AA13 AA14 BB14 CC04 CC05 DD22 DD23 EE01 4C086 AA01 AA02 EA01 MA01 MA04 MA07 NA14 ZA96 ZB15 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 EA22 EA50 FA72 FA74 HA05 HA06 HA07 HA15 HA16

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 サンプル中の所定の一の特徴若しくは複数の特徴の相対的な
    発生量が被検者のＲＡの存在若しくは不存在を示すものである、 （ａ）２次元電気泳動によって被検者からの血清若しくは血漿のサンプルを分析
    して、特徴の２次元アレイを得； （ｂ）その相対的な発生量がＲＡの存在若しくは不存在と相関する少なくとも一
    の所定の特徴について、該サンプルにおける各所定の特徴の発生量をＲＡをもた
    ない一人以上のヒトからの血清若しくは血漿における該所定の特徴の発生量と比
    較することを含む、 被検者におけるＲＡのスクリーニング、診断若しくは予後に関するまたは被検者
    に投与される抗ＲＡ薬剤若しくは治療の効果をモニターする方法。 【請求項２】 血清若しくは血漿サンプルと比較した場合の関節液サンプル
    中の所定の一の特徴若しくは複数の特徴の相対的な発生量が被検者のＲＡの存在
    若しくは不存在を示すものである、 （ａ）２次元電気泳動によって被検者からの関節液のサンプルを分析して、特徴
    の２次元アレイを得； （ｂ）２次元電気泳動によって被検者からの血清若しくは血漿のサンプルを分析
    して、特徴の２次元アレイを得； （ｃ）その相対的な発生量がＲＡの存在若しくは不存在と相関する少なくとも一
    の所定の特徴について、関節液のサンプルにおける各所定の特徴の発生量を血清
    若しくは血漿のサンプルにおける該所定の特徴の発生量と比較することを含む、
    被検者におけるＲＡのスクリーニング、診断若しくは予後に関するまたは被検者
    に投与される抗ＲＡ薬剤若しくは治療の効果をモニターする方法。 【請求項３】 一以上の発現参照特徴（ＥＲＦ）に対するサンプル中の所定
    の一の特徴若しくは複数の特徴の強度が被検者のＲＡの存在若しくは不存在を示
    すものである、 （ａ）２次元電気泳動によって被検者からの関節液、血清若しくは血漿のサンプ
    ルを分析して、特徴の２次元アレイを得； （ｂ）その強度がＲＡの存在若しくは不存在と相関する少なくとも一の所定の特
    徴について、該サンプルにおける各所定の特徴の強度を該被検者からの関節液、
    血清若しくは血漿における該一以上の所定の発現参照特徴（ＥＲＦ）の強度と比
    較することを含む、 被検者におけるＲＡのスクリーニング、診断若しくは予後に関するまたは被検者
    に投与される抗ＲＡ薬剤若しくは治療の効果をモニターする方法。 【請求項４】 （ａ）２次元電気泳動によって被検者からの関節液、血清若
    しくは血漿のサンプルを分析して、等電点及び電気泳動移動度に従って複数のタ
    ンパク質を分離し；および （ｂ）下記のＲＡ診断特徴（ＲＡＤＦ）：ＲＡＤＦ−１、ＲＡＤＦ−２、ＲＡＤ
    Ｆ−３、ＲＡＤＦ−４、ＲＡＤＦ−５、ＲＡＤＦ−６、ＲＡＤＦ−７、ＲＡＤＦ
    −８、ＲＡＤＦ−９、ＲＡＤＦ−１０、ＲＡＤＦ−１１、ＲＡＤＦ−１２、ＲＡ
    ＤＦ−１３、ＲＡＤＦ−１４、ＲＡＤＦ−１５、ＲＡＤＦ−１６、ＲＡＤＦ−１
    ７、ＲＡＤＦ−１８、ＲＡＤＦ−１９、ＲＡＤＦ−２０、ＲＡＤＦ−２１、ＲＡ
    ＤＦ−２２、ＲＡＤＦ−２３、ＲＡＤＦ−２４、ＲＡＤＦ−２５、ＲＡＤＦ−２
    ６、ＲＡＤＦ−２７、ＲＡＤＦ−２８、ＲＡＤＦ−２９、ＲＡＤＦ−３０、ＲＡ
    ＤＦ−３１、ＲＡＤＦ−３２、ＲＡＤＦ−３３、ＲＡＤＦ−３４、ＲＡＤＦ−３
    ５、ＲＡＤＦ−３６、ＲＡＤＦ−３７、ＲＡＤＦ−３８、ＲＡＤＦ−３９及びＲ
    ＡＤＦ−４０の少なくとも一を定量的に検出することを含む、 被検者におけるＲＡのスクリーニング、診断若しくは予後に関するまたは被検者
    に投与される抗ＲＡ薬剤若しくは治療の効果をモニターする方法。 【請求項５】 該段階（ａ）は等電点電気泳動さらにはドデシル硫酸ナトリ
    ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を含む、請求項１、
    ２、３または４に記載の方法。 【請求項６】 （ａ）被検者からの関節液、血清若しくは血漿のサンプルに
    おいて、下記ＲＡ診断タンパク質イソ型（ＲＰＩ）：ＲＰＩ−１、ＲＰＩ−２、
    ＲＰＩ−３、ＲＰＩ−４、ＲＰＩ−５、ＲＰＩ−６、ＲＰＩ−８、ＲＰＩ−９、
    ＲＰＩ−１０、ＲＰＩ−１１、ＲＰＩ−１２、ＲＰＩ−１３、ＲＰＩ−１４、Ｒ
    ＰＩ−１５、ＲＰＩ−１６、ＲＰＩ−１７、ＲＰＩ−１８、ＲＰＩ−１９、ＲＰ
    Ｉ−２０、ＲＰＩ−２１若しくはＲＰＩ−２２、ＲＰＩ−２３、ＲＰＩ−２４、
    ＲＰＩ−２５、ＲＰＩ−２６、ＲＰＩ−２７、ＲＰＩ−２８、ＲＰＩ−２９、Ｒ
    ＰＩ−３０、ＲＰＩ−３１、ＲＰＩ−３２、ＲＰＩ−３３、ＲＰＩ−３４、ＲＰ
    Ｉ−３５、ＲＰＩ−３６、ＲＰＩ−３７、及びＲＰＩ−３８の少なくとも一を定
    量的に検出することを含む、 被検者におけるＲＡのスクリーニング、診断若しくは予後に関するまたは被検者
    に投与される抗ＲＡ薬剤若しくは治療の効果をモニターする方法。 【請求項７】 該定量的に検出する段階はサンプルの少なくとも一のアリコ
    ートを試験することからなり、該試験する段階は、 （ａ）アリコートを予め選択されるＲＰＩに対して免疫特異的である抗体と接触
    させ；および （ｂ）結合が該抗体及び該アリコートにおける少なくとも一の物質との間に起こ
    るか否かを検出することを含む、 請求項６に記載の方法。 【請求項８】 該抗体はモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法
    。 【請求項９】 該定量的に検出する段階は複数のアリコートを複数の抗体で
    試験することを含む、請求項７に記載の方法。 【請求項１０】 該抗体はモノクローナル抗体である、請求項９に記載の方
    法。 【請求項１１】 以下の分離されたＲＡ診断タンパク質イソ型（ＲＰＩ）：
    ＲＰＩ−１、ＲＰＩ−２、ＲＰＩ−３、ＲＰＩ−４、ＲＰＩ−５、ＲＰＩ−６、
    ＲＰＩ−８、ＲＰＩ−９、ＲＰＩ−１０、ＲＰＩ−１１、ＲＰＩ−１２、ＲＰＩ
    −１３、ＲＰＩ−１４、ＲＰＩ−１５、ＲＰＩ−１６、ＲＰＩ−１７、ＲＰＩ−
    １８、ＲＰＩ−１９、ＲＰＩ−２０、ＲＰＩ−２１またはＲＰＩ−２２、ＲＰＩ
    −２３、ＲＰＩ−２４、ＲＰＩ−２５、ＲＰＩ−２６、ＲＰＩ−２７、ＲＰＩ−
    ２８、ＲＰＩ−２９、ＲＰＩ−３０、ＲＰＩ−３１、ＲＰＩ−３２、ＲＰＩ−３
    ３、ＲＰＩ−３４、ＲＰＩ−３５、ＲＰＩ−３６、ＲＰＩ−３７、またはＲＰＩ
    −３８の一を含む調製物。 【請求項１２】 請求項１１の調製物を含むキット。 【請求項１４】 請求項１１の複数の調製物を含むキット。 【請求項１５】 分離されたヒトのタンパク質を含む調製物であって、該タ
    ンパク質は下記配列：ＶＡＡＩＥＨＦＧＲまたはＶＡＡＬＥＨＦＧＲの一方を有
    するペプチドを含む調製物。 【請求項１６】 該タンパク質は約５．９８の等電点（ｐＩ）及び約５２，
    ６３１の見かけの分子量（ＭＷ）を有する、請求項１５に記載の調製物。 【請求項１７】 該ｐＩは５．９８の１０％以内であり、該ＭＷは５２，６
    ３１の１０％以内である、請求項１６に記載の調製物。 【請求項１８】 該ｐＩは５．９８の５％以内であり、該ＭＷは５２，６３
    １の５％以内である、請求項１７に記載の調製物。 【請求項１９】 該ｐＩは５．９８の１％以内であり、該ＭＷは５２，６３
    １の１％以内である、請求項１８に記載の調製物。 【請求項２０】 分離されたヒトのタンパク質を含む調製物であって、該タ
    ンパク質は下記配列：ＤＳＧＡＤＩＳまたはＤＳＧＡＤＬＳの一方を有するペプ
    チドを含む調製物。 【請求項２１】 該タンパク質は約５．３６の等電点（ｐＩ）及び約２４，
    １２４の見かけの分子量（ＭＷ）を有する、請求項２０に記載の調製物。 【請求項２２】 該ｐＩは５．３６の１０％以内であり、該ＭＷは２４，１
    ２４の１０％以内である、請求項２１に記載の調製物。 【請求項２３】 該ｐＩは５．３６の５％以内であり、該ＭＷは２４，１２
    ４の５％以内である、請求項２２に記載の調製物。 【請求項２４】 該ｐＩは５．３６の１％以内であり、該ＭＷは２４，１２
    ４の１％以内である、請求項２３に記載の調製物。 【請求項２５】 分離されたヒトのタンパク質を含む調製物であって、該タ
    ンパク質は下記配列：ＮＶＩＤＡＰＨＡＲまたはＮＶＬＤＡＰＨＡＲの一方を有
    するペプチドを含む調製物。 【請求項２６】 該タンパク質は約５．９６の等電点（ｐＩ）及び約１５８
    ，８６８の見かけの分子量（ＭＷ）を有する、請求項２５に記載の調製物。 【請求項２７】 該ｐＩは５．９６の１０％以内であり、該ＭＷは１５８，
    ８６８の１０％以内である、請求項２６に記載の調製物。 【請求項２８】 該ｐＩは５．９６の５％以内であり、該ＭＷは１５８，８
    ６８の５％以内である、請求項２７に記載の調製物。 【請求項２９】 該ｐＩは５．９６の１％以内であり、該ＭＷは１５８，８
    ６８の１％以内である、請求項２８に記載の調製物。 【請求項３０】 下記ＲＡ診断タンパク質イソ型（ＲＰＩ）：ＲＰＩ−１、
    ＲＰＩ−２、ＲＰＩ−３、ＲＰＩ−４、ＲＰＩ−５、ＲＰＩ−６、ＲＰＩ−８、
    ＲＰＩ−９、ＲＰＩ−１０、ＲＰＩ−１１、ＲＰＩ−１２、ＲＰＩ−１３、ＲＰ
    Ｉ−１４、ＲＰＩ−１５、ＲＰＩ−１６、ＲＰＩ−１７、ＲＰＩ−１８、ＲＰＩ
    −１９、ＲＰＩ−２０、ＲＰＩ−２１またはＲＰＩ−２２、ＲＰＩ−２３、ＲＰ
    Ｉ−２４、ＲＰＩ−２５、ＲＰＩ−２６、ＲＰＩ−２７、ＲＰＩ−２８、ＲＰＩ
    −２９、ＲＰＩ−３０、ＲＰＩ−３１、ＲＰＩ−３２、ＲＰＩ−３３、ＲＰＩ−
    ３４、ＲＰＩ−３５、ＲＰＩ−３６、ＲＰＩ−３７、及びＲＰＩ−３８の一に免
    疫特異的に結合できる抗体。 【請求項３１】 請求項３０の抗体を含むキット。 【請求項３２】 請求項３０の複数の抗体を含むキット。 【請求項３３】 治療上有効な量の下記ＲＡ診断タンパク質イソ型（ＲＰＩ
    ）：ＲＰＩ−１２、ＲＰＩ−１３、ＲＰＩ−１４、ＲＰＩ−１５、ＲＰＩ−１６
    、ＲＰＩ−１７、ＲＰＩ−１８、ＲＰＩ−１９、ＲＰＩ−２０、ＲＰＩ−２１、
    ＲＰＩ−２２、ＲＰＩ−２３、及びＲＰＩ−２４の一以上を含む薬剤組成物。 【請求項３４】 治療上有効な量の下記ＲＡ診断タンパク質イソ型（ＲＰＩ
    ）：ＲＰＩ−１、ＲＰＩ−２、ＲＰＩ−３、ＲＰＩ−４、ＲＰＩ−５、ＲＰＩ−
    ６、ＲＰＩ−８、ＲＰＩ−９、ＲＰＩ−１０、またはＲＰＩ−１１の一に免疫特
    異的に結合する抗体を含む薬剤組成物。 【請求項３５】 治療上有効な量の下記ＲＡ診断タンパク質イソ型（ＲＰＩ
    ）：ＲＰＩ−１、ＲＰＩ−２、ＲＰＩ−３、ＲＰＩ−４、ＲＰＩ−５、ＲＰＩ−
    ６、ＲＰＩ−８、ＲＰＩ−９、ＲＰＩ−１０、若しくはＲＰＩ−１１の一に免疫
    特異的に結合する抗体の断片または誘導体、該抗体の結合ドメインを含む断片ま
    たは誘導体；および製薬上許容できる担体を含む薬剤組成物。 【請求項３６】 治療上有効な量の下記ＲＡ診断タンパク質イソ型（ＲＰＩ
    ）：ＲＰＩ−１２、ＲＰＩ−１３、ＲＰＩ−１４、ＲＰＩ−１５、ＲＰＩ−１６
    、ＲＰＩ−１８、ＲＰＩ−１９、ＲＰＩ−２１、ＲＰＩ−２２、ＲＰＩ−２３、
    もしくはＲＰＩ−２４の一をコード化する核酸をＲＡの治療または予防の必要な
    被検者に投与することを含むＲＡの治療または予防方法。 【請求項３７】 治療上有効な量の下記ＲＡ診断タンパク質イソ型（ＲＰＩ
    ）：ＲＰＩ−１、ＲＰＩ−２、ＲＰＩ−３、ＲＰＩ−４、ＲＰＩ−５、ＲＰＩ−
    ６、ＲＰＩ−８、ＲＰＩ−９、またはＲＰＩ−１１の一以上の機能を阻害する核
    酸をＲＡの治療または予防の必要な被検者に投与することを含むまたは予防方法
    。 【請求項３８】 該核酸はＲＰＩアンチセンス核酸またはリボザイムである
    、請求項３７の方法。 【請求項３９】 被検者におけるＲＡのスクリーニング、診断若しくは予後
    におけるまたは被検者に投与される抗ＲＡ薬剤若しくは治療の効果をモニターす
    るための請求項４に記載の一以上のＲＡＤＦの使用。 【請求項４０】 被検者におけるＲＡのスクリーニング、診断若しくは予後
    におけるまたは被検者に投与される抗ＲＡ薬剤若しくは治療の効果をモニターす
    るための請求項６に記載の一以上のＲＰＩの使用。 【請求項４１】 被検者におけるＲＡのスクリーニング、診断若しくは予後
    におけるまたは被検者に投与される抗ＲＡ薬剤若しくは治療の効果をモニターす
    るための請求項６に記載のＲＰＩに対して免疫特異的な少なくとも一の抗体の使
    用。 【請求項４２】 該少なくとも一の抗体はモノクローナル抗体である、請求
    項４１に記載の使用。 【請求項４３】 被検者におけるＲＡのスクリーニング、診断若しくは予後
    におけるまたは被検者に投与される抗ＲＡ薬剤若しくは治療の効果をモニターす
    るための請求項１５〜２９のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。 【請求項４４】 ＲＡの予防または治療に使用される薬剤の調製における請
    求項３３に記載の少なくとも一のＲＰＩの使用。 【請求項４５】 ＲＡの予防または治療に使用される薬剤の調製における請
    求項３４に記載の少なくとも一の抗体の使用。 【請求項４６】 ＲＡの予防または治療に使用される薬剤の調製における請
    求項３５に記載の抗体の断片または誘導体の使用。 【請求項４７】 ＲＡの予防または治療に使用される薬剤の調製における請
    求項３６に記載の核酸の使用。 【請求項４８】 ＲＡの予防または治療に使用される薬剤の調製における請
    求項３７に記載の核酸の使用。
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