JP2002507723A - リウマチ様関節炎の診断のための方法および組成物 - Google Patents
リウマチ様関節炎の診断のための方法および組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、RAのスクリーニング、診断及び予後のための、RA治療の有効性をモニターするための、ならびに薬剤の開発のための方法及び組成物を提供するものである。血清または血漿の2次元電気泳動によって検出可能である、RA診断特徴(RADF)が記載される。本発明はさらに、関節液、血清または血漿中で検出可能であるRA診断タンパク質イソ型(RPI)、分離されたRPIからなる調製物、RPIに免疫特異的である抗体、および前記からなるキットを提供するものである。
Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
1.イントロダクション
本発明は、リウマチ様関節炎に関連するタンパク質およびタンパク質イソ型の
同定に関するものであり、ならびに、スクリーニング、診断、予後、治療および
薬剤開発のためのそれらの使用に関するものである。 【0002】 2.発明の背景 リウマチ様関節炎(RA)は、免疫異常によって対称性関節性炎症、関節性び
らん、および関節外の合併症を特徴的に引き起こす複合系疾患である。これは最
も一般的な不自由にする自己免疫性関節炎であり、遺伝的感受性がよく定義され
ている。人口の約1〜3%がこれに罹患している。罹患率は年齢とともに増加す
るが、ピークは30〜55歳である。 【0003】 リウマチ因子は、すなわち免疫グロブリンG(IgG)のFc断片に対する抗
体であり、RAを罹患している患者の75%に存在する。リウマチ因子はIgM
、IgGまたはIgAでありうる。自然に生じるリウマチ因子は、外来抗原を対
外に除去することに関する役割を持つと考えられている。RAにおいて、リウマ
チ因子は滑膜プラズマ細胞によって生産され、免疫複合体を形成し、補体を活性
化し、炎症性応答に関与する能力を持ち、それらがRAの病因に関与しているこ
とが示唆されている。RAにおけるリウマチ因子および減少されたIGのガラク
トシル化が共存することによって、数種の病気が予想される。 【0004】 滑膜組織は、RAにおける炎症の主要巣であり、CD4+Tリンパ球、活性B
細胞、単核細胞および多核白血球の慢性滑膜の浸潤が起こる。HLAクラスIIの
発現は増加し、ほとんどすべての細胞型で見出され、それらが活性状態であるこ
とを示す。慢性疾患の特徴は、軟骨および骨のびらん、ならびに滑膜肥大である
。 【0005】 RAの診断は困難でありつづけている。既往症、病気の初期における検査およ
び調査から、病気のパターンがはっきりしないからである。RAに対する診断テ
ストはないが、リウマチ学で有名なアメリカの大学がその分類に関する基準を定
義した(Medicine, ed. Axford, J., Blackwell Science, 1996, pp. 3.18-3.22
)。これらの基準は、単に観察用のランドマークであり、これは組み合わせてR
Aを指示するためと思われる。 【0006】 RAをもつ成人の75%は、IgMリウマチ因子陽性である。これは病気の初
期において見出されない。リウマチ因子のレベルは予後的に診断で使用されうる
が、その機能は病気のモニタリングの役には立たない。抗核の抗体が患者の30
%に存在する。 【0007】 IgMのリウマチ因子は通常、凝集テストによって測定される。これらは、I
gGで被覆された粒子が凝集するラテックステスト(latex test)、羊赤血球が
凝集する羊赤血球凝集反応(SCATまたはローズ−ワーラーテスト(Rose-Waa
ler test))を含む。他の基準によって診断されたRA患者の少なくとも70%
は、リウマチ因子のラテックス凝集反応陽性である。リウマチ因子テストはまた
、他のリウマチ性疾患、ウイルス感染、慢性炎症性疾患、腫瘍または化学療法に
おいても陽性であり、深刻なことに4%の健康な個体も陽性である。 【0008】 RAの薬剤治療は、(1)痛みを緩和する(鎮痛剤);(2)一度炎症が引き
起こされた炎症性事象を改変する(抗炎症性薬剤);および(3)炎症を導く免
疫性事象を改変する(疾患−改変薬剤)を目的としている。 【0009】 3.発明の概要 本発明は、RAのスクリーニング、診断ならびに予後のため、RA治療の有効
性をモニタリングするため、RAの治療ならびに薬剤開発のための方法および化
合物を提供するものである。 【0010】 1 本発明の第一の観点において、RAの診断のための方法を提供する。これはサ
ンプル(例えば、血漿、血清または関節液)を二次元電気泳動によって分析し、
少なくとも一のリウマチ様関節炎特徴(Rheumatoid Arthritis-Diagnostic Feat
ure (RADF))のレベルを検出することを含み、例えばここで開示されるRADF
類の群から選択されたRADFである。これらの方法はまた、スクリーニング、
予後、治療結果のモニタリングおよび薬剤開発に適している。 【0011】 本発明の第二の観点において、RA診断のための方法を提供する。これはサン
プル(例えば血漿、血清または関節液)中の少なくとも一つのリウマチ様関節炎
診断タンパク質イソ型(Rheumatoid Arthritis-Diagnostic Protein Isoform (
RPI))を検出することを含み、例えばここで開示されるRPI類の群か選択さ れるRPIである。これらの方法はまた、スクリーニング、予後、治療結果のモ
ニタリングおよび薬剤開発に適している。 【0012】 本発明の第三の観点において、RPIに対して免疫特異的に結合することので
きるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を提供するものであり、例え
ばここで開示されるRPIである。 【0013】 本発明の第四の観点において、分離されたRPI、すなわち顕著に異なる等電
点または顕著に異なる見かけの分子量を持つタンパク質もしくはタンパク質イソ
型から分離したRPIを含む製剤を提供する。 【0014】 本発明の第五の観点において、RAの治療または予防のための方法を提供する
。これは、RA患者の血清と比較してRA患者の関節液において増加したレベル
で存在する、少なくとも一つのRADFのレベルまたは少なくとも一つのRPI
のレベルまたは活性を減少させることができる化合物を投与することを含む。好
ましくは、投与される化合物は、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボ
ザイムまたはトリプレックス(triple helix)を形成できるオリゴヌクレオチド
である。 【0015】 本発明の第六の観点において、RAの治療または予防のための方法を提供する
。これは、RA患者の血清と比較してRA患者の関節液において減少したレベル
で存在する、少なくとも一つのRADFのレベルまたは少なくとも一つのRPI
のレベルもしくは活性を増加させることができる化合物を投与することを含む。
好ましくは、投与される該化合物は、RPI、RPIをコードする核酸、(例え
ば、発現ベクターの一部である核酸)または一つまたはそれ以上のRPIを発現
および分泌できる細胞である。 【0016】 5.発明の詳細な説明 以下に説明される本発明は、被検者におけるRAのスクリーニング、診断およ
び予後のための方法および組成物、RA治療結果のモニタリングの方法、薬剤開
発の方法、および、RA治療の方法を含む。好ましくは、該被検者は哺乳類であ
り、より好ましくはヒトであり、最も好ましくはヒト成人である。 【0017】 限定することなく開示を明確するために、本発明は血清および関節液サンプル
の分析に関して記載されている。しかしながら、当業者にとって明らかなように
、ここで記載された分析および技術は、体液(例えば、血漿、尿、脳席髄液、関
節吸引液)、組織サンプルまたはそれらのホモジネートを含む、他のタイプの患
者のサンプルにも適用することができる。 【0018】 5.1 リウマチ様関節炎診断特徴(RADF) 本発明の一つの観点において、二次元電気泳動は、RAのスクリーニングまた
は診断のために一つまたはそれ以上のリウマチ様関節炎特徴(Rheumatoid Arthr
itis-Diagnostic Features(RADF))の発生量を測定するため、RA患者の
予後を測定するため、RA治療の有効性をモニターするため、被検者からの血清
を分析するため、または、薬剤開発のために用いられる。ここで用いられている
ように、「二次元電気泳動」(2D電気泳動)は、変性電気泳動によってなされ
る等電点電気泳動を含む技術を意味し、これにより複数の分離されたタンパク質
を含む二次元ゲル(2Dゲル)を得る。好ましくは、変性電気泳動の段階におい
て、ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PA
GE)が使用される。特に好ましくは、米国特許出願第08/980,574号
に記載されている非常に正確な自動方法およびその装置(「好ましい技術(the
Preferred Technology)」)であり、ここにその全体を参照させることによって
引用する。簡潔にいうと、該好ましい技術とは、生物学的サンプル中において生
物学的分子を選択し特徴づけるために、有効なコンピューター支援による方法お
よび装置を提供するものである。二次元アレイ(two-dimensional array)は、 電気泳動移動度および等電点に従って二次元ゲル上で生物学的分子を分離するこ
とによって生じる。該アレイのコンピューターによるデジタルプロファイルが作
成され、これは二次元アレイ中に検出された多数の生物学的分子の同一性、見か
けの分子量、等電点および相対発生量を表現するものであり、それによって複数
の生物学的サンプルからのプロファイルをコンピューターが媒介して比較するこ
と、および興味深い分離されたタンパク質をコンピューターの補助により切り出
すことが可能である。 【0019】 ここで用いられているように、「リウマチ様関節炎特徴(Rheumatoid Arthrit
is-Diagnostic Feature(RADF))」とは、生物学的サンプルの2D電気泳 動によって検出された特徴(例えば、2Dゲル上のスポット)であり、すなわち
他の関連するタンパク質と比較してあるサンプル中に差別的に存在するものであ
り、例えば(1)RAを持たない被検者の血清と比較した、RAを持つ被検者の
血清において、または、(2)RAを持つ被検者の血清と比較した、RAを持つ
被検者の関節液においてである。 【0020】 ここで用いられているように、特徴(またはタンパク質イソ型)とは、第二サ
ンプルに対して第一サンプル中に「差別的に存在する」ものであり、その場合、
その特徴またはイソ型を検出する方法(例えば2Dゲル電気泳動またはイムノア
ッセイ)によって、その特徴(またはタンパク質イソ型)が第二サンプルと比較
して第一サンプル中に異なる相対的な発生量で存在することは明白である。第一
サンプルにおいて測定された特徴が第二サンプルにおいてより高い相対的な発生
量で存在する場合、該特徴またはイソ型は第二サンプルに対して第一サンプルに
おいて「増加」しており、逆に第一サンプルにおいて測定された特徴が、第二サ
ンプルにおいてより低い相対的な発生量で存在する場合、該特徴またはイソ型は
第二サンプルに対して第一サンプルにおいて「減少」している。 【0021】 好ましくは、二つのサンプルにおける特徴の相対的な発生量は、二つの段階で
決定される。第一に、サンプル中で検出された特徴について得られたシグナルは
、例えば分析されたサンプル中における総タンパク質(例えば、ゲルにローディ
ングした総タンパク質)に対する適切なバックグラウンドパラメータ、不変の特
徴、すなわち比較されるサンプル中でその発生量が類似していることがわかって
いる特徴(例えば、ここで開示されているERF等の、一つまたはそれ以上の発
現参照特徴(Expression Reference Features(ERF))、または、サンプル 中のすべてのタンパク質から検出された総シグナルを参照することによって基準
化(normalized)する。 【0022】 第二に、一つまたはそれ以上のサンプルセット中の特徴に関して基準化された
シグナルは、他のサンプルまたはサンプルセット中の同じ特徴に関して基準化さ
れたシグナルと比較される。これは、第二サンプルに関して、第一サンプル(ま
たはサンプルセット)中に「差別的に存在する」特徴を同定するためである。 【0023】 ここで開示されたRADFとは、一つまたはそれ以上のサンプルを比較するこ
とによって同定されている。RADFの第一グループは、(a)RAを持つ被検
者の血清と比較してRAを持つ被検者の関節液中に差別的に存在する、および(
b)RAを持たない被検者の血清と比較してRAを持たない被検者の関節液中に
差別的に存在しない特徴のことである。RAを持たない被検者は、既知の病気ま
たは症状を持たない正常な被検者、または、通風、変形性関節炎または滑膜炎(
例えば外傷性滑膜炎)を含むRA以外の関節の病気または症状を持つ被検者を含
みうる。RADFの第二グループは、RAを持たない被検者の血清と比較してR
Aを持つ被検者の血清中で差別的に存在する特徴のことである。 【0024】 RADFの四のグループは、該好ましい技術の方法および装置によって同定さ
れている。第一グループは、RAを持つ被検者の関節液中で増加しているが、R
Aを持たない被検者中の血清中に対して関節液中で増加していないようなRAD
Fを含む。これらのRADFは見かけの分子量(MW)および等電点(pI)に
よって下記のように記載されうる。 【0025】 【表1】 【0026】 第二グループは、RAを持つ被検者の血清中に対して関節液中で減少している
が、RAを持たない被検者の血清に対して関節液中で減少していないようなRA
DFを含む。これらのRADFは見かけの分子量(MW)および等電点(pI)
によって下記のように記載されうる。 【0027】 【表2】 【0028】 第三グループは、RAを持たない被検者の血清と比較してRAを持つ被検者の
血清において増加しているようなRADFを含む。これらのRADFは見かけの
分子量(MW)および等電点(pI)によって下記のように記載されうる。 【0029】 【表3】 【0030】 第四グループは、RAを持たない被検者の血清と比較してRAを持つ被検者の
血清で減少しているようなRADFを含む。これらのRADFは見かけの分子量
(MW)および等電点(pI)によって下記のように記載されうる。 【0031】 【表4】 【0032】 第一および第二グループにおける任意の目的のRADFに関して、RAを持つ
被検者の血清中で測定されたシグナルに対して、RAを持つ被検者の関節液中で
測定されたシグナルを比較して得られた比率は、用いた特別な分析方法および検
出技術に依存するだろう。従って本発明は、第一および第二グループ中のそれぞ
れのRADFにおいて、実験室が、従来の診断技術としての分析方法および検出
技術に従って、RAを含むおよび含まない被検者の血清に対する関節液中の各R
ADFの比率に関する参照範囲を確立することを実現しうる。好ましくは、RA
を持つことが知られている被検者の関節液および血清サンプルの少なくとも一つ
の対照対(control pair)、または、RAを持つことがわかっていない被検者の
関節液および血清サンプルの少なくとも一つの対照対(およびより好ましくは,
このような対照対の少なくともいずれか一つ)は、分析されるテストサンプルの
それぞれのバッチとともに含まれる。 【0033】 同様に、第三および第四グループの任意の目的とするRADFにおいて、RA
を持たない被検者の血清中で測定されたシグナルに対して、RAを持つ被検者の
血清中で測定されたシグナルを比較して得られた比率は、用いられた特別な分析
方法および検出技術に依存するだろう。従って、本発明は、それぞれの実験室が
従来の診断技術としての分析方法および検出技術に従って、RAを含むおよび含
まない被検者の第三および第四グループ中の各RADFの比率に関する参照範囲
を確立することを実現しうる。好ましくは、RAを持つことが知られている被検
者の少なくとも一つの陽性対照血清サンプル、または、RAを持つことが知られ
ていない被検者の少なくとも一つの陰性対照血清サンプルは、分析されたテスト
サンプルのそれぞれのバッチとともに含まれる。 【0034】 好ましい実施形態において、RADFと関連するシグナルは、同じ2Dゲルで
検出された一つまたはそれ以上のの発現参照特徴(ERF)を参照して基準に合
わせられる。当業者にとって明白なように、このようなERFは好ましい技術 (Preferred Technology)を用いて異なるサンプルを比較することにより容易に
決定されうる。この目的に対して適切なERFは、これらに限定されないが、以
下の表に示されるものを含む。 【0035】 【表5】 【0036】 表IVは、実施例により、ERF−1およびERF−3に対して基準化された、
表Iおよび表IIで同定されたRADFのレベルを示している。当業者であれば、
RADFのレベルは任意の望ましいERFに関して基準化されうることがわかる
であろう。表VIで示された値は、問題のERFに関する各RADFの比率であり
、ここで陽性の比率はERFに関するRADFの増強されたレベルを示しており
、陰性の比率はERFに関するRADFの減少されたレベルを示している。当業
者にとって明白なように、このRADF/ERF比率はそれら自身の本来の状態
における診断パラメータとして与えられる。 【0037】 【表6】 【0038】 同様に、表VIIはERF−1およびERF−3に対して基準化された、表IIIお
よびIVで同定されたRADFのレベルを示している。当業者であれば、RADF
のレベルは任意の望ましいERFに関して発現され、このRADF/ERF比率
はそれら自身の本来の状態における診断パラメータとして与えられることがわか
るであろう。 【0039】 【表7】 【0040】 熟練した当業者が認識しているように、目的の特徴またはタンパク質イソ型の
測定されたMWおよびpIは、2D電気泳動のそれぞれの段階、および、ランド
マークマッチングで用いられる方法の正確さに依存して、ある程度変化しうる。
ここで用いられているように、「MW」および「pI」という用語は、それぞれ
、以下のセクション6に記載の実験方法(「参照方法」)に正確にしたがって測
定された特徴またはタンパク質イソ型の見かけの分子量および等電点を意味する
と定義される。該参照方法が用いられ、サンプルは二連(duplicate)またはそ れ以上の反復で実験される場合、測定されたRADFまたはRPIのpI平均の
変動は概して±1%以下であり、測定されたRADFまたはRPIのMW平均の
変動は概して±5%以下である。熟練した当業者が参照方法から逸脱する場合、
(a)参照方法によって、および(b)逸脱した方法によって検出されるRAD
Fまたはタンパク質イソ型それぞれに対するMWおよびpIを比較することで検
定実験を行うべきである。 【0041】 RADFは検出、予後、診断もしくはRAのモニタリングまたは薬剤開発に有
用である。本発明の一つの実施形態において、被検者の関節液および血清は2D
電気泳動によって、RADF−1〜RADF−12からなる群より選択される一
つまたはそれ以上のRADFの定量的な検出に関して分析される。ここで、血漿
に対して関節液で増加したRADFの発生量は、RAの存在を示している。 【0042】 本発明の他の実施形態において、被検者の関節液および血清は、2D電気泳動
によって、RADF−13〜RADF−22からなる群より選択される一つまた
はそれ以上のRADFの定量的な検出に関して分析される。ここで血清に対する
関節液中の減少したRADFの発生量はRAの存在を示している。 【0043】 本発明の他の実施形態は、被検者の関節液は、2D電気泳動によって、RAD
F−1〜RADF−22からなる群より選択される一つまたはそれ以上のRAD
Fの定量的な検出に関して分析される。ここで発現参照特徴(ERF)に対する
一つまたはそれ以上のRADFの比率は、RAの存在を示しており、ERF−1
およびERF−3がこの目的においては好ましい。 【0044】 本発明のさらに他の実施形態において、RAを持つ被検者の血清は、2D電気
泳動によって、RADF−13、RADF−16およびRADF−22〜RAD
F−31からなる群より選択される一つまたはそれ以上のRADFの定量的な検
出に関して分析される。ここで被検者またはRAを持たない被検者の血清に関連
した被検者の血清中で増加したRADFの発生量(例えば対照サンプルまたは前
もって決定された参照範囲)は、RAの存在を示している。 【0045】 本発明の他の実施形態において、被検者からの血清は、2D電気泳動によって
、RADF−32〜RADF−40からなる群より選択される一つまたはそれ以
上のRADFの定量的な検出に関して分析される。ここで被検者またはらを持た
ない被検者の血清に関連した被検者の血清中で減少したRADFの発生量(例え
ば対照サンプルまたは前もって決定された参照範囲)はRAの存在を示している
。 【0046】 本発明の他の実施形態において、被検者からの関節液は、2D電気泳動によっ
て、RADF−13、RADF−16、RADF−22〜RADF−40からな
る群より選択される一つまたはそれ以上のRADFの定量的な検出に関して分析
される。ここでERFに関連する一つまたはそれ以上のRADFの比率はRAの
存在を示しており、ERF−1およびERF−3はこの目的に適したERFであ
る。 【0047】 5.2 リウマチ様関節炎診断 タンパク質イソ型(RPI) 本発明の他の観点において、被検者からの血清は、RAのスクリーニングもし
くは診断のために、RA患者の予後を決定するために、もしくは、RA治療の有
効性をモニターするために、または、薬剤開発のために、一つまたはそれ以上の
リウマチ様関節炎診断タンパク質イソ型(RPI)の定量的な検出のために分析
される。ここで用いられているように、「リウマチ様関節炎診断タンパク質イソ
型」は、(1)RAを持たない被検者の血清と比較してRAを持つ被検者の血清
において差別的に存在するタンパク質イソ型、および(2)(a)RAを持つ被
検者の血清と比較してRAを持つ被検者の関節液中に差別的に存在する、および
(b)RAを持たない被検者の血清と比較して関節液中で差別的に存在する、タ
ンパク質イソ型を含む。当業界では周知のように、単一遺伝子のタンパク質生産
物は、異なる翻訳後改変の結果として異なる変異体として発現され(例えば、糖
付加、リン酸化、アシル化等)、そのために同一なアミノ酸配列のタンパク質で
もそれらのpI、MWまたはその両方において異なり、および/または、それら
のアミノ酸組成において異なる(例えばそれにかわるスプライシングまたは制限
タンパク質分解の結果としてである)。それは、タンパク質イソ型が差別的に存
在することは、問題のタンパク質をコードしている遺伝子が差別的に発現される
ことを必要としない、ということを裏付けている。 【0048】 RPIの四つのグループは、RADFの部分的なアミノ酸配列によって、好ま
しい技術の方法および装置を用いて同定されている。第一グループは、RAを持
つ被検者の血清に対して関節液中で増加しているが、RAを持たない被検者の血
清に対して関節液中で増加していないようなRPIを含む。これらのRPIのM
W、pI,および部分的アミノ酸配列は、下記の表VIIIに示される。 【0049】 【表8】 【0050】 【表9】 【0051】 【表10】 【0052】 第二グループは、RAを持つ被検者の血清に対して関節液中で減少しているが
、RAを持たない被検者の血清に対して関節液中で減少していないようなRPI
を含む。これらのRPIのMW、pIおよび部分的アミノ酸配列は、以下の表IX
に示される。 【0053】 【表11】 【0054】 【表12】 【0055】 【表13】 【0056】 【表14】 【0057】 第三グループは、RAを持たない被検者の血清で比較したRAを持つ被検者の
血清中で増加しているようなRPIを含む。これらのRPIのMW、pIおよび
部分的アミノ酸配列は以下の表Xに示される。 【0058】 【表15】 【0059】 【表16】 【0060】 【表17】 【0061】 第四グループは、RAを持たない被検者の血清と比較したRAを持つ被検者の
血清中で減少しているようなRPIを含む。これらのRPIのMW、pI、およ
び部分的アミノ酸配列は、以下の表XIに示される。 【0062】 【表18】 【0063】 本発明の一つの実施形態において、被検者の関節液および血清は、RPI−1
〜RPI−11からなる群より選択された一つまたはそれ以上のRPIの定量的
な検出に関して分析され、ここで、血清に相対して関節液中で増加した一つまた
はそれ以上の上記RPIの発生量はRAの存在を示している。本発明の更なる実
施形態において、被検者の関節液および血清は、RPI−12〜RPI−24か
らなる群より選択される一つまたはそれ以上のRPIの定量的な検出に関して分
析される。ここで血清に関連する関節液中で減少した一つまたはそれ以上の上記
RPIの発生量は、RAの存在を示す。 【0064】 本発明の他の実施形態において、被検者の血清は、RPI−12、RPI−1 6、RPI−17およびRPI−24〜RPI−32からなる群より選択される
一つまたはそれ以上のRPIの定量的な検出に関して分析される。ここで被検者
の血清中で増加した一つまたはそれ以上の上記RPIの発生量は、RAの存在を
示している。本発明の他の実施形態において、被検者の血清は、RPI−33〜
RPI−38からなる群より選択される一つまたはそれ以上のRPIの定量的な
検出に関して分析される。ここで、被検者の血清中で減少する一つまたはそれ以
上のRPI発生量は、RAの存在を示している。 【0065】 好ましくは、RPIの発生量は発現参照タンパク質(ERPI)に対し基準化
される。ERPIは上述したERFの部分的アミノ酸配列によって好ましい技術
の方法の技術を用いて同定されたものである。これらのERPIの部分的アミノ
酸配列および相同な既知のタンパク質は表XIbに示される。 【0066】 【表19】 【0067】 上述したように、ここで記載されたRPIは、そのイソ型がRAに関連するこ
とがまだ知られていない既知のタンパク質、および、未知のタンパク質を含む。
さらに本発明は、それぞれのRPIに関して、分離されたRPIまたはそれらの
断片、および、前期RPIまたは前期断片に結合する抗体を含む。ここで用いら
れているように、「分離された」RPIは、2D電気泳動によって決定されたよ
うに、RPIのものと顕著に異なるpIまたはMWをもつタンパク質またはタン
パク質イソ型から遊離したRPIである。ここで用いられているように、「顕著
に異なる」pIまたはMWは、参照方法にしたがって実施される2D電気泳動上
で、混在するタンパク質イソ型をRPIから分析することができるものである。 【0068】 一つの実施形態において、分離されたタンパク質は、RPIに関する表VIII、
IX、XまたはXIで同定されたアミノ酸配列を持つペプチドを含む前期タンパク質
、RPIに関する表VIII、IX、XまたはXIで同定された値の10%以内(好まし
くは5%以内、さらに好ましくは1%以内)のpIおよびMWを持つ前期タンパ
ク質を含む。 【0069】 本発明のRPIは、当業界で周知の方法によって分析される。一つの実施形態
において、RPIは、それらのMWおよびpIによって2Dゲル上で分離されて
おり、ゲル染色によって可視化される。 【0070】 あるいは、RPIは、RAの検出、予後、診断もしくはモニタリングのために
、または、薬剤開発のために例えばイムノアッセイのような分析によって検出さ
れうる。一つの実施形態において、イムノアッセイは、テストされる被検者から
得られたサンプルを、免疫特異的な結合が起こりうる条件下で、抗RPI抗体と
接触させ、抗体に結合している任意の免疫特異的結合の量を検出または測定する
ことによって実行される。好ましくは、該抗RPI抗体は、同じタンパク質の他
のイソ型ではなくむしろ優先的にRPIと結合する。好ましい実施形態において
、該抗RPI抗体は、前期同じタンパク質の他のイソ型に比べて、少なくとも2
倍大きい親和性、より好ましくは少なくとも5倍大きい親和性、さらにより好ま
しくは10倍大きい親和性でRPIと結合する。 【0071】 他の実施形態において、イムノアッセイは、免疫特異的結合が起こりうる条件
下で、例えばテストされる被検者から得られたサンプルを、抗RPI抗体の複数
と接触させ、同時に、複数の抗体による複数のRPIへの任意の免疫特異的結合
の量を検出または測定することによって行われる。好ましくは、それぞれの抗R
PI抗体は異なるRPIに結合し、かつ任意に固体の支持体(solid support) に固定される。例えば、抗体は二次元アレイ中に固定され、ここでそれぞれの配
列の位置は、単一のRPIに特異的に結合している抗体によって占有されており
、その配列は一つまたはそれ以上のRPIに対して特異的な抗体を有している。
好ましくは、それぞれの抗RPI抗体は、同じタンパク質の他のイソ型よりむし
ろ、RPIに優先的に結合する。好ましい実施形態において、該抗RPI抗体は
、前期同じタンパク質の他のイソ型に比べて、少なくとも2倍大きい親和性、よ
り好ましくは少なくとも5倍大きい親和性、さらにより好ましくは少なくとも1
0倍大きい親和性ででRPIと結合する。 【0072】 一つの実施形態において、組織部位における抗体の結合は、異所的なRPI局
在またはRPIの異所的な(例えば高い、低い、存在しない)レベルを検出する
のに用いられうる。特殊な実施形態において、RPIに対する抗体は、RPIの
存在に関して、患者の組織または血清サンプルを分析することに用いることがで
き、ここで異所的なレベルのRPIはRAを示している。ここで用いられている
ように、「異所的なレベル」とは、その存在に関連して、または、体の一部また
はRAを持たない被検者の類似サンプルにおいてその存在をあらわす標準的なレ
ベル二関連して、増加または減少しているレベルを意味する。 【0073】 使用されうるイムノアッセイは、これらに限定されないが、例えばウェスタン
ブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(enzyme linked immunosorbent
assay;酵素様免疫吸着法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降法、 ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集法、補体結合法、プロティンAイムノアッ
セイ等の技術を用いた、競合的および非競合的な分析システム分析を含む。 【0074】 必要に応じて、RPIは二段階のサンドイッチ分析を用いて検出される。RP
Iがタンパク質の特殊なグリコフォーム(glycoform)を意味する場合、第一段 階において、抗RPI抗体(これは必要に応じて固相上に固定されうる)はRP
Iを補足するために使用されうる。第二段階において、直接または間接的に標識
したレクチンが、補足されたRPIを検出するのに用いられる。(a)RPIと
同じ核タンパク質を持つ他のグリコフォームまたは(b)抗体によって認識され
た抗原決定基を共有している他のイソ型よりも、RPIに優先的に結合するよう
な任意のレクチンがこの目的のために使用される。好ましい実施形態において、
選択されたレクチンは、前期RPIと同じ核タンパク質を持つ他のイソ型に比べ
て、少なくとも2倍の大きさの親和性、より好ましくは5倍の大きさの親和性、
さらにより好ましくは10倍の大きさの親和性でRPIに結合する。目的のRP
Iを検出するのに適したレクチンは、当業界で周知の方法で容易に同定でき、例
えば、Sumar等, Lectins as Indicators of Disease-Associated Glycoforms, I
n: Gabius H-JおよびGabius S (eds.), 1993, Lectins and Glycobiology, 第15
8〜174頁(ここに参照することによってその全体を引用させる)の、第158〜159
頁に記載の表1で列挙されている一つまたはそれ以上のレクチンを試験すること
である。 【0075】 必要に応じて、RPIをコード化した遺伝子、関連した遺伝子ならびに関連し
た核酸配列およびサブ配列(subsequences)は、相補的配列も含み、ハイブリダ
イゼーション分析にも用いられうる。少なくとも約8ヌクレオチドを含むRPI
をコード化したヌクレオチドもしくはそれらのサブ配列、または、前述の相補物
は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用されうる。ハイブリダイゼーシ
ョン分析は、特にRAもしくは治療後のRAの再発におけるRPI遺伝子発現の
異常な変化に関して、検出、予後、診断、または、症状、障害もしくは病気の状
態のモニタリングに使用されうる。特に、このようなハイブリダイゼーション分
析は、RPIをコードしているDNAまたはRNAと、ハイブリダイゼーション
できる核酸プローブを持つ核酸を含むサンプルを、ハイブリダイゼーションしう
る条件下で接触させ、結果生じた任意のハイブリッドを検出または測定すること
を含む方法によって行われる。 【0076】 本発明はまた、診断キットを提供するものであり、このキットは一つまたはそ
れ以上の抗RPI抗体のコンテナを含む。加えて、このようなキットは任意の一
つまたはそれ以上の(1)診断、予後、治療、モニタリング、薬剤開発、または
任意のこれら用途の組み合わせに関する説明書、(2)医薬もしくは生物的製剤
の製造、使用または販売を制御する政府機関(governmental agency)によって 処方された形態において、ヒトへの投与のための製造、使用または販売機関によ
る認可を反映することを通知する通知書、(3)標識された、抗体へ結合するパ
ートナー、および(4)抗RPI抗体が固定されている固相(solid phase)( 例えば試薬片(reagent strip))を任意に含む。標識された、抗体に結合する パートナーがない場合は、抗RPI抗体それ自身を、例えば化学発光、酵素、蛍
光、検出または放射活性成分等のマーカーで標識することができる。 【0077】 本発明はまた、一つまたはそれ以上のコンテナ中に、種類の異なるRPIをコ
ード化したRNAにハイブリダイゼーションできる核酸プローブを含むキットを
提供する。特殊な実施形態において、キットは、一つまたはそれ以上のコンテナ
中にプライマー対を含み(例えば、それぞれ6〜30ヌクレオチドの範囲のサイ
ズであり、より好ましくは10〜20である)、これらは、例えば、RPIをコ
ード化した核酸の少なくとも一部分に対して、適切な反応条件下でポリメラーゼ
チェーンリアクション(例えばInnis等, 1990, PCR Protocols, Academic Press
, Inc., San Diego, CAを参照)、Q(登録商標)レプリカーゼを用いたリガー ゼチェーンリアクション(欧州特許第320,308号参照)、サイクリックプ
ローブリアクションまたは当業界で周知の方法を用いて、増幅反応を仕込むこと
ができる。 【0078】 キットはまた、RPIの複数またはRPIをそれぞれコードする複数の核酸を
検出することも可能である。キットはさらに、例えば標準または対照として使用
するために、分離したRPIタンパク質またはRPIをコード化した核酸の、予
め決められた量を必要に応じて含みうる。 【0079】 5.3 臨床研究における使用 本発明の診断方法および組成物は、例えばRAの治療のための薬剤をテストす
るために、臨床研究のモニターを支援することができる。ひとつの実施形態にお
いて、RAを罹患している患者におけるRADFまたはRPIのレベルを、RA
を罹患していない被検者で見出されたレベルに復活させる、または、治療された
患者において、RADFもしくはRPIレベルを非RAもしくは血清の値、もし
くはその付近に維持する能力に関して、候補分子をテストする。一つまたはそれ
以上のRADFまたはRPIのレベルが分析される。 【0080】 他の実施形態において、本発明の方法および組成物は、臨床研究のための候補
をスクリーニングする場合に、RAを持つそれぞれの個体を同定するために使用
され、次にこのような個体は研究を続行もしくは遮断され、または、治療もしく
は分析のために別々の集団におかれうる。 【0081】 5.4 RPIの精製 特別な観点において、本発明は、これらは抗原決定基(すなわち抗体によって
認識されうるもの)を含む、または、機能的に活性な、分離されたRPI、好ま
しくはヒトRPIならびにその断片ならびに誘導体、および、前述のものをコー
ドする核酸配列を提供する。ここで用いられる「機能的に活性な」RPIとは、
全長(野生型)RPIと関連する、例えばRPI基質またはRPI結合パートナ
ーへの結合、抗原性(抗ターゲット抗体への結合)、免疫原性等の一つまたはそ
れ以上の既知の機能活性を表示する物質のことを言う。 【0082】 特殊な実施形態において、本発明は、少なくとも6個のアミノ酸、10個のア
ミノ酸、50個のアミノ酸、または、少なくとも75個のアミノ酸の断片を提供
する。RPIのいくつかまたはすべての領域が欠損している断片からなる断片ま
たはタンパク質もまた提供される。前述のものをコード化した核酸が提供される
。 【0083】 RPI遺伝子配列を含む組換え核酸が同定されると、その遺伝子生産物を分析
することができる。これは、その生産物の物理的または機能的特性を基礎として
分析することによって達成され、ゲル電気泳動、イムノアッセイ等による生産物
の放射活性標識を含む。 【0084】 RPIが同定されると、クロマトグラフィー(例えばイオン交換、アフィニテ
ィーおよびサイズ分画カラムクロマトグラフィー(sizing column chromatograp
hy))、遠心分離、異なる溶解度による方法(differential solubility)、ま たは、タンパク質を精製する他の任意の標準的な技術を含む標準的な方法によっ
て分離精製される。 【0085】 あるいは、一度組換え核酸によって生産されたRPIが同定されると、RPI
の全体のアミノ酸配列を、組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列
から類推することができる。結果として、そのタンパク質は、当業界で周知の標
準的な化学的方法(例えば、Hunkapille等, M., 1984, Nature 310:105-111参照
)によって合成されうる。 【0086】 他の代替の実施形態において、野生型RPIは、上述したような標準的な方法
によって天然のソースから精製することができる(例えば、免疫親和性精製(im
munoaffinity purification))。 【0087】 好ましい実施形態において、RPIは、米国特許出願番号第08/980,5
74号(ここに参照させることによって引用させる)において説明されている好
ましい方法によって分離される。調整用スケールの実施(preparative-scale ru
ns)に関して、WestermeierのElectrophoresis in Practice (pp. 197-209, 199
3、VCH, Weinheim, Germany)(ここに参照させることによってその全体を参照さ
せる)において説明されている方法に従って、2pHまたはそれ以下の範囲のp
Hを持つ、狭い範囲の「ズームゲル」が、等電点段階において好ましい。この改
変により、大量のターゲットタンパク質をゲルにローディングさせることが可能
になり、それによって当該ゲルから見出されうる分離RPIの量が増えた。調整
用スケールの実施においてこの方法を用いる場合、該好ましい技術は、分離され
たRPIを、1回の実施で一般的に100ngまで供給し、また1000ngま
でも供給可能である。当業界の技術において、ゲル等電点電気泳動を用いる任意
の分離方法において、ズームゲルが用いられることが認められるであろう。 【0088】 本発明の特殊な実施形態において、このようなRPIは、組換えDNA技術ま
たは化学合成方法または天然タンパク質の精製によって生産された場合、これら
に限定されないが、RPIのアミノ酸配列の全部または一部を含むもの、同様に
それらの断片、他の誘導体および類似体を含み、それらに対するタンパク質相同
体も含む。 【0089】 5.5 RPIに対する抗体の生産 本発明に従って、RPI、その断片または他の誘導体、もしくは、それらの類
似体は、免疫抗原として使用され、このような免疫抗原に免疫特異的に結合する
抗体を生産する。このようなタンパク質、断片、誘導体または類似体は、この出
願で上述したセクションにおいて記載された方法を含む任意の従来法によって分
離することができる。生産された抗体は、これらに限定されないが、ポリクロー
ナル、モノクローナル、キメラ、単鎖(single chain)、Fab断片、および、
Fab発現ライブラリを含む。特殊な実施形態において、ヒトRPIに対する抗
体が生産される。他の実施形態において、RPIのドメインに対する抗体が生産
される。特殊な実施形態において、RPIの親水性断片が抗体生産のための免疫
抗原として使用される。 【0090】 1.1 当業界で周知の多様な方法が、RPIまたは誘導体または類似体に対するポリ
クローナル抗体の生産に用いられうる。特殊な実施形態において、RPIのエピ
トープに対するウサギポリクローナル抗体、または、それらのサブ配列が得られ
る。抗体の生産に関して、天然RPIまたはそれらの合成物もしくは誘導体(例
えば断片)を注射することによって、多様な宿主動物が免疫化され、これらに限
定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ウマ、ヤギ等である。多様なアジュバ
ント(adjuvant)が免疫的反応を高めるために使用され、これは宿主種により、
これらに限定されないが、完全または不完全のフロイントのアジュバント、例え
ば水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、例えばリゾレクチン、プルロニックポ
リオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペッ
トヘモシアニン、ジニトロフェノール等の表面活性化物質、ならびに例えばBC
G(カルメット−ゲラン杆菌)等の潜在的に有効なヒトアジュバント、ならびに
コリネバクテリウム−パルバムを含む。 【0091】 RPI配列またはそれらの類似体に対するモノクローナル抗体の調整に関して
、培養における連続した細胞株による抗体分子生産に必要な任意の技術が用いら
れ得る。例えば、Kohlerおよび Milstein (1975, Nature 256:495-497)によって
最初に開発されたハイブリドーマ技術、および、トリオーマ(trioma)技術、ヒ
トB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor 等., 1983, Immunology Today 4:72)、 および、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBV−ハイブリドーマ技術
(Cole等, 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss
, Inc., pp. 77-96)等である(それぞれの外国の参考文献を、ここにそれぞれを
参照させることによって引用させる)。本発明の追加の実施形態において、モノ
クローナル抗体は、PCT/US90/02545(ここに参照させることによ
って引用させる)で説明したように、無菌動物中で生産され得る。 【0092】 5.3 臨床研究における使用 本発明の診断方法および組成物は、臨床研究、例えばRA治療のための薬剤の
テスト、をモニターする際に補助することができる。ある実施形態においては、
候補分子は、RAに冒されている患者におけるRADFまたはRPIレベルを、
RAに冒されていない被験者において確認されるレベル、または、非RAまたは
血清におけるRADFまたはRFIのレベルかそれに近しい値に維持されるよう
に治療が施された患者において確認されるレベルにまで回復させる能力が試験さ
れる。1もしくはそれ以上のRADFまたはRPIのレベルを分析してもよい。
他の実施形態においては、本発明の方法および組成物は、臨床研究のために候補
をスクリーニングする時に、RAを有する個体を同定するために用いられる。こ
のような個体は、その後研究に含んでもよく、除外してもよく、または、治療も
しくは分析のために別のコホートに配置されてもよい。 【0093】 5.4 RPIの精製 特殊な観点においては、本発明は抗原性の決定因子(すなわち、抗体によって
認識されうる)からなる、または前記のものをコード化すると同時に機能的に活
性な、分離されたRPI、好ましくは、ヒトのRPIおよび断片ならびにその誘
導体を提供する。ここで用いられる機能的に活性なRPIとは、フルレング(野
生型)RPIに付随した、1または2以上の公知の機能的な活性を示す物質をい
い、例えば、RPI基質もしくはRPI結合パートナーへの結合、(アンチター
ゲット抗体に結合した)抗原性、または免疫抗原性などがある。 【0094】 特殊な実施形態においては、本発明は、少なくとも6アミノ酸、10アミノ酸
、50アミノ酸、または少なくとも75アミノ酸からなるRPIの断片を提供す
る。RPIの領域が部分的にまたはすべてが欠如している断片または断片を含ん
でなるタンパク質も提供される。前記のものをコード化する核酸が提供される。
RPI遺伝子配列を発現する組換え核酸が同定されると、その遺伝子生成物は分
析されうる。これは生成物の物理的なまたは機能的な特性に基づく分析によって
成され、ゲル電気泳動、イムノアッセイなどによる分析を伴う生成物の放射性標
識が含まれる。RPIが同定されると、クロマトグラフィー(例えば、イオン交
換、アフィニティー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー)、遠心沈殿
法、異なる溶解度による方法(differential solubility)、またはタンパク質 の精製に用いられる通常の他のすべての技術を含む一般的な方法により分離され
、精製されうる。その他に、組換え核酸によって生成されたRPIが同定された
とき、組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列からRPIのアミノ
酸配列全体を推測することができる。結果として、タンパク質は技術的に公知の
一般的な化学的方法によって合成されうる(例えば、Hunkapilleら,
M.,1984,Nature310105−111参照)。他のかわりの実施
形態においては、上記記載の一般的な方法(例えば、イムノアフィニティー精製
)によって天然型RPIが天然のソースから精製されうる。好ましい実施形態に
おいては、参照としてここに組み込まれる米国出願第08/980,574号に
記載の「好ましい技術」によってRPIは分離される。調整段階での実施のため
には、Westermeier,1993,Electrophoresis
in Practice(VCH,Weinheim,Germany),pp
.197−209(全体が参照としてここに組み込まれる)に記載の方法にした
がって、等電点電気泳動段階において2pH単位またはそれ以下のpH範囲を有
する狭い範囲のズームゲルを使用することが好ましい。この変はより大量のター
ゲットタンパク質がゲル上にローディングされることを可能にし、それによって
ゲルから取り出される分離RPIの量も増加する。調整段階での実施のためにこ
の方法が用いられたときは、「好ましい技術」は、一回の実施で一般的には10
0ngにまで及ぶ分離RPIを提供し、1000ngにまで及ぶ量を提供しうる
。当該技術に精通したものであれば、ズームゲルは、ゲル等電収束法を用いたい
かなる分離戦略においても使用されうるものであることを認識するであろう。本
発明の特殊な実施形態においては、そのうようなRPIは、組換えDNA技術に
よって製造されたものであれ、化学的な合成方法によるものであれ、天然タンパ
ク質の精製によるものであれ、断片および他の誘導体ならびにそれらの類似体に
加えて、RPIのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含んでなるものからなる(
しかし、これに限られるものではない)。また、ホモローグなタンパク質を含む
。 【0095】5.5 RPIに対する抗体の製造 本発明にしたがって、RPI、その断片、および他の誘導体、並びにそれらの
類似体が、免疫特異的にイムノゲンに結合する抗体を生成するイムノゲンとして
使用されうる。そのようなタンパク質、断片、誘導体、および類似体は、いかな
る慣用の方法によって分離してもよく、本願の以前のセクションに記載された方
法を含む。生成される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一重
鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリーを含むがこれらに限られるもの
ではない。特殊な実施形態においては、ヒトRPIに対する抗体が製造される。
他の実施形態においては、RPIのドメインに対する抗体が製造されうる。特殊
な実施形態においては、抗体製造のためのイムノゲンとしてRPIの親水性断片
が使用される。 【0096】 1.1 RPIもしくは誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体の製造のため
に、技術的に公知の種々の手法が使用されうる。特殊な実施形態においては、R
PIのエピトープに対するウサギポリクローナル抗体またはその配列が得られる
。抗体の製造のために、天然のRPIもしくは合成型またはその誘導体(例えば
、断片)の注入によってさまざまなホスト動物、ウサギ、マウス、ラット、ウマ
、ヤギ、などが含まれるがこれらに限られるものではない、が免疫される。種々
のアジュバントが免疫学的反応を増加させるために使用されうる。それらはホス
ト種に依存し、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、
水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンなどの表面活性化物質、
プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールカサ
ガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG(Bacille Ca
lmette−Guerin)およびコリネバクテリウム パルバムのような潜
在的に有用なヒトアジュバントが含まれるがこれらに限定されるものではない。
RPI配列およびその類似体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養
中の連続した細胞株による抗体分子の製造のためのいかなる技術を用いてもよい
。例えば、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら,
1983,Immunology Today472)、およびヒトモノクロー
ナル抗体を製造するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら,1985,
in Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77−96)に加
えて、元来KohlerおよびMilstein(1975,Nature25 6 495−497)によって開発されたハイブリドーマ技術がある。(前記文献
はそれぞれ参照としてここに組み込まれる) 本発明の付加的な実施形態においては、ここに参照として組み込まれるPCT
/US90/02545に記載されるように、無菌動物中にてモノクローナル抗
体は製造されうる。本発明にしたがってヒト抗体は使用され、また、ヒトハイブ
リドーマを用いて(Coteら,1983,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA802026−2030)、またはヒトB細胞をインビトロにおい
てEBVウイルスで形質転換することによって(Coleら,1985,in
Monoclonal Antibodies and Cancer The
rapy,Alan R.Liss,pp.77−96)、得ることができる。
実際、本発明次第では、好ましい生物学的に活性なヒト抗体分子から得た遺伝子
に付随するRPIに特異的なマウス抗体分子から得た遺伝子のスプライシングに
よるキメラ抗体の製造のために開発された技術(Morrisonら,1984
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851−6855;N
eubergerら,1984,Nature312604−608;Take
daら,1985,Nature314452−454)を用いることができる
。このような抗体は、本発明の範囲に属するものである。(前記文献はそれぞれ
参照としてここに組み込まれる) 本発明次第では、一重鎖抗体の製造のための技術(参照としてここに組み込ま れる米国特許第4,946,778号)が、RPI特異的な一重鎖抗体を製造す
るために用いられうる。本発明の付加的な実施形態は、Fab発現ライブラリー
の構築のために記載された技術(Huseら,1989,Science246 1275−1281)を利用し、迅速かつ容易なRPI、誘導体、または類似体
に望ましい特異性を有するモノクローナルFab断片の同定を可能にする。分子
のイディオタイプを含む抗体断片は公知の技術によって生成されうる。例えば、
そのような断片としては、抗体分子のペプシン処理によって製造されうるF(a
b´)2断片、F(ab´)2断片のジスルフィド架橋を還元することによって 製造されるFab’断片、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによ
って製造されるFab断片、Fv断片、が含まれるがこられに限られるものでは
ない。抗体の製造に際しては、所望の抗体のためのスクリーニングは、例えば、
ELISA(enzyme−linked immunosorbent as
say)などの公知技術によって遂行される。例えば、RPIの特定のドメイン
を認識する抗体を選択するためには、そのようなドメインを含むRPI断片に結
合する生成物のために、製造されたハイブリドーマを分析することができる。第
一PRIホモローグに特異的に結合するが、異なるRPIホモローグには特異的
に結合しない抗体の選択のためには、第一RPIホモローグへの能動的な結合お
よび第二RPIホモローグへの結合の欠如に基づいて選択することができる。同
様に、RPIに特異的に結合するが、同一のタンパク質(例えば、RPIと同一
のコアペプチドを有する、異なるグリコフォーム)の異なるイソ型には特異的に
結合しない抗体の選択は、RPIへの能動的な結合および異なるイソ型(例えば
、グリコフォーム)への結合の欠如に基づいて選択することができる。RPIの
ドメインに特異的な抗体も提供される。前記抗体は、本発明のRPIの位置およ
び活性に関する技術的に公知の方法、例えば、これらのタンパク質のイメージ化
、好適な生理学的なサンプルにおけるそれらのレベルの測定、診断方法などにお
いて用いられる。 【0097】 加えて、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに、適切な抗
原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによってなさ
れる「キメラ抗体」の製造に関して開発された技術 (Morrison等,1984,Proc.Nat
l.Acad.Sci.,81,6851-6855;Neuberger等,1984,Nature 312,604-608;Takeda等,
1985, Nature,314,452-454)が、使用されうる。キメラ抗体は分子であり、それ において例えばマウスmAbおよびヒト免疫グロブリンコンスタント領域から誘
導された可変領域を持つもの等の異なるタンパク質が、異なる動物種から誘導さ
れる(例えばCabilly等,米国特許第4,816,567号;およびBoss等の米国特許第4,8
16397号をここに参照させることによって引用する)。 【0098】 加えて、ヒト化された交代の製造に関して技術が開発されている(例えばQuee
nの米国特許第5,585,089号およびWinterの米国特許第5,225,539号をここに参照 させることによって引用する)。免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変領域は、
三つの超可変領域によって断続される「フレームワーク」領域からなり、相補決
定領域(complementarity determining region(CDR))として言及される。
フレームワーク領域およびCDRの伸張は、正確に定義されている("Sequences
of Proteins of Immunological Interest", Kabat E.等, U.S.Department of H
ealth and Human Services(1983)を参照)。手短に言うと,ヒト化された抗体 は、非ヒト種からの一つまたはそれ以上のCDRおよびヒト免疫グロブリン分子
からのフレームワーク領域を持つ、非ヒト種からの抗体分子である。 【0099】 あるいは、単鎖の抗体の製造に関して説明された技術(米国特許第4,946,778 号;Bird,1988,Science 242, 423-426;Huston等, 1988, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 85,5879-5883;およびWard等 1989, Nature 334, 544-546を参照)が使 用されうる。単鎖抗体は、Fv領域の重鎖と軽鎖とをアミノ酸架橋によって結合
させ、単鎖ポリペプチドを得るることによって形成される。 【0100】 特異的なエピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって製造され得る
。例えば,このような断片は、これらに限定されないが,抗体分子のペプシン消
化によって生産され得るF(ab’)2断片、および、F(ab’)2断片のジ
スルフィド架橋を還元ことによって生じるFab断片である。 【0101】 あるいは、Fab発現ライブラリが構築され(Huse等,1989, Science, 246, 1
275-1281)、望ましい特異性を持つモノクローナルFab断片の迅速で簡便な同
定が可能である。 【0102】 抗体の標識およびそれらの使用 一つまたはそれ以上のRPIエピトープまたはRPIの保存された可変もしく
はペプチド断片を特異的に認識することのできる検出可能な標識分子に関する方
法がここで説明される。ここで用いられる標識分子および検出方法は、例えば、
HarlowおよびLane(Harlow,E.およびLane,D., 1988, "Antibodies: A Laborator
y Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York)において説明されているものであり、これをその全体を参照させることに
よってここに引用される。 【0103】 RPI特異的抗体またはペプチド類似体(mimetic)が標識され得る一
つの方法は、これを酵素に結合させることによってなされ、例えばELISA(
酵素様免疫吸着法)のような酵素イムノアッセイにおいて使用されうる。抗体に
結合した酵素は適切な基質と反応し、例えば蛍光分光分析法、蛍光定量法または
ウイルスを用いた方法によって検出され得るキメラ部位を生産するこのような方
法において、好ましくは色素を生産する基質(chromogenic substrate)である 。抗体、それらの誘導体および類似体ならびにペプチドを検出可能に標識するた
めに用いられる酵素は、これらに限定されないが、リンゴ酸脱水素酵素、スタフ
ィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−5−ステロイドイソメラーゼ、イーストア
ルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロホスフェート、脱水素酵素、トリオー
スフォスフェートイソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラ
クトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−
ホスフェート−脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラー
ゼである。検出は、該酵素に対する比色基質を用いた比色法によって行われ得る
。検出はまた、同様に調整されたスタンダードと比較した気質の酵素反応の程度
を可視的に比較することによっても行われる。 【0104】 検出方法における使用のために、分子は放射線同位体で標識することが好まし
く、125I、131I、または90mTcが含まれるがこれらに限定されるも
のではない。このようなペプチドおよび抗体は、ラジオイムノアッセイ(RIA
)またはラジオプローブを用いてインビボ分析において検出することができる。
放射性活性な同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの
使用のような方法やオートラジオグラフィーによって検出することができる。抗
体、その誘導体、類似体、およびペプチドを蛍光物質で標識することが可能であ
る。蛍光的に標識されたペプチドは好適な波長の光にさらされ、蛍光によってそ
の存在を確認することができる。最も一般的に使用される蛍光標識が付された化
合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、
フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルデハイド(o−phthal
dehyde)、およびフルオレセスアミン(fluorescamine)で
ある。 【0105】 抗体、その誘導体および類似体ならびにペプチドを、ビオチンで標識すること
も可能である。ビオチンで標識されたペプチドは、アビジンに共有結合した蛍光
標識のようなアビジンと結合した検出可能なマーカーにさらされうる。 【0106】 抗体、その誘導体および類似体、並びにペプチドは、152Euや他のランタ
ニド種のような蛍光発光金属を用いて検出可能なように標識が付されうる。これ
らの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)やエチレンジアミン
テトラ酢酸(EDTA)のような金属キレート群を用いて、抗体、その類似体、
およびペプチドに結合させうる。 【0107】 抗体、その誘導体および類似体、並びにペプチドは、化学発光化合物にカップ
リングすることによって検出可能なように標識することもできる。その後、化学
発光で標識された化合物の存在は、化学反応の過程中に生じる蛍光の存在を検出
することによって確認される。特に有用な化学発光標識化合物の例としては、ル
ミノール、イソルミノール、サロマティックアクリジニウムエステル(ther
omatic acridinium ester)、イミダゾール、アクリジ
ニウム塩、およびシュウ酸エステルが挙げられる。 【0108】 同様に、本発明の抗体、その誘導体および類似体、並びにペプチドに標識する
ために生物発光化合物を用いることもできる。生物発光は、生物学的システム中
に見出される化学発光の一種であり、触媒作用をするタンパクにより化学発光反
応の効率が増加する。生物発光タンパクの存在は、蛍光の存在を検出することに
より確認される。標識の目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、
ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。 【0109】 多様な生物学的サンプルにおけるRPIの存在を検出するために、RPIに特
異的に結合するようにされた標識された抗体を用いることができ、生物学的サン
プルとしては、体液(例えば、血漿、尿、髄液、関節吸引液)、組織サンプル、
またはそのホモジネートが含まれる。そのような標識された抗体は、個体細胞内
または個体細胞上のRPIの位置を可視化するために用いることもできる。 【0110】 RPIに特異的に結合するようにされた、標識された抗体を、RPIの存在を
検出するための診断上の有効量、患者に投与することができる。診断上の有効量
とは、技術的に一般的に入手可能な方法を用いて細胞を検出できるように、その
表面にRPIを含んでなる細胞を診断のターゲットとするのに十分な分子の量を
いう。 【0111】 5.6 RPIをコード化するDNAの分離 RPI遺伝子のクローニングのための特殊な実施形態を以下に例を用いて述べ
るが、これに限定されるものではない。DNAおよびRNAを含み、RPIもし
くは断片またはその類似体をコード化する配列からなる本発明のヌクレオチド配
列は、慣用的な化学的アプローチまたは重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ
チェーンリアクション(PCR)増幅などの技術的に公知の方法を用いて合成さ
れうる。配列はいかなる種のRPI遺伝子の同定およびクローニングも提供し、
例えば、cDNAライブラリー、ゲノミックライブラリー、または発現ライブラ
リーのスクリーニングが挙げられる。本発明のRPIをコード化する配列からな
るヌクレオチド配列は、他のタンパク遺伝子の相補的な伸長と選択的に二重鎖分
子を形成する能力において有用である。応用形態によるが、さまざまな配列同定
を遂行するために種々のハイブリダイゼーション条件が採用されうる。選択性の
度合いを高めるためには、塩が少なく温度が高い条件などの比較的緊縮した条件
が二重鎖を形成するために使用される。ここで使用されている「高度に緊縮した
条件」とは、65℃の0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム( SDS)、1mM EDTA中において濾過器に結合されたDNAへハイブリダ
イゼーションし、68℃の0.1xSSC/0.1%SDSで洗浄することを意
味する(全体が参照としてここに組み込まれるAusubel F.M.ら,e
ds.,1989,Current Protocols in Molecu
lar Biology,Vol.I,Green Publishing A
ssociates,Inc.,and John Wiley&sons,I
nc.,ニューヨーク,p.2.10.3)。いくつかの応用にあたっては、緊
縮度合いがより少ないハイブリダイゼーション条件が必要とされる。ここで用い
られる「適度に緊縮した条件」とは、42℃の0.2xSSC/0.1%SDS
で洗浄することを意味する(Ausubelら,1989,上記文献)。ハイブ
リダイゼーション条件は、ハイブリッド二重鎖を不安定化させるために、ホルム
アミドの量を増加することによってより緊縮したものとすることもできる。この
ように、特定のハイブリダイゼーション条件は容易に操作されるものであり、一
般的には所望する結果に応じて選択される。例えば、50%のホルムアミド存在
下における慣用的なハイブリダイゼーション温度は、RPI遺伝子断片に対して
95〜100%ホモローグであるプローブに対しては42℃であり、90〜95
%ホモローグの時は37℃、70〜90%ホモローグの時は32℃である。ゲノ
ミックライブラリーの調製にあたっては、その一部がRPIの一部または全体を
コード化するDNA断片が製造される。DNAは種々の制限酵素を用いて特定の
サイトで開裂することもできる。かわりに、DNAを断片化するためにマンガン
存在下においてDNアーゼを用いることもでき、または、例えば、超音波処理に
よってDNAを物理的にせん断することもできる。DNA断片は、その後、一般
的な技術によって大きさに従って分離される。方法としては、アガロースおよび
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、並びにショ糖勾
配遠心法が含まれるがこれらに限定されるものではない。DAN断片はその後好
適なベクター、プラスミド、コスミド、バクテリアファージラムダもしくはT4
、およびイースト人工クロモソーム(YAC)が含まれるが限定されるものでは
ない、に挿入される。(例えば、Sambrookら,1989,Molecu
lar Cloning,A Laboratory Manual,2d E
d.,Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,Cold Spring Harbor,ニューヨーク;Glover,
D.M.(ed.),1985,DNA Cloning A Practic
al Approach,MRL Press,Ltd.,Oxford,イギ
リス国 Vol.I,II;Ausubel F.M.ら,eds.,1989
,Current Protocols in Molecular Biol
ogy,Vol.I,Green Publishing Associate
s,Inc.,and John Wiley&sons,Inc.,ニューヨ
ーク参照)。ゲノミックライブラリーは、標識されたプローブへの核酸ハイブリ
ダイゼーションによってスクリーニングすることもできる(Benton an
d Davis,1977,Science196180;Grunstein
and Hogness,1975,Proc.Natl.Acad.Sci
.USA723961)。ゲノミックライブラリーは、技術的に公知の最適なア
プローチを用いて、RPIのいかなるペプチドのアミノ酸配列も対応する標識さ
れた改変オリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングすることもできる。
用いられるプローブは、10ヌクレオチドまたはそれ以上であることが好ましく
、15ヌクレオチドまたはそれ以上であることがより好ましい。上記表8〜11
に示されるように、ここで開示されるいくつかのRPIは、その配列が公知であ
る遺伝子によってコード化された、以前に同定されたタンパクに対応するもので
ある。そのような遺伝子をスクリーニングするために、その遺伝子またはその補
体に相補的ないかなるプローブを用いてもよい。プローブは10ヌクレオチドま
たはそれ以上であることが好ましく、15ヌクレオチドまたはそれ以上であるこ
とがより好ましい。http//www.ncbi.nlm.nih.gov/
でアクセス可能なNational Center for Biotechn
ology Information(NCBI)に保持されているEntre
zデータベースは、以下の受け入れ番号によりこれらのRPIに対応する遺伝子
配列を提供する。また、それぞれの配列はここに組み込まれる。 【0112】 【表20】 【0113】 【表21】 【0114】 RPI−10、RPI−17、およびRPI−20のそれぞれに関しては、以
下のような変質した一連のプローブが提供される。 (a) RPI−10に対するプローブ 【0115】 【化1】 【0116】 (b) RPI−17に対するプローブ 【0117】 【化2】 【0118】 (c) RPI−20に対するプローブ 【0119】 【化3】 【0120】 RPIまたはその断片をコード化する挿入DNAを有するライブラリーのクロ
ーンは、1またはそれ以上の改変オリゴヌクレオチドプローブ(またはそれらの
相補体)にハイブリダイゼーションする。そのようなオリゴヌクレオチドプロー
ブのゲノミックライブラリーへのハイブリダイゼーションは、技術的に公知の方
法を用いて実施される。例えば、上述した一連の改変したオリゴヌクレオチドプ
ローブもしくはそれらの相補体と(または、そのような一連のものもしくは相補
体の1つと)のハイブリダイゼーションは、前記高度に緊縮した条件、または適
度に緊縮した条件下において実施される。または、55℃の2X SSC、1.
0%SDS中で実施し、同条件で洗浄する。さらに他の観点においては、RPI
もしくはRPI誘導ポリペプチドの一部または全体をコード化するヌクレオチド
配列のクローンを、発現ライブラリーのスクリーニングによって得ることもでき
る。例えば、ベクターが導入されるホストセルによってベクター内に挿入された
配列が発現しうるように、関連するソースからのDNAが分離され、ランダム断
片が調製され、発現ベクター中(例えば、バクテリオファージ、プラスミド、フ
ァージミド、またはコスミド)にライゲーションされる。種々のスクリーニング
分析がその後、発現したRPIまたはRPI誘導ポリペプチドに対する選択のた
めに使用されうる。ある実施形態においては、本発明の種々のアンチRPI抗体
は、技術的に公知の方法を用いて、所望のクローンを同定するために使用されう
る。例えば、HarlowおよびLane,1988,Antibodies
A Laboratory Manual,Cold Spring Harb
or Laboratory Press,Cold Spring Harb
or,NY,Appendix IV参照。ライブラリーからのクローンまたは
プラークは、結合するそれらのクローンを同定するために抗体と接触するように
される。ある実施形態においては、RPIもしくはRPI誘導ポリペプチドをコ
ード化するDNAを含んでなるクローンまたはプラークは、ここに参照として組
み込まれるOlsvickら,29th ICAAC,Houston,Tex
.1989に従い、DYNAビーズを用いて検出することができる。アンチRP
I抗体はトシル化されたDYNAビーズM280に架橋され、その後、これらの
抗体を含むビーズは、RPIもしくはRPI誘導ポリペプチドを発現するクロー
ンまたはプラークに吸着するために使用される。RPIもしくはRPI誘導ポリ
ペプチドを発現するクローンまたはプラークは、ビーズに結合するこれらのいず
れかとして同定される。かわりに、アンチRPI抗体は、シリカやCelite
(登録商標)樹脂のような好適な単体に非特異的に固定されうる。その後、この
物質は、前節に記載したように、RPIタンパクまたはRPI誘導ポリペプチド
を発現する細菌性コロニーに吸着するために使用される。他の観点においては、
PCR増幅が、ゲノミックDNAからのRPIの一部または全体をコード化する
十分に純粋なDNAを製造するために使用されうる。公知のRPI配列に対応す
るオリゴヌクレオチドプライマー、変質物、その他のものは、プライマーとして
使用されうる。例えばPerkin−Elmer Cetus thermal
cycler and Taq polymerase(Gene Amp(
登録商標))によって、PCRは実施されうる。PCR反応において使用するた
めに、数種の異なる改変プライマーを合成することを選択することができる。変
質プライマーとDNA中の対応する配列とのヌクレオチド配列類似性の度合いを
向上または減少させるために、PCR反応のプライミングの際に用いられるハイ
ブリダイゼーション条件の緊縮度を変化させることも可能である。RPIをコー
ド化する配列のセグメントの連続した増幅後、セグメントは分子的にクローニン
グ、および配列され、完全なゲノミッククローンを分離するためプローブとして
利用される。前記文献に記載したように、これにより、遺伝子の完全なヌクレオ
チド配列、その発現の分析、および機能的な分析のためのそのタンパク生成物の
製造が順番に可能となる。RPI遺伝子はインビトロ翻訳を伴う核酸ハイブリダ
イゼーションによるmRNA選択によっても同定することができる。この手法に
おいては、断片はハイブリダイゼーションによる相補性mRNAを分離するため
に使用される。そのようなDNA断片は、入手可能な他の種(例えば、マウス、
ヒト)の精製RPI DNAを再現することができる。分離されたmRNAの分
離生成物のインビトロ翻訳生成物の免疫沈降分析または機能分析(例えば、イン
ビトロでの凝集能力、レセプターへの結合)によりmRNAが同定され、したが
って所望の配列を含む相補性DNA断片が同定される。さらに、RPIに対して
特異的な固定された抗体への、細胞から分離されたポリソームの吸着によって特
異的mRNAを選択することができる。放射線標識されたRPI cDNAは、
テンプレートとして選択された(吸着ポリソームからの)mRNAを用いて合成
することができる。放射線標識されたmRNAまたはcDNAは、その後、他の
ゲノミックDNA断片中からRPI DNA断片を同定するためにプローブとし
て使用することができる。分離されたRPIゲノミックDNAの代用としては、
公知の配列からの遺伝子配列そのものの化学合成、またはRPIをコード化する
mRNAに対するcDNAの調製が含まれるがこられに限定されるものではない
。例えば、RPI遺伝子cDNAクローニングのためのRNAは、RPIを発現
する細胞から分離することができる。他の方法も可能であり、本発明の範囲に含
まれるものである。 【0121】 いずれの真核生物細胞も、潜在的にRPI遺伝子の分子クローニングのための
核酸ソースとして作用しうる。RPIをコード化する核酸配列は、霊長類ソース
、昆虫、植物などに加えて、脊椎動物、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ
、ウマ、イヌ、から分離することができる。DNAは、化学合成によって、cD
NAクローニングによって、またはゲノミックDNAもしくはその断片のクロー
ニングによってクローンDNA(例えば、DNAライブラリー)から技術的に一
般的な公知の手法によって得ることができ、所望の細胞から精製される(例えば
、Sambrookら,1989,Molecular Cloning,A
Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring
Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor,ニューヨーク;Glover,D.M.(ed.),1985
,DNA Cloning A Practical Approach,MR
L Press,Ltd.,Oxford,イギリス国Vol.I,II.参照
)ゲノミックDNAから誘導されたクローンは、コード化領域に加えて調節およ
びイントロン領域を含んでいてもよく、cDNAから誘導されたクローンはエク
ソン配列のみを含むものである。ソースが何であれ、RPI遺伝子は、調製のた
めに好適なベクター内に分子的にクローンされるべきである。同定され分離され
た遺伝子またはcDNAは、その後、好適なクローニングベクター内に挿入され
うる。技術的に公知の多数のベクター−ホスト系を使用することが可能である。
可能なベクターとしては、プラスミド、改変ウイルスが含まれるがこれらに限ら
れるものではない。しかし、ベクター系は使用されるホスト細胞に適合するもの
でなければならない。そのようなベクターとしては、ラムダ誘導体のようなバク
テリオファージ、PBR322もしくはpUCプラスミド誘導体またはBlue
scriptベクター(Stratagene)のようなプラスミドが含まれる
がこれらに限られるものではない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、
相補的な相補末端を有するクローニングベクターへのDNA断片のライゲーショ
ンによって実施することができる。しかし、もしDNAを断片化するために用い
られる相補的な制限サイトがクローニングベクターには存在しなければ、DNA
分子の末端を酵素的に修飾することができる。かわりに,所望のいかなるサイト
をDNA末端へのヌクレオチド配列(リンカー)のライゲーションによって作製
することもでき、これらのライゲーションされるリンカーは、制限エンドヌクレ
アーゼ認識配列をコード化する化学合成された特異的なオリゴヌクレオチドを含
んでいてもよい。代用方法においては、開裂したベクターおよびRPI遺伝子は
、ホモポリマー性テーリングによって修飾されてもよい。遺伝子配列の多数のコ
ピーを生成するために、組換え分子を形質転換、形質移入、感染、エレクトロポ
レーションなどによってホスト細胞中に導入することができる。特殊な実施形態
においては、分離されたRPI遺伝子、cDNA、または合成DNA分子を組み
込んだ組換えDNA分子でのホスト細胞の形質転換により、遺伝子の多様なコピ
ーの製造が可能になる。このように、遺伝子は形質転換物を成長させ、形質転換
物から組換えDNA分子を分離し、必要とあれば分離組換えDNAから挿入され
た遺伝子を検索することによって大量に得ることができる。 【0122】 本発明によって提供されるRPI配列は、天然RPIにおいて確認されるもの
と実質的に同一であるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列、および機
能的に同等なアミノ酸を有するアミノ酸配列をコード化した配列、それに、他の
ターゲット誘導体およびその類似体をコード化する配列を含むがこれらに限られ
るものではない。 【0123】 5.7 RPIをコード化するDANの発現 RPIもしくは機能的に活性な類似体もしくはその断片または誘導体をコード
化するヌクレオチド配列は、好適な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパ
ク質コード化配列の転写および翻訳のために必要な要素を含むベクター、中に挿
入することができる。必要な転写のおよび翻訳のシグナルは、天然RPI遺伝子
またはその側面領域によって供給することができる。種々のホスト−ベクター系
を、タンパク質コード化配列を発現させるために利用することができる。これら
としては、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)に感
染した哺乳類細胞株、ウイルス(バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞株、イ
ーストベクターを含むイーストにような微生物、またはバクテリオファージ、D
NA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換されたバクテリア
が含まれるがこれらに限定されるものではない。ベクターの発現要素は、強度お
よび特異性において異なる。利用されるホスト−ベクター系によって、いくつか
の好適な転写および翻訳要素の一つが使用されうる。特殊な実施形態においては
、ヒトRPI遺伝子、またはヒトRPIの機能的に活性な部分をコード化する配
列が発現される。さらに他の実施形態においては、RPIのドメインを含んでな
るターゲットの断片が発現される。 【0124】 1.1 1.1 好適な転写および翻訳制御シグナル並びにタンパク質コード化配列からなるキ
メラ遺伝子を含んでなる発現ベクターを構築するために、ベクター内へのDNA
断片の挿入に関して以前に記載されたいかなる方法を用いることもできる。これ
らの方法はインビトロ組換えDNAおよび合成方法並びにインビボ組換え体(遺
伝学的組換え)を含む。RPIおよびペプチド断片をコード化する核酸配列の発
現は、第2核酸配列によって調節され、組換えDNA分子で形質転換されたホス
トにおいてRPIまたはペプチドが発現する。例えば、RPIの発現は、技術的
に公知のいかなるプロモーターまたはエンハンサー要素によっても制御すること
ができる。RPI遺伝子発現を制御するために用いられるプロモーターとしては
、SV40早期プロモーター領域(BernoistおよびChambon,1
981,Nature290304−310)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末
端反復に含まれるプロモーター(Yamamotoら,1980,Cell22 787−797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら,
1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA781441−14
45)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982
,Nature29639−42)、β−ラクタマーゼプロモーターのような原
核細胞発現ベクター(Villa−Kamaroffら,1978,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA753727−3731)、またはtac
プロモーター(DeBoerら,1983,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA8021−25)が含まれるがこれらに限られるものではない。S
cientific American,1980,24274−94記載の組
換えバクテリアから得られた有用なタンパク;ノパリンシンセターゼプロモータ
ー領域(Herrera−Estrellaら,Nature303209−2
13)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Ga
rdnerら,1981,Nucl.Acids Res.92871)および
光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター(Her
rera−Estrellaら,1984,Nature310115−120
)からなる植物発現ベクター;Gal4プロモーター、ADC(alcohol
dehydrogenase)プロモーター、PGK(phosphogly
cerol kinase)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモータ
ー、および組織特異性を示し、膵腺房細胞において活性なトランスジェニック動
物エラスターゼI遺伝子制御領域において活用される以下の動物転写制御領域、
のようなイーストもしくは他の菌類から得たプロモーター要素(Swiftら,
1984,Cell38639−646;Ornitzら,1986,Cold
Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399
−409;MacDonald,1987,Hepatology7425−5
15);膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan
,1985,Nature315115−122)、リンパ球において活性なイ
ムノグロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら,1984,Cell 38 647−658;Adamesら, 1985,Nature318533
−538;Alexanderら,1987,Mol.Cell.Biol.7 1436−1444)、精巣、胸部、リンパ球、および肥満細胞において活性な
マウス***腫瘍ウイルス制御領域(Lederら,1986,Cell4548
5−495)、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert
ら,1987,Genes and Devel.1268−276)、肝臓に
おいて活性なアルファフェトタンパク遺伝子制御領域(Krumlaufら,1
985,Mol.Cell.Biol.51639−1648;Hammerら
,1987,Science23553−58);肝臓において活性なアルファ
1−アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら,1987,Genes
and Devel.1161−171)、脊髄細胞において活性なベータグ
ロビン遺伝子領域(Mogramら,1985,Nature315338−3
40;Kolliasら,1986,Cell4689−94);脳の乏突起膠
細胞において活性なミエリン塩基性タンパク遺伝子制御領域(Readhead
ら,1987,Cell48703−712);骨格筋において活性なミオシン
軽鎖−2遺伝子制御領域(Sani,1985,Nature314283−2
86)、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制
御領域(Masonら,1986,Science2341372−1378)
も参照される。 【0125】 特殊な実施形態においては、操作可能なようにRPIコード化核酸に結合した
プロモーター、1またはそれ以上の複写源、および、場合によっては1またはそ
れ以上の選択可能なマーカー(例えば、抗生物質抵抗性の遺伝子)からなるベク
ターが使用される。 【0126】 特殊な実施形態においては、発現構成は、3つのpGEXベクター(グルタチ
オンS−トランスフェラーゼ発現ベクター;SmithおよびJohnson,
1988,Gene731−40)それぞれのEcoRI制限サイトに、RPI
をコードする配列をサブクローニングすることによって成される。これにより、
正しいリーディングフレームにおいてサブクローンからのRPI生成物の発現が
可能になる。 【0127】 RPI遺伝子挿入を含んでなる発現ベクターは3つの一般的なアプローチ、(
a)核酸ハイブリダイゼーション、(b)マーカー遺伝子機能の存在または欠如
、および(c)挿入された配列の発現、によって同定されうる。第一のアプロー
チにおいては、発現ベクターに挿入されたRPI遺伝子の存在は、挿入されたR
PI遺伝子にホモローグである配列を含んでなるプローブを用いた核酸ハイブリ
ダイゼーションによって検出することができる。第2のアプローチにおいては、
組換えベクター/ホスト系は、ベクター中のRPI遺伝子の挿入によって引き起
こされる、あるマーカー遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質
抵抗性、形質転換フェノタイプ、バキュロウイルスにおける吸蔵体形成(occlus
ion body formation)など)の存在または欠如に基づいて同定され、選択される
。例えば、RPI遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、
RPI遺伝子挿入を含んでなる組換え体はマーカー遺伝子機能の欠如によって同
定することができる。第3のアプローチにおいては、組換え発現ベクターは組換
え体によって発現されるRPI遺伝子生成物を分析することによって同定するこ
とができる。そのような分析は、例えば、インビトロ分析システムにおけるRP
Iの物理的または機能的な特性、例えば、アンチRPI抗体との結合に基づくも
のでありうる。 【0128】 特定の組換えDNA分子が同定および分離されると、技術的に公知の数種の方
法がそれを増殖させるために用いられうる。好適なホストシステムおよび成長条
件が設定されると、組換え発現ベクターは増殖され、大量に調製される。前記説
明したように、使用されうる発現ベクターとしては、いくつかの例を挙げると、
以下のベクターおよびその誘導体、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスの
ようなヒトまたは動物ウイルス;バキュロウイルスのような昆虫ウイルス;イー
ストベクター;バクテリオファージベクター(例えば、ラムダ)、並びにプラス
ミドおよびコスミドDNAベクター、が含まれるがこられに限られるものではな
い。 【0129】 加えて、挿入された配列の発現を調節する、または所望の特殊な方法で遺伝子
生成物を改変し加工するホスト細胞株を選択することができる。あるプロモータ
ーからの発現は、ある誘導物質の存在下において上昇させることができる。この
ように遺伝子工学的に加工されたRPIの発現を制御しうる。さらに、異なるホ
スト細胞は、翻訳中のおよび翻訳後の加工および改変(例えば、タンパクの糖付
加、リン酸エステル化)に関する固有で特異的なメカニズムを有する。発現され
た外来タンパクに所望の改変および加工を確保するために、好適な細胞株または
ホストシステムを選択することができる。例えば、糖付加されていないコアタン
パク生成物を製造するために、細菌性システムにおける発現を用いることができ
る。イーストにおける発現により糖付加生成物が製造される。哺乳類細胞におけ
る発現は、ヘテロローグタンパクの天然糖付加を確実にするために使用されうる
。さらに、ベクター/ホスト発現系が異なると、加工反応への影響も異なるもの
となりうる。 【0130】 組換えタンパクの長期間、高収率生成のためには安定した発現が好ましい。例
えば、差別的に発現されたまたは経路遺伝子タンパク(pathway gene protein)
を安定的に発現する細胞株が設計されてもよい。複写のウイルス起源を含む発現
ベクターを使用するよりも、好適な発現制御要素(例えば、プロモーター、エン
ハンサー、シーケンサー、転写ターミネーター、ポリアデニレーションサイトな
ど)および選択可能なマーカーによって制御されたDNAで、ホスト細胞を形質
転換する方が好ましい。外来DNAの導入に続いて、設計された細胞を1〜2日
間強化培地において成長させ、その後選択性の培地に切り替えることができる。
組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に抵抗力を与え、細胞が安定的
にプラスミドをクロモソームと結合させ、成長して、順にクローニングされ細胞
株内に展開されるフォーカスを形成することを可能にする。この方法は、差別的
に発現されたまたは経路遺伝子タンパクを発現する細胞株を設計するために好適
に使用されうる。そのような設計された細胞株は、差別的に発現されたまたは経
路遺伝子タンパクの内因性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評
価において特に有用でありうる。 【0131】 多数の選択システムを使用することができ、単純ヘルペスウイルスチミジンキ
ナーゼ(Wiglerら,1977,Cell11223)、ヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska&Szybal
ski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48202
6)、およびアデニンフォスフォリボシールトランスフェラーゼ(Lowyら,
1980,Cell22817)遺伝子が、それぞれtk-,hgprt-または
aprt-細胞において採用されうるがこれらに限られるものではない。また、 アンチメタボライト耐性が、耐性をメトトレキセートに付与するdhfr(Wi
glerら,1980,Natl.Acad.Sci.USA773567;O
´Hareら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA7 8 1527)、マイコフェノル酸に耐性を付与するgpt(Mulligan&
Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA7820
72)、アミノグリコシドG−418に耐性を付与するneo(Colberr
e−Garapinら,1981,J.Mol.Biol.1501)、ヒグロ
マイシンに耐性を付与するhygro(Santerreら,1984,Gen
e30147)遺伝子に対する選別の基礎として用いられうる。 【0132】 他の特殊な実施形態においては、RPI、断片、類似体、および誘導体が、(
(異なるタンパクの)ヘテロローグタンパク配列に結合したペプチドを解して結
合したタンパク、断片、類似体、または誘導体からなる)融合体またはキメラタ
ンパク生成物として発現されうる。そのようなキメラ生成物は、所望のアミノ酸
配列をコード化する好適な核酸配列を、技術的に公知の方法を用いて適切なコー
ディングフレームにおいて互いにライゲーションし、技術的に一般的に知られた
方法によってキメラ生成物を発現することによって成される。かわりに、そのよ
うなキメラ生成物はタンパク合成技術によって、例えば、ペプチド合成機の使用
によって成すこともできる。cDNAおよびゲノミック配列の双方がクローニン
グされ、発現しうる。 【0133】 5.8 RPIの治療上の使用 本発明は治療上の化合物の投与による種々の疾病および疾患の治療並びに予防
を提供する。そのような化合物としては、RPIおよび類似体並びに(断片を含
む)それらの誘導体(例えば、ここに記載したようなもの);その抗体(ここに
記載);RPI、類似体、または誘導体(ここに記載)をコード化する核酸;R
PI遺伝子アンチセンス核酸並びにRPI遺伝子作動薬および拮抗剤が含まれる
がこれらに限られるものではない。ここに記載されたように、本発明の重要な特
性は、リウマチ様関節炎に含まれるRPI遺伝子の同定である。関節炎は、RA
患者の血清に対して関節液において減少するRPIの機能もしくは発現を促進す
る、治療上の化合物を投与することによって治療または予防されうる。関節炎は
、RA患者の血清に対して関節液において増加するRPIの機能または発現を低
下させる治療上の化合物の投与によっても治療または予防されうる。一般的に、
種の起源または(抗体の場合には)種の反応性が患者の化合物と同じ種である化
合物を投与することが好ましい。このように、好ましい実施形態においては、治
療または予防のために、ヒトRPI、誘導体、もしくは類似体、もしくは核酸、
またはヒトRPIに対する抗体がヒト患者に投与される。 【0134】 5.8.1 リウマチ様関節炎の治療および予防 リウマチ様関節炎は、RAを有する被験者の血清に対して関節液において減少
する1もしくはそれ以上のRPIのレベルもしくは機能、または1もしくはそれ
以上のRADFのレベルを促進する(すなわち、増加または供給する)化合物の
投与によって、治療または予防される。そのような化合物の例としては、機能的
に活性で、特にインビトロ分析または動物モデルにおいて活性であることが証明
されるRPI、誘導体、または断片、並びにRPIもしくは機能的に活性な誘導
体またはその断片(例えば、遺伝子治療においての使用のため)をコード化する
核酸が含まれるがこれに限られるものではない。使用されうる他の化合物、例え
ばRPI作動薬は、インビボ分析を用いて同定されうる。 【0135】 リウマチ様関節炎は、RAを有する被験者の血清に対して関節液において増加
量を示す1もしくはそれ以上のEPIのレベルもしくは機能、または1もしくは
それ以上のRADFのレベルを阻害する(すなわち減少する)化合物の投与によ
っても治療されまたは予防される。そのような化合物の例としては、RPIアン
チセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはRPIに対して検出される抗
体が含まれるがこれらに限られるものではない。使用されうる他の化合物、例え
ば、RPI拮抗薬は、インビトロ分析を用いて同定できる。 【0136】 特殊な実施形態において、1もしくはそれ以上のRPIのレベルもしくは機能
、または1もしくはそれ以上のRADFのレベルを促進する化合物は、治療的に
(RPIレベルもしくは機能、またはRADFレベルの欠如や減少(通常のまた
は好ましいものと比較して)が、RA患者の血清と比較してRA患者の関節液に
おいて同定されたときは予防的にも)投与される。他の実施形態においては、R
PIのレベルもしくは機能、またはRADFのレベルを阻害する化合物が治療的
に(RPIレベルもしくは機能、またはRADFレベルの増加(通常のまたは好
ましいものと比較して)が、RA患者の血清と比較してRA患者の関節液におい
て同定されたときは予防的に)投与される。そのような化合物の投与によるRP
I機能もしくはレベルまたはRADFレベルの変化は、例えば、患者の組織サン
プルを得て(例えば、生検で)、インビトロにおいてRNAもしくはタンパクレ
ベルまたは表現されたRPI RNAもしくはタンパクの活性を分析することに
よって容易に同定することができる。「好ましい技術」も、化合物投与の前後に
おいてRPIまたはRADFのレベルを検出するために使用されうる。技術的に
一般的な多種の方法がこのように用いられ、キナーゼ分析、RPIを検出および
/または視覚化するためのイムノアッセイ(例えば、ウェスタン法、ドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を伴う免疫沈降、免疫細胞化学な
ど)、および/またはRPIをコード化するmRNAをそれぞれ検出および/ま
たは視覚化することによってRPI表現を検出するためのハイブリダイゼーショ
ン分析(例えば、ノーザン法、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼー
ション、など)、などが含まれるがこれらに限られるものではない。 【0137】 本発明の化合物としては、例えば、その化合物が非ステロイドの炎症剤(NS
AID)(例えば、プレドニゾン、イブプロフェン、フェノプロフェン、ケトプ
ロフェン、フルルブプロフェン、インドメタシン、スリンダク、アスピリン、サ
リチルサリチル酸、ジフルニサル、ナプロキセン、ピロキシカム、テノキシカム
、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン)ではない条件の下で、RA RP
IまたはRADFプロフィールを通常にまで回復させる小さな有機分子、タンパ
ク、ペプチド、抗体、核酸など、金塩、D−ペニシラミン、ヒドロキシクロロキ
ン、またはサルファサルアジンのような抗マラリア薬、アザチオプリン、シクロ
ホスファミド、クロランブシル、メトトレキセート、コルチコステロイド、アン
チ−CD4モノクローナル抗体、並びにアンチ−CDw52抗体が含まれるがこ
れらのいずれいも限られるものではない。 【0138】 5.8.2 遺伝子治療 特殊な実施形態において、RPIまたはそれらの機能的な誘導体をコード化し
た配列を含む核酸は、RPI機能を促進するために遺伝子治療の手法によって投
与される。遺伝子治療は、発現された、または、発現可能な核酸物質を投与する
ことによって行われる治療のことである。本発明のこの実施形態において、該核
酸は、RPI機能を促進することによって治療的効果を仲介する、コードされた
タンパク質を生産する。 【0139】 当業界で使用され得る遺伝子治療の任意の方法が、本発明に従って使用され得
る。模範的な方法を以下に記載する。 【0140】 遺伝子治療方法の一般的な報告として、Goldspiel等, 1993, Clinical Pharma
cy 12488-505; WuおよびWu, 1991, Biotherapy 387-95; Tolstoshev, 1993, A nn. Rev. Pharmacol. Toxicol . 32573-596;Mulligan, 1993, Science 260926-9
32;ならびに、MorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62191-217 ; May, 1993, TIBTECH 11(5)155-215)が参照される。当業界で周知の、使用さ れる組換えDNA技術の方法は、Ausubel等,(eds.), 1993, Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY;および Kriegler, 1990, Gen
e Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYで説明
されている。 【0141】 好ましい観点において、その化合物は、RPIをコード化した核酸、好ましい
宿主中でRPIまたはそれらの断片もしくはキメラタンパク質を発現する発現ベ
クターの部分である前記核酸を含む。特に、このような核酸は、RPIコード領
域に操作可能に(operably)結合したプロモーター、誘導性または構成性および
任意に組織特異的な前記プロモーターを有している。他の特別な実施形態におい
て、核酸分子が用いられ、その際、RPIコード配列および他の任意の望ましい
配列が、ゲノム中の望ましい部位における相同性組換えを促進するような領域の
側に配置され、このようにしてRPI核酸の染色体内発現に供給される(Koller
およびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 868932-8935; Zijlstra 等, 1989, Nature 342435-438)。 【0142】 核酸の患者への運搬が、直接的であれば、患者は直接的に該核酸または核酸を
含むベクターにさらされ、または、直接的であれば、細胞は最初にインビトロで
核酸により形質転換され、次に患者中に移植される。これら二つのアプローチが
、それぞれ、インビボまたはインビトロの遺伝子治療として知られている。 【0143】 特別な実施形態において、該核酸は直接的にインビボで投与され、発現されて
コード化した生産物を生産する。これは任意の当業界で周知の膨大な方法によっ
て行われ、例えばそれを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内に
するためにそれを投与する、例えば欠損もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他
のウイルスベクターを用いた感染(例えば、米国特許第4,980,286号)、もしく は、裸のDNAの直接注射、もしくは、マイクロパーティクル照射(microparti
cle bombardment)(例えば、a gene gun;Biolistic, Dupont)、もしくは、脂 質または細胞表面受容体またはトランスフェクション因子(transfecting agent
s)、リポゾーム、マイクロパーティクル(microparticles)もしくはマイクロ カプセル(microcapsules)によるカプセル封入によるコーティング、または、 核に入ることが知られているペプチドへの結合における投与、受容体仲介エンド
サイトーシスを受けるリガンドへの結合における投与(例えばWuおよびWu, 1987
, J. Biol. Chem. 2624429-4432)(これらは特異的に受容体を発現するターゲ ット細胞に対して使用される)等によって行われる。他の実施形態において、核
酸−リガンド複合体が形成され、該リガンドは紡錘状(fusogenic)のウイルス ペプチドを含み、これによりエンドゾームを破砕させ、核酸がリソソーム性分解
を受けないようにする。さらに他の実施形態において、該核酸はインビボで、特
異的な受容体をターゲットにすることによって細胞の特異的な取り込みおよび発
現に関してターゲットにされる(例えば1992年4月15日のPCT出願WO
92/06180(Wu等);1992年12月23日のWO92/22635(W
ilson等);1992年11月26日のWO92/20316(Findeis等);1
993年7月22日のWO93/14188(Clarke等),1993年10月1 4日のWO93/20221(Young)を参照)。あるいは、該核酸は、細胞内 に導入され、宿主細胞の発現のためのDNAと相同組換えによって結合する(Ko
llerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 868932-8935; Zijls
tra等, 1989, Nature 342435-438)。 【0144】 他の実施形態において、RPIをコードする核酸を含むウイルスベクターが使
用される(Miller等, 1993, Meth. Enzymol. 217581-599)。これらのレトロウ イルスは、ウイルスゲノムのパッケージングや宿主細胞DNAへの統合に必要な
いレトロウイルス配列を削除することによって改変されてある。遺伝子治療で使
用されるRPIをコード化した核酸はベクターにクローニングされ、これは患者
への遺伝子運搬を促進する。レトロウイルスベクターに関するより詳細なことは
、Boesen等, 1994, Biotherapy 6291-302で見出され、これはmdr1遺伝子を 造血幹細胞に運搬して該幹細胞を化学療法に対して体制を持たせるために、レト
ロウイルスベクターを使用することが説明されている。遺伝子治療におけるレト
ロウイルスの使用を説明した他の参考文献として、Clowes等, 1994, J. Clin. I
nvest. 93644-651; Kiem等, 1994, Blood 831467-1473;Salmons and Gunzberg
, 1993, Human Gene Therapy 4129-141; and GrossmanおよびWilson, 1993, Cu
rr. Opin. in Genetics and Devel. 3110-114が挙げられる。 【0145】 アデノウイルスは、遺伝子治療に用いられる他のウイルスベクターである。ア
デノウイルスは、呼吸肺細胞に遺伝子を運搬するための特に有効な運搬体(vehi
cles)である。一般的に、アデノウイルスは呼吸肺細胞に感染し、軽い病気を引
き起こす。アデノウイルス−ベースの運搬システムに関する他のターゲットは、
肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは非***細胞に
観戦することができる利点を持つ。KozarskyおよびWilson, 1993, Current Opin
ion in Genetics and Development 3499-503において、アデノウイルス−ベース
の遺伝子治療の報告がなされている。Bout等, 1994, Human Gene Therapy 53-10
において、アカゲザルの呼吸肺細胞へ遺伝子を輸送するためにアデノウイルスを
使用することが示されている。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例として、 Rosenfeld等, 1991, Science 252431-434; Rosenfeld等, 1992, Ce
ll 68143-155; Mastrangeli等, 1993, J. Clin. Invest. 91225-234; PCT公報
WO94/12649;およびWang等, 1995, Gene Therapy 2775-783等が見出されている 。 【0146】 アデノ関連ウイルス(AAV)はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
いる(Walsh等, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204289-300; 米国特許番 号第5,436,146号)。 【0147】 遺伝子治療に関する他のアプローチは、例えばエレクトロポレーション(elec
troporation)、リポフェクション(lipofection)、リン酸カルシウム仲介トラ
ンスフェクション(calcium phosphate mediated transfection)またはウイル ス感染の方法によって組織培養中に細胞に遺伝子をトランスファーさせることを
含む。通常、トランスファー方法は、選択可能なマーカーを細胞にトランスファ
ーすることを含む。該細胞は次に選択され、トランスファーされた遺伝子を取り
込み発現している細胞を分離する。これらの細胞は次に患者に適用される。 【0148】 この実施形態において、生じた組換え細胞をインビボで投与する前に、この核
酸が細胞に導入される。このような導入は、これらに限定されないが、例えばト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核
酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターの注入、マイクロセル
仲介遺伝子トランスファー(microcell-mediated gene transfer)、スフェロプ
ラスト融合(spheroplast fusion)等の当業界で周知の任意の方法によって行わ
れる。外来遺伝子を細胞に導入する膨大な技術が当業界で周知であり(例えばLo
efflerおよびBehr, 1993, Meth. Enzymol. 217599-618; Cohenおよび, 1993, M
eth. Enzymol. 217618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 296992を参照)、 本発明により使用され、受容細胞の必要な開発的、物理的機能が失われない。該
技術は、細胞への核酸の安定したトランスファーを提供し、そのために該核酸は
該細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝的であり、その細胞の後代によ
って発現可能である。 【0149】 生じた組換え細胞は、当業界で周知のさまざまな方法によって患者に輸送され
る。好ましい実施形態において、上皮細胞が、例えば皮下注射によって注入され
る。他の実施形態において、組換え皮膚細胞は患者への皮膚移植として適用でき
る。組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞、前駆細胞)は、好ましくは静脈注射
によって投与される。使用を考えた細胞の量は、望ましい効果、患者の状態等に
依存しており、当業者によって決定される。 【0150】 遺伝子治療の目的で核酸が導入された細胞は、任意の望ましい、使用可能な細
胞型を含み、これらに限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、線維芽
細胞、筋肉細胞、肝細胞;例えばTリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファー
ジ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等の血液細胞;さまざまな幹細胞または前
駆細胞、特に造血肝または前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血(umbilical cord blo
od)、末梢血液、胎児肝等である。 【0151】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に用いられる細胞は、患者に対して事
故由来である。 【0152】 組換え細胞が遺伝子治療において使用される実施形態において、RPIをコー
ド化した核酸は細胞に導入され、該細胞またはそれらの前駆対によって発現され
、組換え細胞は次に治療効果のためにインビボで投与される。特殊な実施形態に
おいて、肝細胞または前駆細胞が使用される。分離されインビトロで維持されう
る任意の肝細胞および/または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在
的に使用され得る(例えば、1994年4月28日のPCT公開番号WO94/085
98号; Stemple and Anderson, 1992, Cell 71973-985; Rheinwald, 1980, Met
h. Cell Bio. 21A229;ならびにPittelkowおよびScott, 1986, Mayo Clinic Pro
c. 61771を参照)。 【0153】 特異的な実施形態において、遺伝子治療の目的のために導入された核酸は、例
えば核酸の発現が、適切な転写のインデューサーの存在または非存在を制御する
ことによって制御されるような、コード化した領域に手術的に結合できる誘導性
プロモーター(inducible promoter)を含む。 【0154】 5.8.3. リウマチ様関節炎を治療するためのRPIの阻害 1.1.1 本発明の一の実施形態においては、RAに悩む患者の血清に比べて関節液にお
いて増加するRPIのレベルまたは/およびRPIの機能を中和(阻害)する化
合物の投与によって、RAは治療または予防される。使用されうる化合物はアン
チRPI抗体(および、断片、並びにその結合部位を含むその誘導体)、RPI
アンチセンスもしくはリボザイム核酸、およびホモローグ組換えによって内因性
のRPI機能を「ノックアウト」するのに用いられる機能不全RPIをコード化
する核酸(例えば、Capecchi,1989,Science244:12
88−1292参照)が含まれるが、これらに限られるものではない。本発明の
特殊な実施形態においては、RPI側面をコード化するヌクレオチドが(5’お
よび3’の双方へ)異なる遺伝子配列であるRPI遺伝子の一部を含む核酸が、
RPI拮抗物質としてホモローグ組換えによるRPI不活性化を促進するため用
いられる(KollerおよびSmithies,1989,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA86:8932−8935;Zijlstraら
,1989,Nature,342:435−438も参照)。RPI機能を阻
害する他の化合物は、遺伝子分析を採用してもよいが、公知の有用なインビトロ
分析を用いて、例えば、他のタンパクへのRPIの結合を阻害する性能または公
知のRPI機能を阻害する性能に基づいて同定され、好ましくはインビトロもし
くは細胞培養中で分析される。該化合物の投与前および投与後のRPIのレベル
を検出するために「好ましい技術」を用いることも有用である。 【0155】 適切なインビトロまたはインビボ分析が、特定の化合物の効果、およびその投
与を冒された組織の治療に適用できるかを決定するために使用されることが好ま
しい。 【0156】 特殊な実施形態においては、RPI機能を阻害する化合物は、RAに悩む患者
の血清と比べて関節液においてRPIのレベルまたはRPI機能の増加が検出さ
れたとき(例えば、通常レベルまたは望ましいレベルより増加したとき)、治療
的(予防的を含む)に投与される。RPIまたは機能のレベルの増加は、例えば
、タンパクおよび/またはRNAの量を測定することによって、患者の関節液お
よび血清サンプルを得てRNAもしくはタンパクレベル、RPIコード化する表
現されたRNAの構造または/および活性、またはRPIそのものに関してそれ
らをインビトロで分析することによって容易に検出されうる。技術的に標準的な
多数の方法がこのように採用され、キナーゼ分析、RPIを検出および/または
視覚化するためのイムノアッセイ(例えば、ウェスタン法、ドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を伴う免疫沈降、免疫細胞化学など)、お
よび/またはRPIをコード化するmRNAをそれぞれ検出および/または視覚
化することによってRPI表現を検出するためのハイブリダイゼーション分析(
例えば、ノーザン法、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、
など)などが含まれるがこれらに限られるものではない。 【0157】 5.8.4. RPIのアンチセンス調節 1.1.1 特殊な実施形態においては、RPIアンチセンス核酸の使用によってPRIの
機能が抑制される。本発明は、RPIもしくはその一部をコード化する遺伝子ま
たはcDNAにアンチセンスである少なくとも6つのヌクレオチドからなる核酸
の、治療的なまたは予防的な使用を提供するものである。ここで使用されている
RPI「アンチセンス」核酸とは、ある程度の配列相補性によってRPI(好ま
しくはmRNA)をコード化するRNAの一部にハイブリダイゼーション可能な
核酸をいう。アンチセンス核酸は、RPIをコード化するmRNAのコーディン
グ領域および/または非コーティング領域に相補的であってもよい。そのような
アンチセンス核酸は、RPI機能を阻害する化合物として利便性を有し、リウマ
チ様関節炎の治療または予防に用いられうる。 【0158】 本発明のアンチセンス核酸は、一重鎖または二重鎖のオリゴヌクレオチドであ
りうる。また、RNAもしくはDNAまたはこれらの変態もしくは誘導体であり
うる。細胞に直接投与することができ、外因性の導入された配列の転写によって
細胞内で製造することもできる。 【0159】 本発明は、以下に記載するが、製薬上許容できる担体中に本発明のRPIアン
チセンス核酸の有効量を含んでなる薬剤組成物を提供するものでもある。 【0160】 他の実施形態においては、本発明は原核細胞または真核細胞中においてRPI
核酸配列の表現を阻害する方法に用いられ、細胞に本発明のRPIアンチセンス
核酸を含んでなる組成物の有効量を供与することが含まれる。 【0161】 RPIアンチセンス核酸およびその使用を以下に詳細に説明する。 【0162】 RPIアンチセンス核酸 RPIアンチセンス核酸は、少なくとも6ヌクレオチドを有し、好ましくはオ
リゴヌクレオチド(6〜約50オリゴヌクレオチド)である。特定の形態におい
ては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌ
クレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、または少なくとも200ヌクレオ
チドである。オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNAまたはキメラ混合物ま
たは誘導体またはこれらの修飾形態であってもよく、1本鎖であってもまたは2
本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、塩基部分で、糖部分で、またはホ
スフェート主鎖(phosphate backbone)で修飾されてもよい。オリゴヌクレオチド
としては、ペプチド等の他の付随する基(appending group)、または細胞膜での 輸送を容易にする物質(例えば、Letsinger 等., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 86, 6553-6556; Lemaitre 等., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 648
-652; 1988年12月15日に公開された、PCT公報番号WO88/09 810号を参照)、または血液−脳バリアー(例えば、1988年4月25日に
公開された、PCT公報番号WO 89/10134号を参照)、ハイブリダイ
ゼーションを開始させる切断物質(hybridization-triggered cleavage agent)(
例えば、Krol 等., 1988, BioTechniques 6, 958-976を参照)またはインターカ
レーション物質(intercalating agent)(例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5, 5
39-549を参照)が挙げられる。 【0163】 本発明の好ましい形態において、RPIアンチセンスオリゴヌクレオチドが、
好ましくは1本鎖のDNAで提供される。オリゴヌクレオチドは、当該分野にお
いて通常既知である置換基でその構造物のいずれかの位置で修飾されてもよい。
RPIアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下に制限されないが、5−フルオ
ロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロ
キシメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン
、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガ
ラクトシルクエオシン(betaD-galactosylqueosine)、イノシン、N6−イソペン
テニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチル
グアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5
−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメ
チルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノ
シルクエオシン(beta-D-mannosylqueosine)、5’−メトキシカルボキシメチル ウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデ
ニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(V)、ウイブトキソシン(wybutoxosine)、シ
ュードウラシル(pseudouracil)、クエオシン(queosine)、2−チオシトシン、5
−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチ
ルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ
酢酸(V)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−
カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、及び2,6−ジアミノプリン
を含む群より選ばれる少なくとも一の修飾塩基部分を有していてもよい。 【0164】 他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一の修飾される糖
部分、例えば、アラビノース、2−フルオロアラビノース、キシルロース、およ
びヘキソースからなる群より選ばれる糖部分からなる。 【0165】 さらなる他の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエー
ト(phosphorothioate)、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホル
アミドチオエート(phosphoramidothioate)、ホスホルアミデート(phosphoramida
te)、ホスホルジアミデート(phosphordiamidate)、メチルホスホネート、アルキ
ルホスホトリエステル、及びこれらのホルムアセタールまたは類似体からなる群
より選ばれる少なくとも一の修飾されるホスフェート主鎖からなる。 【0166】 さらなる他の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリ
ゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、一般的なβ−単位
とは逆に、ストランドが相互に平行に走る相補的RNAとの特定の2本鎖のハイ
ブリッドを形成する(Gautier 等., 1987, Nucl. Acids Res. 15, 6625-6641) 。 【0167】 オリゴヌクレオチドは、他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショ
ンを開始させる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションを開始させる切断物質
などに共役してもよい。 【0168】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野における既知の標準的な方法によっ
て、例えば、自動DNA合成器(バイオサーチ(Biosearch)、アプライドバイオ システムズ(Applied Biosystems)などから市販されるものなど)の使用によって
、合成されてもよい。例としては、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはス
テイン(Stein)らの方法(1988, Nucl. Acids Res. 16, 3209)によって合成されて
もよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御された細孔ガラスポリマ
ー支持体を用いることによって調製できる(Sarin等, 1988, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85, 7448-7451)。 【0169】 特定の実施形態において、本発明のRPIアンチセンス核酸は、外来の配列
からの転写によって細胞内で製造される。例えばベクターは、細胞内に吸収され
るようにインビボで導入されてもよく、この細胞内でベクターまたはこの一部が
転写され、本発明のアンチセンス核酸(RNA)が産生される。このようなベク
ターは、RPIアンチセンス核酸をコード化する配列を含む。このようなベクタ
ーは、所望のアンチセンスRNAを産生するように転写できる限り、エピソーム
であり続けてもあるいは染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、
当該分野における標準的な組換DNA技術方法によって構築できる。ベクターは
、哺乳動物細胞における複製や発現に使用される、プラスミド、ウィルス性、ま
たは当該分野において既知の他のものであってもよい。RPIアンチセンスRN
Aをコード化する配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト、の細胞において作
用することが当該分野において既知であるプロモーターによってできる。このよ
うなプロモーターは、誘導性であっても構成性であってもよい。このようなプロ
モーターとしては、以下に制限されないが、SV40初期プロモーター領域(Ber
noist and Chambon, 1981, Nature 290, 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’ の長い末端繰り返し中に含まれるプロモーター(Yamamoto 等., 1980, Cell 22,
787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner 等., 1981, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 78, 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Bri
nster 等., 1982, Nature 296, 39-42)などが挙げられる。 【0170】 本発明のアンチセンスは核酸は、RPI遺伝子、好ましくはヒトのRPI遺伝
子のRNA転写産物の少なくとも一部に相補的な配列を有する。しかしながら、
好ましいものの、完全な相補性は必要ではない。本明細書中で引用される、RN
Aの少なくとも一部分に相補的な配列は、RNAとハイブリッド形成して安定な
デュプレックスを形成できるのに十分な相補性を有する配列を意味する;ゆえに
、2本鎖のRPIアンチセンス核酸の場合では、デュプレックスDNAの1本鎖
を試験してもよい、あるいはトリプレックスの形成を分析してもよい。ハイブリ
ッド形成能は、相補性の度合いやアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。
通常、ハイブリッド形成する核酸が長ければ長いほど、RPIをコード化するR
NAとの塩基のミスマッチ数が多くなるが安定なデュプレックス(または、場合
によってはトリプレックス)を形成する。当業者はハイブリッド形成した複合体
の融点を測定する標準的な方法の使用によってミスマッチの許容できる程度を確
認できる。 【0171】 5.8.5 RPIの治療への使用 アンチセンス核酸 RPIアンチセンス核酸は、有益なRPIをリウマチ様関節炎を患っている患
者の関節液中で過剰に発現させて、リウマチ様関節炎を治療(または予防)する
のに使用できる。好ましい実施形態においては、1本鎖のDNAのアンチセンス
RPIオリゴヌクレオチドを使用する。 【0172】 RPIをコード化するRNAを発現または過剰に発現する細胞のタイプは当該
分野において既知の様々な方法によって同定できる。このような細胞のタイプと
しては、以下に制限されるものではないが、白血球(例えば、好中球、マクロフ
ァージ、単球)及びレジデント細胞(例えば、滑膜細胞)が挙げられる。このよ
うな方法としては、以下に制限されるものではないが、RPIに特異的な核酸と
のハイブリッド形成(例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロッ
トハイブリダイゼーション、インサイチュ(in situ)ハイブリダイゼーション) 、ある細胞タイプ由来のRNAのインビトロでのRPIへの翻訳能を考察する、
イムノアッセイなどが挙げられる。好ましい形態において、患者からの1次組織
を、例えば、免疫細胞化学またはin situハイブリダイゼーションによって、治 療前のRPIの発現について分析できる。 【0173】 製薬上許容できる担体中に有効量のRPIアンチセンス核酸を含む、本発明の
薬剤組成物は、リウマチ様関節炎を有する患者に投与できる。 【0174】 RAの治療に有効であろうRPIアンチセンス核酸の量は、標準的な臨床テク
ニックによって決定されうる。可能である場合には、インビトロで、さらにはヒ
トに試験及び使用される前に有用な動物モデルシステムにおいて、治療される腫
瘍のタイプのアンチセンス細胞毒性を測定することが望ましい。 【0175】 特定の実施形態において、RPIアンチセンス核酸を含む薬剤組成物は、リポ
ソーム、微粒子、またはマイクロカプセルを介して投与される。本発明の様々な
実施形態において、このような組成物を用いてRPIアンチセンス核酸の一様の
放出を達成することは有用である。特定の実施形態においては、特定の同定可能
な腫瘍抗原に対する抗体を介してターゲットにされるリポソームを利用すること
が望ましい(Leonetti等, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2448-2451;
Renneisen 等, 1990, J. Biol. Chem. 265, 16337-16342)。 【0176】 5.8.6 阻害リボザイム及びトリプレックスアプローチ 他の実施形態においては、RAの症状は、RPI遺伝子配列を既知の遺伝子ノ
ックアウト、リボザイムおよび/またはトリプレックス方法を組合わせて使用し
て、RPI遺伝子の発現レベルを減少することによって、RPI遺伝子の発現レ
ベルおよび/またはRPI遺伝子産物の活性を減少することによって、改善され
てもよい。RAの症状を改善する能力を含む、RPI遺伝子の活性、発現または
合成を調節する能力を発揮する化合物の中には、リボザイム及びトリプレックス
分子がある。このような分子は、損なわれていない、または適切である場合には
、変異型ターゲット遺伝子活性のいずれかを減少するまたは阻害するように設計
されてもよい。このような分子の製造及び使用に関する技術は、当業者にはよく
知られている。 【0177】 RPI遺伝子mRNA転写産物を触媒により切断するように設計されるリボザ
イム分子を用いて、ターゲット遺伝子mRNAの翻訳及び、ゆえにRPI遺伝子
産物の発現を防止できる。(例えば、1990年10月4日に公開された、PC
T国際公開 WO90/11364号;Sarver 等., 1990, Science 247, 1222-
1225)。 【0178】 リボザイムは、RNAの特異的な切断を触媒できる酵素的RNA分子である。
(書評では、Rossi, 1994, Current Biology 4, 469-471を参照)。リボザイム 作用のメカニズムは、相補的ターゲットRNAへのリボザイム作用分子の配列特
異的なハイブリダイゼーション、さらにはエンドヌクレアーゼによる切断事象(e
ndonucleolytic cleavage event)を含む。リボザイム分子の組成物は、ターゲッ
ト遺伝子mRNAに対して相補的な一以上の配列を含むものでなければならず、
また、mRNA切断に応答性のある既知の触媒配列を含むものでなければならな
い。この配列に関しては、例えば、その全体を参考のために本明細書中に引用さ
れる、米国特許第5,093,246号を参照。 【0179】 部位特異的な認識配列でmRNAを切断するリボザイムをRPIをコード化す
るmRNAを破壊するのに使用できるものの、シュモクザメのリボザイム(hamme
rhead ribozyme)の使用が好ましい。シュモクザメのリボザイムは、ターゲット mRNAと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって規定される位置
でmRNAを切断する。ターゲットmRNAが下記2塩基配列:5’−UG−3
’を有することが唯一の必要条件である。シュモクザメのリボザイムの構築及び
製造は、当該分野において既知であり、その全体を参考のために本明細書中に引
用される、Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology A Comprehensi
ve Desk Reference, VCH Publishers, New York(特に833頁、図4を参照) およびHaseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334, 585-591により詳しき記載さ
れる。 【0180】 好ましくは、リボザイムは、切断認識部位がRPIをコード化するmRNAの
5’末端付近に位置する、即ち、効率を上げかつ非機能性mRNA転写産物の細
胞内蓄積を最小限にするように操作される。 【0181】 本発明のリボザイムとしてはまた、テトラヒメナ サーモフィラ(Tetrahymena
thermophila)中に天然に生じ(IVS、またはL−19 IVS RNAとし て既知である)、Thomas Cech及び協力者らによって広範に記載されたもの(Zau
g, 等., 1984, Science, 224, 574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231,
470-475; Zaug, 等., 1986, Nature, 324, 429-433; ユニヴァーシティー パテンツ インコーポレイテッド(University Patents Inc.)による公開国際特 許出願番号WO 88/04300号 ; Been and Cech, 1986, Cell, 47, 207
-216)などのRNAエンドヌクレアーゼ(以降、Cechタイプリボザイム)が
挙げられる。Cechタイプリボザイムは、後にターゲットRNAの切断が行わ
れるターゲットRNA配列とハイブリッド形成する8塩基対活性部位を有する。
本発明は、RPIをコード化する遺伝子中に存在する8塩基対活性部位配列をタ
ーゲットとするこれらのCechタイプリボザイムを包含する。 【0182】 アンチセンスアプローチにおいて、リボザイムは、(例えば、改善された安定
性、ターゲッティングなどを目的として)修飾されたオリゴヌクレオチドから構
成されることができ,インビボでRPIを発現する細胞に輸送されなければなら
ない。好ましい輸送方法は、トランスフェクトされた細胞がRPIをコード化す
る内因性のmRNAを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生
するように、強力な構成性pol IIIまたはpol IIプロモーターの制
御下でのリボザイムをコード化するDNA構築物を用いることを含む。リボザイ
ムは、アンチセンス分子と異なり、触媒性であるので、低細胞内濃度が効率のた
めに必要である。 【0183】 内因性のRPI発現はまた、ターゲットされた相同的組換を用いてRPI遺伝
子またはそのプロモーターを不活性化またはノックアウトすることによって減少
できる(例えば、Smithies, 等., 1985, Nature 317, 230-234; Thomas and Ca
pecchi, 1987, Cell 51, 503-512; Thompson 等., 1989, Cell 5, 313-321を参
照;これらのそれぞれは、その全体を参考のために本明細書中に引用される)。
例えば、内因性RPI遺伝子(RPIをコード化する遺伝子のコーディング領域
または調節領域のいずれか)に相同するDNAに隣接する変異型の、非機能性R
PI遺伝子(または全く関連のないDNA配列)を、インビボでターゲット遺伝
子を発現する細胞をトランスフェクトするために、選択マーカーおよび/または
ネガティブな選択マーカーと一緒にまたはを用いずに、使用できる。ターゲット
された相同的組換を介した、DNA構築物の挿入によって、ターゲット遺伝子が
不活性化される。このようなアプローチは、ES(胚幹)細胞への修飾が不活性
ターゲット遺伝子を有する動物子孫を発生するのに使用できる農業分野に特に適
する(例えば、Thomas and Capecchi, 1987 and Thompson, 1989, 上記を参照)
。しかしながら、このアプローチは、組換DNA構築物を適当なウィルスベクタ
ーを用いてインビボで必要な部位に直接投与するまたはターゲットされる場合に
はヒトへの使用に適用されうる。 【0184】 または、内因性のRPI遺伝子の発現は、RPI遺伝子の調節領域(即ち、R
PI遺伝子プロモーターおよび/またはエンハンサー)に相補性のあるデオキシ
リボヌクレオチド配列をターゲットとして体内のターゲット細胞におけるRPI
遺伝子の転写を防止するトリプレックス構造物を形成することによって抑制され
うる。(通常、Helene, 1991, Anticancer Drug Des., 6(6), 569-584; Helene
, 等., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660, 27-36; and Maher, 1992, Bioassa
ys 14(12), 807-815を参照)。 【0185】 転写の阻害を目的とするトリプレックス形成に使用される核酸分子は、1本鎖
であり、デオキシヌクレオチドから構成されなければならない。これらのオリゴ
ヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対原則によるトリプレック
ス形成を促進するように設計されなければならず、これは、通常、プリンまたは
ピリミジンのいずれかの相当の大きさのストレッチがデュプレックスの1本鎖に
存在する必要がある。ヌクレオチド配列はピリミジンを基礎としてもよく、これ
により、得られるトリプレックスの3つの会合するストランドにTAT及びGC
C+のトリプレットが生じるであろう。ピリミジンリッチな分子は、1本鎖に平 行な方向にデュプレックスのその1本鎖のプリンリッチな領域に対する塩基の相
補性が提供される。加えて、プリンリッチである、例えば、G残基のストレッチ
を含む、核酸分子が選択されてもよい。これらの分子は、大多数のプリン残基が
、トリプレックスの3ストランドにGGCトリプレットを生じる、ターゲットに
されるデュプレックスの1本鎖上に位置する、GC対リッチなDNAデュプレッ
クスとトリプレックスを形成するであろう。 【0186】 または、3重螺旋の形成のためにターゲットされうる潜在的な配列をいわゆる
スイッチバック核酸分子を作製することによって増やしてもよい。スイッチバッ
ク分子は、デュプレックスの最初の一ストランドと次に他方と塩基対を形成して
、プリンまたはピリミジンのいずれかの相当の大きさがデュプレックスの1スト
ランドに存在する必要性を排除するように、交互の5’−3’、3’−5’様式
で合成される。 【0187】 本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイム、および/またはトリプレッ
クス分子を利用して変異型遺伝子発現を阻害する場合には、その技術が、存在す
る正常なRPI遺伝子産物の濃度が正常な表現型に必要であるより低い可能性が
生じるくらい、非常に効果的に正常なRPI遺伝子アレルによって産生されるm
RNAの転写(トリプレックス)および/または翻訳(アンチセンス、リボザイ
ム)を抑制または阻害することが可能である。したがって、このような場合には
、RPI遺伝子活性の実質的に正常なレベルを確実に維持するために、正常なR
PI遺伝子活性を発揮するRPI遺伝子ポリペプチドをコード化、発現する核酸
分子を、アンチセンス、リボザイム、またはトリプレックス治療が利用されてい
るどんなものにも感受性のある配列を含まない遺伝子療法を介して細胞中に導入
してもよい。または、RPI遺伝子が細胞外タンパク質をコード化する場合には
、ターゲット遺伝子活性の必要なレベルを維持するために正常なRPI遺伝子タ
ンパク質を同時に投与する(co-administer)ことが好ましい。 【0188】 本発明のアンチセンスRNA及びDNA、リボザイム、ならびにトリプレック
ス分子は、上記したように、DNA及びRNA分子の合成に関する当該分野にお
ける既知の方法によって調製されてもよい。これらとしては、例えば、固相ホス
ホルアミダイト(phosphoramidite)化学合成などの当該分野で既知のオリゴデオ キシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するに技術が
挙げられる。または、RNA分子を、アンチセンスRNA分子をコード化するD
NA配列のインビトロ及びインビボ転写によって得てもよい。このようなDNA
配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適当なRNAポリメ
ラーゼプロモーターが取り込まれた広範な様々なベクター中に導入されてもよい
。または、使用されるプロモーターによって、構成により(constitutively)また
は誘導により(inducibly)アンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA 構築物を細胞株に安定して導入してもよい。 【0189】 5.9 治療または予防のための利用のデモンストレーション 本発明の化合物は、ヒトに使用される前に、所望の治療または予防活性に関し
てインビトロ、次にインビボで試験されることが好ましい。例えば、特定の化合
物の投与が必要であるかどうかを決定するのに使用できるインビトロ分析として
は、患者の組織サンプルを培養液中で成育させ、化合物に晒すあるいは化合物を
投与して、このような化合物の組織サンプルへの効果を観察するインビトロの培
養分析が挙げられる。 【0190】 テスト化合物は、RAを患っている患者のRADFまたはRPIレベルがRA
を患っていない被検者中で見出されるレベルにまで戻るまたはRAの実験動物モ
デル(例えば、ラットのアジュバント関節炎)における同様の変化を作製するこ
とができるかについて試験されうる。上記レベルを回復できる化合物を、さらな
る薬剤発見を目的としたリード化合物(lead compound)として使用できる、また は治療に使用できる。 【0191】 RADF及びRPIの発現は、好ましい技術、イムノアッセイ、ゲル電気泳動
後可視化、または他の当業者に既知の方法によって分析できる。このような分析
は、RADFまたはRPIの発現量が臨床的病気の代用マーカーとして機能でき
る際には、候補薬剤をスクリーニングするためにまたは臨床的なモニタリング若
しくは薬剤の開発に使用できる。 【0192】 様々な特定の実施形態において、インビトロ分析は、患者の疾患にかかわる細
胞型の代表的な細胞を用いて行なわれ、化合物がこのような細胞型に目的とする
効果を有するかどうかを決定できる。 【0193】 治療に使用される化合物は、以下に限られないが、ラット、マウス、ニワトリ
、ウシ、サル、ウサギなどの適当な動物モデルシステムでヒトでの試験の前に試
験されうる。インビボ試験に関しては、ヒトへの投与前に、当該分野において既
知のいずれかの動物モデルシステムを使用してもよい。 【0194】 5.10 治療/予防のための投与及び組成物 本発明は、有効量の本発明の化合物び被検者への投与による治療(及び予防)
方法を提供するものである。好ましい形態においては、化合物は実質的に純粋で
ある(例えば、その効果を制限するあるいは望ましくない副作用を産する物質を
実質的に含まない)。被検者は、好ましくは、以下に限られないが、ウシ、ブタ
、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物を含む、動物であり、好ましくは哺乳動
物であり、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態においては、非ヒト哺乳
動物が被検者である。 【0195】 化合物が核酸からなる際に使用できる配合物及び投与方法は上記と同様である
;さらなる適当な配合物及び投与経路は、下記したものから選択できる。 【0196】 様々な輸送システムが知られており、本発明の化合物を投与するのに使用でき
、例えば、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現でき
る組換細胞、レセプターが介するエンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, 198
7, J. Biol. Chem. 262,4429-4432を参照)、レトロウィルスまたは他のベクタ
ーの一部としての核酸の構築などがある。導入方法としては、以下に限られない
が、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙
げられる。化合物は、いずれかの簡便な経路によって、例えば、輸液または大量
注射によって、上皮または粘膜皮膚内層(例えば、経口、粘膜、直腸及び腸粘膜
など)による吸収によって投与されてもよく、また、他の生物学的に活性のある
薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は全身または局所であってもよい。加えて
、脳室内及び髄腔内などの、適当な経路によって中枢神経系中に本発明の薬剤組
成物を導入することが望ましい;脳室内注射は例えば、オマヤレザバー等の、レ
ザバーに取り付けられる、脳室内カテーテルによって容易になる。肺への投与も
また、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアゾール投与剤(aerosolizin
g agent)との配合によって、使用されうる。 【0197】 特定の実施形態においては、治療を必要とする領域に局所的に本発明の薬剤組
成物を投与することが望ましい;これは、例えば、以下に限定されるわけではな
いが、外科手術中の局所的な輸液、例えば、外科手術後に創傷被覆剤と組み合わ
せた、局所的な塗布、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、また
はインプラントによって、達成されてもよいが、上記インプラントは、多孔性、
非多孔性、またはゼラチン製材料からなり、シアラスティック膜(sialastic mem
brane)等の膜、または繊維などが挙げられる。一実施形態においては、投与は、
悪性腫瘍または新生物性の若しくは新生物発生前の組織のある部位(または前の
部位)に直接注射することによってもよい。 【0198】 他の実施形態においては、化合物が、ベシクル、特にリポソーム中に輸送され
てもよい(Langer, Science 249, 1527-1533 (1990); Treat 等., in Liposome
s in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and F
idler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid
., pp. 317-327を参照;同書を参照)。 【0199】 さらなる実施形態においては、化合物が、制御された放出システム中に輸送さ
れてもよい。一実施形態においては、ポンプを使用してもよい(Langer、上記;
Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14, 201 (1987); Buchwald 等., Surge
ry 88, 507 (1980); Saudek 等., N. Engl. J. Med. 321, 574 (1989)を参照)
。他の実施形態においては、高分子材料を使用してもよい(Medical Applicatio
ns of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton,
Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design a
nd Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger
and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23, 61 (1983)を参照;
また、Levy 等., Science 228, 190 (1985); During 等., Ann. Neurol. 25, 3
51 (1989); Howard 等., J. Neurosurg. 71, 105 (1989)を参照)。さらなる他
の実施形態においては、制御された放出システムを、全身性の投薬量のフラクシ
ョンのみを必要とする、治療のターゲット、即ち、脳の付近に置かれてもよい(
例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, v
ol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照)。 【0200】 他の制御された放出システムは、Langer (Science 249, 1527-1533 (1990))の
書評で討論される。 【0201】 本発明の化合物がタンパク質をコード化する核酸である特殊な実施形態におい
ては、核酸が、例えば、レトロウィルスベクター(米国特許第4,980,28
6号を参照)の使用によって、核酸を適当な核酸の発現ベクターの一部として構
築し細胞内になるように投与することによって、または直接注射によって、また
は微粒子の衝撃(例えば、遺伝子ガン;Biolistic, Dupont)の使用によって、 または脂質若しくは細胞表面レセプター若しくはトランスフェクション剤(trans
fecting agent)による被覆によって、または核に入ることが知られているホメオ
ボックス様ペプチド(例えば、Joliot 等., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88, 1864-1868を参照)に結合する核酸を投与することなどによって、インビボ
で投与されてコード化されたタンパク質の発現を促進してもよい。または、核酸
を、細胞内に導入して、相同的組換によって、発現用の宿主細胞DNA内に取り
込んでもよい。 【0202】 本発明はまた、薬剤組成物を提供するものである。このような組成物は治療上
有効な量の化合物及び製薬上許容できる担体からなる。特殊な実施形態において
は、「製薬上許容できる」ということばは、連邦管理局(regulatory agency of
the Federal)、若しくは州政府によって認可されていること、または米国薬局方
もしくは動物、特にヒトへの使用に関して一般的に認知されている他の薬局方に
リストとして挙げられていることを意味する。「担体」ということばは、治療剤
が一緒に投与される希釈液、アジュバント、賦形剤、またはベヒクルを意味する
。このような製薬上の担体は、水ならびに、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ
油等の、石油、動物、植物若しくは合成由来のものなどの、油等の滅菌液体であ
りうる。水は、薬剤組成物を静脈内で投与される場合には好ましい担体である。
食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液もまた、特に注射可能な
溶液用に、液状担体として使用できる。適当な製薬上の賦形剤としては、デンプ
ン、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、
チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレー
ト、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、
グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。本組成物は、必要であれば、少
量の湿潤若しくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は
、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性配合物などの形
態がとられる。組成物は、伝統的な結合剤及びトリグリセリド等の担体を用いて
、坐剤として配合されてもよい。経口用の配合物は、薬剤グレードのマンニトー
ル、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム
(sodium saccharine)、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含 みうる。適当な製薬上の担体の例は、E.W. MartinによるRemington's Pharmaceu
tical Sciencesに記載される。このような組成物は、患者に適当に投与するため
の形態を提供できるように適当な量の担体と共に、好ましくは純粋な形態の、治
療上有効な量の本化合物を含むであろう。配合物は、投与の形態に適するもので
なければならない。 【0203】 好ましい実施形態においては、本組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適用
される薬剤組成物として定常的な方法に従って配合される。具体的には、静脈内
投与用の組成物は、滅菌等張水性緩衝液における溶液である。必要であれば、組
成物はまた、可溶化剤及び注射部位での痛みを和らげるためのリドカイン等の局
所麻酔剤を含んでもよい。通常、成分は、例えば、一定量の活性物質を表示する
アンプル若しくは小袋(sachette)等の密閉容器における乾燥凍結乾燥粉末若しく
は水分のない濃縮液として、単位服用量形態(unit dosage form)で別々にまたは
一緒に混合してのいずれかで供給される。組成物を輸液によって投与しようとす
る際には、組成物を滅菌した薬剤グレードの水または食塩水を含む輸液用ボトル
で調剤されうる。本組成物を注射によって投与する際には、注射用の滅菌水また
は食塩水のアンプルを、投与前に成分を混合するように提供できる。 【0204】 本発明の組成物は、中性または塩形態として配合されてもよい。製薬上許容で
きる塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の塩などの遊離
アミノ基を用いて形成される塩、ならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム
、カルシウム、水酸化第2鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エ
チルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の塩などの遊離カルボキ
シル基を用いて形成される塩が挙げられる。 【0205】 RAの治療に有効であろう本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術によって
決定できる。加えて、インビトロ分析を必要であれば最適な投与範囲を同定する
のを補助するのに使用してもよい。配合物に用いられる正確な投与量はまた、投
与経路、及び病気または疾患の重篤度によって異なり、開業医や各患者の環境の
判断に従って決定されなければならない。しかしながら、静脈内投与に関する適
当な投与量の範囲は、通常、約20〜500mgの活性化合物/kg体重である
。鼻腔内投与に関する適当な投与量の範囲は、通常、約0.01pg/kg体重
〜1mg/kg体重である。有効な投与量は、インビトロまたは動物モデル試験
システムから派生される線量効果曲線から外挿されてもよい。 【0206】 坐剤は、通常、0.5質量%〜10質量%の範囲の活性成分を含む;経口用配
合物は、好ましくは、10%〜95%の活性成分を含む。 【0207】 本発明はまた、本発明の薬剤組成物の一以上の成分を充填する一以上の容器か
らなる薬剤パックまたはキットを提供するものである。必要であれば、製剤また
は生物学的製品の製造、使用または販売を調節する政府の機関(governmental ag
ency)によって規定される形態の通知をこのような容器につけてもよく、この通 知はヒトへの投与のための製造、使用及び販売の政府機関(agency of manufactu
re, use or sale)による認可を反映するものである。 【0208】 6 実施例:RAによる患者の血清及び関節液由来のタンパク質 下記の参考プロトコルを用いて、リウマチ様関節炎(RA)の患者からのまた
はRAでない患者(即ち、痛風、変形性関節症、または外傷性の滑膜炎の患者)
からの血清及び関節液中のタンパク質を、等電点電気泳動さらにはSDS−PA
GEによって分離し、比較した。各サンプルは2連で流した。 【0209】 6.1 サンプル調製 1.1 タンパク質の分析を、受け取ったままのサンプルで行なった(Pierce BCA Cat
# 23225)。300μgの全タンパク質に相当する容積の血清を分取し、等容の1
0%(w/v)SDS(Fluka 71729)、2.3%(w/v)のジチオトレイトー ル(BDH 443852A)を添加した。このサンプルを95℃で5分間加熱した後、20 ℃に冷却した。次に、125μlの以下の緩衝液をサンプルに加えた: 8M 尿素(BDH 452043w) 4% CHAPS(Sigma C3023) 65mM ジチオトレイトール(DTT) 2%(v/v) リゾライト(Resolytes) 3.5−10(BDH 44338 2x)。 【0210】 この混合物をボルテックスして、15℃で13000rpmで5分間、遠心し
、上清を等電点電気泳動によって分析した。 【0211】 6.2 等電点電気泳動 臨床研究における使用 本発明の診断方法および組成物は、臨床研究、例えばRA治療のための薬剤の
テスト、をモニターする際に補助することができる。ある実施形態においては、
候補分子は、RAに冒されている患者におけるRADFまたはRPIレベルを、
RAに冒されていない被験者において確認されるレベル、または、非RAまたは
血清におけるRADFまたはRFIのレベルかそれに近しい値に維持されるよう
に治療が施された患者において確認されるレベルにまで回復させる能力が試験さ
れる。1もしくはそれ以上のRADFまたはRPIのレベルを分析してもよい。
他の実施形態においては、本発明の方法および組成物は、臨床研究のために候補
をスクリーニングする時に、RAを有する個体を同定するために用いられる。こ
のような個体は、その後研究に含んでもよく、除外してもよく、または、治療も
しくは分析のために別のコホートに配置されてもよい。 【0212】 RPIの精製 特殊な観点においては、本発明は抗原性の決定因子(すなわち、抗体によって
認識されうる)からなる、または前記のものをコード化すると同時に機能的に活
性な、分離されたRPI、好ましくは、ヒトのRPIおよび断片ならびにその誘
導体を提供する。ここで用いられる機能的に活性なRPIとは、フルレング(野
生型)RPIに付随した、1または2以上の公知の機能的な活性を示す物質をい
い、例えば、RPI基質もしくはRPI結合パートナーへの結合、(アンチター
ゲット抗体に結合した)抗原性、または免疫抗原性などがある。 【0213】 特殊な実施形態においては、本発明は、少なくとも6アミノ酸、10アミノ酸
、50アミノ酸、または少なくとも75アミノ酸からなるRPIの断片を提供す
る。RPIの領域が部分的にまたはすべてが欠如している断片または断片を含ん
でなるタンパクも提供される。前記のものをコード化する核酸が提供される。R
PI遺伝子配列を発現する組換え核酸が同定されると、その遺伝子生成物は分析
されうる。これは生成物の物理的なまたは機能的な特性に基づく分析によって成
され、ゲル電気泳動、イムノアッセイなどによる分析を伴う生成物の放射性標識
が含まれる。RPIが同定されると、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換
、アフィニティー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー)、遠心沈殿法
、異なる溶解度による方法(differential solubility)、またはタンパクの精 製に用いられる通常の他のすべての技術を含む一般的な方法により分離され、精
製されうる。その他に、組換え核酸によって生成されたRPIが同定されたとき
、組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列からRPIのアミノ酸配
列全体を推測することができる。結果として、タンパクは技術的に公知の一般的
な化学的方法によって合成されうる(例えば、Hunkapille等,M.,
1984,Nature 310 105−111参照)。他のかわりの実施形
態においては、上記記載の一般的な方法(例えば、イムノアフィニティー精製)
によって天然型RPIが天然のソースから精製されうる。好ましい実施形態にお
いては、参照としてここに組み込まれる米国出願第08/980,574号に記
載の「好ましい技術」によってRPIは分離される。調整段階での実施のために
は、Westermeier,1993,Electrophoresis i
n Practice(VCH,Weinheim,Germany),pp.
197−209(全体が参照としてここに組み込まれる)に記載の方法にしたが
って、等電段階において2pHまたはそれ以下のpH範囲を有する狭い範囲のズ
ームゲルを使用することが好ましい。この改変によって、より大量のターゲット
タンパク質がゲル上にローディングされることを可能にし、それによってゲルか
ら取り出される分離RPIの量も増加する。調整段階での実施のためにこの方法
が用いられたときは、「好ましい技術」は、一回の実施で一般的には100ng
にまで及ぶ分離RPIを提供し、1000ngにまで及ぶ量を提供しうる。当該
技術に精通したものであれば、ズームゲルは、ゲル等電収束法を用いたいかなる
分離戦略においても使用されうるものであることを認識するであろう。本発明の
特殊な実施形態においては、そのうようなRPIは、組換えDNA技術によって
製造されたものであれ、化学的な合成方法によるものであれ、天然タンパクの精
製によるものであれ、断片および他の誘導体ならびにそれらの類似体に加えて、
RPIのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含んでなるものからなる(しかし、
これに限られるものではない)。また、ホモローグなタンパクを含む。 【0214】 RPIに対する抗体の製造 本発明にしたがって、RPI、その断片、および他の誘導体、並びにそれらの
類似体が、免疫特異的にイムノゲンに結合する抗体を生成するイムノゲンとして
使用されうる。そのようなタンパク、断片、誘導体、および類似体は、いかなる
慣用の方法によって分離してもよく、本願の以前のセクションに記載された方法
を含む。生成される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一重鎖
、Fab断片、およびFab発現ライブラリーを含むがこれらに限られるもので
はない。特殊な実施形態においては、ヒトRPIに対する抗体が製造される。他
の実施形態においては、RPIのドメインに対する抗体が製造されうる。特殊な
実施形態においては、抗体製造のためのイムノゲンとしてRPIの親水性断片が
使用される。RPIもしくは誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体の
製造のために、技術的に公知の種々の手法が使用されうる。特殊な実施形態にお
いては、RPIのエピトープに対するウサギポリクローナル抗体またはその配列
が得られる。抗体の製造のために、天然のRPIもしくは合成型またはその誘導
体(例えば、断片)の注入によってさまざまなホスト動物、ウサギ、マウス、ラ
ット、ウマ、ヤギ、などが含まれるがこれらに限られるものではない、が免疫さ
れる。種々のアジュバントが免疫学的反応を増加させるために使用されうる。そ
れらはホスト種に依存し、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジ
ュバント、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンなどの表面活
性化物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キー
ホールカサガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG(Bacil
le Calmette−Guerin)およびコリネバクテリウム パルバム
のような潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるがこれらに限定されるもの
ではない。RPI配列およびその類似体に対するモノクローナル抗体の調製のた
めに、培養中の連続した細胞株による抗体分子の製造のためのいかなる技術を用
いてもよい。例えば、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Koz
borら,1983,Immunology Today472)、およびヒト
モノクローナル抗体を製造するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら,
1985,in Monoclonal Antibodies and Ca
ncer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77−
96)に加えて、元来KohlerおよびMilstein(1975,Nat
ure256495−497)によって開発されたハイブリドーマ技術がある。
(前記文献はそれぞれ参照としてここに組み込まれる) 本発明の付加的な実施形態においては、ここに参照として組み込まれるPCT
/US90/02545に記載されるように、無菌動物中にてモノクローナル抗
体は製造されうる。本発明にしたがってヒト抗体は使用され、また、ヒトハイブ
リドーマを用いて(Coteら,1983,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA802026−2030)、またはヒトB細胞をインビトロにおい
てEBVウイルスで形質転換することによって(Coleら,1985,in
Monoclonal Antibodies and Cancer The
rapy,Alan R.Liss,pp.77−96)、得ることができる。
実際、本発明次第では、好ましい生物学的に活性なヒト抗体分子から得た遺伝子
に付随するRPIに特異的なマウス抗体分子から得た遺伝子のスプライシングに
よるキメラ抗体の製造のために開発された技術(Morrisonら,1984
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851−6855;N
eubergerら,1984,Nature312604−608;Take
daら,1985,Nature314452−454)を用いることができる
。このような抗体は、本発明の範囲に属するものである。(前記文献はそれぞれ
参照としてここに組み込まれる) 本発明次第では、一重鎖抗体の製造のための技術(参照としてここに組み込ま れる米国特許第4,946,778号)が、RPI特異的な一重鎖抗体を製造す
るために用いられうる。本発明の付加的な実施形態は、Fab発現ライブラリー
の構築のために記載された技術(Huseら,1989,Science246 1275−1281)を利用し、迅速かつ容易なRPI、誘導体、または類似体
に望ましい特異性を有するモノクローナルFab断片の同定を可能にする。分子
のイディオタイプを含む抗体断片は公知の技術によって生成されうる。例えば、
そのような断片としては、抗体分子のペプシン処理によって製造されうるF(a
b’)2断片、F(ab’)2断片のジスルフィド架橋を還元することによって製
造されるFab’断片、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによっ
て製造されるFab断片、Fv断片、が含まれるがこられに限られるものではな
い。抗体の製造に際しては、所望の抗体のためのスクリーニングは、例えば、E
LISA(enzyme-linked immunosorbent assay)などの公知技術によって遂行 される。例えば、RPIの特定のドメインを認識する抗体を選択するためには、
そのようなドメインを含むRPI断片に結合する生成物のために、製造されたハ
イブリドーマを分析することができる。第一PRIホモローグに特異的に結合す
るが、異なるRPIホモローグには特異的に結合しない抗体の選択のためには、
第一RPIホモローグへの能動的な結合および第二RPIホモローグへの結合の
欠如に基づいて選択することができる。同様に、RPIに特異的に結合するが、
同一のタンパク(例えば、RPIと同一のコアペプチドを有する、異なるグリコ
フォーム)の異なるイソ型には特異的に結合しない抗体の選択は、RPIへの能
動的な結合および異なるイソ型(例えば、グリコフォーム)への結合の欠如に基
づいて選択することができる。RPIのドメインに特異的な抗体も提供される。
前記抗体は、本発明のRPIの位置および活性に関する技術的に公知の方法、例
えば、これらのタンパクのイメージ化、好適な生理学的なサンプルにおけるそれ
らのレベルの測定、診断方法などにおいて用いられる。 【0215】 RPIをコード化するDNAの分離 RPI遺伝子のクローニングのための特殊な実施形態を以下に例を用いて述べ
るが、これに限定されるものではない。DNAおよびRNAを含み、RPIもし
くは断片またはその類似体をコード化する配列からなる本発明のヌクレオチド配
列は、慣用的な化学的アプローチまたは重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ
チェーンリアクション(PCR)増幅などの技術的に公知の方法を用いて合成さ
れうる。配列はいかなる種のRPI遺伝子の同定およびクローニングも提供し、
例えば、cDNAライブラリー、ゲノミックライブラリー、または発現ライブラ
リーのスクリーニングが挙げられる。本発明のRPIをコード化する配列からな
るヌクレオチド配列は、他のタンパク遺伝子の相補的な伸長と選択的に二重鎖分
子を形成する能力において有用である。応用形態によるが、さまざまな配列同定
を遂行するために種々のハイブリダイゼーション条件が採用されうる。選択性の
度合いを高めるためには、塩が少なく温度が高い条件などの比較的緊縮した条件
が二重鎖を形成するために使用される。ここで使用されている「高度に緊縮した
条件(highlystringentconditions)」とは、65℃の0.5M NaHPO4、
7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中において濾過器に
結合されたDNAへハイブリダイゼーションし、68℃の0.1xSSC/0.
1%SDSで洗浄することを意味する(全体が参照としてここに組み込まれるA
usubel F.M.等,eds.,1989,Current Proto
cols in Molecular Biology,Vol.I,Gree
n Publishing Associates,Inc.,and Joh
n Wiley&sons,Inc.,ニューヨーク,p.2.10.3)。い
くつかの応用にあたっては、緊縮度合いがより少ないハイブリダイゼーション条
件が必要とされる。ここで用いられる「適度に緊縮した条件(moderatelystring
entconditions)」とは、42℃の0.2xSSC/0.1%SDSで洗浄する ことを意味する(Ausubelら,1989,上記文献)。ハイブリダイゼー
ション条件は、ハイブリッド二重鎖を不安定化させるために、ホルムアミドの量
を増加することによってより緊縮したものとすることもできる。このように、特
定のハイブリダイゼーション条件は容易に操作されるものであり、一般的には所
望する結果に応じて選択される。例えば、50%のホルムアミド存在下における
慣用的なハイブリダイゼーション温度は、RPI遺伝子断片に対して95〜10
0%ホモローグであるプローブに対しては42℃であり、90〜95%ホモロー
グの時は37℃、70〜90%ホモローグの時は32℃である。ゲノミックライ
ブラリーの調製にあたっては、その一部がRPIの一部または全体をコード化す
るDNA断片が製造される。DNAは種々の制限酵素を用いて特定のサイトで開
裂することもできる。かわりに、DNAを断片化するためにマンガン存在下にお
いてDNアーゼを用いることもでき、または、例えば、超音波処理によってDN
Aを物理的にせん断することもできる。DNA断片は、その後、一般的な技術に
よって大きさに従って分離される。方法としては、アガロースおよびポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、並びにショ糖勾配遠心法が
含まれるがこれらに限定されるものではない。DAN断片はその後好適なベクタ
ー、プラスミド、コスミド、バクテリアファージラムダもしくはT4、およびイ
ースト人工クロモソーム(YAC)が含まれるが限定されるものではない、に挿
入される。(例えば、Sambrookら,1989,Molecular C
loning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Co
ld Spring Harbor Laboratory Press,Co
ld Spring Harbor,ニューヨーク;Glover,D.M.(
ed.),1985,DNA Cloning A Practical Ap
proach,MRL Press,Ltd.,Oxford,イギリス国 V
ol.I,II;Ausubel F.M.ら,eds.,1989,Curr
ent Protocols in Molecular Biology,V
ol.I,Green Publishing Associates,Inc
.,and John Wiley&sons,Inc.,ニューヨーク参照)
。ゲノミックライブラリーは、標識されたプローブへの核酸ハイブリダイゼーシ
ョンによってスクリーニングすることもできる(Benton and Dav
is,1977,Science196 180;Grunstein and
Hogness,1975,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72 3961)。ゲノミックライブラリーは、技術的に公知の最適なアプローチ
を用いて、RPIのいかなるペプチドのアミノ酸配列も対応する標識された変性
オリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングすることもできる。用いられ
るプローブは、10ヌクレオチドまたはそれ以上であることが好ましく、15ヌ
クレオチドまたはそれ以上であることがより好ましい。上記表VIII〜XIに示され
るように、ここで開示されるいくつかのRPIは、その配列が公知である遺伝子
によってコード化された、以前に同定されたタンパクに対応するものである。そ
のような遺伝子をスクリーニングするために、その遺伝子またはその補体に相補
的ないかなるプローブを用いてもよい。プローブは10ヌクレオチドまたはそれ
以上であることが好ましく、15ヌクレオチドまたはそれ以上であることがより
好ましい。http//www.ncbi.nlm.nih.gov/でアクセ
ス可能なNational Center for Biotechnolog
y Information(NCBI)に保持されているEntrezデータ
ベースは、以下の受け入れ番号によりこれらのRPIに対応する遺伝子配列を提
供する。また、それぞれの配列はここに組み込まれる。 【0216】 表XII RPI関連タンパクの遺伝子配列 RADF #RPI 受け入れ番号 RADF−1 RPI−1 T40090,T40068 RADF−3 RPI−3 AA551927,AA260531,W977
41,N99366,T70526,T40177,T40060,T4003
4,T39910,T39894 RADF−4 RPI−4 T41010,T40102,T40058,T
39954 RADF−6 RPI−5 AA269874 RADF−8 RPI−6 Z20858,AA503766,H51308
,H03365 RADF−9 RPI−7 Z20858,AA503766,H51308
,H03365 RADF−10 RPI−8 Z21022,Z19947 RADF−11 RPI−9 T41063,T41020,T41005,
T40881,T40190,T40139,T40125,T40114,T
40096,T39908 RADF−12 RPI−11 T40090,T40068 RADF−13 RPI−12 AA551927,AA260531,W97
741,N99366,T70526,T40177,T40060,T400
34,T39910,T39894 RADF−14 RPI−13 T40090,T40068 RADF−15 RPI−15 T40940,T40002 RADF−16 RPI−16 T73244,T71043,T71032,
T40181,T40116 RADF−18 RPI−21 N99641,N99445,N99528,
Z20485,Z20465 RADF−19 RPI−22 AA269874 RADF−20 RPI−23 Z20858,AA503766,H5130
8,H03365 RADF−22 RPI−24 T1952,H73939,Z20894,T
40182,T40167,T40158 RADF−23 RPI−25 AA614684,AA523377,AA7
15907,AA580429,AA630254,AA617854,AA5
80356 RADF−24 RPI−26 AA268201,T64416,T6214
9,T40186 RADF−25 RPI−27 Z21017,Z20888,Z19984,
Z19971,T41056,T40108 RADF−26 RPI−28 T1952,H73939,Z20894,T
40182,T40167,T40158 RADF−26 RPI−29 Z21017,Z20888,Z19984,
Z19971,T41056,T40108 RADF−26 RPI−30 T64707 RADF−27 RPI−31 Z20858,AA503766,H5130
8,H03365 RADF−32 RPI−33 T40090,T40068 RADF−33 RPI−34 T40090,T40068 RADF−35 RPI−36 Z21022,Z19947 RADF−36 RPI−37 Z20858,AA503766,H5130
8,H03365 RPI−10、RPI−17、およびRPI−20のそれぞれに関しては、以
下のような変質した一連のプローブが提供される。 (a) RPI−10に対するプローブ 【0217】 【化4】 【0218】 (b) RPI−17に対するプローブ 【0219】 【化5】 【0220】 (c) RPI−20に対するプローブ 【0221】 【化6】 【0222】 RPIまたはその断片をコード化する挿入DNAを有するライブラリーのクロ
ーンは、1またはそれ以上の変性オリゴヌクレオチドプローブ(またはそれらの
相補体)にハイブリダイゼーションする。そのようなオリゴヌクレオチドプロー
ブのゲノミックライブラリーへのハイブリダイゼーションは、技術的に公知の方
法を用いて実施される。例えば、上述した一連の変性したオリゴヌクレオチドプ
ローブもしくはそれらの相補体と(または、そのような一連のものもしくは相補
体の1つと)のハイブリダイゼーションは、前記高度に緊縮した条件、または適
度に緊縮した条件下において実施される。または、55℃の2X SSC、1.
0%SDS中で実施し、同条件で洗浄する。さらに他の観点においては、RPI
もしくはRPI誘導ポリペプチドの一部または全体をコード化するヌクレオチド
配列のクローンを、発現ライブラリーのスクリーニングによって得ることもでき
る。例えば、ベクターが導入されるホストセルによってベクター内に挿入された
配列が発現しうるように、関連するソースからのDNAが分離され、ランダム断
片が調製され、発現ベクター中(例えば、バクテリオファージ、プラスミド、フ
ァージミド、またはコスミド)にライゲーションされる。種々のスクリーニング
分析がその後、発現したRPIまたはRPI誘導ポリペプチドに対する選択のた
めに使用されうる。ある実施形態においては、本発明の種々のアンチRPI抗体
は、技術的に公知の方法を用いて、所望のクローンを同定するために使用されう
る。例えば、HarlowおよびLane,1988,Antibodies
A Laboratory Manual,Cold Spring Harb
or Laboratory Press,Cold Spring Harb
or,NY,Appendix IV参照。ライブラリーからのクローンまたは
プラークは、結合するそれらのクローンを同定するために抗体と接触するように
される。ある実施形態においては、RPIもしくはRPI誘導ポリペプチドをコ
ード化するDNAを含んでなるクローンまたはプラークは、ここに参照として組
み込まれるOlsvickら,29th ICAAC,Houston,Tex
.1989に従い、DYNAビーズを用いて検出することができる。アンチRP
I抗体はトシル化されたDYNAビーズM280に架橋され、その後、これらの
抗体を含むビーズは、RPIもしくはRPI誘導ポリペプチドを発現するクロー
ンまたはプラークに吸着するために使用される。RPIもしくはRPI誘導ポリ
ペプチドを発現するクローンまたはプラークは、ビーズに結合するこれらのいず
れかとして同定される。かわりに、アンチRPI抗体は、シリカやCelite
(登録商標)樹脂のような好適な単体に非特異的に固定されうる。その後、この
物質は、前節に記載したように、RPIタンパクまたはRPI誘導ポリペプチド
を発現する細菌性コロニーに吸着するために使用される。他の観点においては、
PCR増幅が、ゲノミックDNAからのRPIの一部または全体をコード化する
十分に純粋なDNAを製造するために使用されうる。公知のRPI配列に対応す
るオリゴヌクレオチドプライマー、変質物、その他のものは、プライマーとして
使用されうる。例えばPerkin−Elmer Cetus thermal
cycler and Taq polymerase(Gene Amp(
登録商標))によって、PCRは実施されうる。PCR反応において使用するた
めに、数種の異なる変性プライマーを合成することを選択することができる。変
質プライマーとDNA中の対応する配列とのヌクレオチド配列類似性の度合いを
向上または減少させるために、PCR反応のプライミングの際に用いられるハイ
ブリダイゼーション条件の緊縮度を変化させることも可能である。RPIをコー
ド化する配列のセグメントの連続した増幅後、セグメントは分子的にクローニン
グ、および配列され、完全なゲノミッククローンを分離するためプローブとして
利用される。前記文献に記載したように、これにより、遺伝子の完全なヌクレオ
チド配列、その発現の分析、および機能的な分析のためのそのタンパク生成物の
製造が順番に可能となる。RPI遺伝子はインビトロ翻訳を伴う核酸ハイブリダ
イゼーションによるmRNA選択によっても同定することができる。この手法に
おいては、断片はハイブリダイゼーションによる相補性mRNAを分離するため
に使用される。そのようなDNA断片は、入手可能な他の種(例えば、マウス、
ヒト)の精製RPI DNAを再現することができる。分離されたmRNAの分
離生成物のインビトロ翻訳生成物の免疫沈降分析または機能分析(例えば、イン
ビトロでの凝集能力、レセプターへの結合)によりmRNAが同定され、したが
って所望の配列を含む相補性DNA断片が同定される。さらに、RPIに対して
特異的な固定された抗体への、細胞から分離されたポリソームの吸着によって特
異的mRNAを選択することができる。放射線標識されたRPI cDNAは、
テンプレートとして選択された(吸着ポリソームからの)mRNAを用いて合成
することができる。放射線標識されたmRNAまたはcDNAは、その後、他の
ゲノミックDNA断片中からRPI DNA断片を同定するためにプローブとし
て使用することができる。分離されたRPIゲノミックDNAの代用としては、
公知の配列からの遺伝子配列そのものの化学合成、またはRPIをコード化する
mRNAに対するcDNAの調製が含まれるがこられに限定されるものではない
。例えば、RPI遺伝子cDNAクローニングのためのRNAは、RPIを発現
する細胞から分離することができる。他の方法も可能であり、本発明の範囲に含
まれるものである。 【0223】 いずれの真核生物細胞も、潜在的にRPI遺伝子の分子クローニングのための
核酸ソースとして作用しうる。RPIをコード化する核酸配列は、霊長類ソース
、昆虫、植物などに加えて、脊椎動物、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ
、ウマ、イヌ、から分離することができる。DNAは、化学合成によって、cD
NAクローニングによって、またはゲノミックDNAもしくはその断片のクロー
ニングによってクローンDNA(例えば、DNAライブラリ)から技術的に一般
的な公知の手法によって得ることができ、所望の細胞から精製される(例えば、
Sambrookら,1989,Molecular Cloning,A L
aboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring
Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor,ニューヨーク;Glover,D.M.(ed.),1985,
DNA Cloning A Practical Approach,MRL
Press,Ltd.,Oxford,イギリス国Vol.I,II.参照)
ゲノミックDNAから誘導されたクローンは、コード化領域に加えて調節および
イントロン領域を含んでいてもよく、cDNAから誘導されたクローンはエクソ
ン配列のみを含むものである。ソースが何であれ、RPI遺伝子は、調製のため
に好適なベクター内に分子的にクローンされるべきである。同定され分離された
遺伝子またはcDNAは、その後、好適なクローニングベクター内に挿入されう
る。技術的に公知の多数のベクター−ホスト系を使用することが可能である。可
能なベクターとしては、プラスミド、変性ウイルスが含まれるがこれらに限られ
るものではない。しかし、ベクター系は使用されるホスト細胞に適合するもので
なければならない。そのようなベクターとしては、ラムダ誘導体のようなバクテ
リオファージ、PBR322もしくはpUCプラスミド誘導体またはBlues
criptベクター(Stratagene)のようなプラスミドが含まれるが
これらに限られるものではない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相
補的な相補末端を有するクローニングベクターへのDNA断片のライゲーション
によって実施することができる。しかし、もしDNAを断片化するために用いら
れる相補的な制限サイトがクローニングベクターには存在しなければ、DNA分
子の末端を酵素的に変性することができる。かわりに,所望のいかなるサイトを
DNA末端へのヌクレオチド配列(リンカー)のライゲーションによって作製す
ることもでき、これらのライゲーションされるリンカーは、制限エンドヌクレア
ーゼ認識配列をコード化する化学合成された特異的なオリゴヌクレオチドを含ん
でいてもよい。代用方法においては、開裂したベクターおよびRPI遺伝子は、
ホモポリマー性テーリングによって変性されてもよい。遺伝子配列の多数のコピ
ーを生成するために、組換え分子を形質転換、形質移入、感染、エレクトロポレ
ーションなどによってホスト細胞中に導入することができる。特殊な実施形態に
おいては、分離されたRPI遺伝子、cDNA、または合成DNA分子を組み込
んだ組換えDNA分子でのホスト細胞の形質転換により、遺伝子の多様なコピー
の製造が可能になる。このように、遺伝子は形質転換物を成長させ、形質転換物
から組換えDNA分子を分離し、必要とあれば分離組換えDNAから挿入された
遺伝子を検索することによって大量に得ることができる。本発明によって提供さ
れるRPI配列は、天然RPIにおいて確認されるものとほぼ同一であるアミノ
酸配列をコード化するヌクレオチド配列、および機能的に同等なアミノ酸を有す
るアミノ酸配列をコード化した配列、それに、他のターゲット誘導体およびその
類似体をコード化する配列を含むがこれらに限られるものではない。 【0224】 RPIをコード化するDANの発現 RPIもしくは機能的に活性な類似体もしくはその断片または誘導体をコード
化するヌクレオチド配列は、好適な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパ
ク質コード化配列の転写および翻訳のために必要な要素を含むベクター、中に挿
入することができる。必要な転写のおよび翻訳のシグナルは、天然RPI遺伝子
またはその側面領域によって供給することができる。種々のホスト−ベクター系
を、タンパク質コード化配列を発現させるために利用することができる。これら
としては、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)に感
染した哺乳類細胞株、ウイルス(バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞株、イ
ーストベクターを含むイーストにような微生物、またはバクテリオファージ、D
NA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換されたバクテリア
が含まれるがこれらに限定されるものではない。ベクターの発現要素は、強度お
よび特異性において異なる。利用されるホスト−ベクター系によって、いくつか
の好適な転写および翻訳要素の一つが使用されうる。特殊な実施形態においては
、ヒトRPI遺伝子、またはヒトRPIの機能的に活性な部分をコード化する配
列が発現される。さらに他の実施形態においては、RPIのドメインを含んでな
るターゲットの断片が発現される。 【0225】 好適な転写および翻訳制御シグナル並びにタンパク質コード化配列からなるキ
メラ遺伝子を含んでなる発現ベクターを構築するために、ベクター内へのDNA
断片の挿入に関して以前に記載されたいかなる方法を用いることもできる。これ
らの方法はインビトロ組換えDNAおよび合成方法並びにインビボ組換え体(遺
伝学的組換え)を含む。RPIおよびペプチド断片をコード化する核酸配列の発
現は、第2核酸配列によって調節され、組換えDNA分子で形質転換されたホス
トにおいてRPIまたはペプチドが発現する。例えば、RPIの発現は、技術的
に公知のいかなるプロモーターまたはエンハンサー要素によっても制御すること
ができる。RPI遺伝子発現を制御するために用いられるプロモーターとしては
、SV40早期プロモーター領域(BernoistおよびChambon,1
981,Nature290304−310)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末
端反復に含まれるプロモーター(Yamamotoら,1980,Cell22 787−797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら,
1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA781441−14
45)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982
,Nature29639−42)、β−ラクタマーゼプロモーターのような原
核細胞発現ベクター(Villa−Kamaroffら,1978,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA753727−3731)、またはtac
プロモーター(DeBoerら,1983,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA8021−25)が含まれるがこれらに限られるものではない。S
cientific American,1980,24274−94記載の組
換えバクテリアから得られた有用なタンパク;ノパリンシンセターゼプロモータ
ー領域(Herrera−Estrellaら,Nature303209−2
13)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Ga
rdnerら,1981,Nucl.Acids Res.92871)および
光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター(Her
rera−Estrellaら,1984,Nature310115−120
)からなる植物発現ベクター;Gal4プロモーター、ADC(alcohol
dehydrogenase)プロモーター、PGK(phosphogly
cerol kinase)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモータ
ー、および組織特異性を示し、膵腺房細胞において活性なトランスジェニック動
物エラスターゼI遺伝子制御領域において活用される以下の動物転写制御領域、
のようなイーストもしくは他の菌類から得たプロモーター要素(Swiftら,
1984,Cell38639−646;Ornitzら,1986,Cold
Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399
−409;MacDonald,1987,Hepatology7425−5
15);膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan
,1985,Nature315115−122)、リンパ球において活性なイ
ムノグロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら,1984,Cell 38 647−658;Adamesら, 1985,Nature318533
−538;Alexanderら,1987,Mol.Cell.Biol.7 1436−1444)、精巣、胸部、リンパ球、および肥満細胞において活性な
マウス***腫瘍ウイルス制御領域(Lederら,1986,Cell4548
5−495)、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert
ら,1987,Genes and Devel.1268−276)、肝臓に
おいて活性なアルファフェトタンパク遺伝子制御領域(Krumlaufら,1
985,Mol.Cell.Biol.51639−1648;Hammerら
,1987,Science23553−58);肝臓において活性なアルファ
1−アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら,1987,Genes
and Devel.1161−171)、脊髄細胞において活性なベータグ
ロビン遺伝子領域(Mogramら,1985,Nature315338−3
40;Kolliasら,1986,Cell4689−94);脳の乏突起膠
細胞において活性なミエリン塩基性タンパク遺伝子制御領域(Readhead
ら,1987,Cell48703−712);骨格筋において活性なミオシン
軽鎖−2遺伝子制御領域(Sani,1985,Nature314283−2
86)、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制
御領域(Masonら,1986,Science2341372−1378)
も参照される。特殊な実施形態においては、操作可能なようにRPIコード化核
酸に結合したプロモーター、1またはそれ以上の複写源、および、場合によって
は1またはそれ以上の選択可能なマーカー(例えば、抗生物質抵抗性の遺伝子)
からなるベクターが使用される。特殊な実施形態においては、発現構成は、3つ
のpGEXベクター(グルタチオンS−トランスフェラーゼ発現ベクター;Sm
ithおよびJohnson,1988,Gene731−40)それぞれのE
coRI制限サイトに、RPIをコードする配列をサブクローニングすることに
よって成される。これにより、正しいリーディングフレームにおいてサブクロー
ンからのRPI生成物の発現が可能になる。RPI遺伝子挿入を含んでなる発現
ベクターは3つの一般的なアプローチ、(a)核酸ハイブリダイゼーション、(
b)マーカー遺伝子機能の存在または欠如、および(c)挿入された配列の発現
、によって同定されうる。第一のアプローチにおいては、発現ベクターに挿入さ
れたRPI遺伝子の存在は、挿入されたRPI遺伝子にホモローグである配列を
含んでなるプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出すること
ができる。第2のアプローチにおいては、組換えベクター/ホスト系は、ベクタ
ー中のRPI遺伝子の挿入によって引き起こされる、あるマーカー遺伝子機能(
例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質抵抗性、形質転換フェノタイプ、バキ
ュロウイルスにおけるオクルージョン体形成など)の存在または欠如に基づいて
同定され、選択される。例えば、もしRPI遺伝子がベクターのマーカー遺伝子
配列内に挿入されれば、RPI遺伝子挿入を含んでなる組換え体はマーカー遺伝
子機能の欠如によって同定することができる。第3のアプローチにおいては、組
換え発現ベクターは組換え体によって発現されるRPI遺伝子生成物を分析する
ことによって同定することができる。そのような分析は、例えば、インビトロ分
析システムにおけるRPIの物理的または機能的な特性、例えば、アンチRPI
抗体との結合に基づくものでありうる。特定の組換えDNA分子が同定および分
離されると、技術的に公知の数種の方法がそれを増殖させるために用いられうる
。好適なホストシステムおよび成長条件が設定されると、組換え発現ベクターは
増殖され、大量に調製される。前記説明したように、使用されうる発現ベクター
としては、いくつかの例を挙げると、以下のベクターおよびその誘導体、ワクシ
ニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス;バキュロ
ウイルスのような昆虫ウイルス;イーストベクター;バクテリオファージベクタ
ー(例えば、ラムダ)、並びにプラスミドおよびコスミドDNAベクター、が含
まれるがこられに限られるものではない。加えて、挿入された配列の発現を調節
する、または所望の特殊な方法で遺伝子生成物を変性し加工するホスト細胞株を
選択することができる。あるプロモーターからの発現は、ある誘導物質の存在下
において上昇させることができる。このように遺伝子工学的に加工されたRPI
の発現を制御しうる。さらに、異なるホスト細胞は、翻訳中のおよび翻訳後の加
工および変性(例えば、タンパクの糖付加、リン酸エステル化)に関する固有で
特異的なメカニズムを有する。発現された外来タンパクに所望の変性および加工
を確保するために、好適な細胞株またはホストシステムを選択することができる
。例えば、糖付加されていないコアタンパク生成物を製造するために、細菌性シ
ステムにおける発現を用いることができる。イーストにおける発現により糖付加
生成物が製造される。哺乳類細胞における発現は、ヘテロローグタンパクの天然
糖付加を確実にするために使用されうる。さらに、ベクター/ホスト発現系が異
なると、加工反応への影響も異なるものとなりうる。組換えタンパクの長期間、
高収率生成のためには安定した発現が好ましい。例えば、差別的に発現されたま
たは経路遺伝子タンパクを安定的に発現する細胞株が設計されてもよい。複写の
ウイルス起源を含む発現ベクターを使用するよりも、好適な発現制御要素(例え
ば、プロモーター、エンハンサー、シーケンサー、転写ターミネーター、ポリア
デニレーションサイトなど)および選択可能なマーカーによって制御されたDN
Aで、ホスト細胞を形質転換する方が好ましい。外来DNAの導入に続いて、設
計された細胞を1〜2日間強化培地において成長させ、その後選択性の培地に切
り替えることができる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に抵抗
力を与え、細胞が安定的にプラスミドをクロモソームと結合させ、成長して、順
にクローニングされ細胞株内に展開されるフォーカスを形成することを可能にす
る。この方法は、差別的に発現されたまたは経路遺伝子タンパクを発現する細胞
株を設計するために好適に使用されうる。そのような設計された細胞株は、差別
的に発現されたまたは経路遺伝子タンパクの内因性活性に影響を及ぼす化合物の
スクリーニングおよび評価において特に有用でありうる。多数の選択システムを
使用することができ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら
,1977,Cell11223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ(Szybalska&Szybalski,1962,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA482026)、およびアデニンフ
ォスフォリボシールトランスフェラーゼ(Lowyら,1980,Cell22 817)遺伝子が、それぞれtk-,hgprt-またはaprt-細胞において 採用されうるがこれらに限られるものではない。また、アンチメタボライト耐性
が、耐性をメトトレキセートに付与するdhfr(Wiglerら,1980,
Natl.Acad.Sci.USA773567;O´Hareら,198 1,Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527)、マイコフ
ェノル酸に耐性を付与するgpt(Mulligan&Berg,1981,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA782072)、アミノグリコシ
ドG−418に耐性を付与するneo(Colberre−Garapinら,
1981,J.Mol.Biol.1501)、ヒグロマイシンに耐性を付与す
るhygro(Santerreら,1984,Gene30147)遺伝子に
対する選別の基礎として用いられうる。他の特殊な実施形態においては、RPI
、断片、類似体、および誘導体が、((異なるタンパクの)ヘテロローグタンパ
ク配列に結合したペプチドを解して結合したタンパク、断片、類似体、または誘
導体からなる)融合体またはキメラタンパク生成物として発現されうる。そのよ
うなキメラ生成物は、所望のアミノ酸配列をコード化する好適な核酸配列を、技
術的に公知の方法を用いて適切なコーディングフレームにおいて互いにライゲー
ションし、技術的に一般的に知られた方法によってキメラ生成物を発現すること
によって成される。かわりに、そのようなキメラ生成物はタンパク合成技術によ
って、例えば、ペプチド合成機の使用によって成すこともできる。cDNAおよ
びゲノミック配列の双方がクローニングされ、発現しうる。 【0226】 RPIの治療上の使用 本発明は治療上の化合物の投与による種々の疾病および疾患の治療並びに予防
を提供する。そのような化合物としては、RPIおよび類似体並びに(断片を含
む)それらの誘導体(例えば、ここに記載したようなもの);その抗体(ここに
記載);RPI、類似体、または誘導体(ここに記載)をコード化する核酸;R
PI遺伝子アンチセンス核酸並びにRPI遺伝子作動薬および拮抗剤が含まれる
がこれらに限られるものではない。ここに記載されたように、本発明の重要な特
性は、リウマチ様関節炎に含まれるRPI遺伝子の同定である。関節炎は、RA
患者の血清に対して関節液において減少するRPIの機能もしくは発現を促進す
る、治療上の化合物を投与することによって治療または予防されうる。関節炎は
、RA患者の血清に対して関節液において増加するRPIの機能または発現を低
下させる治療上の化合物の投与によっても治療または予防されうる。一般的に、
種の起源または(抗体の場合には)種の反応性が患者の化合物と同じ種である化
合物を投与することが好ましい。このように、好ましい実施形態においては、治
療または予防のために、ヒトRPI、誘導体、もしくは類似体、もしくは核酸、
またはヒトRPIに対する抗体がヒト患者に投与される。 【0227】 リウマチ様関節炎の治療および予防 リウマチ様関節炎は、RAを有する被験者の血清に対して関節液において減少
する1もしくはそれ以上のRPIのレベルもしくは機能、または1もしくはそれ
以上のRADFのレベルを促進する(すなわち、増加または供給する)化合物の
投与によって、治療または予防される。そのような化合物の例としては、機能的
に活性で、特にインビトロ分析または動物モデルにおいて活性であることが証明
されるRPI、誘導体、または断片、並びにRPIもしくは機能的に活性な誘導
体またはその断片(例えば、遺伝子治療においての使用のため)をコード化する
核酸が含まれるがこれに限られるものではない。使用されうる他の化合物、例え
ばRPI作動薬は、インビボ分析を用いて同定されうる。リウマチ様関節炎は、
RAを有する被験者の血清に対して関節液において増加量を示す1もしくはそれ
以上のEPIのレベルもしくは機能、または1もしくはそれ以上のRADFのレ
ベルを阻害する(すなわち減少する)化合物の投与によっても治療されまたは予
防される。そのような化合物の例としては、RPIアンチセンスオリゴヌクレオ
チド、リボザイム、またはRPIに対して検出される抗体が含まれるがこれらに
限られるものではない。使用されうる他の化合物、例えば、RPI拮抗薬は、イ
ンビトロ分析を用いて同定できる。特殊な実施形態において、1もしくはそれ以
上のRPIのレベルもしくは機能、または1もしくはそれ以上のRADFのレベ
ルを促進する化合物は、治療的に(RPIレベルもしくは機能、またはRADF
レベルの欠如や減少(通常のまたは好ましいものと比較して)が、RA患者の血
清と比較してRA患者の関節液において同定されたときは予防的にも)投与され
る。他の実施形態においては、RPIのレベルもしくは機能、またはRADFの
レベルを阻害する化合物が治療的に(RPIレベルもしくは機能、またはRAD
Fレベルの増加(通常のまたは好ましいものと比較して)が、RA患者の血清と
比較してRA患者の関節液において同定されたときは予防的に)投与される。そ
のような化合物の投与によるRPI機能もしくはレベルまたはRADFレベルの
変化は、例えば、患者の組織サンプルを得て(例えば、生検で)、インビトロに
おいてRNAもしくはタンパクレベルまたは表現されたRPI RNAもしくは
タンパクの活性を分析することによって容易に同定することができる。「好まし
い技術」も、化合物投与の前後においてRPIまたはRADFのレベルを検出す
るために使用されうる。技術的に一般的な多種の方法がこのように用いられ、キ
ナーゼ分析、RPIを検出および/または視覚化するためのイムノアッセイ(例
えば、ウェスタン法、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
を伴う免疫沈降、免疫細胞化学など)、および/またはRPIをコード化するm
RNAをそれぞれ検出および/または視覚化することによってRPI表現を検出
するためのハイブリダイゼーション分析(例えば、ノーザン法、ドットブロット
、インサイチュハイブリダイゼーション、など)、などが含まれるがこれらに限
られるものではない。本発明の化合物としては、例えば、その化合物が非ステロ
イドの炎症剤(NSAID)(例えば、プレドニゾン、イブプロフェン、フェノ
プロフェン、ケトプロフェン、フルルブプロフェン、インドメタシン、スリンダ
ク、アスピリン、サリチルサリチル酸、ジフルニサル、ナプロキセン、ピロキシ
カム、テノキシカム、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン)ではない条件
の下で、RA RPIまたはRADFプロフィールを通常にまで回復させる小さ
な有機分子、タンパク、ペプチド、抗体、核酸など、金塩、D−ペニシラミン、
ヒドロキシクロロキン、またはサルファサルアジンのような抗マラリア薬、アザ
チオプリン、シクロホスファミド、クロランブシル、メトトレキセート、コルチ
コステロイド、アンチ−CD4モノクローナル抗体、並びにアンチ−CDw52
抗体が含まれるがこれらのいずれいも限られるものではない。 【0228】 遺伝子治療 特殊な実施形態において、RPIまたはそれらの機能的な誘導体をコード化し
た配列を含む核酸は、RPI機能を促進するために遺伝子治療の手法によって投
与される。遺伝子治療は、発現された、または、発現可能な核酸物質を投与する
ことによって行われる治療のことである。本発明のこの実施形態において、該核
酸は、RPI機能を促進することによって治療的効果を仲介する、コードされた
タンパク質を生産する。当業界で使用され得る遺伝子治療の任意の方法が、本発
明に従って使用され得る。模範的な方法を以下に記載する。遺伝子治療方法の一
般的な報告として、Goldspiel等, 1993, Clinical Pharmacy 12488-505; Wuお よびWu, 1991, Biotherapy 387-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol . 32573-596;Mulligan, 1993, Science 260926-932;ならびに、Morga
nおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62191-217; May, 1993, TIBTEC
H 11(5)155-215)が参照される。当業界で周知の使用される組換えDNA技術の 方法は、Ausubel等,(eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, NY;および Kriegler, 1990, Gene Transfer and Express
ion, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYで説明されている。好ましい観
点において、その化合物は、RPIをコード化した核酸、好ましい宿主中でRP
Iまたはそれらの断片もしくはキメラタンパク質を発現する発現ベクターの部分
である前記核酸を含む。特に、このような核酸は、RPIコード領域に操作可能
に(operably)結合したプロモーター、誘導性または構成性および任意に組織特
異的な前記プロモーターを有している。他の特別な実施形態において、核酸分子
が用いられ、その際、RPIコード配列および他の任意の望ましい配列が、ゲノ
ム中の望ましい部位における相同性組換えを促進するような領域の側に配置され
、このようにしてRPI核酸の染色体内発現に供給される(KollerおよびSmithi
es, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 868932-8935; Zijlstra等, 1989, Nat
ure 342435-438)。核酸の患者への運搬が、直接的であれば、患者は直接的に該
核酸または核酸を含むベクターにさらされ、または、間接的であれば、細胞は最
初にインビトロで核酸により形質転換され、次に患者中に移植される。これら二
つのアプローチが、それぞれインビボまたはインビトロの遺伝子治療として知ら
れている。特別な実施形態において、該核酸は直接的にインビボで投与され、発
現され、コード化した生産物を生産する。このような核酸は任意の当業界で周知
の膨大な方法によって行われ、例えばそれを適切な核酸発現ベクターの一部とし
て構築し、細胞内に導入するためにそれを投与する、例えば欠損もしくは弱毒化
レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染(例えば、米国特許第
4,980,286号)、もしくは、裸のDNAの直接注射、もしくは、マイク
ロバーティクル照射(microparticle bombardment)(例えば、a gene gun; Bio
listic, Dupont)、もしくは、脂質または細胞表面受容体またはトランスフェク
ション因子(transfecting agents)、リポゾーム、マイクロパーティクル(mic
roparticles)もしくはマイクロカプセル(microcapsules)によるカプセル封入
によるコーティング、または、核に入ることが知られているペプチドへの結合に
おける投与、受容体仲介エンドサイトーシスを受けるリガンドへの結合における
投与(例えばWuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 2624429-4432)(これらは特 異的に受容体を発現するターゲット細胞に対して使用される)等によって行われ
る。他の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され、該リガンドは紡
錘状(fusogenic)のウイルスペプチドを含み、これによりエンドゾームを破砕 させ、核酸がリソソーム性分解を受けないようにする。さらに他の実施形態にお
いて、該核酸はインビボで、特異的な受容体をターゲットにすることによって細
胞の特異的な取り込みおよび発現に関してターゲットにされる(例えば1992
年4月15日のPCT出願WO92/06180(Wu等);1992年12月2 3日のWO92/22635(Wilson等);1992年11月26日のWO92
/20316(Findeis等);1993年7月22日のWO93/14188(C
larke等),1993年10月14日のWO93/20221(Young)を参照) 。あるいは、該核酸は、細胞内に導入され、宿主細胞の発現のためのDNAと相
同組換えによって結合する(KollerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 868932-8935; Zijlstra等, 1989, Nature 342435-438)。他の実施形
態において、RPIをコードする核酸を含むウイルスベクターが使用される(Mi
ller等, 1993, Meth. Enzymol. 217581-599)。これらのレトロウイルスは、ウ イルスゲノムのパッケージングや宿主細胞DNAへの統合に必要ないレトロウイ
ルス配列を削除することによって改変されてある。遺伝子治療で使用されるRP
Iをコード化した核酸はベクターにクローニングされ、これは患者への遺伝子運
搬を促進する。レトロウイルスベクターに関するより詳細なことは、Boesen等,
1994, Biotherapy 6291-302で見出され、これはmdr1遺伝子を造血幹細胞に 運搬して該幹細胞を化学療法に対して体制を持たせるために、レトロウイルスベ
クターを使用することが説明されている。遺伝子治療におけるレトロウイルスの
使用を説明した他の参考文献として、Clowes等, 1994, J. Clin. Invest. 93644
-651; Kiem等, 1994, Blood 831467-1473;Salmons and Gunzberg, 1993, Huma
n Gene Therapy 4129-141; and GrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. in
Genetics and Devel. 3110-114が挙げられる。アデノウイルスは、呼吸肺細胞 に遺伝子を運搬するための特に有効なベヒクル(vehicles)である。一般的に、
アデノウイルスは呼吸肺細胞に感染し、軽い病気を引き起こす。アデノウイルス
−ベースの運搬システムに関する他のターゲットは、肝臓、中枢神経系、内皮細
胞および筋肉である。アデノウイルスは非***細胞に感染することができる利点
を持つ。KozarskyおよびWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Deve
lopment 3499-503において、アデノウイルス−ベースの遺伝子治療の報告がなさ
れている。Bout等, 1994, Human Gene Therapy 53-10において、アカゲザルの呼
吸肺細胞へ遺伝子を輸送するためにアデノウイルスを使用することが示されてい
る。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例として、 Rosenfeld等,
1991, Science 252431-434; Rosenfeld等, 1992, Cell 68143-155; Mastrange
li等, 1993, J. Clin. Invest. 91225-234; PCT公報WO94/12649;およびWan
g等, 1995, Gene Therapy 2775-783等が見出されている。アデノ関連ウイルス(
AAV)はまた、遺伝子治療における使用が提案されている(Walsh等, 1993, P
roc. Soc. Exp. Biol. Med. 204289-300; U.S. Patent No. 5,436,146)。遺伝
子治療に関する他のアプローチは、例えばエレクトロポレーション(electropor
ation)、リポフェクション(lipofection)、リン酸カルシウム仲介トランスフ
ェクション(calcium phosphate mediated transfection)またはウイルス感染 の方法によって組織培養中に細胞に遺伝子をトランスファーさせることを含む。
通常、トランスファー方法は、選択可能なマーカーを細胞にトランスファーする
ことを含む。該細胞は次に選択され、トランスファーされた遺伝子を取り込み発
現している細胞を分離する。これらの細胞は次に患者に適用される。この実施形
態において、生じた組換え細胞をインビボで投与する前に、この核酸が細胞に導
入される。このような導入は、これらに限定されないが、例えばトランスフェク
ション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含む
ウイルスまたはバクテリオファージベクターの注入、マイクロセル仲介遺伝子ト
ランスファー(microcell-mediated gene transfer)、スフェロプラスト融合(
spheroplast fusion)等の当業界で周知の任意の方法によって行われる。外来遺
伝子を細胞に導入する膨大な技術が当業界で周知であり(例えばLoefflerおよび
Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217599-618; Cohenおよび, 1993, Meth. Enzymol
. 217618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 296992を参照)、本発明により 使用され、受容細胞の必要な開発的、物理的機能が失われない。該技術は、細胞
への核酸の安定したトランスファーを提供し、そのために該核酸は該細胞によっ
て発現可能であり、好ましくは遺伝的であり、その細胞の後代によって発現可能
である。生じた組換え細胞は、当業界で周知のさまざまな方法によって患者に輸
送される。好ましい実施形態において、上皮細胞が、例えば皮下注射によって注
入される。他の実施形態において、組換え皮膚細胞は患者への皮膚移植として適
用できる。組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞、前駆細胞)は、好ましくは静
脈注射によって投与される。使用を考えた細胞の量は、望ましい効果、患者の状
態等に依存しており、当業者によって決定される。遺伝子治療の目的で核酸が導
入された細胞は、任意の望ましい、使用可能な細胞型を含み、これらに限定され
ないが、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞;例え
ばTリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、
顆粒球等の血液細胞;さまざまな幹細胞または前駆細胞、特に造血肝または前駆
細胞、例えば骨髄、臍帯血(umbilical cord blood)、末梢血液、胎児肝等であ
る。好ましい実施形態において、遺伝子治療に用いられる細胞は、患者に対して
事故由来である。組換え細胞が遺伝子治療において使用される実施形態において
、RPIをコード化した核酸は細胞に導入され、該細胞またはそれらの前駆対に
よって発現され、組換え細胞は次に治療効果のためにインビボで投与される。特
殊な実施形態において、肝細胞または前駆細胞が使用される。分離されインビト
ロで維持されうる任意の肝細胞および/または前駆細胞は、本発明のこの実施形
態に従って潜在的に使用され得る(例えば、1994年4月28日のPCT公開
番号WO94/08598号; Stemple and Anderson, 1992, Cell 71973-985; Rheinw
ald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A229;ならびにPittelkowおよびScott, 1986, M
ayo Clinic Proc. 61771を参照)。特異的な実施形態において、遺伝子治療の目
的のために導入された核酸は、例えば核酸の発現が、適切な転写のインデューサ
ーの存在または非存在を制御することによって制御されるような、コード化した
領域に手術的に結合できる誘導性プロモーター(inducible promoter)を含む。 【0229】 RPIアンチセンス核酸 RPIアンチセンス核酸は、少なくとも6ヌクレオチドを有し、好ましくはオ
リゴヌクレオチド(6〜約50オリゴヌクレオチド)である。特定の形態におい
ては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌ
クレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、または少なくとも200ヌクレオ
チドである。オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNAまたはキメラ混合物ま
たは誘導体またはこれらの修飾形態であってもよく、1本鎖であってもまたは2
本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、塩基部分で、糖部分で、またはホ
スフェート主鎖(phosphate backbone)で修飾されてもよい。 【0230】 オリゴヌクレオチドとしては、ペプチド等の他の付随する基(appending group
)、または細胞膜での輸送を容易にする物質(例えば、Letsinger 等., 1989, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553-6556; Lemaitre 等., 1987, Proc. Natl.
Acad. Sci. 84, 648-652; 1988年12月15日に公開された、PCT公報
番号WO 88/09810号を参照)または血液脳関門(例えば、1988年
4月25日に公開された、PCT公報番号WO 89/10134号を参照)、
ハイブリダイゼーションを開始させる切断物質(hybridization-triggered cleav
age agent)(例えば、Krol 等., 1988, BioTechniques 6, 958-976を参照)また
はインターカレーション物質(intercalating agent)(例えば、 Zon, 1988, Pha
rm. Res. 5, 539-549を参照)が挙げられる。 【0231】 本発明の好ましい形態において、RPIアンチセンスオリゴヌクレオチドが、
好ましくは1本鎖のDNAで提供される。オリゴヌクレオチドは、当該分野にお
いて通常既知である置換基でその構造物のいずれかの位置で修飾されてもよい。
RPIアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下に制限されないが、5−フルオ
ロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロ
キシメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン
、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガ
ラクトシルクエオシン(betaD-galactosylqueosine)、イノシン、N6−イソペン
テニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチル
グアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5
−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメ
チルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノ
シルクエオシン(beta-D-mannosylqueosine)、5’−メトキシカルボキシメチル ウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデ
ニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(V)、ウイブトキソシン(wybutoxosine)、シ
ュードウラシル(pseudouracil)、クエオシン(queosine)、2−チオシトシン、5
−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチ
ルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ
酢酸(V)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−
カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、及び2,6−ジアミノプリン
を含む群より選ばれる少なくとも一の修飾塩基部分を有していてもよい。 【0232】 他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一の修飾される糖
部分、例えば、アラビノース、2−フルオロアラビノース、キシルロース、およ
びヘキソースからなる群より選ばれる糖部分からなる。さらなる他の実施形態に
おいては、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート(phosphorothioate)、ホ
スホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホルアミドチオエート(phospho
ramidothioate)、ホスホルアミデート(phosphoramidate)、ホスホルジアミデー ト(phosphordiamidate)、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、 及びこれらのホルムアセタールまたは類似体からなる群より選ばれる少なくとも
一の修飾されるホスフェート主鎖からなる。さらなる他の実施形態においては、
オリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマー
オリゴヌクレオチドは、一般的なβ−単位とは逆に、ストランドが相互に平行に
走る相補的RNAとの特定の2本鎖のハイブリッドを形成する(Gautier 等., 1
987, Nucl. Acids Res. 15, 6625-6641)。 【0233】 オリゴヌクレオチドは、他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショ
ンを開始させる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションを開始させる切断物質
などに共役してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野における既知
の標準的な方法によって、例えば、自動DNA合成器(バイオサーチ(Biosearch
)、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)などから市販されるもの など)の使用によって、合成されてもよい。例としては、ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドはステイン(Stein)らの方法(1988, Nucl. Acids Res. 16, 320
9)によって合成されてもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御さ
れた細孔ガラスポリマー支持体を用いることによって調製できる(Sarin 等., 19
88, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451)。 【0234】 特定の実施形態において、本発明のRPIアンチセンス核酸は、外来の配列か
らの転写によって細胞内で製造される。例えばベクターは、細胞内に吸収される
ようにインビボで導入されてもよく、この細胞内でベクターまたはこの一部が転
写され、本発明のアンチセンス核酸(RNA)が産生される。このようなベクタ
ーは、RPIアンチセンス核酸をコード化する配列を含む。このようなベクター
は、所望のアンチセンスRNAを産生するように転写できる限り、エピソームで
あり続けてもあるいは染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当
該分野における標準的な組換DNA技術方法によって構築できる。ベクターは、
哺乳動物細胞における複製や発現に使用される、プラスミド、ウィルス性、また
は当該分野において既知の他のものであってもよい。RPIアンチセンスRNA
をコード化する配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト、の細胞において作用
することが当該分野において既知であるプロモーターによってできる。このよう
なプロモーターは、誘導性であっても構成性であってもよい。このようなプロモ
ーターとしては、以下に制限されないが、SV40初期プロモーター領域(Berno
ist and Chambon, 1981, Nature 290, 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’の 長い末端繰り返し中に含まれるプロモーター(Yamamoto 等., 1980, Cell 22, 78
7-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner 等., 1981, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 78, 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brins
ter 等., 1982, Nature 296, 39-42)などが挙げられる。 【0235】 本発明のアンチセンスは核酸は、RPI遺伝子、好ましくはヒトのRPI遺伝
子のRNA転写産物の少なくとも一部に相補的な配列を有する。しかしながら、
好ましいものの、完全な相補性は必要ではない。本明細書中で引用される、RN
Aの少なくとも一部分に相補的な配列は、RNAとハイブリッド形成して安定な
デュプレックスを形成できるのに十分な相補性を有する配列を意味する;ゆえに
、2本鎖のRPIアンチセンス核酸の場合では、デュプレックスDNAの1本鎖
を試験してもよい、あるいはトリプレックスの形成を分析してもよい。ハイブリ
ッド形成能は、相補性の度合いやアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。
通常、ハイブリッド形成する核酸が長ければ長いほど、RPIをコード化するR
NAとの塩基のミスマッチ数が多くなるが安定なデュプレックス(または、場合
によってはトリプレックス)を形成する。当業者はハイブリッド形成した複合体
の融点を測定する標準的な方法の使用によってミスマッチの許容できる程度を確
認できる。 【0236】 RPIの治療への使用 アンチセンス核酸 RPIアンチセンス核酸は、有益なRPIをリウマチ様関節炎を患っている患
者の関節液中で過剰に発現させて、リウマチ様関節炎を治療(または予防)する
のに使用できる。好ましい実施形態においては、1本鎖のDNAのアンチセンス
RPIオリゴヌクレオチドを使用する。RPIをコード化するRNAを発現また
は過剰に発現する細胞のタイプは当該分野において既知の様々な方法によって同
定できる。このような細胞のタイプとしては、以下に制限されるものではないが
、白血球(例えば、好中球、マクロファージ、単球)及びレジデント細胞(例え
ば、滑膜細胞)が挙げられる。このような方法としては、以下に制限されるもの
ではないが、RPIに特異的な核酸とのハイブリッド形成(例えば、ノーザンハ
イブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、インサイチュ
(in situ)ハイブリダイゼーション)、ある細胞タイプ由来のRNAのインビト ロでのRPIへの翻訳能を考察する、イムノアッセイなどが挙げられる。好まし
い形態において、患者からの1次組織を、例えば、免疫細胞化学またはin situ ハイブリダイゼーションによって、治療前のRPIの発現について分析できる。 【0237】 製薬上許容できる担体中に有効量のRPIアンチセンス核酸を含む、本発明の
薬剤組成物は、リウマチ様関節炎を有する患者に投与できる。RAの治療に有効
であろうRPIアンチセンス核酸の量は、標準的な臨床テクニックによって決定
されうる。可能である場合には、インビトロで、さらにはヒトに試験及び使用さ
れる前に有用な動物モデルシステムにおいて、治療される腫瘍のタイプのアンチ
センス細胞毒性を測定することが望ましい。特定の実施形態において、RPIア
ンチセンス核酸を含む薬剤組成物は、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプ
セルを介して投与される。本発明の様々な実施形態において、このような組成物
を用いてRPIアンチセンス核酸の一様の放出を達成することは有用である。特
定の実施形態においては、特定の同定可能な腫瘍抗原に対する抗体を介してター
ゲットにされるリポソームを利用することが望ましい(Leonetti 等., 1990, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2448-2451; Renneisen 等., 1990, J. Biol. Ch
em. 265, 16337-16342)。 【0238】 阻害リボザイム及びトリプレックスアプローチ 他の実施形態においては、RAの症状は、RPI遺伝子配列を既知の遺伝子ノ
ックアウト、リボザイムおよび/またはトリプレックス方法を組合わせて使用し
て、RPI遺伝子の発現レベルを減少することによって、RPI遺伝子の発現レ
ベルおよび/またはRPI遺伝子産物の活性を減少することによって、改善され
てもよい。RAの症状を改善する能力を含む、RPI遺伝子の活性、発現または
合成を調節する能力を発揮する化合物の中には、リボザイム及びトリプレックス
分子がある。このような分子は、損なわれていない、または適切である場合には
、変異型ターゲット遺伝子活性のいずれかを減少するまたは阻害するように設計
されてもよい。このような分子の製造及び使用に関する技術は、当業者にはよく
知られている。RPI遺伝子mRNA転写産物を触媒により切断するように設計
されるリボザイム分子を用いて、ターゲット遺伝子mRNAの翻訳及び、ゆえに
RPI遺伝子産物の発現を防止できる。(例えば、1990年10月4日に公開
された、PCT国際公開 WO90/11364号;Sarver 等., 1990, Scienc
e 247, 1222-1225)。 【0239】 リボザイムは、RNAの特異的な切断を触媒できる酵素的RNA分子である。
(書評では、Rossi, 1994, Current Biology 4, 469-471を参照)。リボザイム 作用のメカニズムは、相補的ターゲットRNAへのリボザイム作用分子の配列特
異的なハイブリダイゼーション、さらにはエンドヌクレアーゼによる切断事象(e
ndonucleolytic cleavage event)を含む。リボザイム分子の組成物は、ターゲッ
ト遺伝子mRNAに対して相補的な一以上の配列を含むものでなければならず、
また、mRNA切断に応答性のある既知の触媒配列を含むものでなければならな
い。この配列に関しては、例えば、その全体を参考のために本明細書中に引用さ
れる、米国特許第5,093,246号を参照。部位特異的な認識配列でmRN
Aを切断するリボザイムをRPIをコード化するmRNAを破壊するのに使用で
きるものの、シュモクザメのリボザイム(hammerhead ribozyme)の使用が好まし い。シュモクザメのリボザイムは、ターゲットmRNAと相補的な塩基対を形成
するフランキング領域によって規定される位置でmRNAを切断する。ターゲッ
トmRNAが下記2塩基配列:5’−UG−3’を有することが唯一の必要条件
である。シュモクザメのリボザイムの構築及び製造は、当該分野において既知で
あり、その全体を参考のために本明細書中に引用される、Myers, 1995, Molecul
ar Biology and Biotechnology A Comprehensive Desk Reference, VCH Publish
ers, New York(特に833頁、図4を参照)およびHaseloff and Gerlach, 198
8, Nature, 334, 585-591により詳しき記載される。好ましくは、リボザイムは 、切断認識部位がRPIをコード化するmRNAの5’末端付近に位置する、即
ち、効率を上げかつ非機能性mRNA転写産物の細胞内蓄積を最小限にするよう
に操作される。本発明のリボザイムとしてはまた、テトラヒメナ サーモフィラ
(Tetrahymena thermophila)中に天然に生じ(IVS、またはL−19 IVS RNAとして既知である)、Thomas Cech及び協力者らによって広範に記載さ れたもの(Zaug, 等., 1984, Science, 224, 574-578; Zaug and Cech, 1986,
Science, 231, 470-475; Zaug, 等., 1986, Nature, 324, 429-433; ユニヴァ
ーシティー パテンツ インコーポレイテッド(University Patents Inc.)によ る公開国際特許出願番号WO 88/04300号 ; Been and Cech, 1986, C
ell, 47, 207-216)などのRNAエンドヌクレアーゼ(以降、Cechタイプリ
ボザイム)が挙げられる。 【0240】 Cechタイプリボザイムは、後にターゲットRNAの切断が行われるターゲ
ットRNA配列とハイブリッド形成する8塩基対活性部位を有する。本発明は、
RPIをコード化する遺伝子中に存在する8塩基対活性部位配列をターゲットと
するこれらのCechタイプリボザイムを包含する。アンチセンスアプローチに
おいて、リボザイムは、(例えば、改善された安定性、ターゲッティングなどを
目的として)修飾されたオリゴヌクレオチドから構成されることができ,インビ
ボでRPIを発現する細胞に輸送されなければならない。好ましい輸送方法は、
トランスフェクトされた細胞がRPIをコード化する内因性のmRNAを破壊し
、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するように、強力な構成性p
ol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下でのリボザイムをコード
化するDNA構築物を用いることを含む。リボザイムは、アンチセンス分子と異
なり、触媒性であるので、低細胞内濃度が効率のために必要である。内因性のR
PI発現はまた、ターゲットされた相同的組換を用いてRPI遺伝子またはその
プロモーターを不活性化またはノックアウトすることによって減少できる(例え
ば、Smithies, 等., 1985, Nature 317, 230-234; Thomas and Capecchi, 1987
, Cell 51, 503-512; Thompson 等., 1989, Cell 5, 313-321を参照;これらの
それぞれは、その全体を参考のために本明細書中に引用される)。例えば、内因
性RPI遺伝子(RPIをコード化する遺伝子のコーディング領域または調節領
域のいずれか)に相同するDNAに隣接する変異型の、非機能性RPI遺伝子(
または全く関連のないDNA配列)を、インビボでターゲット遺伝子を発現する
細胞をトランスフェクトするために、選択マーカーおよび/またはネガティブな
選択マーカーと一緒にまたはを用いずに、使用できる。ターゲットされた相同的
組換を介した、DNA構築物の挿入によって、ターゲット遺伝子が不活性化され
る。このようなアプローチは、ES(胚幹)細胞への修飾が不活性ターゲット遺
伝子を有する動物子孫を発生するのに使用できる農業分野に特に適する(例えば
、Thomas and Capecchi, 1987 and Thompson, 1989, 上記を参照)。 【0241】 しかしながら、このアプローチは、組換DNA構築物を適当なウィルスベクタ
ーを用いてインビボで必要な部位に直接投与するまたはターゲットされる場合に
はヒトへの使用に適用されうる。または、内因性のRPI遺伝子の発現は、RP
I遺伝子の調節領域(即ち、RPI遺伝子プロモーターおよび/またはエンハン
サー)に相補性のあるデオキシリボヌクレオチド配列をターゲットとして体内の
ターゲット細胞におけるRPI遺伝子の転写を防止するトリプレックス構造物を
形成することによって抑制されうる。(通常、Helene, 1991, Anticancer Drug
Des., 6(6), 569-584; Helene, 等., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660, 27-3
6; and Maher, 1992, Bioassays 14(12), 807-815を参照)。 【0242】 転写の阻害を目的とするトリプレックス形成に使用される核酸分子は、1本鎖
であり、デオキシヌクレオチドから構成されなければならない。これらのオリゴ
ヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対原則によるトリプレック
ス形成を促進するように設計されなければならず、これは、通常、プリンまたは
ピリミジンのいずれかの相当の大きさのストレッチがデュプレックスの1本鎖に
存在する必要がある。ヌクレオチド配列はピリミジンを基礎としてもよく、これ
により、得られるトリプレックスの3つの会合するストランドにTAT及びGC
C+のトリプレットが生じるであろう。ピリミジンリッチな分子は、1本鎖に平 行な方向にデュプレックスのその1本鎖のプリンリッチな領域に対する塩基の相
補性が提供される。加えて、プリンリッチである、例えば、G残基のストレッチ
を含む、核酸分子が選択されてもよい。これらの分子は、大多数のプリン残基が
、トリプレックスの3ストランドにGGCトリプレットを生じる、ターゲットに
されるデュプレックスの1本鎖上に位置する、GC対リッチなDNAデュプレッ
クスとトリプレックスを形成するであろう。 【0243】 または、3重螺旋の形成のためにターゲットされうる潜在的な配列をいわゆる
スイッチバック核酸分子を作製することによって増やしてもよい。スイッチバッ
ク分子は、デュプレックスの最初の一ストランドと次に他方と塩基対を形成して
、プリンまたはピリミジンのいずれかの相当の大きさがデュプレックスの1スト
ランドに存在する必要性を排除するように、交互の5’−3’、3’−5’様式
で合成される。本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイム、および/また
はトリプレックス分子を利用して変異型遺伝子発現を阻害する場合には、その技
術が、存在する正常なRPI遺伝子産物の濃度が正常な表現型に必要であるより
低い可能性が生じるくらい、非常に効果的に正常なRPI遺伝子アレルによって
産生されるmRNAの転写(トリプレックス)および/または翻訳(アンチセン
ス、リボザイム)を抑制または阻害することが可能である。したがって、このよ
うな場合には、RPI遺伝子活性の実質的に正常なレベルを確実に維持するため
に、正常なRPI遺伝子活性を発揮するRPI遺伝子ポリペプチドをコード化、
発現する核酸分子を、アンチセンス、リボザイム、またはトリプレックス治療が
利用されているどんなものにも感受性のある配列を含まない遺伝子療法を介して
細胞中に導入してもよい。または、RPI遺伝子が細胞外タンパク質をコード化
する場合には、ターゲット遺伝子活性の必要なレベルを維持するために正常なR
PI遺伝子タンパク質を同時に投与する(co-administer)ことが好ましい。 【0244】 本発明のアンチセンスRNA及びDNA、リボザイム、ならびにトリプレック
ス分子は、上記したように、DNA及びRNA分子の合成に関する当該分野にお
ける既知の方法によって調製されてもよい。これらとしては、例えば、固相ホス
ホルアミダイト(phosphoramidite)化学合成などの当該分野で既知のオリゴデオ キシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するに技術が
挙げられる。または、RNA分子を、アンチセンスRNA分子をコード化するD
NA配列のインビトロ及びインビボ転写によって得てもよい。このようなDNA
配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適当なRNAポリメ
ラーゼプロモーターが取り込まれた広範な様々なベクター中に導入されてもよい
。または、使用されるプロモーターによって、構成により(constitutively)また
は誘導により(inducibly)アンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA 構築物を細胞株に安定して導入してもよい。 【0245】 治療または予防のための利用のデモンストレーション 本発明の化合物は、ヒトに使用される前に、所望の治療または予防活性に関し
てインビトロ、次にインビボで試験されることが好ましい。例えば、特定の化合
物の投与が必要であるかどうかを決定するのに使用できるインビトロ分析として
は、患者の組織サンプルを培養液中で成育させ、化合物に晒すあるいは化合物を
投与して、このような化合物の組織サンプルへの効果を観察するインビトロの培
養分析が挙げられる。テスト化合物は、RAを患っている患者のRADFまたは
RPIレベルがRAを患っていない被検者中で見出されるレベルにまで戻るまた
はRAの実験動物モデル(例えば、ラットのアジュバント関節炎)における同様
の変化を作製することができるかについて試験されうる。上記レベルを回復でき
る化合物を、さらなる薬剤発見を目的としたリード化合物(lead compound)とし て使用できる、または治療に使用できる。 【0246】 RADF及びRPIの発現は、好ましい技術、イムノアッセイ、ゲル電気泳動
後可視化、または他の当業者に既知の方法によって分析できる。このような分析
は、RADFまたはRPIの発現量が臨床的病気の代用マーカーとして機能でき
る際には、候補薬剤をスクリーニングするためにまたは臨床的なモニタリング若
しくは薬剤の開発に使用できる。様々な特定の実施形態において、インビトロ分
析は、患者の疾患にかかわる細胞型の代表的な細胞を用いて行なわれ、化合物が
このような細胞型に目的とする効果を有するかどうかを決定できる。治療に使用
される化合物は、以下に限られないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル
、ウサギなどの適当な動物モデルシステムでヒトでの試験の前に試験されうる。
インビボ試験に関しては、ヒトへの投与前に、当該分野において既知のいずれか
の動物モデルシステムを使用してもよい。 【0247】 治療/予防のための投与及び組成物 本発明は、有効量の本発明の化合物び被検者への投与による治療(及び予防)
方法を提供するものである。好ましい形態においては、化合物は実質的に純粋で
ある(例えば、その効果を制限するあるいは望ましくない副作用を産する物質を
実質的に含まない)。被検者は、好ましくは、以下に限られないが、ウシ、ブタ
、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物を含む、動物であり、好ましくは哺乳動
物であり、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態においては、非ヒト哺乳
動物が被検者である。 【0248】 化合物が核酸からなる際に使用できる配合物及び投与方法は上記と同様である
;さらなる適当な配合物及び投与経路は、下記したものから選択できる。様々な
輸送システムが知られており、本発明の化合物を投与するのに使用でき、例えば
、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現できる組換細
胞、レセプターが介するエンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, 1987, J. Bi
ol. Chem. 262,4429-4432を参照)、レトロウィルスまたは他のベクターの一部
としての核酸の構築などがある。導入方法としては、以下に限られないが、皮内
、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられる
。化合物は、いずれかの簡便な経路によって、例えば、輸液または大量注射によ
って、上皮または粘膜皮膚内層(例えば、経口、粘膜、直腸及び腸粘膜など)に
よる吸収によって投与されてもよく、また、他の生物学的に活性のある薬剤と一
緒に投与されてもよい。投与は全身または局所であってもよい。 【0249】 加えて、脳室内及び髄腔内などの、適当な経路によって中枢神経系中に本発明
の薬剤組成物を導入することが望ましい;脳室内注射は例えば、オマヤレザバー
等の、レザバーに取り付けられる、脳室内カテーテルによって容易になる。肺へ
の投与もまた、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアゾール投与剤(aer
osolizing agent)との配合によって、使用されうる。特定の実施形態においては
、治療を必要とする領域に局所的に本発明の薬剤組成物を投与することが望まし
い;これは、例えば、以下に限定されるわけではないが、外科手術中の局所的な
輸液、例えば、外科手術後に創傷被覆剤と組み合わせた、局所的な塗布、注射に
よって、カテーテルによって、坐剤によって、またはインプラントによって、達
成されてもよいが、上記インプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン製
材料からなり、シアラスティック膜(sialastic membrane)等の膜、または繊維な
どが挙げられる。一実施形態においては、投与は、悪性腫瘍または新生物性の若
しくは新生物発生前の組織のある部位(または前の部位)に直接注射することに
よってもよい。他の実施形態においては、化合物が、ベシクル、特にリポソーム
中に輸送されてもよい(Langer, Science 249, 1527-1533 (1990); Treat 等.,
in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Ber
estein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Ber
estein, ibid., pp. 317-327を参照;同書を参照)。さらなる実施形態において
は、化合物が、制御された放出システム中に輸送されてもよい。一実施形態にお
いては、ポンプを使用してもよい(Langer、上記;Sefton, CRC Crit. Ref. Bio
med. Eng. 14, 201 (1987); Buchwald 等., Surgery 88, 507 (1980); Saudek
等., N. Engl. J. Med. 321, 574 (1989)を参照)。他の実施形態においては、
高分子材料を使用してもよい(Medical Applications of Controlled Release,
Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controll
ed Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and
Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. S
ci. Rev. Macromol. Chem. 23, 61 (1983)を参照;また、Levy 等., Science 22
8, 190 (1985); During 等., Ann. Neurol. 25, 351 (1989); Howard 等., J.
Neurosurg. 71, 105 (1989)を参照)。さらなる他の実施形態においては、制御
された放出システムを、全身性の投薬量のフラクションのみを必要とする、治療
のターゲット、即ち、脳の付近に置かれてもよい(例えば、Goodson, in Medica
l Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) を参照)。他の制御された放出システムは、Langer (Science 249, 1527-1533 (
1990))の書評で討論される。 【0250】 本発明の化合物がタンパク質をコード化する核酸である特殊な実施形態におい
ては、核酸が、例えば、レトロウィルスベクター(米国特許第4,980,28
6号を参照)の使用によって、核酸を適当な核酸の発現ベクターの一部として構
築し細胞内になるように投与することによって、または直接注射によって、また
は微粒子の衝撃(例えば、遺伝子ガン;Biolistic, Dupont)の使用によって、 または脂質若しくは細胞表面レセプター若しくはトランスフェクション剤(trans
fecting agent)による被覆によって、または核に入ることが知られているホメオ
ボックス様ペプチド(例えば、Joliot 等., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88, 1864-1868を参照)に結合する核酸を投与することなどによって、インビボ
で投与されてコード化されたタンパク質の発現を促進してもよい。または、核酸
を、細胞内に導入して、相同的組換によって、発現用の宿主細胞DNA内に取り
込んでもよい。 【0251】 本発明はまた、薬剤組成物を提供するものである。このような組成物は治療上
有効な量の化合物及び製薬上許容できる担体からなる。特殊な実施形態において
は、「製薬上許容できる」ということばは、連邦管理局(regulatory agency of
the Federal)、若しくは州政府によって認可されていること、または米国薬局方
もしくは動物、特にヒトへの使用に関して一般的に認知されている他の薬局方に
リストとして挙げられていることを意味する。「担体」ということばは、治療剤
が一緒に投与される希釈液、アジュバント、賦形剤、またはベヒクルを意味する
。このような製薬上の担体は、水ならびに、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ
油等の、石油、動物、植物若しくは合成由来のものなどの、油等の滅菌液体であ
りうる。水は、薬剤組成物を静脈内で投与される場合には好ましい担体である。
食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液もまた、特に注射可能な
溶液用に、液状担体として使用できる。適当な製薬上の賦形剤としては、デンプ
ン、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、
チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレー
ト、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、
グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。 【0252】 本組成物は、必要であれば、少量の湿潤若しくは乳化剤、またはpH緩衝剤を
含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセ
ル、粉末、徐放性配合物などの形態がとられる。組成物は、伝統的な結合剤及び
トリグリセリド等の担体を用いて、坐剤として配合されてもよい。経口用の配合
物は、薬剤グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグ
ネシウム、サッカリンナトリウム(sodium saccharine)、セルロース、炭酸マグ ネシウムなどの標準的な担体を含みうる。適当な製薬上の担体の例は、E.W. Mar
tinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載される。このような組成
物は、患者に適当に投与するための形態を提供できるように適当な量の担体と共
に、好ましくは純粋な形態の、治療上有効な量の本化合物を含むであろう。 【0253】 配合物は、投与の形態に適するものでなければならない。好ましい実施形態に
おいては、本組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適用される薬剤組成物とし
て定常的な方法に従って配合される。具体的には、静脈内投与用の組成物は、滅
菌等張水性緩衝液における溶液である。必要であれば、組成物はまた、可溶化剤
及び注射部位での痛みを和らげるためのリドカイン等の局所麻酔剤を含んでもよ
い。通常、成分は、例えば、一定量の活性物質を表示するアンプル若しくは小袋
(sachette)等の密閉容器における乾燥凍結乾燥粉末若しくは水分のない濃縮液と
して、単位服用量形態(unit dosage form)で別々にまたは一緒に混合してのいず
れかで供給される。組成物を輸液によって投与しようとする際には、組成物を滅
菌した薬剤グレードの水または食塩水を含む輸液用ボトルで調剤されうる。本組
成物を注射によって投与する際には、注射用の滅菌水または食塩水のアンプルを
、投与前に成分を混合するように提供できる。 【0254】 本発明の組成物は、中性または塩形態として配合されてもよい。製薬上許容で
きる塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の塩などの遊離
アミノ基を用いて形成される塩、ならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム
、カルシウム、水酸化第2鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エ
チルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の塩などの遊離カルボキ
シル基を用いて形成される塩が挙げられる。 【0255】 RAの治療に有効であろう本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術によって
決定できる。加えて、インビトロ分析を必要であれば最適な投与範囲を同定する
のを補助するのに使用してもよい。配合物に用いられる正確な投与量はまた、投
与経路、及び病気または疾患の重篤度によって異なり、開業医や各患者の環境の
判断に従って決定されなければならない。しかしながら、静脈内投与に関する適
当な投与量の範囲は、通常、約20〜500mgの活性化合物/kg体重である
。鼻腔内投与に関する適当な投与量の範囲は、通常、約0.01pg/kg体重
〜1mg/kg体重である。有効な投与量は、インビトロまたは動物モデル試験
システムから派生される線量効果曲線から外挿されてもよい。坐剤は、通常、0
.5質量%〜10質量%の範囲の活性成分を含む;経口用配合物は、好ましくは
、10%〜95%の活性成分を含む。 【0256】 本発明はまた、本発明の薬剤組成物の一以上の成分を充填する一以上の容器か
らなる薬剤パックまたはキットを提供するものである。必要であれば、製剤また
は生物学的製品の製造、使用または販売を調節する政府の機関(governmental ag
ency)によって規定される形態の通知をこのような容器につけてもよく、この通 知はヒトへの投与のための製造、使用及び販売の政府機関(agency of manufactu
re, use or sale)による認可を反映するものである。 【0257】 実施例 RAによる患者の血清及び関節液由来のタンパク質 下記の参考プロトコルを用いて、リウマチ様関節炎(RA)の患者からのまた
はRAでない患者(即ち、痛風、変形性関節症、または外傷性の滑膜炎の患者)
からの血清及び関節液中のタンパク質を、等電点電気泳動さらにはSDS−PA
GEによって分離し、比較した。各サンプルは2連で流した。 【0258】 サンプル調製 タンパク質の分析を、受け取ったままのサンプルで行なった(Pierce BCA Cat
# 23225)。300μgの全タンパク質に相当する容積の血清を分取し、等容の1
0%(w/v)SDS(Fluka 71729)、2.3%(w/v)のジチオトレイトー ル(BDH 443852A)を添加した。このサンプルを95℃で5分間加熱した後、20 ℃に冷却した。次に、125μlの以下の緩衝液をサンプルに加えた:8M 尿
素(BDH 452043w)、4% CHAPS(Sigma C3023)、65mM ジチオトレイト
ール(DTT)、2%(v/v) リゾライト(Resolytes) 3.5−10(BDH
44338 2x)。この混合物をボルテックスして、15℃で13000rpmで5分 間、遠心し、上清を等電点電気泳動によって分析した。 【0259】 等電点電気泳動 等電点電気泳動(IEF)を、製造社の指示に記載される方法に従って、イム
ノビリン(登録)ドライストリップキット(Immobiline DryStrip Kit)(Pharmaci
a BioTech)を用いて行なった、Instructions for Immobiline DryStrip Kit, Ph
armacia, # 18-1038-63, Edition AB(その全体を参考のために本明細書中に引 用される)を参照。固定化pHグラジエント(IPG)ストリップ(18cm、
pH 3〜10 非線形ストリップ;Pharmacia Cat. # 17-1235-01)を、イン モビリンドライストリップユーザーズマニュアル(Immobiline DryStrip Users M
anual)に記載されるようにして、8M 尿素、2%(w/v) CHAPS、1
0mM DTT、2%(v/v) リゾライト(Resolytes) 3.5−10(BDH
44338 2x)の溶液中に20℃で一晩、再度水和させた。IEFに関しては、50 μlの上清(上記と同様にして調製)をストリップにのせて、カップ−ローディ
ング単位(cup-loading unit)をストリップの塩基性末端に置いた。次に、のせら
れたゲルを鉱油(Pharmacia 17-3335-01)で被覆して、電圧を、ファルマシアEP
S3500XLパワーサプライ(Pharmacia EPS3500XL power supply)(Cat 19-35
00-01)を用いて、即座に下記プロフィールに従ってストリップにかけた: 初期電圧=300Vで2時間、 300V〜3500Vの直線ランプを3時間、 3500Vで19時間維持。 【0260】 このプロセスのすべての段階で、電流制限は12ゲルで10mAに設定し、ワ
ット数の制限は5Wにセットした。温度は泳動中20℃に維持した。 【0261】 6.3 ゲル平衡及びSDS−PAGE ゲル平衡及びSDS−PAGE 1.1 最終の19時間の段階の後、ストリップを即座に取り出し、下記組成の第一の
溶液中に20℃で10分間浸漬した:6M 尿素;2%(w/v) DTT;2
%(w/v) SDS;30%(v/v) グリセロール(Fluka 49767);0. 05M トリス/HCl、pH6.8(Sigma Cat T-1503)。これらのストリップ
を第一の溶液から取り出し、下記組成の第二の溶液中に20℃で10分間浸漬し
た:6M 尿素;2%(w/v) ヨードアセトアミド(Sigma I-6125);2%(
w/v) SDS;30%(v/v) グリセロール(Fluka 49767);0.05 M トリス/HCl、pH6.8。第二の溶液から取り出した後、ストリップを
、以下に詳述するように修飾した、Hochstrasser 等., 1988, Analytical Bioch
emistry 173:412-423(その全体を参考のために本明細書中に引用される)に従 ってSDS−PAGE用の支持ゲルにのせた。 【0262】 6.4 支持ゲルの調製 支持ゲルの調製 ゲルを、下記寸法の2枚のガラス板間に注いだ:23cm幅×24cm長(後
ろの板);中央の19cmに2cm深さのノッチを有する23cm幅×24cm
長(前の板)。SDS−PAGEゲルの共有結合を促進するために、後ろの板を
エタノールにおける0.4% γ−メタクリル−オキシプロピルトリメトキシシ
ラン溶液(バインドシラン(商標)(BindSilaneTM); Pharmacia Cat. # 17-1330
-01)で処理した。前の板を、ゲルの付着を抑制するために、レペルシラン(商標
)(RepelSilaneTM)(Pharmacia Cat. # 17-1332-01)で処理した。過剰の試薬を水
で洗浄することによって除去し、板を乾燥させた。この段階で、ゲルに関する同
定として、および板の被覆面を同定するマーカーとして、粘着性のバーコードを
ゲルマトリックスと接触しないような位置に後ろの板につけた。 【0263】 乾燥させた板を13ゲルサンドイッチの収容能力のあるキャスティングボック
ス中に集めた。各サンドイッチの上部と下部の板を1mm厚で2.5cm幅のス
ペーサーによって間隔をあけた。ゲル重合後にサンドイッチを分離しやすくする
ために、これらのサンドイッチにアセテートシートを挟み込んだ。次に、Hochst
rasser 等.、前掲に従って、キャスティングを行なった。 【0264】 9〜16%の直線のポリアクリルアミド勾配を、アンゲリクグラジエントキャ
スティングシステム(Angelique gradient casting system)(Large Scale Biolog
y)を用いて、前の板のノッチのレベルから2cm下の点まで伸ばすように、キャ
ストした。ストック溶液は下記のとおりであった。アクリルアミド(水において
40%)は、セルヴァ(Serva)(Cat. # 10677)からであった。架橋剤は、全出発 モノマー含量の2.6%(w/w)の濃度の、PDA(BioRad 161-0202)であっ た。ゲルバッファーは、0.375M トリス/HCl、pH8.8であった。
重合触媒は0.05%(v/v) TEMED(BioRad 161-0801)であり、開始 剤は0.1%(w/v) APS(BioRad 161-0700)であった。SDSはゲル中 には含ませず、積重ねゲルは使用しなかった。キャストゲルを20℃で一晩、重
合させた後、6mlのゲルバッファーの入った密閉ポリエチレンバッグ中に4℃
で貯蔵し、4週間以内に使用した。 【0265】 6.5 SDS−PAGE SDS−PAGE 1.1 0.5%(w/v) アガロース(Fluka Cat 05075)の溶液を泳動用バッファ ー(0.025M トリス、0.198M グリシン(Fluka 50050)、1%(w /v) SDS、微量のブロモフェノールブルーを補足)中で調製した。このア
ガロース懸濁液を、アガロースが溶解するまで、攪拌しながら70℃に加熱した
。支持された第二のDゲルの上部をアガロース溶液で満たし、平衡化したストリ
ップをアガロース中に置き、ゲルが第二のDゲルとよく接触するまでパレットナ
イフでゆるやかに軽くたたいた。ゲルを、Amess 等., 1995, Electrophoresis 1
6:1255-1267(その全体を参考のために本明細書中に引用される)によって記載 されるのと同様にして、第二のD泳動タンクに置いた。タンクを、活性ゲル領域
を効率的に冷却できるように、バッファーのレベルがポリアクリルアミドを含む
第二のDゲルの領域の上部よりちょうど高くなるまで、泳動用バッファー(上記
と同様)で満たした。泳動用バッファーをゲルによって形成される上部のバッフ
ァーコンパートメントに加えた後、コンソートE−833パワーサプライ(Conso
rt E-833 power supply)を用いて電圧をゲルに即座にかけた。1時間、ゲルを2
0mA/ゲルで泳動した。ワット数の制限は、6ゲルを含むタンクで150Wに
設定し、電圧の制限は600Vに設定した。次に、1時間後、ゲルを、ブロモフ
ェノールブルーのラインがゲルの低部から0.5cmになるまで、前記と同様の
電圧及びワット数の制限にして、40mA/ゲルで泳動した。温度は、泳動中1
0℃に維持された。 【0266】 6.6 染色 染色 電気泳動の泳動(run)が完了したら、ゲルを即座に固定用のタンクから取り出 した。ゲルカセットの上板を注意深く取り除き、ゲルを底板にくっつかせたまま
にした。次に、このゲルのついた底板を、12ゲルを収容できる、染色装置中に
置いた。ゲルを、40%(v/v) エタノール(BDH 28719)、10%(v/v ) 酢酸(BDH 100016X)、50%(v/v) 水(MilliQ-Millipore)の固定用溶 液中に完全に浸漬し、この溶液をゲル上で連続して循環させた。一晩インキュベ
ーション後、固定用溶液をタンクから抜き、ゲルを、7.5%(v/v) 酢酸
、0.05%(w/v) SDS、92.5%(v/v) 水中に30分間、浸
漬することによって下塗した(prime)。さらに、下塗用溶液を抜き、ゲルを染色 用溶液に4時間完全に浸漬することによって染色した。蛍光染料の溶液は、製造
社の指示に従って希釈用シプロレッド(Sypro Red)(Molecular Probes, Inc., Eu
gene, Oregon)によって調製した;この希釈溶液を0.4μmフィルターで真空 下で濾過した。 【0267】 6.7 ゲルのイメージング 電気泳動の泳動(run)が完了したら、ゲルを即座に固定用のタンクから取り出 した。ゲルカセットの上板を注意深く取り除き、ゲルを底板にくっつかせたまま
にした。次に、このゲルのついた底板を、12ゲルを収容できる、染色装置中に
置いた。ゲルを、40%(v/v) エタノール(BDH 28719)、10%(v/v ) 酢酸(BDH 100016X)、50%(v/v) 水(MilliQ-Millipore)の固定用溶 液中に完全に浸漬し、この溶液をゲル上で連続して循環させた。一晩インキュベ
ーション後、固定用溶液をタンクから抜き、ゲルを、7.5%(v/v) 酢酸
、0.05%(w/v) SDS、92.5%(v/v) 水中に30分間、浸
漬することによって下塗した(prime)。さらに、下塗用溶液を抜き、ゲルを染色 用溶液に4時間完全に浸漬することによって染色した。蛍光染料の溶液は、製造
社の指示に従って希釈用シプロレッド(Sypro Red)(Molecular Probes, Inc., Eu
gene, Oregon)によって調製した;この希釈溶液を0.4μmフィルターで真空 下で濾過した。 【0268】 ゲルのイメージング 1.1 コンピューターで解読可能な出力を、以下のような修飾を加えて、製造社の指
示に従って、ストームスキャナー(Storm scanner)(Molecular Dynamics, Sunnyv
ale, California)で蛍光で染色されたゲルを撮影する(imaging)ことによって作 った(その全体を参考のために本明細書中に引用される、Storm User's Guide,
1995, Version 4.0, Part No. 149-355を参照)。ゲルを染色液から取り出して 、水で簡単に洗浄し、1000VのPMTセッティングで、及び200μmの解
像度で、レッドフルオレセンスモード(Red Fluorescence mode)で、ストームス キャナー(Storm scanner)で撮影した。ゲルはガラス板に強固に結合したので、 ゲルを撮影中にスキャナーベッドに接触させ続けた。ゲルとスキャナーベッドと
の間の不均一な接触から生じる干渉パターンを防止するために、水のフィルムを
ゲルの下に導入して、エアーポケットができないように注意した。さらに、ゲル
を、ゲル中で検出される他の特徴のX、Y座標を決定するための参照ポイント(
M1及びM2と称する)を提供するためにゲルと一緒に撮影される2個の蛍光ボ
タンを備えたフレーム中に置いた。マッチしたフレームを、ゲルの正確な配列を
保存するためにロボットゲル切出し器に置いた。撮影後、ゲルを少量の染色用溶
液を含むポリエチレンバッグ中に密閉した後、4℃で貯蔵した。 【0269】 6.8 データのデジタル解析 データを、下記により詳細に記載されるように、米国特許出願番号08/98
0,574号、セクション5.4及び5.5(その全体を参考のために本明細書
中に引用される)に記載されるのと同様にして処理した。 【0270】 6.8.1 ディテクター出力のコンピューター解析 データのデジタル解析 データを、下記により詳細に記載されるように、米国特許出願番号08/98
0,574号、セクション5.4及び5.5(その全体を参考のために本明細書
中に引用される)に記載されるのと同様にして処理した。 【0271】 ディテクター出力のコンピューター解析 スキャナーからの出力をまず、メラニー(登録)II 2D PAGE分析プ
ログラム(MELANIE II 2D PAGE analysis program)(Release 2.2, 1997, BioRad
Laboratories, Hercules, California, Cat. # 170-7566)を用いて処理すること
によって、登録ポイントM1及びM2を自動的に検出し;イメージを自動的に縁
を切り落とし(即ち、ゲルの境界、例えば、参照フレームの外側にあるスキャン
されたイメージの領域由来のシグナルを除去する);ダストによるアーチファク
トをフィルターで取り除き(filter out);特徴を検出、定量し;さらにGIFフ
ォーマットでイメージファイルを作製した。特徴を以下のパラメーターで検出し
た。 【0272】 なめらかさ(Smooths)=2、 ラプラシアン閾値(Laplacian threshold) 50、 部分閾値(Partials threshold) 1、 飽和度=100、 とがり(Peakedness)=0、 最小周界(Minimum Perimeter)=10。 【0273】 6.9 pI及びMW値の割り当て(Assignment) pI及びMW値の割り当て イメージを、グロス異常を有する、またはローディング若しくは全体のイメー
ジ強度(image intensity)が低すぎる、または解像度が低すぎる、または2連が 類似していない場合のイメージを却下するために評価した。2連のうちの一方の
イメージが却下された場合、2連に属する他方のイメージもまたイメージの質に
かかわらず却下された。却下されたサンプルを繰り返し分析のために予定表に組
み込まれた(scheduled)。 【0274】 ランドマーク同定を用いて、イメージ中に検出された特徴のpI及びMW値を
測定した。このプロセスは、所定の生物学的なサンプル中に発見されることが期
待される特定のタンパク質の同定に係るものである。これらの共通のタンパク質
はサンプル毎に等しい等電点及び分子量を発揮するため、これらを標準として使
用できる;このプロセスはまた、可能性のあるゲルの変動またはゆがみを修正す
る。 【0275】 正常な血清ゲルのデータセットから、ゲルを第一のマスターゲル(Primary Mas
ter Gel)として任意に選んだ。次に、ランドマーク特徴を、この第一のマスター
ゲル中に検出される特徴を正常なヒトの血清の2次元電気泳動ですでに同定され
た特徴と比較することによって同定した。(Bjellqvist 等., 1993, Electropho
resis 14:1357-1365を参照;その全体を参考のために本明細書中に引用される)
。 【0276】 PL1〜PL12及びPL15〜pL16と称する、14個のランドマーク特
徴が第一のマスターゲルで同定された。これらのランドマーク特徴を図1に示し
、表XIIに示されるpIおよび/またはMW値を割り当てた。 【0277】 【表22】 【0278】 可能な限り多くのこれらのランドマークを、データセットの各ゲルイメージで
同定した。 【0279】 次に、マスターゲルのすべての特徴は、すでにpI値を割り当てられた2種の
最も近いランドマークに対する(メラニー II ソフトウェア(MELANIE II so
ftware)を用いた)直線的な内挿/外挿によってpI値を割り当てられ、すでに MW値を割り当てられた2種の最も近いランドマークのMWに対する(メラニー
II ソフトウェア(MELANIE II software)を用いた)直線的な内挿/外挿に よってMW値を割り当てられた。これらの特徴はまた、モレキュラークラスター
インデックス(またはMCI)として既知の独特の数で標識された。 【0280】 第二のマスターゲル(Secondary Master gel)を、RAの血清及びRAの関節液
双方のゲルについて選んだ。これらのゲルの特徴を、メラニー II 2D P
AGE(MELANIE II 2D PAGE)(Release 2.2)ユーザーマニュアル(The Melanie Gr
oup, Geneva, Switzerland)のセクションA、頁8〜10に記載されるのと同様 にして、メラニー II ソフトウェアと共に供給されるアルゴリズムを用いて
、マスターゲルの共通する特徴と対にした。すでに対になった特徴を相当するM
CIに、ゆえに関連するpI及びMW値に結び付ける。これらの第二のマスター
ゲルに存在する対をなさなかった特徴は、ランドマークのpI及びMWに関して
(メラニー II ソフトウェア(MELANIE II software)を用いた直線的な内挿 /外挿によってpI及びMW値を割り当てられた。次に、さらなる独特な項目を
、これらの特徴に関するMCIで作製した。 【0281】 6.9.1 プロフィールの構築 プロフィールの構築 データセットのすべてのゲルをここで第一の及び第二のマスターゲルに,マッ
チさせ、対の特徴をモレキュラークラスターインデックスの相当する項目に結び
つけた。 【0282】 次に、2連のゲルをランドマークにより並べ、マッチングプロセスを2連のゲ
ルにおける同じスポットの対になるように行なった。これにより、対のスポット
が分離の再現性を示し、また、アーチファクトをフィルターで取り除く(filter
out)ので、次に測定される等電点及び分子量が正確であるという保証が増大した
。 【0283】 各タンパク質スポットの強度の測定結果を採取し、保存した。各タンパク質ス
ポットは、同定コードが割り当てられ、マスターゲルでのスポットにマッチさせ
た。 【0284】 分析のこの概念の結果、各同定されたスポットについて:1)独特な任意の同
定コード、2)X、Y座標、3)等電点、4)分子量、5)シグナル値、6)各
前記測定結果に関する標準偏差、及び7)このスポットがマッチするマスターゲ
ルでのスポットのMCIに対するポインターを含むデジタルプロフィールが、単
一の血清または関節液サンプルに代表されるゲルの各2連セットに関して、得ら
れた。ラボラトリーインフォーメーションマネージメントシステム(Laboratory
Information Management System)(LIMS)によって、このプロフィールは、
ゲルプロフィールのデータベースのコンピューター分析によって同定されるタン
パク質が検索できるように、そこから生じた実際の保存されたゲルにまでトレー
ス可能であった。このLIMSによって、プロフィールをオリジナルのサンプル
または患者にまでトレースすることもできた。 【0285】 6.9.2 サンプル間の交差試験 1.1.1 プロフィールが得られたら、分析を、興味のあるタンパク質の選択に向けた。
プロフィールにおけるそれぞれの有意な特徴にインデックス、すべてのゲルにお
ける特徴を同定し、特徴の上記(1)〜(7)のパラメーターに対するポインタ
ーとして機能する「モレキュラークラスターインデックス」(MCI)を割り当
てた。分子クラスターテーブルを各サンプルタイプ(例えば、RA血清及びRA
関節液)に関するマスターゲルから得た。同じタイプのすべての他のサンプルか
らのゲルを関連する第一及び第二のマスターゲルとマッチさせた。次に、各サン
プルに関するデジタルプロフィールに、各マッチした特徴について、マスタープ
ロフィールの上記特徴に割り当てられたMCIを加えることによって、注釈をつ
けた。 【0286】 6.9.3 プロフィールの示差分析 各サンプルセット(関節液または血清)内で、プロフィールを分析して、少な
くとも50%のプロフィールで存在するこれらの特徴を同定、選択した。次に、
これらの選択された特徴を、関節液の特徴のセット及び血清の特徴のセットで集
めた。さらに、各特徴セットのマッチング特徴を比較して、関節液及び血清間で
平均強度で少なくとも2倍の差を示すこれらの特徴を同定した。続いて、同様の
特徴をRAを持たない被検者からの関節液及び血清サンプルで試験した。RAの
関節液サンプルと比べてRA血清では差別的に存在するが非RAの関節液サンプ
ルと比べると非RA血清とは異ならずに存在する特徴を、リウマチ様関節炎−診
断特徴(Rheumatoid Arthritis-Diagnostic Feature)(RADF)として同定し た。 【0287】 6.10 選択されたタンパク質の回収及び分析 選択されたタンパク質の回収及び分析 RADFのタンパク質をロボットで切出して、処理することによって、トリプ
シンペプチドを得た;これらのペプチドの部分的なアミノ酸配列を、de novoシ ークエンシング(de novo sequencing)を用いて、質量分析によって決定した。 【0288】 6.11 結果 結果 1.1 これらの初期実験によって、RAの患者からの血清に対して関節液中で増大す
る12種の特徴及び減少する10種の特徴が同定された。各RADFは、RAの
被検者からの血清に対して関節液においてのみ差別的に存在するが、RAを持た
ない被検者からの血清に対して関節液では異ならずに存在した。 【0289】 部分的なアミノ酸配列をこれらのRADFで差別的に存在するRPIについて
決定した。公的なデータベースのコンピューター分析によって、これらの部分的
に配列が決定されたタンパク質のうち21種が当該分野において既知であり、5
種は試験された公的なデータベースには記載されていなかったことが分かった。
表VIIIから、数種のRPIは同じタンパク質のイソ型であることが示される
。例えば、RPI−1及びRPI−11はトランスフェリンのイソ型である。こ
れらのイソ型は、翻訳後プロセッシング(例えば、グリコシレーション、リン酸
化、アシル化または最小タンパク質分解(minimal proteolysis))における相違 から生じると考えられる。 【0290】 7. 実施例: RAを有する及び有さない患者の血清由来のタンパク質 リウマチ様関節炎(RA)を有する患者からの及びRAを有さない患者からの
血清におけるタンパク質を等電点電気泳動さらにはSDS−PAGEによって分
離し、比較した。 【0291】 分析は、実施例7の比較をRA患者からの血清及び非RA患者からの血清の間
で行なった以外は、実施例6に記載されるのと同様にして行なった。 【0292】 7.1 結果 これらの初期実験によって、非RAの患者からの血清と比較してRAの患者か
らの血清で増大する12種の特徴及び減少する9種の特徴が同定された。これら
のRADFの詳細は表III及びIVに記載される。各RADFは、非RAの血
清に対してRAの血清中で差別的に存在した。 【0293】 部分的なアミノ酸配列をこれらのRADFで差別的に存在するRPIについて
決定した。公的なデータベースのコンピューター分析によって、これらの部分的
に配列が決定されたタンパク質のうち17種が当該分野において既知であり、4
種は試験された公的なデータベースには記載されていなかったことが分かった。
表XIから、数種のRPIは同じタンパク質のイソ型であることが示される。例
えば、RPI−44及びRPI−45はトランスフェリンのイソ型である。これ
らのイソ型は、翻訳後プロセッシング(例えば、グリコシレーション、リン酸化
、アシル化または最小タンパク質分解(minimal proteolysis))における相違か ら生じると考えられる。 【0294】 さらに、表VIII〜XIから、RPI−2、RPI−6、RPI−7、RP
I−14、RPI−23、RPI−25、RPI−31、及びRPI−37は免
疫グロブリンイソ型の代表であることが示される。特にRPI−2は、IgG軽
鎖のイソ型の代表である。換言すると、好ましい技術を用いて、RAと特に関連
し、この病気と関連するオリゴクローナルな体液性免疫反応(oligoclonal humor
al immune response)に反映すると考えられる免疫グロブリンのイソ型の規定さ れるサブセットを同定した。これらの免疫グロブリンのイソ型(及びこの断片や
これに対する抗体など)は診断、予後、治療のためのモニタリング及び薬剤の開
発に有用である。 【0295】 本発明は、具体的に記載された実施形態によって概念を限定されるものではな
く、本発明の一概念の詳細な説明と解する。真に、本明細書中に示され記載され
たものに加えて本発明の様々な修飾が前記説明および添付図面から当業者に明ら
かになるであろう。このような修飾は、添付の特許請求の範囲の概念に含まれる
ものである。 【0296】 本明細書において引用されたすべての公報は、その全体を参考のために本明細
書中に引用される。 【図面の簡単な説明】 【図1】 図1は、正常ヒト血清の二次元電気泳動から得られたイメージであり、これは
PL1〜PL16をデザインした、14個のランドマーク特徴を同定したことを
付記する。
同定に関するものであり、ならびに、スクリーニング、診断、予後、治療および
薬剤開発のためのそれらの使用に関するものである。 【0002】 2.発明の背景 リウマチ様関節炎(RA)は、免疫異常によって対称性関節性炎症、関節性び
らん、および関節外の合併症を特徴的に引き起こす複合系疾患である。これは最
も一般的な不自由にする自己免疫性関節炎であり、遺伝的感受性がよく定義され
ている。人口の約1〜3%がこれに罹患している。罹患率は年齢とともに増加す
るが、ピークは30〜55歳である。 【0003】 リウマチ因子は、すなわち免疫グロブリンG(IgG)のFc断片に対する抗
体であり、RAを罹患している患者の75%に存在する。リウマチ因子はIgM
、IgGまたはIgAでありうる。自然に生じるリウマチ因子は、外来抗原を対
外に除去することに関する役割を持つと考えられている。RAにおいて、リウマ
チ因子は滑膜プラズマ細胞によって生産され、免疫複合体を形成し、補体を活性
化し、炎症性応答に関与する能力を持ち、それらがRAの病因に関与しているこ
とが示唆されている。RAにおけるリウマチ因子および減少されたIGのガラク
トシル化が共存することによって、数種の病気が予想される。 【0004】 滑膜組織は、RAにおける炎症の主要巣であり、CD4+Tリンパ球、活性B
細胞、単核細胞および多核白血球の慢性滑膜の浸潤が起こる。HLAクラスIIの
発現は増加し、ほとんどすべての細胞型で見出され、それらが活性状態であるこ
とを示す。慢性疾患の特徴は、軟骨および骨のびらん、ならびに滑膜肥大である
。 【0005】 RAの診断は困難でありつづけている。既往症、病気の初期における検査およ
び調査から、病気のパターンがはっきりしないからである。RAに対する診断テ
ストはないが、リウマチ学で有名なアメリカの大学がその分類に関する基準を定
義した(Medicine, ed. Axford, J., Blackwell Science, 1996, pp. 3.18-3.22
)。これらの基準は、単に観察用のランドマークであり、これは組み合わせてR
Aを指示するためと思われる。 【0006】 RAをもつ成人の75%は、IgMリウマチ因子陽性である。これは病気の初
期において見出されない。リウマチ因子のレベルは予後的に診断で使用されうる
が、その機能は病気のモニタリングの役には立たない。抗核の抗体が患者の30
%に存在する。 【0007】 IgMのリウマチ因子は通常、凝集テストによって測定される。これらは、I
gGで被覆された粒子が凝集するラテックステスト(latex test)、羊赤血球が
凝集する羊赤血球凝集反応(SCATまたはローズ−ワーラーテスト(Rose-Waa
ler test))を含む。他の基準によって診断されたRA患者の少なくとも70%
は、リウマチ因子のラテックス凝集反応陽性である。リウマチ因子テストはまた
、他のリウマチ性疾患、ウイルス感染、慢性炎症性疾患、腫瘍または化学療法に
おいても陽性であり、深刻なことに4%の健康な個体も陽性である。 【0008】 RAの薬剤治療は、(1)痛みを緩和する(鎮痛剤);(2)一度炎症が引き
起こされた炎症性事象を改変する(抗炎症性薬剤);および(3)炎症を導く免
疫性事象を改変する(疾患−改変薬剤)を目的としている。 【0009】 3.発明の概要 本発明は、RAのスクリーニング、診断ならびに予後のため、RA治療の有効
性をモニタリングするため、RAの治療ならびに薬剤開発のための方法および化
合物を提供するものである。 【0010】 1 本発明の第一の観点において、RAの診断のための方法を提供する。これはサ
ンプル(例えば、血漿、血清または関節液)を二次元電気泳動によって分析し、
少なくとも一のリウマチ様関節炎特徴(Rheumatoid Arthritis-Diagnostic Feat
ure (RADF))のレベルを検出することを含み、例えばここで開示されるRADF
類の群から選択されたRADFである。これらの方法はまた、スクリーニング、
予後、治療結果のモニタリングおよび薬剤開発に適している。 【0011】 本発明の第二の観点において、RA診断のための方法を提供する。これはサン
プル(例えば血漿、血清または関節液)中の少なくとも一つのリウマチ様関節炎
診断タンパク質イソ型(Rheumatoid Arthritis-Diagnostic Protein Isoform (
RPI))を検出することを含み、例えばここで開示されるRPI類の群か選択さ れるRPIである。これらの方法はまた、スクリーニング、予後、治療結果のモ
ニタリングおよび薬剤開発に適している。 【0012】 本発明の第三の観点において、RPIに対して免疫特異的に結合することので
きるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を提供するものであり、例え
ばここで開示されるRPIである。 【0013】 本発明の第四の観点において、分離されたRPI、すなわち顕著に異なる等電
点または顕著に異なる見かけの分子量を持つタンパク質もしくはタンパク質イソ
型から分離したRPIを含む製剤を提供する。 【0014】 本発明の第五の観点において、RAの治療または予防のための方法を提供する
。これは、RA患者の血清と比較してRA患者の関節液において増加したレベル
で存在する、少なくとも一つのRADFのレベルまたは少なくとも一つのRPI
のレベルまたは活性を減少させることができる化合物を投与することを含む。好
ましくは、投与される化合物は、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボ
ザイムまたはトリプレックス(triple helix)を形成できるオリゴヌクレオチド
である。 【0015】 本発明の第六の観点において、RAの治療または予防のための方法を提供する
。これは、RA患者の血清と比較してRA患者の関節液において減少したレベル
で存在する、少なくとも一つのRADFのレベルまたは少なくとも一つのRPI
のレベルもしくは活性を増加させることができる化合物を投与することを含む。
好ましくは、投与される該化合物は、RPI、RPIをコードする核酸、(例え
ば、発現ベクターの一部である核酸)または一つまたはそれ以上のRPIを発現
および分泌できる細胞である。 【0016】 5.発明の詳細な説明 以下に説明される本発明は、被検者におけるRAのスクリーニング、診断およ
び予後のための方法および組成物、RA治療結果のモニタリングの方法、薬剤開
発の方法、および、RA治療の方法を含む。好ましくは、該被検者は哺乳類であ
り、より好ましくはヒトであり、最も好ましくはヒト成人である。 【0017】 限定することなく開示を明確するために、本発明は血清および関節液サンプル
の分析に関して記載されている。しかしながら、当業者にとって明らかなように
、ここで記載された分析および技術は、体液(例えば、血漿、尿、脳席髄液、関
節吸引液)、組織サンプルまたはそれらのホモジネートを含む、他のタイプの患
者のサンプルにも適用することができる。 【0018】 5.1 リウマチ様関節炎診断特徴(RADF) 本発明の一つの観点において、二次元電気泳動は、RAのスクリーニングまた
は診断のために一つまたはそれ以上のリウマチ様関節炎特徴(Rheumatoid Arthr
itis-Diagnostic Features(RADF))の発生量を測定するため、RA患者の
予後を測定するため、RA治療の有効性をモニターするため、被検者からの血清
を分析するため、または、薬剤開発のために用いられる。ここで用いられている
ように、「二次元電気泳動」(2D電気泳動)は、変性電気泳動によってなされ
る等電点電気泳動を含む技術を意味し、これにより複数の分離されたタンパク質
を含む二次元ゲル(2Dゲル)を得る。好ましくは、変性電気泳動の段階におい
て、ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PA
GE)が使用される。特に好ましくは、米国特許出願第08/980,574号
に記載されている非常に正確な自動方法およびその装置(「好ましい技術(the
Preferred Technology)」)であり、ここにその全体を参照させることによって
引用する。簡潔にいうと、該好ましい技術とは、生物学的サンプル中において生
物学的分子を選択し特徴づけるために、有効なコンピューター支援による方法お
よび装置を提供するものである。二次元アレイ(two-dimensional array)は、 電気泳動移動度および等電点に従って二次元ゲル上で生物学的分子を分離するこ
とによって生じる。該アレイのコンピューターによるデジタルプロファイルが作
成され、これは二次元アレイ中に検出された多数の生物学的分子の同一性、見か
けの分子量、等電点および相対発生量を表現するものであり、それによって複数
の生物学的サンプルからのプロファイルをコンピューターが媒介して比較するこ
と、および興味深い分離されたタンパク質をコンピューターの補助により切り出
すことが可能である。 【0019】 ここで用いられているように、「リウマチ様関節炎特徴(Rheumatoid Arthrit
is-Diagnostic Feature(RADF))」とは、生物学的サンプルの2D電気泳 動によって検出された特徴(例えば、2Dゲル上のスポット)であり、すなわち
他の関連するタンパク質と比較してあるサンプル中に差別的に存在するものであ
り、例えば(1)RAを持たない被検者の血清と比較した、RAを持つ被検者の
血清において、または、(2)RAを持つ被検者の血清と比較した、RAを持つ
被検者の関節液においてである。 【0020】 ここで用いられているように、特徴(またはタンパク質イソ型)とは、第二サ
ンプルに対して第一サンプル中に「差別的に存在する」ものであり、その場合、
その特徴またはイソ型を検出する方法(例えば2Dゲル電気泳動またはイムノア
ッセイ)によって、その特徴(またはタンパク質イソ型)が第二サンプルと比較
して第一サンプル中に異なる相対的な発生量で存在することは明白である。第一
サンプルにおいて測定された特徴が第二サンプルにおいてより高い相対的な発生
量で存在する場合、該特徴またはイソ型は第二サンプルに対して第一サンプルに
おいて「増加」しており、逆に第一サンプルにおいて測定された特徴が、第二サ
ンプルにおいてより低い相対的な発生量で存在する場合、該特徴またはイソ型は
第二サンプルに対して第一サンプルにおいて「減少」している。 【0021】 好ましくは、二つのサンプルにおける特徴の相対的な発生量は、二つの段階で
決定される。第一に、サンプル中で検出された特徴について得られたシグナルは
、例えば分析されたサンプル中における総タンパク質(例えば、ゲルにローディ
ングした総タンパク質)に対する適切なバックグラウンドパラメータ、不変の特
徴、すなわち比較されるサンプル中でその発生量が類似していることがわかって
いる特徴(例えば、ここで開示されているERF等の、一つまたはそれ以上の発
現参照特徴(Expression Reference Features(ERF))、または、サンプル 中のすべてのタンパク質から検出された総シグナルを参照することによって基準
化(normalized)する。 【0022】 第二に、一つまたはそれ以上のサンプルセット中の特徴に関して基準化された
シグナルは、他のサンプルまたはサンプルセット中の同じ特徴に関して基準化さ
れたシグナルと比較される。これは、第二サンプルに関して、第一サンプル(ま
たはサンプルセット)中に「差別的に存在する」特徴を同定するためである。 【0023】 ここで開示されたRADFとは、一つまたはそれ以上のサンプルを比較するこ
とによって同定されている。RADFの第一グループは、(a)RAを持つ被検
者の血清と比較してRAを持つ被検者の関節液中に差別的に存在する、および(
b)RAを持たない被検者の血清と比較してRAを持たない被検者の関節液中に
差別的に存在しない特徴のことである。RAを持たない被検者は、既知の病気ま
たは症状を持たない正常な被検者、または、通風、変形性関節炎または滑膜炎(
例えば外傷性滑膜炎)を含むRA以外の関節の病気または症状を持つ被検者を含
みうる。RADFの第二グループは、RAを持たない被検者の血清と比較してR
Aを持つ被検者の血清中で差別的に存在する特徴のことである。 【0024】 RADFの四のグループは、該好ましい技術の方法および装置によって同定さ
れている。第一グループは、RAを持つ被検者の関節液中で増加しているが、R
Aを持たない被検者中の血清中に対して関節液中で増加していないようなRAD
Fを含む。これらのRADFは見かけの分子量(MW)および等電点(pI)に
よって下記のように記載されうる。 【0025】 【表1】 【0026】 第二グループは、RAを持つ被検者の血清中に対して関節液中で減少している
が、RAを持たない被検者の血清に対して関節液中で減少していないようなRA
DFを含む。これらのRADFは見かけの分子量(MW)および等電点(pI)
によって下記のように記載されうる。 【0027】 【表2】 【0028】 第三グループは、RAを持たない被検者の血清と比較してRAを持つ被検者の
血清において増加しているようなRADFを含む。これらのRADFは見かけの
分子量(MW)および等電点(pI)によって下記のように記載されうる。 【0029】 【表3】 【0030】 第四グループは、RAを持たない被検者の血清と比較してRAを持つ被検者の
血清で減少しているようなRADFを含む。これらのRADFは見かけの分子量
(MW)および等電点(pI)によって下記のように記載されうる。 【0031】 【表4】 【0032】 第一および第二グループにおける任意の目的のRADFに関して、RAを持つ
被検者の血清中で測定されたシグナルに対して、RAを持つ被検者の関節液中で
測定されたシグナルを比較して得られた比率は、用いた特別な分析方法および検
出技術に依存するだろう。従って本発明は、第一および第二グループ中のそれぞ
れのRADFにおいて、実験室が、従来の診断技術としての分析方法および検出
技術に従って、RAを含むおよび含まない被検者の血清に対する関節液中の各R
ADFの比率に関する参照範囲を確立することを実現しうる。好ましくは、RA
を持つことが知られている被検者の関節液および血清サンプルの少なくとも一つ
の対照対(control pair)、または、RAを持つことがわかっていない被検者の
関節液および血清サンプルの少なくとも一つの対照対(およびより好ましくは,
このような対照対の少なくともいずれか一つ)は、分析されるテストサンプルの
それぞれのバッチとともに含まれる。 【0033】 同様に、第三および第四グループの任意の目的とするRADFにおいて、RA
を持たない被検者の血清中で測定されたシグナルに対して、RAを持つ被検者の
血清中で測定されたシグナルを比較して得られた比率は、用いられた特別な分析
方法および検出技術に依存するだろう。従って、本発明は、それぞれの実験室が
従来の診断技術としての分析方法および検出技術に従って、RAを含むおよび含
まない被検者の第三および第四グループ中の各RADFの比率に関する参照範囲
を確立することを実現しうる。好ましくは、RAを持つことが知られている被検
者の少なくとも一つの陽性対照血清サンプル、または、RAを持つことが知られ
ていない被検者の少なくとも一つの陰性対照血清サンプルは、分析されたテスト
サンプルのそれぞれのバッチとともに含まれる。 【0034】 好ましい実施形態において、RADFと関連するシグナルは、同じ2Dゲルで
検出された一つまたはそれ以上のの発現参照特徴(ERF)を参照して基準に合
わせられる。当業者にとって明白なように、このようなERFは好ましい技術 (Preferred Technology)を用いて異なるサンプルを比較することにより容易に
決定されうる。この目的に対して適切なERFは、これらに限定されないが、以
下の表に示されるものを含む。 【0035】 【表5】 【0036】 表IVは、実施例により、ERF−1およびERF−3に対して基準化された、
表Iおよび表IIで同定されたRADFのレベルを示している。当業者であれば、
RADFのレベルは任意の望ましいERFに関して基準化されうることがわかる
であろう。表VIで示された値は、問題のERFに関する各RADFの比率であり
、ここで陽性の比率はERFに関するRADFの増強されたレベルを示しており
、陰性の比率はERFに関するRADFの減少されたレベルを示している。当業
者にとって明白なように、このRADF/ERF比率はそれら自身の本来の状態
における診断パラメータとして与えられる。 【0037】 【表6】 【0038】 同様に、表VIIはERF−1およびERF−3に対して基準化された、表IIIお
よびIVで同定されたRADFのレベルを示している。当業者であれば、RADF
のレベルは任意の望ましいERFに関して発現され、このRADF/ERF比率
はそれら自身の本来の状態における診断パラメータとして与えられることがわか
るであろう。 【0039】 【表7】 【0040】 熟練した当業者が認識しているように、目的の特徴またはタンパク質イソ型の
測定されたMWおよびpIは、2D電気泳動のそれぞれの段階、および、ランド
マークマッチングで用いられる方法の正確さに依存して、ある程度変化しうる。
ここで用いられているように、「MW」および「pI」という用語は、それぞれ
、以下のセクション6に記載の実験方法(「参照方法」)に正確にしたがって測
定された特徴またはタンパク質イソ型の見かけの分子量および等電点を意味する
と定義される。該参照方法が用いられ、サンプルは二連(duplicate)またはそ れ以上の反復で実験される場合、測定されたRADFまたはRPIのpI平均の
変動は概して±1%以下であり、測定されたRADFまたはRPIのMW平均の
変動は概して±5%以下である。熟練した当業者が参照方法から逸脱する場合、
(a)参照方法によって、および(b)逸脱した方法によって検出されるRAD
Fまたはタンパク質イソ型それぞれに対するMWおよびpIを比較することで検
定実験を行うべきである。 【0041】 RADFは検出、予後、診断もしくはRAのモニタリングまたは薬剤開発に有
用である。本発明の一つの実施形態において、被検者の関節液および血清は2D
電気泳動によって、RADF−1〜RADF−12からなる群より選択される一
つまたはそれ以上のRADFの定量的な検出に関して分析される。ここで、血漿
に対して関節液で増加したRADFの発生量は、RAの存在を示している。 【0042】 本発明の他の実施形態において、被検者の関節液および血清は、2D電気泳動
によって、RADF−13〜RADF−22からなる群より選択される一つまた
はそれ以上のRADFの定量的な検出に関して分析される。ここで血清に対する
関節液中の減少したRADFの発生量はRAの存在を示している。 【0043】 本発明の他の実施形態は、被検者の関節液は、2D電気泳動によって、RAD
F−1〜RADF−22からなる群より選択される一つまたはそれ以上のRAD
Fの定量的な検出に関して分析される。ここで発現参照特徴(ERF)に対する
一つまたはそれ以上のRADFの比率は、RAの存在を示しており、ERF−1
およびERF−3がこの目的においては好ましい。 【0044】 本発明のさらに他の実施形態において、RAを持つ被検者の血清は、2D電気
泳動によって、RADF−13、RADF−16およびRADF−22〜RAD
F−31からなる群より選択される一つまたはそれ以上のRADFの定量的な検
出に関して分析される。ここで被検者またはRAを持たない被検者の血清に関連
した被検者の血清中で増加したRADFの発生量(例えば対照サンプルまたは前
もって決定された参照範囲)は、RAの存在を示している。 【0045】 本発明の他の実施形態において、被検者からの血清は、2D電気泳動によって
、RADF−32〜RADF−40からなる群より選択される一つまたはそれ以
上のRADFの定量的な検出に関して分析される。ここで被検者またはらを持た
ない被検者の血清に関連した被検者の血清中で減少したRADFの発生量(例え
ば対照サンプルまたは前もって決定された参照範囲)はRAの存在を示している
。 【0046】 本発明の他の実施形態において、被検者からの関節液は、2D電気泳動によっ
て、RADF−13、RADF−16、RADF−22〜RADF−40からな
る群より選択される一つまたはそれ以上のRADFの定量的な検出に関して分析
される。ここでERFに関連する一つまたはそれ以上のRADFの比率はRAの
存在を示しており、ERF−1およびERF−3はこの目的に適したERFであ
る。 【0047】 5.2 リウマチ様関節炎診断 タンパク質イソ型(RPI) 本発明の他の観点において、被検者からの血清は、RAのスクリーニングもし
くは診断のために、RA患者の予後を決定するために、もしくは、RA治療の有
効性をモニターするために、または、薬剤開発のために、一つまたはそれ以上の
リウマチ様関節炎診断タンパク質イソ型(RPI)の定量的な検出のために分析
される。ここで用いられているように、「リウマチ様関節炎診断タンパク質イソ
型」は、(1)RAを持たない被検者の血清と比較してRAを持つ被検者の血清
において差別的に存在するタンパク質イソ型、および(2)(a)RAを持つ被
検者の血清と比較してRAを持つ被検者の関節液中に差別的に存在する、および
(b)RAを持たない被検者の血清と比較して関節液中で差別的に存在する、タ
ンパク質イソ型を含む。当業界では周知のように、単一遺伝子のタンパク質生産
物は、異なる翻訳後改変の結果として異なる変異体として発現され(例えば、糖
付加、リン酸化、アシル化等)、そのために同一なアミノ酸配列のタンパク質で
もそれらのpI、MWまたはその両方において異なり、および/または、それら
のアミノ酸組成において異なる(例えばそれにかわるスプライシングまたは制限
タンパク質分解の結果としてである)。それは、タンパク質イソ型が差別的に存
在することは、問題のタンパク質をコードしている遺伝子が差別的に発現される
ことを必要としない、ということを裏付けている。 【0048】 RPIの四つのグループは、RADFの部分的なアミノ酸配列によって、好ま
しい技術の方法および装置を用いて同定されている。第一グループは、RAを持
つ被検者の血清に対して関節液中で増加しているが、RAを持たない被検者の血
清に対して関節液中で増加していないようなRPIを含む。これらのRPIのM
W、pI,および部分的アミノ酸配列は、下記の表VIIIに示される。 【0049】 【表8】 【0050】 【表9】 【0051】 【表10】 【0052】 第二グループは、RAを持つ被検者の血清に対して関節液中で減少しているが
、RAを持たない被検者の血清に対して関節液中で減少していないようなRPI
を含む。これらのRPIのMW、pIおよび部分的アミノ酸配列は、以下の表IX
に示される。 【0053】 【表11】 【0054】 【表12】 【0055】 【表13】 【0056】 【表14】 【0057】 第三グループは、RAを持たない被検者の血清で比較したRAを持つ被検者の
血清中で増加しているようなRPIを含む。これらのRPIのMW、pIおよび
部分的アミノ酸配列は以下の表Xに示される。 【0058】 【表15】 【0059】 【表16】 【0060】 【表17】 【0061】 第四グループは、RAを持たない被検者の血清と比較したRAを持つ被検者の
血清中で減少しているようなRPIを含む。これらのRPIのMW、pI、およ
び部分的アミノ酸配列は、以下の表XIに示される。 【0062】 【表18】 【0063】 本発明の一つの実施形態において、被検者の関節液および血清は、RPI−1
〜RPI−11からなる群より選択された一つまたはそれ以上のRPIの定量的
な検出に関して分析され、ここで、血清に相対して関節液中で増加した一つまた
はそれ以上の上記RPIの発生量はRAの存在を示している。本発明の更なる実
施形態において、被検者の関節液および血清は、RPI−12〜RPI−24か
らなる群より選択される一つまたはそれ以上のRPIの定量的な検出に関して分
析される。ここで血清に関連する関節液中で減少した一つまたはそれ以上の上記
RPIの発生量は、RAの存在を示す。 【0064】 本発明の他の実施形態において、被検者の血清は、RPI−12、RPI−1 6、RPI−17およびRPI−24〜RPI−32からなる群より選択される
一つまたはそれ以上のRPIの定量的な検出に関して分析される。ここで被検者
の血清中で増加した一つまたはそれ以上の上記RPIの発生量は、RAの存在を
示している。本発明の他の実施形態において、被検者の血清は、RPI−33〜
RPI−38からなる群より選択される一つまたはそれ以上のRPIの定量的な
検出に関して分析される。ここで、被検者の血清中で減少する一つまたはそれ以
上のRPI発生量は、RAの存在を示している。 【0065】 好ましくは、RPIの発生量は発現参照タンパク質(ERPI)に対し基準化
される。ERPIは上述したERFの部分的アミノ酸配列によって好ましい技術
の方法の技術を用いて同定されたものである。これらのERPIの部分的アミノ
酸配列および相同な既知のタンパク質は表XIbに示される。 【0066】 【表19】 【0067】 上述したように、ここで記載されたRPIは、そのイソ型がRAに関連するこ
とがまだ知られていない既知のタンパク質、および、未知のタンパク質を含む。
さらに本発明は、それぞれのRPIに関して、分離されたRPIまたはそれらの
断片、および、前期RPIまたは前期断片に結合する抗体を含む。ここで用いら
れているように、「分離された」RPIは、2D電気泳動によって決定されたよ
うに、RPIのものと顕著に異なるpIまたはMWをもつタンパク質またはタン
パク質イソ型から遊離したRPIである。ここで用いられているように、「顕著
に異なる」pIまたはMWは、参照方法にしたがって実施される2D電気泳動上
で、混在するタンパク質イソ型をRPIから分析することができるものである。 【0068】 一つの実施形態において、分離されたタンパク質は、RPIに関する表VIII、
IX、XまたはXIで同定されたアミノ酸配列を持つペプチドを含む前期タンパク質
、RPIに関する表VIII、IX、XまたはXIで同定された値の10%以内(好まし
くは5%以内、さらに好ましくは1%以内)のpIおよびMWを持つ前期タンパ
ク質を含む。 【0069】 本発明のRPIは、当業界で周知の方法によって分析される。一つの実施形態
において、RPIは、それらのMWおよびpIによって2Dゲル上で分離されて
おり、ゲル染色によって可視化される。 【0070】 あるいは、RPIは、RAの検出、予後、診断もしくはモニタリングのために
、または、薬剤開発のために例えばイムノアッセイのような分析によって検出さ
れうる。一つの実施形態において、イムノアッセイは、テストされる被検者から
得られたサンプルを、免疫特異的な結合が起こりうる条件下で、抗RPI抗体と
接触させ、抗体に結合している任意の免疫特異的結合の量を検出または測定する
ことによって実行される。好ましくは、該抗RPI抗体は、同じタンパク質の他
のイソ型ではなくむしろ優先的にRPIと結合する。好ましい実施形態において
、該抗RPI抗体は、前期同じタンパク質の他のイソ型に比べて、少なくとも2
倍大きい親和性、より好ましくは少なくとも5倍大きい親和性、さらにより好ま
しくは10倍大きい親和性でRPIと結合する。 【0071】 他の実施形態において、イムノアッセイは、免疫特異的結合が起こりうる条件
下で、例えばテストされる被検者から得られたサンプルを、抗RPI抗体の複数
と接触させ、同時に、複数の抗体による複数のRPIへの任意の免疫特異的結合
の量を検出または測定することによって行われる。好ましくは、それぞれの抗R
PI抗体は異なるRPIに結合し、かつ任意に固体の支持体(solid support) に固定される。例えば、抗体は二次元アレイ中に固定され、ここでそれぞれの配
列の位置は、単一のRPIに特異的に結合している抗体によって占有されており
、その配列は一つまたはそれ以上のRPIに対して特異的な抗体を有している。
好ましくは、それぞれの抗RPI抗体は、同じタンパク質の他のイソ型よりむし
ろ、RPIに優先的に結合する。好ましい実施形態において、該抗RPI抗体は
、前期同じタンパク質の他のイソ型に比べて、少なくとも2倍大きい親和性、よ
り好ましくは少なくとも5倍大きい親和性、さらにより好ましくは少なくとも1
0倍大きい親和性ででRPIと結合する。 【0072】 一つの実施形態において、組織部位における抗体の結合は、異所的なRPI局
在またはRPIの異所的な(例えば高い、低い、存在しない)レベルを検出する
のに用いられうる。特殊な実施形態において、RPIに対する抗体は、RPIの
存在に関して、患者の組織または血清サンプルを分析することに用いることがで
き、ここで異所的なレベルのRPIはRAを示している。ここで用いられている
ように、「異所的なレベル」とは、その存在に関連して、または、体の一部また
はRAを持たない被検者の類似サンプルにおいてその存在をあらわす標準的なレ
ベル二関連して、増加または減少しているレベルを意味する。 【0073】 使用されうるイムノアッセイは、これらに限定されないが、例えばウェスタン
ブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(enzyme linked immunosorbent
assay;酵素様免疫吸着法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降法、 ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集法、補体結合法、プロティンAイムノアッ
セイ等の技術を用いた、競合的および非競合的な分析システム分析を含む。 【0074】 必要に応じて、RPIは二段階のサンドイッチ分析を用いて検出される。RP
Iがタンパク質の特殊なグリコフォーム(glycoform)を意味する場合、第一段 階において、抗RPI抗体(これは必要に応じて固相上に固定されうる)はRP
Iを補足するために使用されうる。第二段階において、直接または間接的に標識
したレクチンが、補足されたRPIを検出するのに用いられる。(a)RPIと
同じ核タンパク質を持つ他のグリコフォームまたは(b)抗体によって認識され
た抗原決定基を共有している他のイソ型よりも、RPIに優先的に結合するよう
な任意のレクチンがこの目的のために使用される。好ましい実施形態において、
選択されたレクチンは、前期RPIと同じ核タンパク質を持つ他のイソ型に比べ
て、少なくとも2倍の大きさの親和性、より好ましくは5倍の大きさの親和性、
さらにより好ましくは10倍の大きさの親和性でRPIに結合する。目的のRP
Iを検出するのに適したレクチンは、当業界で周知の方法で容易に同定でき、例
えば、Sumar等, Lectins as Indicators of Disease-Associated Glycoforms, I
n: Gabius H-JおよびGabius S (eds.), 1993, Lectins and Glycobiology, 第15
8〜174頁(ここに参照することによってその全体を引用させる)の、第158〜159
頁に記載の表1で列挙されている一つまたはそれ以上のレクチンを試験すること
である。 【0075】 必要に応じて、RPIをコード化した遺伝子、関連した遺伝子ならびに関連し
た核酸配列およびサブ配列(subsequences)は、相補的配列も含み、ハイブリダ
イゼーション分析にも用いられうる。少なくとも約8ヌクレオチドを含むRPI
をコード化したヌクレオチドもしくはそれらのサブ配列、または、前述の相補物
は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用されうる。ハイブリダイゼーシ
ョン分析は、特にRAもしくは治療後のRAの再発におけるRPI遺伝子発現の
異常な変化に関して、検出、予後、診断、または、症状、障害もしくは病気の状
態のモニタリングに使用されうる。特に、このようなハイブリダイゼーション分
析は、RPIをコードしているDNAまたはRNAと、ハイブリダイゼーション
できる核酸プローブを持つ核酸を含むサンプルを、ハイブリダイゼーションしう
る条件下で接触させ、結果生じた任意のハイブリッドを検出または測定すること
を含む方法によって行われる。 【0076】 本発明はまた、診断キットを提供するものであり、このキットは一つまたはそ
れ以上の抗RPI抗体のコンテナを含む。加えて、このようなキットは任意の一
つまたはそれ以上の(1)診断、予後、治療、モニタリング、薬剤開発、または
任意のこれら用途の組み合わせに関する説明書、(2)医薬もしくは生物的製剤
の製造、使用または販売を制御する政府機関(governmental agency)によって 処方された形態において、ヒトへの投与のための製造、使用または販売機関によ
る認可を反映することを通知する通知書、(3)標識された、抗体へ結合するパ
ートナー、および(4)抗RPI抗体が固定されている固相(solid phase)( 例えば試薬片(reagent strip))を任意に含む。標識された、抗体に結合する パートナーがない場合は、抗RPI抗体それ自身を、例えば化学発光、酵素、蛍
光、検出または放射活性成分等のマーカーで標識することができる。 【0077】 本発明はまた、一つまたはそれ以上のコンテナ中に、種類の異なるRPIをコ
ード化したRNAにハイブリダイゼーションできる核酸プローブを含むキットを
提供する。特殊な実施形態において、キットは、一つまたはそれ以上のコンテナ
中にプライマー対を含み(例えば、それぞれ6〜30ヌクレオチドの範囲のサイ
ズであり、より好ましくは10〜20である)、これらは、例えば、RPIをコ
ード化した核酸の少なくとも一部分に対して、適切な反応条件下でポリメラーゼ
チェーンリアクション(例えばInnis等, 1990, PCR Protocols, Academic Press
, Inc., San Diego, CAを参照)、Q(登録商標)レプリカーゼを用いたリガー ゼチェーンリアクション(欧州特許第320,308号参照)、サイクリックプ
ローブリアクションまたは当業界で周知の方法を用いて、増幅反応を仕込むこと
ができる。 【0078】 キットはまた、RPIの複数またはRPIをそれぞれコードする複数の核酸を
検出することも可能である。キットはさらに、例えば標準または対照として使用
するために、分離したRPIタンパク質またはRPIをコード化した核酸の、予
め決められた量を必要に応じて含みうる。 【0079】 5.3 臨床研究における使用 本発明の診断方法および組成物は、例えばRAの治療のための薬剤をテストす
るために、臨床研究のモニターを支援することができる。ひとつの実施形態にお
いて、RAを罹患している患者におけるRADFまたはRPIのレベルを、RA
を罹患していない被検者で見出されたレベルに復活させる、または、治療された
患者において、RADFもしくはRPIレベルを非RAもしくは血清の値、もし
くはその付近に維持する能力に関して、候補分子をテストする。一つまたはそれ
以上のRADFまたはRPIのレベルが分析される。 【0080】 他の実施形態において、本発明の方法および組成物は、臨床研究のための候補
をスクリーニングする場合に、RAを持つそれぞれの個体を同定するために使用
され、次にこのような個体は研究を続行もしくは遮断され、または、治療もしく
は分析のために別々の集団におかれうる。 【0081】 5.4 RPIの精製 特別な観点において、本発明は、これらは抗原決定基(すなわち抗体によって
認識されうるもの)を含む、または、機能的に活性な、分離されたRPI、好ま
しくはヒトRPIならびにその断片ならびに誘導体、および、前述のものをコー
ドする核酸配列を提供する。ここで用いられる「機能的に活性な」RPIとは、
全長(野生型)RPIと関連する、例えばRPI基質またはRPI結合パートナ
ーへの結合、抗原性(抗ターゲット抗体への結合)、免疫原性等の一つまたはそ
れ以上の既知の機能活性を表示する物質のことを言う。 【0082】 特殊な実施形態において、本発明は、少なくとも6個のアミノ酸、10個のア
ミノ酸、50個のアミノ酸、または、少なくとも75個のアミノ酸の断片を提供
する。RPIのいくつかまたはすべての領域が欠損している断片からなる断片ま
たはタンパク質もまた提供される。前述のものをコード化した核酸が提供される
。 【0083】 RPI遺伝子配列を含む組換え核酸が同定されると、その遺伝子生産物を分析
することができる。これは、その生産物の物理的または機能的特性を基礎として
分析することによって達成され、ゲル電気泳動、イムノアッセイ等による生産物
の放射活性標識を含む。 【0084】 RPIが同定されると、クロマトグラフィー(例えばイオン交換、アフィニテ
ィーおよびサイズ分画カラムクロマトグラフィー(sizing column chromatograp
hy))、遠心分離、異なる溶解度による方法(differential solubility)、ま たは、タンパク質を精製する他の任意の標準的な技術を含む標準的な方法によっ
て分離精製される。 【0085】 あるいは、一度組換え核酸によって生産されたRPIが同定されると、RPI
の全体のアミノ酸配列を、組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列
から類推することができる。結果として、そのタンパク質は、当業界で周知の標
準的な化学的方法(例えば、Hunkapille等, M., 1984, Nature 310:105-111参照
)によって合成されうる。 【0086】 他の代替の実施形態において、野生型RPIは、上述したような標準的な方法
によって天然のソースから精製することができる(例えば、免疫親和性精製(im
munoaffinity purification))。 【0087】 好ましい実施形態において、RPIは、米国特許出願番号第08/980,5
74号(ここに参照させることによって引用させる)において説明されている好
ましい方法によって分離される。調整用スケールの実施(preparative-scale ru
ns)に関して、WestermeierのElectrophoresis in Practice (pp. 197-209, 199
3、VCH, Weinheim, Germany)(ここに参照させることによってその全体を参照さ
せる)において説明されている方法に従って、2pHまたはそれ以下の範囲のp
Hを持つ、狭い範囲の「ズームゲル」が、等電点段階において好ましい。この改
変により、大量のターゲットタンパク質をゲルにローディングさせることが可能
になり、それによって当該ゲルから見出されうる分離RPIの量が増えた。調整
用スケールの実施においてこの方法を用いる場合、該好ましい技術は、分離され
たRPIを、1回の実施で一般的に100ngまで供給し、また1000ngま
でも供給可能である。当業界の技術において、ゲル等電点電気泳動を用いる任意
の分離方法において、ズームゲルが用いられることが認められるであろう。 【0088】 本発明の特殊な実施形態において、このようなRPIは、組換えDNA技術ま
たは化学合成方法または天然タンパク質の精製によって生産された場合、これら
に限定されないが、RPIのアミノ酸配列の全部または一部を含むもの、同様に
それらの断片、他の誘導体および類似体を含み、それらに対するタンパク質相同
体も含む。 【0089】 5.5 RPIに対する抗体の生産 本発明に従って、RPI、その断片または他の誘導体、もしくは、それらの類
似体は、免疫抗原として使用され、このような免疫抗原に免疫特異的に結合する
抗体を生産する。このようなタンパク質、断片、誘導体または類似体は、この出
願で上述したセクションにおいて記載された方法を含む任意の従来法によって分
離することができる。生産された抗体は、これらに限定されないが、ポリクロー
ナル、モノクローナル、キメラ、単鎖(single chain)、Fab断片、および、
Fab発現ライブラリを含む。特殊な実施形態において、ヒトRPIに対する抗
体が生産される。他の実施形態において、RPIのドメインに対する抗体が生産
される。特殊な実施形態において、RPIの親水性断片が抗体生産のための免疫
抗原として使用される。 【0090】 1.1 当業界で周知の多様な方法が、RPIまたは誘導体または類似体に対するポリ
クローナル抗体の生産に用いられうる。特殊な実施形態において、RPIのエピ
トープに対するウサギポリクローナル抗体、または、それらのサブ配列が得られ
る。抗体の生産に関して、天然RPIまたはそれらの合成物もしくは誘導体(例
えば断片)を注射することによって、多様な宿主動物が免疫化され、これらに限
定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ウマ、ヤギ等である。多様なアジュバ
ント(adjuvant)が免疫的反応を高めるために使用され、これは宿主種により、
これらに限定されないが、完全または不完全のフロイントのアジュバント、例え
ば水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、例えばリゾレクチン、プルロニックポ
リオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペッ
トヘモシアニン、ジニトロフェノール等の表面活性化物質、ならびに例えばBC
G(カルメット−ゲラン杆菌)等の潜在的に有効なヒトアジュバント、ならびに
コリネバクテリウム−パルバムを含む。 【0091】 RPI配列またはそれらの類似体に対するモノクローナル抗体の調整に関して
、培養における連続した細胞株による抗体分子生産に必要な任意の技術が用いら
れ得る。例えば、Kohlerおよび Milstein (1975, Nature 256:495-497)によって
最初に開発されたハイブリドーマ技術、および、トリオーマ(trioma)技術、ヒ
トB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor 等., 1983, Immunology Today 4:72)、 および、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBV−ハイブリドーマ技術
(Cole等, 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss
, Inc., pp. 77-96)等である(それぞれの外国の参考文献を、ここにそれぞれを
参照させることによって引用させる)。本発明の追加の実施形態において、モノ
クローナル抗体は、PCT/US90/02545(ここに参照させることによ
って引用させる)で説明したように、無菌動物中で生産され得る。 【0092】 5.3 臨床研究における使用 本発明の診断方法および組成物は、臨床研究、例えばRA治療のための薬剤の
テスト、をモニターする際に補助することができる。ある実施形態においては、
候補分子は、RAに冒されている患者におけるRADFまたはRPIレベルを、
RAに冒されていない被験者において確認されるレベル、または、非RAまたは
血清におけるRADFまたはRFIのレベルかそれに近しい値に維持されるよう
に治療が施された患者において確認されるレベルにまで回復させる能力が試験さ
れる。1もしくはそれ以上のRADFまたはRPIのレベルを分析してもよい。
他の実施形態においては、本発明の方法および組成物は、臨床研究のために候補
をスクリーニングする時に、RAを有する個体を同定するために用いられる。こ
のような個体は、その後研究に含んでもよく、除外してもよく、または、治療も
しくは分析のために別のコホートに配置されてもよい。 【0093】 5.4 RPIの精製 特殊な観点においては、本発明は抗原性の決定因子(すなわち、抗体によって
認識されうる)からなる、または前記のものをコード化すると同時に機能的に活
性な、分離されたRPI、好ましくは、ヒトのRPIおよび断片ならびにその誘
導体を提供する。ここで用いられる機能的に活性なRPIとは、フルレング(野
生型)RPIに付随した、1または2以上の公知の機能的な活性を示す物質をい
い、例えば、RPI基質もしくはRPI結合パートナーへの結合、(アンチター
ゲット抗体に結合した)抗原性、または免疫抗原性などがある。 【0094】 特殊な実施形態においては、本発明は、少なくとも6アミノ酸、10アミノ酸
、50アミノ酸、または少なくとも75アミノ酸からなるRPIの断片を提供す
る。RPIの領域が部分的にまたはすべてが欠如している断片または断片を含ん
でなるタンパク質も提供される。前記のものをコード化する核酸が提供される。
RPI遺伝子配列を発現する組換え核酸が同定されると、その遺伝子生成物は分
析されうる。これは生成物の物理的なまたは機能的な特性に基づく分析によって
成され、ゲル電気泳動、イムノアッセイなどによる分析を伴う生成物の放射性標
識が含まれる。RPIが同定されると、クロマトグラフィー(例えば、イオン交
換、アフィニティー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー)、遠心沈殿
法、異なる溶解度による方法(differential solubility)、またはタンパク質 の精製に用いられる通常の他のすべての技術を含む一般的な方法により分離され
、精製されうる。その他に、組換え核酸によって生成されたRPIが同定された
とき、組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列からRPIのアミノ
酸配列全体を推測することができる。結果として、タンパク質は技術的に公知の
一般的な化学的方法によって合成されうる(例えば、Hunkapilleら,
M.,1984,Nature310105−111参照)。他のかわりの実施
形態においては、上記記載の一般的な方法(例えば、イムノアフィニティー精製
)によって天然型RPIが天然のソースから精製されうる。好ましい実施形態に
おいては、参照としてここに組み込まれる米国出願第08/980,574号に
記載の「好ましい技術」によってRPIは分離される。調整段階での実施のため
には、Westermeier,1993,Electrophoresis
in Practice(VCH,Weinheim,Germany),pp
.197−209(全体が参照としてここに組み込まれる)に記載の方法にした
がって、等電点電気泳動段階において2pH単位またはそれ以下のpH範囲を有
する狭い範囲のズームゲルを使用することが好ましい。この変はより大量のター
ゲットタンパク質がゲル上にローディングされることを可能にし、それによって
ゲルから取り出される分離RPIの量も増加する。調整段階での実施のためにこ
の方法が用いられたときは、「好ましい技術」は、一回の実施で一般的には10
0ngにまで及ぶ分離RPIを提供し、1000ngにまで及ぶ量を提供しうる
。当該技術に精通したものであれば、ズームゲルは、ゲル等電収束法を用いたい
かなる分離戦略においても使用されうるものであることを認識するであろう。本
発明の特殊な実施形態においては、そのうようなRPIは、組換えDNA技術に
よって製造されたものであれ、化学的な合成方法によるものであれ、天然タンパ
ク質の精製によるものであれ、断片および他の誘導体ならびにそれらの類似体に
加えて、RPIのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含んでなるものからなる(
しかし、これに限られるものではない)。また、ホモローグなタンパク質を含む
。 【0095】5.5 RPIに対する抗体の製造 本発明にしたがって、RPI、その断片、および他の誘導体、並びにそれらの
類似体が、免疫特異的にイムノゲンに結合する抗体を生成するイムノゲンとして
使用されうる。そのようなタンパク質、断片、誘導体、および類似体は、いかな
る慣用の方法によって分離してもよく、本願の以前のセクションに記載された方
法を含む。生成される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一重
鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリーを含むがこれらに限られるもの
ではない。特殊な実施形態においては、ヒトRPIに対する抗体が製造される。
他の実施形態においては、RPIのドメインに対する抗体が製造されうる。特殊
な実施形態においては、抗体製造のためのイムノゲンとしてRPIの親水性断片
が使用される。 【0096】 1.1 RPIもしくは誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体の製造のため
に、技術的に公知の種々の手法が使用されうる。特殊な実施形態においては、R
PIのエピトープに対するウサギポリクローナル抗体またはその配列が得られる
。抗体の製造のために、天然のRPIもしくは合成型またはその誘導体(例えば
、断片)の注入によってさまざまなホスト動物、ウサギ、マウス、ラット、ウマ
、ヤギ、などが含まれるがこれらに限られるものではない、が免疫される。種々
のアジュバントが免疫学的反応を増加させるために使用されうる。それらはホス
ト種に依存し、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、
水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンなどの表面活性化物質、
プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールカサ
ガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG(Bacille Ca
lmette−Guerin)およびコリネバクテリウム パルバムのような潜
在的に有用なヒトアジュバントが含まれるがこれらに限定されるものではない。
RPI配列およびその類似体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養
中の連続した細胞株による抗体分子の製造のためのいかなる技術を用いてもよい
。例えば、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら,
1983,Immunology Today472)、およびヒトモノクロー
ナル抗体を製造するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら,1985,
in Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77−96)に加
えて、元来KohlerおよびMilstein(1975,Nature25 6 495−497)によって開発されたハイブリドーマ技術がある。(前記文献
はそれぞれ参照としてここに組み込まれる) 本発明の付加的な実施形態においては、ここに参照として組み込まれるPCT
/US90/02545に記載されるように、無菌動物中にてモノクローナル抗
体は製造されうる。本発明にしたがってヒト抗体は使用され、また、ヒトハイブ
リドーマを用いて(Coteら,1983,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA802026−2030)、またはヒトB細胞をインビトロにおい
てEBVウイルスで形質転換することによって(Coleら,1985,in
Monoclonal Antibodies and Cancer The
rapy,Alan R.Liss,pp.77−96)、得ることができる。
実際、本発明次第では、好ましい生物学的に活性なヒト抗体分子から得た遺伝子
に付随するRPIに特異的なマウス抗体分子から得た遺伝子のスプライシングに
よるキメラ抗体の製造のために開発された技術(Morrisonら,1984
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851−6855;N
eubergerら,1984,Nature312604−608;Take
daら,1985,Nature314452−454)を用いることができる
。このような抗体は、本発明の範囲に属するものである。(前記文献はそれぞれ
参照としてここに組み込まれる) 本発明次第では、一重鎖抗体の製造のための技術(参照としてここに組み込ま れる米国特許第4,946,778号)が、RPI特異的な一重鎖抗体を製造す
るために用いられうる。本発明の付加的な実施形態は、Fab発現ライブラリー
の構築のために記載された技術(Huseら,1989,Science246 1275−1281)を利用し、迅速かつ容易なRPI、誘導体、または類似体
に望ましい特異性を有するモノクローナルFab断片の同定を可能にする。分子
のイディオタイプを含む抗体断片は公知の技術によって生成されうる。例えば、
そのような断片としては、抗体分子のペプシン処理によって製造されうるF(a
b´)2断片、F(ab´)2断片のジスルフィド架橋を還元することによって 製造されるFab’断片、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによ
って製造されるFab断片、Fv断片、が含まれるがこられに限られるものでは
ない。抗体の製造に際しては、所望の抗体のためのスクリーニングは、例えば、
ELISA(enzyme−linked immunosorbent as
say)などの公知技術によって遂行される。例えば、RPIの特定のドメイン
を認識する抗体を選択するためには、そのようなドメインを含むRPI断片に結
合する生成物のために、製造されたハイブリドーマを分析することができる。第
一PRIホモローグに特異的に結合するが、異なるRPIホモローグには特異的
に結合しない抗体の選択のためには、第一RPIホモローグへの能動的な結合お
よび第二RPIホモローグへの結合の欠如に基づいて選択することができる。同
様に、RPIに特異的に結合するが、同一のタンパク質(例えば、RPIと同一
のコアペプチドを有する、異なるグリコフォーム)の異なるイソ型には特異的に
結合しない抗体の選択は、RPIへの能動的な結合および異なるイソ型(例えば
、グリコフォーム)への結合の欠如に基づいて選択することができる。RPIの
ドメインに特異的な抗体も提供される。前記抗体は、本発明のRPIの位置およ
び活性に関する技術的に公知の方法、例えば、これらのタンパク質のイメージ化
、好適な生理学的なサンプルにおけるそれらのレベルの測定、診断方法などにお
いて用いられる。 【0097】 加えて、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに、適切な抗
原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによってなさ
れる「キメラ抗体」の製造に関して開発された技術 (Morrison等,1984,Proc.Nat
l.Acad.Sci.,81,6851-6855;Neuberger等,1984,Nature 312,604-608;Takeda等,
1985, Nature,314,452-454)が、使用されうる。キメラ抗体は分子であり、それ において例えばマウスmAbおよびヒト免疫グロブリンコンスタント領域から誘
導された可変領域を持つもの等の異なるタンパク質が、異なる動物種から誘導さ
れる(例えばCabilly等,米国特許第4,816,567号;およびBoss等の米国特許第4,8
16397号をここに参照させることによって引用する)。 【0098】 加えて、ヒト化された交代の製造に関して技術が開発されている(例えばQuee
nの米国特許第5,585,089号およびWinterの米国特許第5,225,539号をここに参照 させることによって引用する)。免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変領域は、
三つの超可変領域によって断続される「フレームワーク」領域からなり、相補決
定領域(complementarity determining region(CDR))として言及される。
フレームワーク領域およびCDRの伸張は、正確に定義されている("Sequences
of Proteins of Immunological Interest", Kabat E.等, U.S.Department of H
ealth and Human Services(1983)を参照)。手短に言うと,ヒト化された抗体 は、非ヒト種からの一つまたはそれ以上のCDRおよびヒト免疫グロブリン分子
からのフレームワーク領域を持つ、非ヒト種からの抗体分子である。 【0099】 あるいは、単鎖の抗体の製造に関して説明された技術(米国特許第4,946,778 号;Bird,1988,Science 242, 423-426;Huston等, 1988, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 85,5879-5883;およびWard等 1989, Nature 334, 544-546を参照)が使 用されうる。単鎖抗体は、Fv領域の重鎖と軽鎖とをアミノ酸架橋によって結合
させ、単鎖ポリペプチドを得るることによって形成される。 【0100】 特異的なエピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって製造され得る
。例えば,このような断片は、これらに限定されないが,抗体分子のペプシン消
化によって生産され得るF(ab’)2断片、および、F(ab’)2断片のジ
スルフィド架橋を還元ことによって生じるFab断片である。 【0101】 あるいは、Fab発現ライブラリが構築され(Huse等,1989, Science, 246, 1
275-1281)、望ましい特異性を持つモノクローナルFab断片の迅速で簡便な同
定が可能である。 【0102】 抗体の標識およびそれらの使用 一つまたはそれ以上のRPIエピトープまたはRPIの保存された可変もしく
はペプチド断片を特異的に認識することのできる検出可能な標識分子に関する方
法がここで説明される。ここで用いられる標識分子および検出方法は、例えば、
HarlowおよびLane(Harlow,E.およびLane,D., 1988, "Antibodies: A Laborator
y Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York)において説明されているものであり、これをその全体を参照させることに
よってここに引用される。 【0103】 RPI特異的抗体またはペプチド類似体(mimetic)が標識され得る一
つの方法は、これを酵素に結合させることによってなされ、例えばELISA(
酵素様免疫吸着法)のような酵素イムノアッセイにおいて使用されうる。抗体に
結合した酵素は適切な基質と反応し、例えば蛍光分光分析法、蛍光定量法または
ウイルスを用いた方法によって検出され得るキメラ部位を生産するこのような方
法において、好ましくは色素を生産する基質(chromogenic substrate)である 。抗体、それらの誘導体および類似体ならびにペプチドを検出可能に標識するた
めに用いられる酵素は、これらに限定されないが、リンゴ酸脱水素酵素、スタフ
ィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−5−ステロイドイソメラーゼ、イーストア
ルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロホスフェート、脱水素酵素、トリオー
スフォスフェートイソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラ
クトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−
ホスフェート−脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラー
ゼである。検出は、該酵素に対する比色基質を用いた比色法によって行われ得る
。検出はまた、同様に調整されたスタンダードと比較した気質の酵素反応の程度
を可視的に比較することによっても行われる。 【0104】 検出方法における使用のために、分子は放射線同位体で標識することが好まし
く、125I、131I、または90mTcが含まれるがこれらに限定されるも
のではない。このようなペプチドおよび抗体は、ラジオイムノアッセイ(RIA
)またはラジオプローブを用いてインビボ分析において検出することができる。
放射性活性な同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの
使用のような方法やオートラジオグラフィーによって検出することができる。抗
体、その誘導体、類似体、およびペプチドを蛍光物質で標識することが可能であ
る。蛍光的に標識されたペプチドは好適な波長の光にさらされ、蛍光によってそ
の存在を確認することができる。最も一般的に使用される蛍光標識が付された化
合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、
フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルデハイド(o−phthal
dehyde)、およびフルオレセスアミン(fluorescamine)で
ある。 【0105】 抗体、その誘導体および類似体ならびにペプチドを、ビオチンで標識すること
も可能である。ビオチンで標識されたペプチドは、アビジンに共有結合した蛍光
標識のようなアビジンと結合した検出可能なマーカーにさらされうる。 【0106】 抗体、その誘導体および類似体、並びにペプチドは、152Euや他のランタ
ニド種のような蛍光発光金属を用いて検出可能なように標識が付されうる。これ
らの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)やエチレンジアミン
テトラ酢酸(EDTA)のような金属キレート群を用いて、抗体、その類似体、
およびペプチドに結合させうる。 【0107】 抗体、その誘導体および類似体、並びにペプチドは、化学発光化合物にカップ
リングすることによって検出可能なように標識することもできる。その後、化学
発光で標識された化合物の存在は、化学反応の過程中に生じる蛍光の存在を検出
することによって確認される。特に有用な化学発光標識化合物の例としては、ル
ミノール、イソルミノール、サロマティックアクリジニウムエステル(ther
omatic acridinium ester)、イミダゾール、アクリジ
ニウム塩、およびシュウ酸エステルが挙げられる。 【0108】 同様に、本発明の抗体、その誘導体および類似体、並びにペプチドに標識する
ために生物発光化合物を用いることもできる。生物発光は、生物学的システム中
に見出される化学発光の一種であり、触媒作用をするタンパクにより化学発光反
応の効率が増加する。生物発光タンパクの存在は、蛍光の存在を検出することに
より確認される。標識の目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、
ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。 【0109】 多様な生物学的サンプルにおけるRPIの存在を検出するために、RPIに特
異的に結合するようにされた標識された抗体を用いることができ、生物学的サン
プルとしては、体液(例えば、血漿、尿、髄液、関節吸引液)、組織サンプル、
またはそのホモジネートが含まれる。そのような標識された抗体は、個体細胞内
または個体細胞上のRPIの位置を可視化するために用いることもできる。 【0110】 RPIに特異的に結合するようにされた、標識された抗体を、RPIの存在を
検出するための診断上の有効量、患者に投与することができる。診断上の有効量
とは、技術的に一般的に入手可能な方法を用いて細胞を検出できるように、その
表面にRPIを含んでなる細胞を診断のターゲットとするのに十分な分子の量を
いう。 【0111】 5.6 RPIをコード化するDNAの分離 RPI遺伝子のクローニングのための特殊な実施形態を以下に例を用いて述べ
るが、これに限定されるものではない。DNAおよびRNAを含み、RPIもし
くは断片またはその類似体をコード化する配列からなる本発明のヌクレオチド配
列は、慣用的な化学的アプローチまたは重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ
チェーンリアクション(PCR)増幅などの技術的に公知の方法を用いて合成さ
れうる。配列はいかなる種のRPI遺伝子の同定およびクローニングも提供し、
例えば、cDNAライブラリー、ゲノミックライブラリー、または発現ライブラ
リーのスクリーニングが挙げられる。本発明のRPIをコード化する配列からな
るヌクレオチド配列は、他のタンパク遺伝子の相補的な伸長と選択的に二重鎖分
子を形成する能力において有用である。応用形態によるが、さまざまな配列同定
を遂行するために種々のハイブリダイゼーション条件が採用されうる。選択性の
度合いを高めるためには、塩が少なく温度が高い条件などの比較的緊縮した条件
が二重鎖を形成するために使用される。ここで使用されている「高度に緊縮した
条件」とは、65℃の0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム( SDS)、1mM EDTA中において濾過器に結合されたDNAへハイブリダ
イゼーションし、68℃の0.1xSSC/0.1%SDSで洗浄することを意
味する(全体が参照としてここに組み込まれるAusubel F.M.ら,e
ds.,1989,Current Protocols in Molecu
lar Biology,Vol.I,Green Publishing A
ssociates,Inc.,and John Wiley&sons,I
nc.,ニューヨーク,p.2.10.3)。いくつかの応用にあたっては、緊
縮度合いがより少ないハイブリダイゼーション条件が必要とされる。ここで用い
られる「適度に緊縮した条件」とは、42℃の0.2xSSC/0.1%SDS
で洗浄することを意味する(Ausubelら,1989,上記文献)。ハイブ
リダイゼーション条件は、ハイブリッド二重鎖を不安定化させるために、ホルム
アミドの量を増加することによってより緊縮したものとすることもできる。この
ように、特定のハイブリダイゼーション条件は容易に操作されるものであり、一
般的には所望する結果に応じて選択される。例えば、50%のホルムアミド存在
下における慣用的なハイブリダイゼーション温度は、RPI遺伝子断片に対して
95〜100%ホモローグであるプローブに対しては42℃であり、90〜95
%ホモローグの時は37℃、70〜90%ホモローグの時は32℃である。ゲノ
ミックライブラリーの調製にあたっては、その一部がRPIの一部または全体を
コード化するDNA断片が製造される。DNAは種々の制限酵素を用いて特定の
サイトで開裂することもできる。かわりに、DNAを断片化するためにマンガン
存在下においてDNアーゼを用いることもでき、または、例えば、超音波処理に
よってDNAを物理的にせん断することもできる。DNA断片は、その後、一般
的な技術によって大きさに従って分離される。方法としては、アガロースおよび
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、並びにショ糖勾
配遠心法が含まれるがこれらに限定されるものではない。DAN断片はその後好
適なベクター、プラスミド、コスミド、バクテリアファージラムダもしくはT4
、およびイースト人工クロモソーム(YAC)が含まれるが限定されるものでは
ない、に挿入される。(例えば、Sambrookら,1989,Molecu
lar Cloning,A Laboratory Manual,2d E
d.,Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,Cold Spring Harbor,ニューヨーク;Glover,
D.M.(ed.),1985,DNA Cloning A Practic
al Approach,MRL Press,Ltd.,Oxford,イギ
リス国 Vol.I,II;Ausubel F.M.ら,eds.,1989
,Current Protocols in Molecular Biol
ogy,Vol.I,Green Publishing Associate
s,Inc.,and John Wiley&sons,Inc.,ニューヨ
ーク参照)。ゲノミックライブラリーは、標識されたプローブへの核酸ハイブリ
ダイゼーションによってスクリーニングすることもできる(Benton an
d Davis,1977,Science196180;Grunstein
and Hogness,1975,Proc.Natl.Acad.Sci
.USA723961)。ゲノミックライブラリーは、技術的に公知の最適なア
プローチを用いて、RPIのいかなるペプチドのアミノ酸配列も対応する標識さ
れた改変オリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングすることもできる。
用いられるプローブは、10ヌクレオチドまたはそれ以上であることが好ましく
、15ヌクレオチドまたはそれ以上であることがより好ましい。上記表8〜11
に示されるように、ここで開示されるいくつかのRPIは、その配列が公知であ
る遺伝子によってコード化された、以前に同定されたタンパクに対応するもので
ある。そのような遺伝子をスクリーニングするために、その遺伝子またはその補
体に相補的ないかなるプローブを用いてもよい。プローブは10ヌクレオチドま
たはそれ以上であることが好ましく、15ヌクレオチドまたはそれ以上であるこ
とがより好ましい。http//www.ncbi.nlm.nih.gov/
でアクセス可能なNational Center for Biotechn
ology Information(NCBI)に保持されているEntre
zデータベースは、以下の受け入れ番号によりこれらのRPIに対応する遺伝子
配列を提供する。また、それぞれの配列はここに組み込まれる。 【0112】 【表20】 【0113】 【表21】 【0114】 RPI−10、RPI−17、およびRPI−20のそれぞれに関しては、以
下のような変質した一連のプローブが提供される。 (a) RPI−10に対するプローブ 【0115】 【化1】 【0116】 (b) RPI−17に対するプローブ 【0117】 【化2】 【0118】 (c) RPI−20に対するプローブ 【0119】 【化3】 【0120】 RPIまたはその断片をコード化する挿入DNAを有するライブラリーのクロ
ーンは、1またはそれ以上の改変オリゴヌクレオチドプローブ(またはそれらの
相補体)にハイブリダイゼーションする。そのようなオリゴヌクレオチドプロー
ブのゲノミックライブラリーへのハイブリダイゼーションは、技術的に公知の方
法を用いて実施される。例えば、上述した一連の改変したオリゴヌクレオチドプ
ローブもしくはそれらの相補体と(または、そのような一連のものもしくは相補
体の1つと)のハイブリダイゼーションは、前記高度に緊縮した条件、または適
度に緊縮した条件下において実施される。または、55℃の2X SSC、1.
0%SDS中で実施し、同条件で洗浄する。さらに他の観点においては、RPI
もしくはRPI誘導ポリペプチドの一部または全体をコード化するヌクレオチド
配列のクローンを、発現ライブラリーのスクリーニングによって得ることもでき
る。例えば、ベクターが導入されるホストセルによってベクター内に挿入された
配列が発現しうるように、関連するソースからのDNAが分離され、ランダム断
片が調製され、発現ベクター中(例えば、バクテリオファージ、プラスミド、フ
ァージミド、またはコスミド)にライゲーションされる。種々のスクリーニング
分析がその後、発現したRPIまたはRPI誘導ポリペプチドに対する選択のた
めに使用されうる。ある実施形態においては、本発明の種々のアンチRPI抗体
は、技術的に公知の方法を用いて、所望のクローンを同定するために使用されう
る。例えば、HarlowおよびLane,1988,Antibodies
A Laboratory Manual,Cold Spring Harb
or Laboratory Press,Cold Spring Harb
or,NY,Appendix IV参照。ライブラリーからのクローンまたは
プラークは、結合するそれらのクローンを同定するために抗体と接触するように
される。ある実施形態においては、RPIもしくはRPI誘導ポリペプチドをコ
ード化するDNAを含んでなるクローンまたはプラークは、ここに参照として組
み込まれるOlsvickら,29th ICAAC,Houston,Tex
.1989に従い、DYNAビーズを用いて検出することができる。アンチRP
I抗体はトシル化されたDYNAビーズM280に架橋され、その後、これらの
抗体を含むビーズは、RPIもしくはRPI誘導ポリペプチドを発現するクロー
ンまたはプラークに吸着するために使用される。RPIもしくはRPI誘導ポリ
ペプチドを発現するクローンまたはプラークは、ビーズに結合するこれらのいず
れかとして同定される。かわりに、アンチRPI抗体は、シリカやCelite
(登録商標)樹脂のような好適な単体に非特異的に固定されうる。その後、この
物質は、前節に記載したように、RPIタンパクまたはRPI誘導ポリペプチド
を発現する細菌性コロニーに吸着するために使用される。他の観点においては、
PCR増幅が、ゲノミックDNAからのRPIの一部または全体をコード化する
十分に純粋なDNAを製造するために使用されうる。公知のRPI配列に対応す
るオリゴヌクレオチドプライマー、変質物、その他のものは、プライマーとして
使用されうる。例えばPerkin−Elmer Cetus thermal
cycler and Taq polymerase(Gene Amp(
登録商標))によって、PCRは実施されうる。PCR反応において使用するた
めに、数種の異なる改変プライマーを合成することを選択することができる。変
質プライマーとDNA中の対応する配列とのヌクレオチド配列類似性の度合いを
向上または減少させるために、PCR反応のプライミングの際に用いられるハイ
ブリダイゼーション条件の緊縮度を変化させることも可能である。RPIをコー
ド化する配列のセグメントの連続した増幅後、セグメントは分子的にクローニン
グ、および配列され、完全なゲノミッククローンを分離するためプローブとして
利用される。前記文献に記載したように、これにより、遺伝子の完全なヌクレオ
チド配列、その発現の分析、および機能的な分析のためのそのタンパク生成物の
製造が順番に可能となる。RPI遺伝子はインビトロ翻訳を伴う核酸ハイブリダ
イゼーションによるmRNA選択によっても同定することができる。この手法に
おいては、断片はハイブリダイゼーションによる相補性mRNAを分離するため
に使用される。そのようなDNA断片は、入手可能な他の種(例えば、マウス、
ヒト)の精製RPI DNAを再現することができる。分離されたmRNAの分
離生成物のインビトロ翻訳生成物の免疫沈降分析または機能分析(例えば、イン
ビトロでの凝集能力、レセプターへの結合)によりmRNAが同定され、したが
って所望の配列を含む相補性DNA断片が同定される。さらに、RPIに対して
特異的な固定された抗体への、細胞から分離されたポリソームの吸着によって特
異的mRNAを選択することができる。放射線標識されたRPI cDNAは、
テンプレートとして選択された(吸着ポリソームからの)mRNAを用いて合成
することができる。放射線標識されたmRNAまたはcDNAは、その後、他の
ゲノミックDNA断片中からRPI DNA断片を同定するためにプローブとし
て使用することができる。分離されたRPIゲノミックDNAの代用としては、
公知の配列からの遺伝子配列そのものの化学合成、またはRPIをコード化する
mRNAに対するcDNAの調製が含まれるがこられに限定されるものではない
。例えば、RPI遺伝子cDNAクローニングのためのRNAは、RPIを発現
する細胞から分離することができる。他の方法も可能であり、本発明の範囲に含
まれるものである。 【0121】 いずれの真核生物細胞も、潜在的にRPI遺伝子の分子クローニングのための
核酸ソースとして作用しうる。RPIをコード化する核酸配列は、霊長類ソース
、昆虫、植物などに加えて、脊椎動物、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ
、ウマ、イヌ、から分離することができる。DNAは、化学合成によって、cD
NAクローニングによって、またはゲノミックDNAもしくはその断片のクロー
ニングによってクローンDNA(例えば、DNAライブラリー)から技術的に一
般的な公知の手法によって得ることができ、所望の細胞から精製される(例えば
、Sambrookら,1989,Molecular Cloning,A
Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring
Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor,ニューヨーク;Glover,D.M.(ed.),1985
,DNA Cloning A Practical Approach,MR
L Press,Ltd.,Oxford,イギリス国Vol.I,II.参照
)ゲノミックDNAから誘導されたクローンは、コード化領域に加えて調節およ
びイントロン領域を含んでいてもよく、cDNAから誘導されたクローンはエク
ソン配列のみを含むものである。ソースが何であれ、RPI遺伝子は、調製のた
めに好適なベクター内に分子的にクローンされるべきである。同定され分離され
た遺伝子またはcDNAは、その後、好適なクローニングベクター内に挿入され
うる。技術的に公知の多数のベクター−ホスト系を使用することが可能である。
可能なベクターとしては、プラスミド、改変ウイルスが含まれるがこれらに限ら
れるものではない。しかし、ベクター系は使用されるホスト細胞に適合するもの
でなければならない。そのようなベクターとしては、ラムダ誘導体のようなバク
テリオファージ、PBR322もしくはpUCプラスミド誘導体またはBlue
scriptベクター(Stratagene)のようなプラスミドが含まれる
がこれらに限られるものではない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、
相補的な相補末端を有するクローニングベクターへのDNA断片のライゲーショ
ンによって実施することができる。しかし、もしDNAを断片化するために用い
られる相補的な制限サイトがクローニングベクターには存在しなければ、DNA
分子の末端を酵素的に修飾することができる。かわりに,所望のいかなるサイト
をDNA末端へのヌクレオチド配列(リンカー)のライゲーションによって作製
することもでき、これらのライゲーションされるリンカーは、制限エンドヌクレ
アーゼ認識配列をコード化する化学合成された特異的なオリゴヌクレオチドを含
んでいてもよい。代用方法においては、開裂したベクターおよびRPI遺伝子は
、ホモポリマー性テーリングによって修飾されてもよい。遺伝子配列の多数のコ
ピーを生成するために、組換え分子を形質転換、形質移入、感染、エレクトロポ
レーションなどによってホスト細胞中に導入することができる。特殊な実施形態
においては、分離されたRPI遺伝子、cDNA、または合成DNA分子を組み
込んだ組換えDNA分子でのホスト細胞の形質転換により、遺伝子の多様なコピ
ーの製造が可能になる。このように、遺伝子は形質転換物を成長させ、形質転換
物から組換えDNA分子を分離し、必要とあれば分離組換えDNAから挿入され
た遺伝子を検索することによって大量に得ることができる。 【0122】 本発明によって提供されるRPI配列は、天然RPIにおいて確認されるもの
と実質的に同一であるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列、および機
能的に同等なアミノ酸を有するアミノ酸配列をコード化した配列、それに、他の
ターゲット誘導体およびその類似体をコード化する配列を含むがこれらに限られ
るものではない。 【0123】 5.7 RPIをコード化するDANの発現 RPIもしくは機能的に活性な類似体もしくはその断片または誘導体をコード
化するヌクレオチド配列は、好適な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパ
ク質コード化配列の転写および翻訳のために必要な要素を含むベクター、中に挿
入することができる。必要な転写のおよび翻訳のシグナルは、天然RPI遺伝子
またはその側面領域によって供給することができる。種々のホスト−ベクター系
を、タンパク質コード化配列を発現させるために利用することができる。これら
としては、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)に感
染した哺乳類細胞株、ウイルス(バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞株、イ
ーストベクターを含むイーストにような微生物、またはバクテリオファージ、D
NA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換されたバクテリア
が含まれるがこれらに限定されるものではない。ベクターの発現要素は、強度お
よび特異性において異なる。利用されるホスト−ベクター系によって、いくつか
の好適な転写および翻訳要素の一つが使用されうる。特殊な実施形態においては
、ヒトRPI遺伝子、またはヒトRPIの機能的に活性な部分をコード化する配
列が発現される。さらに他の実施形態においては、RPIのドメインを含んでな
るターゲットの断片が発現される。 【0124】 1.1 1.1 好適な転写および翻訳制御シグナル並びにタンパク質コード化配列からなるキ
メラ遺伝子を含んでなる発現ベクターを構築するために、ベクター内へのDNA
断片の挿入に関して以前に記載されたいかなる方法を用いることもできる。これ
らの方法はインビトロ組換えDNAおよび合成方法並びにインビボ組換え体(遺
伝学的組換え)を含む。RPIおよびペプチド断片をコード化する核酸配列の発
現は、第2核酸配列によって調節され、組換えDNA分子で形質転換されたホス
トにおいてRPIまたはペプチドが発現する。例えば、RPIの発現は、技術的
に公知のいかなるプロモーターまたはエンハンサー要素によっても制御すること
ができる。RPI遺伝子発現を制御するために用いられるプロモーターとしては
、SV40早期プロモーター領域(BernoistおよびChambon,1
981,Nature290304−310)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末
端反復に含まれるプロモーター(Yamamotoら,1980,Cell22 787−797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら,
1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA781441−14
45)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982
,Nature29639−42)、β−ラクタマーゼプロモーターのような原
核細胞発現ベクター(Villa−Kamaroffら,1978,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA753727−3731)、またはtac
プロモーター(DeBoerら,1983,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA8021−25)が含まれるがこれらに限られるものではない。S
cientific American,1980,24274−94記載の組
換えバクテリアから得られた有用なタンパク;ノパリンシンセターゼプロモータ
ー領域(Herrera−Estrellaら,Nature303209−2
13)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Ga
rdnerら,1981,Nucl.Acids Res.92871)および
光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター(Her
rera−Estrellaら,1984,Nature310115−120
)からなる植物発現ベクター;Gal4プロモーター、ADC(alcohol
dehydrogenase)プロモーター、PGK(phosphogly
cerol kinase)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモータ
ー、および組織特異性を示し、膵腺房細胞において活性なトランスジェニック動
物エラスターゼI遺伝子制御領域において活用される以下の動物転写制御領域、
のようなイーストもしくは他の菌類から得たプロモーター要素(Swiftら,
1984,Cell38639−646;Ornitzら,1986,Cold
Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399
−409;MacDonald,1987,Hepatology7425−5
15);膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan
,1985,Nature315115−122)、リンパ球において活性なイ
ムノグロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら,1984,Cell 38 647−658;Adamesら, 1985,Nature318533
−538;Alexanderら,1987,Mol.Cell.Biol.7 1436−1444)、精巣、胸部、リンパ球、および肥満細胞において活性な
マウス***腫瘍ウイルス制御領域(Lederら,1986,Cell4548
5−495)、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert
ら,1987,Genes and Devel.1268−276)、肝臓に
おいて活性なアルファフェトタンパク遺伝子制御領域(Krumlaufら,1
985,Mol.Cell.Biol.51639−1648;Hammerら
,1987,Science23553−58);肝臓において活性なアルファ
1−アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら,1987,Genes
and Devel.1161−171)、脊髄細胞において活性なベータグ
ロビン遺伝子領域(Mogramら,1985,Nature315338−3
40;Kolliasら,1986,Cell4689−94);脳の乏突起膠
細胞において活性なミエリン塩基性タンパク遺伝子制御領域(Readhead
ら,1987,Cell48703−712);骨格筋において活性なミオシン
軽鎖−2遺伝子制御領域(Sani,1985,Nature314283−2
86)、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制
御領域(Masonら,1986,Science2341372−1378)
も参照される。 【0125】 特殊な実施形態においては、操作可能なようにRPIコード化核酸に結合した
プロモーター、1またはそれ以上の複写源、および、場合によっては1またはそ
れ以上の選択可能なマーカー(例えば、抗生物質抵抗性の遺伝子)からなるベク
ターが使用される。 【0126】 特殊な実施形態においては、発現構成は、3つのpGEXベクター(グルタチ
オンS−トランスフェラーゼ発現ベクター;SmithおよびJohnson,
1988,Gene731−40)それぞれのEcoRI制限サイトに、RPI
をコードする配列をサブクローニングすることによって成される。これにより、
正しいリーディングフレームにおいてサブクローンからのRPI生成物の発現が
可能になる。 【0127】 RPI遺伝子挿入を含んでなる発現ベクターは3つの一般的なアプローチ、(
a)核酸ハイブリダイゼーション、(b)マーカー遺伝子機能の存在または欠如
、および(c)挿入された配列の発現、によって同定されうる。第一のアプロー
チにおいては、発現ベクターに挿入されたRPI遺伝子の存在は、挿入されたR
PI遺伝子にホモローグである配列を含んでなるプローブを用いた核酸ハイブリ
ダイゼーションによって検出することができる。第2のアプローチにおいては、
組換えベクター/ホスト系は、ベクター中のRPI遺伝子の挿入によって引き起
こされる、あるマーカー遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質
抵抗性、形質転換フェノタイプ、バキュロウイルスにおける吸蔵体形成(occlus
ion body formation)など)の存在または欠如に基づいて同定され、選択される
。例えば、RPI遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、
RPI遺伝子挿入を含んでなる組換え体はマーカー遺伝子機能の欠如によって同
定することができる。第3のアプローチにおいては、組換え発現ベクターは組換
え体によって発現されるRPI遺伝子生成物を分析することによって同定するこ
とができる。そのような分析は、例えば、インビトロ分析システムにおけるRP
Iの物理的または機能的な特性、例えば、アンチRPI抗体との結合に基づくも
のでありうる。 【0128】 特定の組換えDNA分子が同定および分離されると、技術的に公知の数種の方
法がそれを増殖させるために用いられうる。好適なホストシステムおよび成長条
件が設定されると、組換え発現ベクターは増殖され、大量に調製される。前記説
明したように、使用されうる発現ベクターとしては、いくつかの例を挙げると、
以下のベクターおよびその誘導体、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスの
ようなヒトまたは動物ウイルス;バキュロウイルスのような昆虫ウイルス;イー
ストベクター;バクテリオファージベクター(例えば、ラムダ)、並びにプラス
ミドおよびコスミドDNAベクター、が含まれるがこられに限られるものではな
い。 【0129】 加えて、挿入された配列の発現を調節する、または所望の特殊な方法で遺伝子
生成物を改変し加工するホスト細胞株を選択することができる。あるプロモータ
ーからの発現は、ある誘導物質の存在下において上昇させることができる。この
ように遺伝子工学的に加工されたRPIの発現を制御しうる。さらに、異なるホ
スト細胞は、翻訳中のおよび翻訳後の加工および改変(例えば、タンパクの糖付
加、リン酸エステル化)に関する固有で特異的なメカニズムを有する。発現され
た外来タンパクに所望の改変および加工を確保するために、好適な細胞株または
ホストシステムを選択することができる。例えば、糖付加されていないコアタン
パク生成物を製造するために、細菌性システムにおける発現を用いることができ
る。イーストにおける発現により糖付加生成物が製造される。哺乳類細胞におけ
る発現は、ヘテロローグタンパクの天然糖付加を確実にするために使用されうる
。さらに、ベクター/ホスト発現系が異なると、加工反応への影響も異なるもの
となりうる。 【0130】 組換えタンパクの長期間、高収率生成のためには安定した発現が好ましい。例
えば、差別的に発現されたまたは経路遺伝子タンパク(pathway gene protein)
を安定的に発現する細胞株が設計されてもよい。複写のウイルス起源を含む発現
ベクターを使用するよりも、好適な発現制御要素(例えば、プロモーター、エン
ハンサー、シーケンサー、転写ターミネーター、ポリアデニレーションサイトな
ど)および選択可能なマーカーによって制御されたDNAで、ホスト細胞を形質
転換する方が好ましい。外来DNAの導入に続いて、設計された細胞を1〜2日
間強化培地において成長させ、その後選択性の培地に切り替えることができる。
組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に抵抗力を与え、細胞が安定的
にプラスミドをクロモソームと結合させ、成長して、順にクローニングされ細胞
株内に展開されるフォーカスを形成することを可能にする。この方法は、差別的
に発現されたまたは経路遺伝子タンパクを発現する細胞株を設計するために好適
に使用されうる。そのような設計された細胞株は、差別的に発現されたまたは経
路遺伝子タンパクの内因性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評
価において特に有用でありうる。 【0131】 多数の選択システムを使用することができ、単純ヘルペスウイルスチミジンキ
ナーゼ(Wiglerら,1977,Cell11223)、ヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska&Szybal
ski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48202
6)、およびアデニンフォスフォリボシールトランスフェラーゼ(Lowyら,
1980,Cell22817)遺伝子が、それぞれtk-,hgprt-または
aprt-細胞において採用されうるがこれらに限られるものではない。また、 アンチメタボライト耐性が、耐性をメトトレキセートに付与するdhfr(Wi
glerら,1980,Natl.Acad.Sci.USA773567;O
´Hareら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA7 8 1527)、マイコフェノル酸に耐性を付与するgpt(Mulligan&
Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA7820
72)、アミノグリコシドG−418に耐性を付与するneo(Colberr
e−Garapinら,1981,J.Mol.Biol.1501)、ヒグロ
マイシンに耐性を付与するhygro(Santerreら,1984,Gen
e30147)遺伝子に対する選別の基礎として用いられうる。 【0132】 他の特殊な実施形態においては、RPI、断片、類似体、および誘導体が、(
(異なるタンパクの)ヘテロローグタンパク配列に結合したペプチドを解して結
合したタンパク、断片、類似体、または誘導体からなる)融合体またはキメラタ
ンパク生成物として発現されうる。そのようなキメラ生成物は、所望のアミノ酸
配列をコード化する好適な核酸配列を、技術的に公知の方法を用いて適切なコー
ディングフレームにおいて互いにライゲーションし、技術的に一般的に知られた
方法によってキメラ生成物を発現することによって成される。かわりに、そのよ
うなキメラ生成物はタンパク合成技術によって、例えば、ペプチド合成機の使用
によって成すこともできる。cDNAおよびゲノミック配列の双方がクローニン
グされ、発現しうる。 【0133】 5.8 RPIの治療上の使用 本発明は治療上の化合物の投与による種々の疾病および疾患の治療並びに予防
を提供する。そのような化合物としては、RPIおよび類似体並びに(断片を含
む)それらの誘導体(例えば、ここに記載したようなもの);その抗体(ここに
記載);RPI、類似体、または誘導体(ここに記載)をコード化する核酸;R
PI遺伝子アンチセンス核酸並びにRPI遺伝子作動薬および拮抗剤が含まれる
がこれらに限られるものではない。ここに記載されたように、本発明の重要な特
性は、リウマチ様関節炎に含まれるRPI遺伝子の同定である。関節炎は、RA
患者の血清に対して関節液において減少するRPIの機能もしくは発現を促進す
る、治療上の化合物を投与することによって治療または予防されうる。関節炎は
、RA患者の血清に対して関節液において増加するRPIの機能または発現を低
下させる治療上の化合物の投与によっても治療または予防されうる。一般的に、
種の起源または(抗体の場合には)種の反応性が患者の化合物と同じ種である化
合物を投与することが好ましい。このように、好ましい実施形態においては、治
療または予防のために、ヒトRPI、誘導体、もしくは類似体、もしくは核酸、
またはヒトRPIに対する抗体がヒト患者に投与される。 【0134】 5.8.1 リウマチ様関節炎の治療および予防 リウマチ様関節炎は、RAを有する被験者の血清に対して関節液において減少
する1もしくはそれ以上のRPIのレベルもしくは機能、または1もしくはそれ
以上のRADFのレベルを促進する(すなわち、増加または供給する)化合物の
投与によって、治療または予防される。そのような化合物の例としては、機能的
に活性で、特にインビトロ分析または動物モデルにおいて活性であることが証明
されるRPI、誘導体、または断片、並びにRPIもしくは機能的に活性な誘導
体またはその断片(例えば、遺伝子治療においての使用のため)をコード化する
核酸が含まれるがこれに限られるものではない。使用されうる他の化合物、例え
ばRPI作動薬は、インビボ分析を用いて同定されうる。 【0135】 リウマチ様関節炎は、RAを有する被験者の血清に対して関節液において増加
量を示す1もしくはそれ以上のEPIのレベルもしくは機能、または1もしくは
それ以上のRADFのレベルを阻害する(すなわち減少する)化合物の投与によ
っても治療されまたは予防される。そのような化合物の例としては、RPIアン
チセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはRPIに対して検出される抗
体が含まれるがこれらに限られるものではない。使用されうる他の化合物、例え
ば、RPI拮抗薬は、インビトロ分析を用いて同定できる。 【0136】 特殊な実施形態において、1もしくはそれ以上のRPIのレベルもしくは機能
、または1もしくはそれ以上のRADFのレベルを促進する化合物は、治療的に
(RPIレベルもしくは機能、またはRADFレベルの欠如や減少(通常のまた
は好ましいものと比較して)が、RA患者の血清と比較してRA患者の関節液に
おいて同定されたときは予防的にも)投与される。他の実施形態においては、R
PIのレベルもしくは機能、またはRADFのレベルを阻害する化合物が治療的
に(RPIレベルもしくは機能、またはRADFレベルの増加(通常のまたは好
ましいものと比較して)が、RA患者の血清と比較してRA患者の関節液におい
て同定されたときは予防的に)投与される。そのような化合物の投与によるRP
I機能もしくはレベルまたはRADFレベルの変化は、例えば、患者の組織サン
プルを得て(例えば、生検で)、インビトロにおいてRNAもしくはタンパクレ
ベルまたは表現されたRPI RNAもしくはタンパクの活性を分析することに
よって容易に同定することができる。「好ましい技術」も、化合物投与の前後に
おいてRPIまたはRADFのレベルを検出するために使用されうる。技術的に
一般的な多種の方法がこのように用いられ、キナーゼ分析、RPIを検出および
/または視覚化するためのイムノアッセイ(例えば、ウェスタン法、ドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を伴う免疫沈降、免疫細胞化学な
ど)、および/またはRPIをコード化するmRNAをそれぞれ検出および/ま
たは視覚化することによってRPI表現を検出するためのハイブリダイゼーショ
ン分析(例えば、ノーザン法、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼー
ション、など)、などが含まれるがこれらに限られるものではない。 【0137】 本発明の化合物としては、例えば、その化合物が非ステロイドの炎症剤(NS
AID)(例えば、プレドニゾン、イブプロフェン、フェノプロフェン、ケトプ
ロフェン、フルルブプロフェン、インドメタシン、スリンダク、アスピリン、サ
リチルサリチル酸、ジフルニサル、ナプロキセン、ピロキシカム、テノキシカム
、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン)ではない条件の下で、RA RP
IまたはRADFプロフィールを通常にまで回復させる小さな有機分子、タンパ
ク、ペプチド、抗体、核酸など、金塩、D−ペニシラミン、ヒドロキシクロロキ
ン、またはサルファサルアジンのような抗マラリア薬、アザチオプリン、シクロ
ホスファミド、クロランブシル、メトトレキセート、コルチコステロイド、アン
チ−CD4モノクローナル抗体、並びにアンチ−CDw52抗体が含まれるがこ
れらのいずれいも限られるものではない。 【0138】 5.8.2 遺伝子治療 特殊な実施形態において、RPIまたはそれらの機能的な誘導体をコード化し
た配列を含む核酸は、RPI機能を促進するために遺伝子治療の手法によって投
与される。遺伝子治療は、発現された、または、発現可能な核酸物質を投与する
ことによって行われる治療のことである。本発明のこの実施形態において、該核
酸は、RPI機能を促進することによって治療的効果を仲介する、コードされた
タンパク質を生産する。 【0139】 当業界で使用され得る遺伝子治療の任意の方法が、本発明に従って使用され得
る。模範的な方法を以下に記載する。 【0140】 遺伝子治療方法の一般的な報告として、Goldspiel等, 1993, Clinical Pharma
cy 12488-505; WuおよびWu, 1991, Biotherapy 387-95; Tolstoshev, 1993, A nn. Rev. Pharmacol. Toxicol . 32573-596;Mulligan, 1993, Science 260926-9
32;ならびに、MorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62191-217 ; May, 1993, TIBTECH 11(5)155-215)が参照される。当業界で周知の、使用さ れる組換えDNA技術の方法は、Ausubel等,(eds.), 1993, Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY;および Kriegler, 1990, Gen
e Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYで説明
されている。 【0141】 好ましい観点において、その化合物は、RPIをコード化した核酸、好ましい
宿主中でRPIまたはそれらの断片もしくはキメラタンパク質を発現する発現ベ
クターの部分である前記核酸を含む。特に、このような核酸は、RPIコード領
域に操作可能に(operably)結合したプロモーター、誘導性または構成性および
任意に組織特異的な前記プロモーターを有している。他の特別な実施形態におい
て、核酸分子が用いられ、その際、RPIコード配列および他の任意の望ましい
配列が、ゲノム中の望ましい部位における相同性組換えを促進するような領域の
側に配置され、このようにしてRPI核酸の染色体内発現に供給される(Koller
およびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 868932-8935; Zijlstra 等, 1989, Nature 342435-438)。 【0142】 核酸の患者への運搬が、直接的であれば、患者は直接的に該核酸または核酸を
含むベクターにさらされ、または、直接的であれば、細胞は最初にインビトロで
核酸により形質転換され、次に患者中に移植される。これら二つのアプローチが
、それぞれ、インビボまたはインビトロの遺伝子治療として知られている。 【0143】 特別な実施形態において、該核酸は直接的にインビボで投与され、発現されて
コード化した生産物を生産する。これは任意の当業界で周知の膨大な方法によっ
て行われ、例えばそれを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内に
するためにそれを投与する、例えば欠損もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他
のウイルスベクターを用いた感染(例えば、米国特許第4,980,286号)、もしく は、裸のDNAの直接注射、もしくは、マイクロパーティクル照射(microparti
cle bombardment)(例えば、a gene gun;Biolistic, Dupont)、もしくは、脂 質または細胞表面受容体またはトランスフェクション因子(transfecting agent
s)、リポゾーム、マイクロパーティクル(microparticles)もしくはマイクロ カプセル(microcapsules)によるカプセル封入によるコーティング、または、 核に入ることが知られているペプチドへの結合における投与、受容体仲介エンド
サイトーシスを受けるリガンドへの結合における投与(例えばWuおよびWu, 1987
, J. Biol. Chem. 2624429-4432)(これらは特異的に受容体を発現するターゲ ット細胞に対して使用される)等によって行われる。他の実施形態において、核
酸−リガンド複合体が形成され、該リガンドは紡錘状(fusogenic)のウイルス ペプチドを含み、これによりエンドゾームを破砕させ、核酸がリソソーム性分解
を受けないようにする。さらに他の実施形態において、該核酸はインビボで、特
異的な受容体をターゲットにすることによって細胞の特異的な取り込みおよび発
現に関してターゲットにされる(例えば1992年4月15日のPCT出願WO
92/06180(Wu等);1992年12月23日のWO92/22635(W
ilson等);1992年11月26日のWO92/20316(Findeis等);1
993年7月22日のWO93/14188(Clarke等),1993年10月1 4日のWO93/20221(Young)を参照)。あるいは、該核酸は、細胞内 に導入され、宿主細胞の発現のためのDNAと相同組換えによって結合する(Ko
llerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 868932-8935; Zijls
tra等, 1989, Nature 342435-438)。 【0144】 他の実施形態において、RPIをコードする核酸を含むウイルスベクターが使
用される(Miller等, 1993, Meth. Enzymol. 217581-599)。これらのレトロウ イルスは、ウイルスゲノムのパッケージングや宿主細胞DNAへの統合に必要な
いレトロウイルス配列を削除することによって改変されてある。遺伝子治療で使
用されるRPIをコード化した核酸はベクターにクローニングされ、これは患者
への遺伝子運搬を促進する。レトロウイルスベクターに関するより詳細なことは
、Boesen等, 1994, Biotherapy 6291-302で見出され、これはmdr1遺伝子を 造血幹細胞に運搬して該幹細胞を化学療法に対して体制を持たせるために、レト
ロウイルスベクターを使用することが説明されている。遺伝子治療におけるレト
ロウイルスの使用を説明した他の参考文献として、Clowes等, 1994, J. Clin. I
nvest. 93644-651; Kiem等, 1994, Blood 831467-1473;Salmons and Gunzberg
, 1993, Human Gene Therapy 4129-141; and GrossmanおよびWilson, 1993, Cu
rr. Opin. in Genetics and Devel. 3110-114が挙げられる。 【0145】 アデノウイルスは、遺伝子治療に用いられる他のウイルスベクターである。ア
デノウイルスは、呼吸肺細胞に遺伝子を運搬するための特に有効な運搬体(vehi
cles)である。一般的に、アデノウイルスは呼吸肺細胞に感染し、軽い病気を引
き起こす。アデノウイルス−ベースの運搬システムに関する他のターゲットは、
肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは非***細胞に
観戦することができる利点を持つ。KozarskyおよびWilson, 1993, Current Opin
ion in Genetics and Development 3499-503において、アデノウイルス−ベース
の遺伝子治療の報告がなされている。Bout等, 1994, Human Gene Therapy 53-10
において、アカゲザルの呼吸肺細胞へ遺伝子を輸送するためにアデノウイルスを
使用することが示されている。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例として、 Rosenfeld等, 1991, Science 252431-434; Rosenfeld等, 1992, Ce
ll 68143-155; Mastrangeli等, 1993, J. Clin. Invest. 91225-234; PCT公報
WO94/12649;およびWang等, 1995, Gene Therapy 2775-783等が見出されている 。 【0146】 アデノ関連ウイルス(AAV)はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
いる(Walsh等, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204289-300; 米国特許番 号第5,436,146号)。 【0147】 遺伝子治療に関する他のアプローチは、例えばエレクトロポレーション(elec
troporation)、リポフェクション(lipofection)、リン酸カルシウム仲介トラ
ンスフェクション(calcium phosphate mediated transfection)またはウイル ス感染の方法によって組織培養中に細胞に遺伝子をトランスファーさせることを
含む。通常、トランスファー方法は、選択可能なマーカーを細胞にトランスファ
ーすることを含む。該細胞は次に選択され、トランスファーされた遺伝子を取り
込み発現している細胞を分離する。これらの細胞は次に患者に適用される。 【0148】 この実施形態において、生じた組換え細胞をインビボで投与する前に、この核
酸が細胞に導入される。このような導入は、これらに限定されないが、例えばト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核
酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターの注入、マイクロセル
仲介遺伝子トランスファー(microcell-mediated gene transfer)、スフェロプ
ラスト融合(spheroplast fusion)等の当業界で周知の任意の方法によって行わ
れる。外来遺伝子を細胞に導入する膨大な技術が当業界で周知であり(例えばLo
efflerおよびBehr, 1993, Meth. Enzymol. 217599-618; Cohenおよび, 1993, M
eth. Enzymol. 217618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 296992を参照)、 本発明により使用され、受容細胞の必要な開発的、物理的機能が失われない。該
技術は、細胞への核酸の安定したトランスファーを提供し、そのために該核酸は
該細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝的であり、その細胞の後代によ
って発現可能である。 【0149】 生じた組換え細胞は、当業界で周知のさまざまな方法によって患者に輸送され
る。好ましい実施形態において、上皮細胞が、例えば皮下注射によって注入され
る。他の実施形態において、組換え皮膚細胞は患者への皮膚移植として適用でき
る。組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞、前駆細胞)は、好ましくは静脈注射
によって投与される。使用を考えた細胞の量は、望ましい効果、患者の状態等に
依存しており、当業者によって決定される。 【0150】 遺伝子治療の目的で核酸が導入された細胞は、任意の望ましい、使用可能な細
胞型を含み、これらに限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、線維芽
細胞、筋肉細胞、肝細胞;例えばTリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファー
ジ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等の血液細胞;さまざまな幹細胞または前
駆細胞、特に造血肝または前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血(umbilical cord blo
od)、末梢血液、胎児肝等である。 【0151】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に用いられる細胞は、患者に対して事
故由来である。 【0152】 組換え細胞が遺伝子治療において使用される実施形態において、RPIをコー
ド化した核酸は細胞に導入され、該細胞またはそれらの前駆対によって発現され
、組換え細胞は次に治療効果のためにインビボで投与される。特殊な実施形態に
おいて、肝細胞または前駆細胞が使用される。分離されインビトロで維持されう
る任意の肝細胞および/または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在
的に使用され得る(例えば、1994年4月28日のPCT公開番号WO94/085
98号; Stemple and Anderson, 1992, Cell 71973-985; Rheinwald, 1980, Met
h. Cell Bio. 21A229;ならびにPittelkowおよびScott, 1986, Mayo Clinic Pro
c. 61771を参照)。 【0153】 特異的な実施形態において、遺伝子治療の目的のために導入された核酸は、例
えば核酸の発現が、適切な転写のインデューサーの存在または非存在を制御する
ことによって制御されるような、コード化した領域に手術的に結合できる誘導性
プロモーター(inducible promoter)を含む。 【0154】 5.8.3. リウマチ様関節炎を治療するためのRPIの阻害 1.1.1 本発明の一の実施形態においては、RAに悩む患者の血清に比べて関節液にお
いて増加するRPIのレベルまたは/およびRPIの機能を中和(阻害)する化
合物の投与によって、RAは治療または予防される。使用されうる化合物はアン
チRPI抗体(および、断片、並びにその結合部位を含むその誘導体)、RPI
アンチセンスもしくはリボザイム核酸、およびホモローグ組換えによって内因性
のRPI機能を「ノックアウト」するのに用いられる機能不全RPIをコード化
する核酸(例えば、Capecchi,1989,Science244:12
88−1292参照)が含まれるが、これらに限られるものではない。本発明の
特殊な実施形態においては、RPI側面をコード化するヌクレオチドが(5’お
よび3’の双方へ)異なる遺伝子配列であるRPI遺伝子の一部を含む核酸が、
RPI拮抗物質としてホモローグ組換えによるRPI不活性化を促進するため用
いられる(KollerおよびSmithies,1989,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA86:8932−8935;Zijlstraら
,1989,Nature,342:435−438も参照)。RPI機能を阻
害する他の化合物は、遺伝子分析を採用してもよいが、公知の有用なインビトロ
分析を用いて、例えば、他のタンパクへのRPIの結合を阻害する性能または公
知のRPI機能を阻害する性能に基づいて同定され、好ましくはインビトロもし
くは細胞培養中で分析される。該化合物の投与前および投与後のRPIのレベル
を検出するために「好ましい技術」を用いることも有用である。 【0155】 適切なインビトロまたはインビボ分析が、特定の化合物の効果、およびその投
与を冒された組織の治療に適用できるかを決定するために使用されることが好ま
しい。 【0156】 特殊な実施形態においては、RPI機能を阻害する化合物は、RAに悩む患者
の血清と比べて関節液においてRPIのレベルまたはRPI機能の増加が検出さ
れたとき(例えば、通常レベルまたは望ましいレベルより増加したとき)、治療
的(予防的を含む)に投与される。RPIまたは機能のレベルの増加は、例えば
、タンパクおよび/またはRNAの量を測定することによって、患者の関節液お
よび血清サンプルを得てRNAもしくはタンパクレベル、RPIコード化する表
現されたRNAの構造または/および活性、またはRPIそのものに関してそれ
らをインビトロで分析することによって容易に検出されうる。技術的に標準的な
多数の方法がこのように採用され、キナーゼ分析、RPIを検出および/または
視覚化するためのイムノアッセイ(例えば、ウェスタン法、ドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を伴う免疫沈降、免疫細胞化学など)、お
よび/またはRPIをコード化するmRNAをそれぞれ検出および/または視覚
化することによってRPI表現を検出するためのハイブリダイゼーション分析(
例えば、ノーザン法、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、
など)などが含まれるがこれらに限られるものではない。 【0157】 5.8.4. RPIのアンチセンス調節 1.1.1 特殊な実施形態においては、RPIアンチセンス核酸の使用によってPRIの
機能が抑制される。本発明は、RPIもしくはその一部をコード化する遺伝子ま
たはcDNAにアンチセンスである少なくとも6つのヌクレオチドからなる核酸
の、治療的なまたは予防的な使用を提供するものである。ここで使用されている
RPI「アンチセンス」核酸とは、ある程度の配列相補性によってRPI(好ま
しくはmRNA)をコード化するRNAの一部にハイブリダイゼーション可能な
核酸をいう。アンチセンス核酸は、RPIをコード化するmRNAのコーディン
グ領域および/または非コーティング領域に相補的であってもよい。そのような
アンチセンス核酸は、RPI機能を阻害する化合物として利便性を有し、リウマ
チ様関節炎の治療または予防に用いられうる。 【0158】 本発明のアンチセンス核酸は、一重鎖または二重鎖のオリゴヌクレオチドであ
りうる。また、RNAもしくはDNAまたはこれらの変態もしくは誘導体であり
うる。細胞に直接投与することができ、外因性の導入された配列の転写によって
細胞内で製造することもできる。 【0159】 本発明は、以下に記載するが、製薬上許容できる担体中に本発明のRPIアン
チセンス核酸の有効量を含んでなる薬剤組成物を提供するものでもある。 【0160】 他の実施形態においては、本発明は原核細胞または真核細胞中においてRPI
核酸配列の表現を阻害する方法に用いられ、細胞に本発明のRPIアンチセンス
核酸を含んでなる組成物の有効量を供与することが含まれる。 【0161】 RPIアンチセンス核酸およびその使用を以下に詳細に説明する。 【0162】 RPIアンチセンス核酸 RPIアンチセンス核酸は、少なくとも6ヌクレオチドを有し、好ましくはオ
リゴヌクレオチド(6〜約50オリゴヌクレオチド)である。特定の形態におい
ては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌ
クレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、または少なくとも200ヌクレオ
チドである。オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNAまたはキメラ混合物ま
たは誘導体またはこれらの修飾形態であってもよく、1本鎖であってもまたは2
本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、塩基部分で、糖部分で、またはホ
スフェート主鎖(phosphate backbone)で修飾されてもよい。オリゴヌクレオチド
としては、ペプチド等の他の付随する基(appending group)、または細胞膜での 輸送を容易にする物質(例えば、Letsinger 等., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 86, 6553-6556; Lemaitre 等., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 648
-652; 1988年12月15日に公開された、PCT公報番号WO88/09 810号を参照)、または血液−脳バリアー(例えば、1988年4月25日に
公開された、PCT公報番号WO 89/10134号を参照)、ハイブリダイ
ゼーションを開始させる切断物質(hybridization-triggered cleavage agent)(
例えば、Krol 等., 1988, BioTechniques 6, 958-976を参照)またはインターカ
レーション物質(intercalating agent)(例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5, 5
39-549を参照)が挙げられる。 【0163】 本発明の好ましい形態において、RPIアンチセンスオリゴヌクレオチドが、
好ましくは1本鎖のDNAで提供される。オリゴヌクレオチドは、当該分野にお
いて通常既知である置換基でその構造物のいずれかの位置で修飾されてもよい。
RPIアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下に制限されないが、5−フルオ
ロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロ
キシメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン
、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガ
ラクトシルクエオシン(betaD-galactosylqueosine)、イノシン、N6−イソペン
テニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチル
グアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5
−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメ
チルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノ
シルクエオシン(beta-D-mannosylqueosine)、5’−メトキシカルボキシメチル ウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデ
ニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(V)、ウイブトキソシン(wybutoxosine)、シ
ュードウラシル(pseudouracil)、クエオシン(queosine)、2−チオシトシン、5
−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチ
ルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ
酢酸(V)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−
カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、及び2,6−ジアミノプリン
を含む群より選ばれる少なくとも一の修飾塩基部分を有していてもよい。 【0164】 他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一の修飾される糖
部分、例えば、アラビノース、2−フルオロアラビノース、キシルロース、およ
びヘキソースからなる群より選ばれる糖部分からなる。 【0165】 さらなる他の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエー
ト(phosphorothioate)、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホル
アミドチオエート(phosphoramidothioate)、ホスホルアミデート(phosphoramida
te)、ホスホルジアミデート(phosphordiamidate)、メチルホスホネート、アルキ
ルホスホトリエステル、及びこれらのホルムアセタールまたは類似体からなる群
より選ばれる少なくとも一の修飾されるホスフェート主鎖からなる。 【0166】 さらなる他の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリ
ゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、一般的なβ−単位
とは逆に、ストランドが相互に平行に走る相補的RNAとの特定の2本鎖のハイ
ブリッドを形成する(Gautier 等., 1987, Nucl. Acids Res. 15, 6625-6641) 。 【0167】 オリゴヌクレオチドは、他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショ
ンを開始させる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションを開始させる切断物質
などに共役してもよい。 【0168】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野における既知の標準的な方法によっ
て、例えば、自動DNA合成器(バイオサーチ(Biosearch)、アプライドバイオ システムズ(Applied Biosystems)などから市販されるものなど)の使用によって
、合成されてもよい。例としては、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはス
テイン(Stein)らの方法(1988, Nucl. Acids Res. 16, 3209)によって合成されて
もよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御された細孔ガラスポリマ
ー支持体を用いることによって調製できる(Sarin等, 1988, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85, 7448-7451)。 【0169】 特定の実施形態において、本発明のRPIアンチセンス核酸は、外来の配列
からの転写によって細胞内で製造される。例えばベクターは、細胞内に吸収され
るようにインビボで導入されてもよく、この細胞内でベクターまたはこの一部が
転写され、本発明のアンチセンス核酸(RNA)が産生される。このようなベク
ターは、RPIアンチセンス核酸をコード化する配列を含む。このようなベクタ
ーは、所望のアンチセンスRNAを産生するように転写できる限り、エピソーム
であり続けてもあるいは染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、
当該分野における標準的な組換DNA技術方法によって構築できる。ベクターは
、哺乳動物細胞における複製や発現に使用される、プラスミド、ウィルス性、ま
たは当該分野において既知の他のものであってもよい。RPIアンチセンスRN
Aをコード化する配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト、の細胞において作
用することが当該分野において既知であるプロモーターによってできる。このよ
うなプロモーターは、誘導性であっても構成性であってもよい。このようなプロ
モーターとしては、以下に制限されないが、SV40初期プロモーター領域(Ber
noist and Chambon, 1981, Nature 290, 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’ の長い末端繰り返し中に含まれるプロモーター(Yamamoto 等., 1980, Cell 22,
787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner 等., 1981, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 78, 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Bri
nster 等., 1982, Nature 296, 39-42)などが挙げられる。 【0170】 本発明のアンチセンスは核酸は、RPI遺伝子、好ましくはヒトのRPI遺伝
子のRNA転写産物の少なくとも一部に相補的な配列を有する。しかしながら、
好ましいものの、完全な相補性は必要ではない。本明細書中で引用される、RN
Aの少なくとも一部分に相補的な配列は、RNAとハイブリッド形成して安定な
デュプレックスを形成できるのに十分な相補性を有する配列を意味する;ゆえに
、2本鎖のRPIアンチセンス核酸の場合では、デュプレックスDNAの1本鎖
を試験してもよい、あるいはトリプレックスの形成を分析してもよい。ハイブリ
ッド形成能は、相補性の度合いやアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。
通常、ハイブリッド形成する核酸が長ければ長いほど、RPIをコード化するR
NAとの塩基のミスマッチ数が多くなるが安定なデュプレックス(または、場合
によってはトリプレックス)を形成する。当業者はハイブリッド形成した複合体
の融点を測定する標準的な方法の使用によってミスマッチの許容できる程度を確
認できる。 【0171】 5.8.5 RPIの治療への使用 アンチセンス核酸 RPIアンチセンス核酸は、有益なRPIをリウマチ様関節炎を患っている患
者の関節液中で過剰に発現させて、リウマチ様関節炎を治療(または予防)する
のに使用できる。好ましい実施形態においては、1本鎖のDNAのアンチセンス
RPIオリゴヌクレオチドを使用する。 【0172】 RPIをコード化するRNAを発現または過剰に発現する細胞のタイプは当該
分野において既知の様々な方法によって同定できる。このような細胞のタイプと
しては、以下に制限されるものではないが、白血球(例えば、好中球、マクロフ
ァージ、単球)及びレジデント細胞(例えば、滑膜細胞)が挙げられる。このよ
うな方法としては、以下に制限されるものではないが、RPIに特異的な核酸と
のハイブリッド形成(例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロッ
トハイブリダイゼーション、インサイチュ(in situ)ハイブリダイゼーション) 、ある細胞タイプ由来のRNAのインビトロでのRPIへの翻訳能を考察する、
イムノアッセイなどが挙げられる。好ましい形態において、患者からの1次組織
を、例えば、免疫細胞化学またはin situハイブリダイゼーションによって、治 療前のRPIの発現について分析できる。 【0173】 製薬上許容できる担体中に有効量のRPIアンチセンス核酸を含む、本発明の
薬剤組成物は、リウマチ様関節炎を有する患者に投与できる。 【0174】 RAの治療に有効であろうRPIアンチセンス核酸の量は、標準的な臨床テク
ニックによって決定されうる。可能である場合には、インビトロで、さらにはヒ
トに試験及び使用される前に有用な動物モデルシステムにおいて、治療される腫
瘍のタイプのアンチセンス細胞毒性を測定することが望ましい。 【0175】 特定の実施形態において、RPIアンチセンス核酸を含む薬剤組成物は、リポ
ソーム、微粒子、またはマイクロカプセルを介して投与される。本発明の様々な
実施形態において、このような組成物を用いてRPIアンチセンス核酸の一様の
放出を達成することは有用である。特定の実施形態においては、特定の同定可能
な腫瘍抗原に対する抗体を介してターゲットにされるリポソームを利用すること
が望ましい(Leonetti等, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2448-2451;
Renneisen 等, 1990, J. Biol. Chem. 265, 16337-16342)。 【0176】 5.8.6 阻害リボザイム及びトリプレックスアプローチ 他の実施形態においては、RAの症状は、RPI遺伝子配列を既知の遺伝子ノ
ックアウト、リボザイムおよび/またはトリプレックス方法を組合わせて使用し
て、RPI遺伝子の発現レベルを減少することによって、RPI遺伝子の発現レ
ベルおよび/またはRPI遺伝子産物の活性を減少することによって、改善され
てもよい。RAの症状を改善する能力を含む、RPI遺伝子の活性、発現または
合成を調節する能力を発揮する化合物の中には、リボザイム及びトリプレックス
分子がある。このような分子は、損なわれていない、または適切である場合には
、変異型ターゲット遺伝子活性のいずれかを減少するまたは阻害するように設計
されてもよい。このような分子の製造及び使用に関する技術は、当業者にはよく
知られている。 【0177】 RPI遺伝子mRNA転写産物を触媒により切断するように設計されるリボザ
イム分子を用いて、ターゲット遺伝子mRNAの翻訳及び、ゆえにRPI遺伝子
産物の発現を防止できる。(例えば、1990年10月4日に公開された、PC
T国際公開 WO90/11364号;Sarver 等., 1990, Science 247, 1222-
1225)。 【0178】 リボザイムは、RNAの特異的な切断を触媒できる酵素的RNA分子である。
(書評では、Rossi, 1994, Current Biology 4, 469-471を参照)。リボザイム 作用のメカニズムは、相補的ターゲットRNAへのリボザイム作用分子の配列特
異的なハイブリダイゼーション、さらにはエンドヌクレアーゼによる切断事象(e
ndonucleolytic cleavage event)を含む。リボザイム分子の組成物は、ターゲッ
ト遺伝子mRNAに対して相補的な一以上の配列を含むものでなければならず、
また、mRNA切断に応答性のある既知の触媒配列を含むものでなければならな
い。この配列に関しては、例えば、その全体を参考のために本明細書中に引用さ
れる、米国特許第5,093,246号を参照。 【0179】 部位特異的な認識配列でmRNAを切断するリボザイムをRPIをコード化す
るmRNAを破壊するのに使用できるものの、シュモクザメのリボザイム(hamme
rhead ribozyme)の使用が好ましい。シュモクザメのリボザイムは、ターゲット mRNAと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって規定される位置
でmRNAを切断する。ターゲットmRNAが下記2塩基配列:5’−UG−3
’を有することが唯一の必要条件である。シュモクザメのリボザイムの構築及び
製造は、当該分野において既知であり、その全体を参考のために本明細書中に引
用される、Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology A Comprehensi
ve Desk Reference, VCH Publishers, New York(特に833頁、図4を参照) およびHaseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334, 585-591により詳しき記載さ
れる。 【0180】 好ましくは、リボザイムは、切断認識部位がRPIをコード化するmRNAの
5’末端付近に位置する、即ち、効率を上げかつ非機能性mRNA転写産物の細
胞内蓄積を最小限にするように操作される。 【0181】 本発明のリボザイムとしてはまた、テトラヒメナ サーモフィラ(Tetrahymena
thermophila)中に天然に生じ(IVS、またはL−19 IVS RNAとし て既知である)、Thomas Cech及び協力者らによって広範に記載されたもの(Zau
g, 等., 1984, Science, 224, 574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231,
470-475; Zaug, 等., 1986, Nature, 324, 429-433; ユニヴァーシティー パテンツ インコーポレイテッド(University Patents Inc.)による公開国際特 許出願番号WO 88/04300号 ; Been and Cech, 1986, Cell, 47, 207
-216)などのRNAエンドヌクレアーゼ(以降、Cechタイプリボザイム)が
挙げられる。Cechタイプリボザイムは、後にターゲットRNAの切断が行わ
れるターゲットRNA配列とハイブリッド形成する8塩基対活性部位を有する。
本発明は、RPIをコード化する遺伝子中に存在する8塩基対活性部位配列をタ
ーゲットとするこれらのCechタイプリボザイムを包含する。 【0182】 アンチセンスアプローチにおいて、リボザイムは、(例えば、改善された安定
性、ターゲッティングなどを目的として)修飾されたオリゴヌクレオチドから構
成されることができ,インビボでRPIを発現する細胞に輸送されなければなら
ない。好ましい輸送方法は、トランスフェクトされた細胞がRPIをコード化す
る内因性のmRNAを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生
するように、強力な構成性pol IIIまたはpol IIプロモーターの制
御下でのリボザイムをコード化するDNA構築物を用いることを含む。リボザイ
ムは、アンチセンス分子と異なり、触媒性であるので、低細胞内濃度が効率のた
めに必要である。 【0183】 内因性のRPI発現はまた、ターゲットされた相同的組換を用いてRPI遺伝
子またはそのプロモーターを不活性化またはノックアウトすることによって減少
できる(例えば、Smithies, 等., 1985, Nature 317, 230-234; Thomas and Ca
pecchi, 1987, Cell 51, 503-512; Thompson 等., 1989, Cell 5, 313-321を参
照;これらのそれぞれは、その全体を参考のために本明細書中に引用される)。
例えば、内因性RPI遺伝子(RPIをコード化する遺伝子のコーディング領域
または調節領域のいずれか)に相同するDNAに隣接する変異型の、非機能性R
PI遺伝子(または全く関連のないDNA配列)を、インビボでターゲット遺伝
子を発現する細胞をトランスフェクトするために、選択マーカーおよび/または
ネガティブな選択マーカーと一緒にまたはを用いずに、使用できる。ターゲット
された相同的組換を介した、DNA構築物の挿入によって、ターゲット遺伝子が
不活性化される。このようなアプローチは、ES(胚幹)細胞への修飾が不活性
ターゲット遺伝子を有する動物子孫を発生するのに使用できる農業分野に特に適
する(例えば、Thomas and Capecchi, 1987 and Thompson, 1989, 上記を参照)
。しかしながら、このアプローチは、組換DNA構築物を適当なウィルスベクタ
ーを用いてインビボで必要な部位に直接投与するまたはターゲットされる場合に
はヒトへの使用に適用されうる。 【0184】 または、内因性のRPI遺伝子の発現は、RPI遺伝子の調節領域(即ち、R
PI遺伝子プロモーターおよび/またはエンハンサー)に相補性のあるデオキシ
リボヌクレオチド配列をターゲットとして体内のターゲット細胞におけるRPI
遺伝子の転写を防止するトリプレックス構造物を形成することによって抑制され
うる。(通常、Helene, 1991, Anticancer Drug Des., 6(6), 569-584; Helene
, 等., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660, 27-36; and Maher, 1992, Bioassa
ys 14(12), 807-815を参照)。 【0185】 転写の阻害を目的とするトリプレックス形成に使用される核酸分子は、1本鎖
であり、デオキシヌクレオチドから構成されなければならない。これらのオリゴ
ヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対原則によるトリプレック
ス形成を促進するように設計されなければならず、これは、通常、プリンまたは
ピリミジンのいずれかの相当の大きさのストレッチがデュプレックスの1本鎖に
存在する必要がある。ヌクレオチド配列はピリミジンを基礎としてもよく、これ
により、得られるトリプレックスの3つの会合するストランドにTAT及びGC
C+のトリプレットが生じるであろう。ピリミジンリッチな分子は、1本鎖に平 行な方向にデュプレックスのその1本鎖のプリンリッチな領域に対する塩基の相
補性が提供される。加えて、プリンリッチである、例えば、G残基のストレッチ
を含む、核酸分子が選択されてもよい。これらの分子は、大多数のプリン残基が
、トリプレックスの3ストランドにGGCトリプレットを生じる、ターゲットに
されるデュプレックスの1本鎖上に位置する、GC対リッチなDNAデュプレッ
クスとトリプレックスを形成するであろう。 【0186】 または、3重螺旋の形成のためにターゲットされうる潜在的な配列をいわゆる
スイッチバック核酸分子を作製することによって増やしてもよい。スイッチバッ
ク分子は、デュプレックスの最初の一ストランドと次に他方と塩基対を形成して
、プリンまたはピリミジンのいずれかの相当の大きさがデュプレックスの1スト
ランドに存在する必要性を排除するように、交互の5’−3’、3’−5’様式
で合成される。 【0187】 本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイム、および/またはトリプレッ
クス分子を利用して変異型遺伝子発現を阻害する場合には、その技術が、存在す
る正常なRPI遺伝子産物の濃度が正常な表現型に必要であるより低い可能性が
生じるくらい、非常に効果的に正常なRPI遺伝子アレルによって産生されるm
RNAの転写(トリプレックス)および/または翻訳(アンチセンス、リボザイ
ム)を抑制または阻害することが可能である。したがって、このような場合には
、RPI遺伝子活性の実質的に正常なレベルを確実に維持するために、正常なR
PI遺伝子活性を発揮するRPI遺伝子ポリペプチドをコード化、発現する核酸
分子を、アンチセンス、リボザイム、またはトリプレックス治療が利用されてい
るどんなものにも感受性のある配列を含まない遺伝子療法を介して細胞中に導入
してもよい。または、RPI遺伝子が細胞外タンパク質をコード化する場合には
、ターゲット遺伝子活性の必要なレベルを維持するために正常なRPI遺伝子タ
ンパク質を同時に投与する(co-administer)ことが好ましい。 【0188】 本発明のアンチセンスRNA及びDNA、リボザイム、ならびにトリプレック
ス分子は、上記したように、DNA及びRNA分子の合成に関する当該分野にお
ける既知の方法によって調製されてもよい。これらとしては、例えば、固相ホス
ホルアミダイト(phosphoramidite)化学合成などの当該分野で既知のオリゴデオ キシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するに技術が
挙げられる。または、RNA分子を、アンチセンスRNA分子をコード化するD
NA配列のインビトロ及びインビボ転写によって得てもよい。このようなDNA
配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適当なRNAポリメ
ラーゼプロモーターが取り込まれた広範な様々なベクター中に導入されてもよい
。または、使用されるプロモーターによって、構成により(constitutively)また
は誘導により(inducibly)アンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA 構築物を細胞株に安定して導入してもよい。 【0189】 5.9 治療または予防のための利用のデモンストレーション 本発明の化合物は、ヒトに使用される前に、所望の治療または予防活性に関し
てインビトロ、次にインビボで試験されることが好ましい。例えば、特定の化合
物の投与が必要であるかどうかを決定するのに使用できるインビトロ分析として
は、患者の組織サンプルを培養液中で成育させ、化合物に晒すあるいは化合物を
投与して、このような化合物の組織サンプルへの効果を観察するインビトロの培
養分析が挙げられる。 【0190】 テスト化合物は、RAを患っている患者のRADFまたはRPIレベルがRA
を患っていない被検者中で見出されるレベルにまで戻るまたはRAの実験動物モ
デル(例えば、ラットのアジュバント関節炎)における同様の変化を作製するこ
とができるかについて試験されうる。上記レベルを回復できる化合物を、さらな
る薬剤発見を目的としたリード化合物(lead compound)として使用できる、また は治療に使用できる。 【0191】 RADF及びRPIの発現は、好ましい技術、イムノアッセイ、ゲル電気泳動
後可視化、または他の当業者に既知の方法によって分析できる。このような分析
は、RADFまたはRPIの発現量が臨床的病気の代用マーカーとして機能でき
る際には、候補薬剤をスクリーニングするためにまたは臨床的なモニタリング若
しくは薬剤の開発に使用できる。 【0192】 様々な特定の実施形態において、インビトロ分析は、患者の疾患にかかわる細
胞型の代表的な細胞を用いて行なわれ、化合物がこのような細胞型に目的とする
効果を有するかどうかを決定できる。 【0193】 治療に使用される化合物は、以下に限られないが、ラット、マウス、ニワトリ
、ウシ、サル、ウサギなどの適当な動物モデルシステムでヒトでの試験の前に試
験されうる。インビボ試験に関しては、ヒトへの投与前に、当該分野において既
知のいずれかの動物モデルシステムを使用してもよい。 【0194】 5.10 治療/予防のための投与及び組成物 本発明は、有効量の本発明の化合物び被検者への投与による治療(及び予防)
方法を提供するものである。好ましい形態においては、化合物は実質的に純粋で
ある(例えば、その効果を制限するあるいは望ましくない副作用を産する物質を
実質的に含まない)。被検者は、好ましくは、以下に限られないが、ウシ、ブタ
、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物を含む、動物であり、好ましくは哺乳動
物であり、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態においては、非ヒト哺乳
動物が被検者である。 【0195】 化合物が核酸からなる際に使用できる配合物及び投与方法は上記と同様である
;さらなる適当な配合物及び投与経路は、下記したものから選択できる。 【0196】 様々な輸送システムが知られており、本発明の化合物を投与するのに使用でき
、例えば、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現でき
る組換細胞、レセプターが介するエンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, 198
7, J. Biol. Chem. 262,4429-4432を参照)、レトロウィルスまたは他のベクタ
ーの一部としての核酸の構築などがある。導入方法としては、以下に限られない
が、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙
げられる。化合物は、いずれかの簡便な経路によって、例えば、輸液または大量
注射によって、上皮または粘膜皮膚内層(例えば、経口、粘膜、直腸及び腸粘膜
など)による吸収によって投与されてもよく、また、他の生物学的に活性のある
薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は全身または局所であってもよい。加えて
、脳室内及び髄腔内などの、適当な経路によって中枢神経系中に本発明の薬剤組
成物を導入することが望ましい;脳室内注射は例えば、オマヤレザバー等の、レ
ザバーに取り付けられる、脳室内カテーテルによって容易になる。肺への投与も
また、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアゾール投与剤(aerosolizin
g agent)との配合によって、使用されうる。 【0197】 特定の実施形態においては、治療を必要とする領域に局所的に本発明の薬剤組
成物を投与することが望ましい;これは、例えば、以下に限定されるわけではな
いが、外科手術中の局所的な輸液、例えば、外科手術後に創傷被覆剤と組み合わ
せた、局所的な塗布、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、また
はインプラントによって、達成されてもよいが、上記インプラントは、多孔性、
非多孔性、またはゼラチン製材料からなり、シアラスティック膜(sialastic mem
brane)等の膜、または繊維などが挙げられる。一実施形態においては、投与は、
悪性腫瘍または新生物性の若しくは新生物発生前の組織のある部位(または前の
部位)に直接注射することによってもよい。 【0198】 他の実施形態においては、化合物が、ベシクル、特にリポソーム中に輸送され
てもよい(Langer, Science 249, 1527-1533 (1990); Treat 等., in Liposome
s in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and F
idler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid
., pp. 317-327を参照;同書を参照)。 【0199】 さらなる実施形態においては、化合物が、制御された放出システム中に輸送さ
れてもよい。一実施形態においては、ポンプを使用してもよい(Langer、上記;
Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14, 201 (1987); Buchwald 等., Surge
ry 88, 507 (1980); Saudek 等., N. Engl. J. Med. 321, 574 (1989)を参照)
。他の実施形態においては、高分子材料を使用してもよい(Medical Applicatio
ns of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton,
Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design a
nd Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger
and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23, 61 (1983)を参照;
また、Levy 等., Science 228, 190 (1985); During 等., Ann. Neurol. 25, 3
51 (1989); Howard 等., J. Neurosurg. 71, 105 (1989)を参照)。さらなる他
の実施形態においては、制御された放出システムを、全身性の投薬量のフラクシ
ョンのみを必要とする、治療のターゲット、即ち、脳の付近に置かれてもよい(
例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, v
ol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照)。 【0200】 他の制御された放出システムは、Langer (Science 249, 1527-1533 (1990))の
書評で討論される。 【0201】 本発明の化合物がタンパク質をコード化する核酸である特殊な実施形態におい
ては、核酸が、例えば、レトロウィルスベクター(米国特許第4,980,28
6号を参照)の使用によって、核酸を適当な核酸の発現ベクターの一部として構
築し細胞内になるように投与することによって、または直接注射によって、また
は微粒子の衝撃(例えば、遺伝子ガン;Biolistic, Dupont)の使用によって、 または脂質若しくは細胞表面レセプター若しくはトランスフェクション剤(trans
fecting agent)による被覆によって、または核に入ることが知られているホメオ
ボックス様ペプチド(例えば、Joliot 等., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88, 1864-1868を参照)に結合する核酸を投与することなどによって、インビボ
で投与されてコード化されたタンパク質の発現を促進してもよい。または、核酸
を、細胞内に導入して、相同的組換によって、発現用の宿主細胞DNA内に取り
込んでもよい。 【0202】 本発明はまた、薬剤組成物を提供するものである。このような組成物は治療上
有効な量の化合物及び製薬上許容できる担体からなる。特殊な実施形態において
は、「製薬上許容できる」ということばは、連邦管理局(regulatory agency of
the Federal)、若しくは州政府によって認可されていること、または米国薬局方
もしくは動物、特にヒトへの使用に関して一般的に認知されている他の薬局方に
リストとして挙げられていることを意味する。「担体」ということばは、治療剤
が一緒に投与される希釈液、アジュバント、賦形剤、またはベヒクルを意味する
。このような製薬上の担体は、水ならびに、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ
油等の、石油、動物、植物若しくは合成由来のものなどの、油等の滅菌液体であ
りうる。水は、薬剤組成物を静脈内で投与される場合には好ましい担体である。
食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液もまた、特に注射可能な
溶液用に、液状担体として使用できる。適当な製薬上の賦形剤としては、デンプ
ン、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、
チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレー
ト、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、
グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。本組成物は、必要であれば、少
量の湿潤若しくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は
、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性配合物などの形
態がとられる。組成物は、伝統的な結合剤及びトリグリセリド等の担体を用いて
、坐剤として配合されてもよい。経口用の配合物は、薬剤グレードのマンニトー
ル、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム
(sodium saccharine)、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含 みうる。適当な製薬上の担体の例は、E.W. MartinによるRemington's Pharmaceu
tical Sciencesに記載される。このような組成物は、患者に適当に投与するため
の形態を提供できるように適当な量の担体と共に、好ましくは純粋な形態の、治
療上有効な量の本化合物を含むであろう。配合物は、投与の形態に適するもので
なければならない。 【0203】 好ましい実施形態においては、本組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適用
される薬剤組成物として定常的な方法に従って配合される。具体的には、静脈内
投与用の組成物は、滅菌等張水性緩衝液における溶液である。必要であれば、組
成物はまた、可溶化剤及び注射部位での痛みを和らげるためのリドカイン等の局
所麻酔剤を含んでもよい。通常、成分は、例えば、一定量の活性物質を表示する
アンプル若しくは小袋(sachette)等の密閉容器における乾燥凍結乾燥粉末若しく
は水分のない濃縮液として、単位服用量形態(unit dosage form)で別々にまたは
一緒に混合してのいずれかで供給される。組成物を輸液によって投与しようとす
る際には、組成物を滅菌した薬剤グレードの水または食塩水を含む輸液用ボトル
で調剤されうる。本組成物を注射によって投与する際には、注射用の滅菌水また
は食塩水のアンプルを、投与前に成分を混合するように提供できる。 【0204】 本発明の組成物は、中性または塩形態として配合されてもよい。製薬上許容で
きる塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の塩などの遊離
アミノ基を用いて形成される塩、ならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム
、カルシウム、水酸化第2鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エ
チルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の塩などの遊離カルボキ
シル基を用いて形成される塩が挙げられる。 【0205】 RAの治療に有効であろう本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術によって
決定できる。加えて、インビトロ分析を必要であれば最適な投与範囲を同定する
のを補助するのに使用してもよい。配合物に用いられる正確な投与量はまた、投
与経路、及び病気または疾患の重篤度によって異なり、開業医や各患者の環境の
判断に従って決定されなければならない。しかしながら、静脈内投与に関する適
当な投与量の範囲は、通常、約20〜500mgの活性化合物/kg体重である
。鼻腔内投与に関する適当な投与量の範囲は、通常、約0.01pg/kg体重
〜1mg/kg体重である。有効な投与量は、インビトロまたは動物モデル試験
システムから派生される線量効果曲線から外挿されてもよい。 【0206】 坐剤は、通常、0.5質量%〜10質量%の範囲の活性成分を含む;経口用配
合物は、好ましくは、10%〜95%の活性成分を含む。 【0207】 本発明はまた、本発明の薬剤組成物の一以上の成分を充填する一以上の容器か
らなる薬剤パックまたはキットを提供するものである。必要であれば、製剤また
は生物学的製品の製造、使用または販売を調節する政府の機関(governmental ag
ency)によって規定される形態の通知をこのような容器につけてもよく、この通 知はヒトへの投与のための製造、使用及び販売の政府機関(agency of manufactu
re, use or sale)による認可を反映するものである。 【0208】 6 実施例:RAによる患者の血清及び関節液由来のタンパク質 下記の参考プロトコルを用いて、リウマチ様関節炎(RA)の患者からのまた
はRAでない患者(即ち、痛風、変形性関節症、または外傷性の滑膜炎の患者)
からの血清及び関節液中のタンパク質を、等電点電気泳動さらにはSDS−PA
GEによって分離し、比較した。各サンプルは2連で流した。 【0209】 6.1 サンプル調製 1.1 タンパク質の分析を、受け取ったままのサンプルで行なった(Pierce BCA Cat
# 23225)。300μgの全タンパク質に相当する容積の血清を分取し、等容の1
0%(w/v)SDS(Fluka 71729)、2.3%(w/v)のジチオトレイトー ル(BDH 443852A)を添加した。このサンプルを95℃で5分間加熱した後、20 ℃に冷却した。次に、125μlの以下の緩衝液をサンプルに加えた: 8M 尿素(BDH 452043w) 4% CHAPS(Sigma C3023) 65mM ジチオトレイトール(DTT) 2%(v/v) リゾライト(Resolytes) 3.5−10(BDH 44338 2x)。 【0210】 この混合物をボルテックスして、15℃で13000rpmで5分間、遠心し
、上清を等電点電気泳動によって分析した。 【0211】 6.2 等電点電気泳動 臨床研究における使用 本発明の診断方法および組成物は、臨床研究、例えばRA治療のための薬剤の
テスト、をモニターする際に補助することができる。ある実施形態においては、
候補分子は、RAに冒されている患者におけるRADFまたはRPIレベルを、
RAに冒されていない被験者において確認されるレベル、または、非RAまたは
血清におけるRADFまたはRFIのレベルかそれに近しい値に維持されるよう
に治療が施された患者において確認されるレベルにまで回復させる能力が試験さ
れる。1もしくはそれ以上のRADFまたはRPIのレベルを分析してもよい。
他の実施形態においては、本発明の方法および組成物は、臨床研究のために候補
をスクリーニングする時に、RAを有する個体を同定するために用いられる。こ
のような個体は、その後研究に含んでもよく、除外してもよく、または、治療も
しくは分析のために別のコホートに配置されてもよい。 【0212】 RPIの精製 特殊な観点においては、本発明は抗原性の決定因子(すなわち、抗体によって
認識されうる)からなる、または前記のものをコード化すると同時に機能的に活
性な、分離されたRPI、好ましくは、ヒトのRPIおよび断片ならびにその誘
導体を提供する。ここで用いられる機能的に活性なRPIとは、フルレング(野
生型)RPIに付随した、1または2以上の公知の機能的な活性を示す物質をい
い、例えば、RPI基質もしくはRPI結合パートナーへの結合、(アンチター
ゲット抗体に結合した)抗原性、または免疫抗原性などがある。 【0213】 特殊な実施形態においては、本発明は、少なくとも6アミノ酸、10アミノ酸
、50アミノ酸、または少なくとも75アミノ酸からなるRPIの断片を提供す
る。RPIの領域が部分的にまたはすべてが欠如している断片または断片を含ん
でなるタンパクも提供される。前記のものをコード化する核酸が提供される。R
PI遺伝子配列を発現する組換え核酸が同定されると、その遺伝子生成物は分析
されうる。これは生成物の物理的なまたは機能的な特性に基づく分析によって成
され、ゲル電気泳動、イムノアッセイなどによる分析を伴う生成物の放射性標識
が含まれる。RPIが同定されると、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換
、アフィニティー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー)、遠心沈殿法
、異なる溶解度による方法(differential solubility)、またはタンパクの精 製に用いられる通常の他のすべての技術を含む一般的な方法により分離され、精
製されうる。その他に、組換え核酸によって生成されたRPIが同定されたとき
、組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列からRPIのアミノ酸配
列全体を推測することができる。結果として、タンパクは技術的に公知の一般的
な化学的方法によって合成されうる(例えば、Hunkapille等,M.,
1984,Nature 310 105−111参照)。他のかわりの実施形
態においては、上記記載の一般的な方法(例えば、イムノアフィニティー精製)
によって天然型RPIが天然のソースから精製されうる。好ましい実施形態にお
いては、参照としてここに組み込まれる米国出願第08/980,574号に記
載の「好ましい技術」によってRPIは分離される。調整段階での実施のために
は、Westermeier,1993,Electrophoresis i
n Practice(VCH,Weinheim,Germany),pp.
197−209(全体が参照としてここに組み込まれる)に記載の方法にしたが
って、等電段階において2pHまたはそれ以下のpH範囲を有する狭い範囲のズ
ームゲルを使用することが好ましい。この改変によって、より大量のターゲット
タンパク質がゲル上にローディングされることを可能にし、それによってゲルか
ら取り出される分離RPIの量も増加する。調整段階での実施のためにこの方法
が用いられたときは、「好ましい技術」は、一回の実施で一般的には100ng
にまで及ぶ分離RPIを提供し、1000ngにまで及ぶ量を提供しうる。当該
技術に精通したものであれば、ズームゲルは、ゲル等電収束法を用いたいかなる
分離戦略においても使用されうるものであることを認識するであろう。本発明の
特殊な実施形態においては、そのうようなRPIは、組換えDNA技術によって
製造されたものであれ、化学的な合成方法によるものであれ、天然タンパクの精
製によるものであれ、断片および他の誘導体ならびにそれらの類似体に加えて、
RPIのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含んでなるものからなる(しかし、
これに限られるものではない)。また、ホモローグなタンパクを含む。 【0214】 RPIに対する抗体の製造 本発明にしたがって、RPI、その断片、および他の誘導体、並びにそれらの
類似体が、免疫特異的にイムノゲンに結合する抗体を生成するイムノゲンとして
使用されうる。そのようなタンパク、断片、誘導体、および類似体は、いかなる
慣用の方法によって分離してもよく、本願の以前のセクションに記載された方法
を含む。生成される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一重鎖
、Fab断片、およびFab発現ライブラリーを含むがこれらに限られるもので
はない。特殊な実施形態においては、ヒトRPIに対する抗体が製造される。他
の実施形態においては、RPIのドメインに対する抗体が製造されうる。特殊な
実施形態においては、抗体製造のためのイムノゲンとしてRPIの親水性断片が
使用される。RPIもしくは誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体の
製造のために、技術的に公知の種々の手法が使用されうる。特殊な実施形態にお
いては、RPIのエピトープに対するウサギポリクローナル抗体またはその配列
が得られる。抗体の製造のために、天然のRPIもしくは合成型またはその誘導
体(例えば、断片)の注入によってさまざまなホスト動物、ウサギ、マウス、ラ
ット、ウマ、ヤギ、などが含まれるがこれらに限られるものではない、が免疫さ
れる。種々のアジュバントが免疫学的反応を増加させるために使用されうる。そ
れらはホスト種に依存し、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジ
ュバント、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンなどの表面活
性化物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キー
ホールカサガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG(Bacil
le Calmette−Guerin)およびコリネバクテリウム パルバム
のような潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるがこれらに限定されるもの
ではない。RPI配列およびその類似体に対するモノクローナル抗体の調製のた
めに、培養中の連続した細胞株による抗体分子の製造のためのいかなる技術を用
いてもよい。例えば、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Koz
borら,1983,Immunology Today472)、およびヒト
モノクローナル抗体を製造するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら,
1985,in Monoclonal Antibodies and Ca
ncer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77−
96)に加えて、元来KohlerおよびMilstein(1975,Nat
ure256495−497)によって開発されたハイブリドーマ技術がある。
(前記文献はそれぞれ参照としてここに組み込まれる) 本発明の付加的な実施形態においては、ここに参照として組み込まれるPCT
/US90/02545に記載されるように、無菌動物中にてモノクローナル抗
体は製造されうる。本発明にしたがってヒト抗体は使用され、また、ヒトハイブ
リドーマを用いて(Coteら,1983,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA802026−2030)、またはヒトB細胞をインビトロにおい
てEBVウイルスで形質転換することによって(Coleら,1985,in
Monoclonal Antibodies and Cancer The
rapy,Alan R.Liss,pp.77−96)、得ることができる。
実際、本発明次第では、好ましい生物学的に活性なヒト抗体分子から得た遺伝子
に付随するRPIに特異的なマウス抗体分子から得た遺伝子のスプライシングに
よるキメラ抗体の製造のために開発された技術(Morrisonら,1984
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851−6855;N
eubergerら,1984,Nature312604−608;Take
daら,1985,Nature314452−454)を用いることができる
。このような抗体は、本発明の範囲に属するものである。(前記文献はそれぞれ
参照としてここに組み込まれる) 本発明次第では、一重鎖抗体の製造のための技術(参照としてここに組み込ま れる米国特許第4,946,778号)が、RPI特異的な一重鎖抗体を製造す
るために用いられうる。本発明の付加的な実施形態は、Fab発現ライブラリー
の構築のために記載された技術(Huseら,1989,Science246 1275−1281)を利用し、迅速かつ容易なRPI、誘導体、または類似体
に望ましい特異性を有するモノクローナルFab断片の同定を可能にする。分子
のイディオタイプを含む抗体断片は公知の技術によって生成されうる。例えば、
そのような断片としては、抗体分子のペプシン処理によって製造されうるF(a
b’)2断片、F(ab’)2断片のジスルフィド架橋を還元することによって製
造されるFab’断片、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによっ
て製造されるFab断片、Fv断片、が含まれるがこられに限られるものではな
い。抗体の製造に際しては、所望の抗体のためのスクリーニングは、例えば、E
LISA(enzyme-linked immunosorbent assay)などの公知技術によって遂行 される。例えば、RPIの特定のドメインを認識する抗体を選択するためには、
そのようなドメインを含むRPI断片に結合する生成物のために、製造されたハ
イブリドーマを分析することができる。第一PRIホモローグに特異的に結合す
るが、異なるRPIホモローグには特異的に結合しない抗体の選択のためには、
第一RPIホモローグへの能動的な結合および第二RPIホモローグへの結合の
欠如に基づいて選択することができる。同様に、RPIに特異的に結合するが、
同一のタンパク(例えば、RPIと同一のコアペプチドを有する、異なるグリコ
フォーム)の異なるイソ型には特異的に結合しない抗体の選択は、RPIへの能
動的な結合および異なるイソ型(例えば、グリコフォーム)への結合の欠如に基
づいて選択することができる。RPIのドメインに特異的な抗体も提供される。
前記抗体は、本発明のRPIの位置および活性に関する技術的に公知の方法、例
えば、これらのタンパクのイメージ化、好適な生理学的なサンプルにおけるそれ
らのレベルの測定、診断方法などにおいて用いられる。 【0215】 RPIをコード化するDNAの分離 RPI遺伝子のクローニングのための特殊な実施形態を以下に例を用いて述べ
るが、これに限定されるものではない。DNAおよびRNAを含み、RPIもし
くは断片またはその類似体をコード化する配列からなる本発明のヌクレオチド配
列は、慣用的な化学的アプローチまたは重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ
チェーンリアクション(PCR)増幅などの技術的に公知の方法を用いて合成さ
れうる。配列はいかなる種のRPI遺伝子の同定およびクローニングも提供し、
例えば、cDNAライブラリー、ゲノミックライブラリー、または発現ライブラ
リーのスクリーニングが挙げられる。本発明のRPIをコード化する配列からな
るヌクレオチド配列は、他のタンパク遺伝子の相補的な伸長と選択的に二重鎖分
子を形成する能力において有用である。応用形態によるが、さまざまな配列同定
を遂行するために種々のハイブリダイゼーション条件が採用されうる。選択性の
度合いを高めるためには、塩が少なく温度が高い条件などの比較的緊縮した条件
が二重鎖を形成するために使用される。ここで使用されている「高度に緊縮した
条件(highlystringentconditions)」とは、65℃の0.5M NaHPO4、
7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中において濾過器に
結合されたDNAへハイブリダイゼーションし、68℃の0.1xSSC/0.
1%SDSで洗浄することを意味する(全体が参照としてここに組み込まれるA
usubel F.M.等,eds.,1989,Current Proto
cols in Molecular Biology,Vol.I,Gree
n Publishing Associates,Inc.,and Joh
n Wiley&sons,Inc.,ニューヨーク,p.2.10.3)。い
くつかの応用にあたっては、緊縮度合いがより少ないハイブリダイゼーション条
件が必要とされる。ここで用いられる「適度に緊縮した条件(moderatelystring
entconditions)」とは、42℃の0.2xSSC/0.1%SDSで洗浄する ことを意味する(Ausubelら,1989,上記文献)。ハイブリダイゼー
ション条件は、ハイブリッド二重鎖を不安定化させるために、ホルムアミドの量
を増加することによってより緊縮したものとすることもできる。このように、特
定のハイブリダイゼーション条件は容易に操作されるものであり、一般的には所
望する結果に応じて選択される。例えば、50%のホルムアミド存在下における
慣用的なハイブリダイゼーション温度は、RPI遺伝子断片に対して95〜10
0%ホモローグであるプローブに対しては42℃であり、90〜95%ホモロー
グの時は37℃、70〜90%ホモローグの時は32℃である。ゲノミックライ
ブラリーの調製にあたっては、その一部がRPIの一部または全体をコード化す
るDNA断片が製造される。DNAは種々の制限酵素を用いて特定のサイトで開
裂することもできる。かわりに、DNAを断片化するためにマンガン存在下にお
いてDNアーゼを用いることもでき、または、例えば、超音波処理によってDN
Aを物理的にせん断することもできる。DNA断片は、その後、一般的な技術に
よって大きさに従って分離される。方法としては、アガロースおよびポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、並びにショ糖勾配遠心法が
含まれるがこれらに限定されるものではない。DAN断片はその後好適なベクタ
ー、プラスミド、コスミド、バクテリアファージラムダもしくはT4、およびイ
ースト人工クロモソーム(YAC)が含まれるが限定されるものではない、に挿
入される。(例えば、Sambrookら,1989,Molecular C
loning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Co
ld Spring Harbor Laboratory Press,Co
ld Spring Harbor,ニューヨーク;Glover,D.M.(
ed.),1985,DNA Cloning A Practical Ap
proach,MRL Press,Ltd.,Oxford,イギリス国 V
ol.I,II;Ausubel F.M.ら,eds.,1989,Curr
ent Protocols in Molecular Biology,V
ol.I,Green Publishing Associates,Inc
.,and John Wiley&sons,Inc.,ニューヨーク参照)
。ゲノミックライブラリーは、標識されたプローブへの核酸ハイブリダイゼーシ
ョンによってスクリーニングすることもできる(Benton and Dav
is,1977,Science196 180;Grunstein and
Hogness,1975,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72 3961)。ゲノミックライブラリーは、技術的に公知の最適なアプローチ
を用いて、RPIのいかなるペプチドのアミノ酸配列も対応する標識された変性
オリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングすることもできる。用いられ
るプローブは、10ヌクレオチドまたはそれ以上であることが好ましく、15ヌ
クレオチドまたはそれ以上であることがより好ましい。上記表VIII〜XIに示され
るように、ここで開示されるいくつかのRPIは、その配列が公知である遺伝子
によってコード化された、以前に同定されたタンパクに対応するものである。そ
のような遺伝子をスクリーニングするために、その遺伝子またはその補体に相補
的ないかなるプローブを用いてもよい。プローブは10ヌクレオチドまたはそれ
以上であることが好ましく、15ヌクレオチドまたはそれ以上であることがより
好ましい。http//www.ncbi.nlm.nih.gov/でアクセ
ス可能なNational Center for Biotechnolog
y Information(NCBI)に保持されているEntrezデータ
ベースは、以下の受け入れ番号によりこれらのRPIに対応する遺伝子配列を提
供する。また、それぞれの配列はここに組み込まれる。 【0216】 表XII RPI関連タンパクの遺伝子配列 RADF #RPI 受け入れ番号 RADF−1 RPI−1 T40090,T40068 RADF−3 RPI−3 AA551927,AA260531,W977
41,N99366,T70526,T40177,T40060,T4003
4,T39910,T39894 RADF−4 RPI−4 T41010,T40102,T40058,T
39954 RADF−6 RPI−5 AA269874 RADF−8 RPI−6 Z20858,AA503766,H51308
,H03365 RADF−9 RPI−7 Z20858,AA503766,H51308
,H03365 RADF−10 RPI−8 Z21022,Z19947 RADF−11 RPI−9 T41063,T41020,T41005,
T40881,T40190,T40139,T40125,T40114,T
40096,T39908 RADF−12 RPI−11 T40090,T40068 RADF−13 RPI−12 AA551927,AA260531,W97
741,N99366,T70526,T40177,T40060,T400
34,T39910,T39894 RADF−14 RPI−13 T40090,T40068 RADF−15 RPI−15 T40940,T40002 RADF−16 RPI−16 T73244,T71043,T71032,
T40181,T40116 RADF−18 RPI−21 N99641,N99445,N99528,
Z20485,Z20465 RADF−19 RPI−22 AA269874 RADF−20 RPI−23 Z20858,AA503766,H5130
8,H03365 RADF−22 RPI−24 T1952,H73939,Z20894,T
40182,T40167,T40158 RADF−23 RPI−25 AA614684,AA523377,AA7
15907,AA580429,AA630254,AA617854,AA5
80356 RADF−24 RPI−26 AA268201,T64416,T6214
9,T40186 RADF−25 RPI−27 Z21017,Z20888,Z19984,
Z19971,T41056,T40108 RADF−26 RPI−28 T1952,H73939,Z20894,T
40182,T40167,T40158 RADF−26 RPI−29 Z21017,Z20888,Z19984,
Z19971,T41056,T40108 RADF−26 RPI−30 T64707 RADF−27 RPI−31 Z20858,AA503766,H5130
8,H03365 RADF−32 RPI−33 T40090,T40068 RADF−33 RPI−34 T40090,T40068 RADF−35 RPI−36 Z21022,Z19947 RADF−36 RPI−37 Z20858,AA503766,H5130
8,H03365 RPI−10、RPI−17、およびRPI−20のそれぞれに関しては、以
下のような変質した一連のプローブが提供される。 (a) RPI−10に対するプローブ 【0217】 【化4】 【0218】 (b) RPI−17に対するプローブ 【0219】 【化5】 【0220】 (c) RPI−20に対するプローブ 【0221】 【化6】 【0222】 RPIまたはその断片をコード化する挿入DNAを有するライブラリーのクロ
ーンは、1またはそれ以上の変性オリゴヌクレオチドプローブ(またはそれらの
相補体)にハイブリダイゼーションする。そのようなオリゴヌクレオチドプロー
ブのゲノミックライブラリーへのハイブリダイゼーションは、技術的に公知の方
法を用いて実施される。例えば、上述した一連の変性したオリゴヌクレオチドプ
ローブもしくはそれらの相補体と(または、そのような一連のものもしくは相補
体の1つと)のハイブリダイゼーションは、前記高度に緊縮した条件、または適
度に緊縮した条件下において実施される。または、55℃の2X SSC、1.
0%SDS中で実施し、同条件で洗浄する。さらに他の観点においては、RPI
もしくはRPI誘導ポリペプチドの一部または全体をコード化するヌクレオチド
配列のクローンを、発現ライブラリーのスクリーニングによって得ることもでき
る。例えば、ベクターが導入されるホストセルによってベクター内に挿入された
配列が発現しうるように、関連するソースからのDNAが分離され、ランダム断
片が調製され、発現ベクター中(例えば、バクテリオファージ、プラスミド、フ
ァージミド、またはコスミド)にライゲーションされる。種々のスクリーニング
分析がその後、発現したRPIまたはRPI誘導ポリペプチドに対する選択のた
めに使用されうる。ある実施形態においては、本発明の種々のアンチRPI抗体
は、技術的に公知の方法を用いて、所望のクローンを同定するために使用されう
る。例えば、HarlowおよびLane,1988,Antibodies
A Laboratory Manual,Cold Spring Harb
or Laboratory Press,Cold Spring Harb
or,NY,Appendix IV参照。ライブラリーからのクローンまたは
プラークは、結合するそれらのクローンを同定するために抗体と接触するように
される。ある実施形態においては、RPIもしくはRPI誘導ポリペプチドをコ
ード化するDNAを含んでなるクローンまたはプラークは、ここに参照として組
み込まれるOlsvickら,29th ICAAC,Houston,Tex
.1989に従い、DYNAビーズを用いて検出することができる。アンチRP
I抗体はトシル化されたDYNAビーズM280に架橋され、その後、これらの
抗体を含むビーズは、RPIもしくはRPI誘導ポリペプチドを発現するクロー
ンまたはプラークに吸着するために使用される。RPIもしくはRPI誘導ポリ
ペプチドを発現するクローンまたはプラークは、ビーズに結合するこれらのいず
れかとして同定される。かわりに、アンチRPI抗体は、シリカやCelite
(登録商標)樹脂のような好適な単体に非特異的に固定されうる。その後、この
物質は、前節に記載したように、RPIタンパクまたはRPI誘導ポリペプチド
を発現する細菌性コロニーに吸着するために使用される。他の観点においては、
PCR増幅が、ゲノミックDNAからのRPIの一部または全体をコード化する
十分に純粋なDNAを製造するために使用されうる。公知のRPI配列に対応す
るオリゴヌクレオチドプライマー、変質物、その他のものは、プライマーとして
使用されうる。例えばPerkin−Elmer Cetus thermal
cycler and Taq polymerase(Gene Amp(
登録商標))によって、PCRは実施されうる。PCR反応において使用するた
めに、数種の異なる変性プライマーを合成することを選択することができる。変
質プライマーとDNA中の対応する配列とのヌクレオチド配列類似性の度合いを
向上または減少させるために、PCR反応のプライミングの際に用いられるハイ
ブリダイゼーション条件の緊縮度を変化させることも可能である。RPIをコー
ド化する配列のセグメントの連続した増幅後、セグメントは分子的にクローニン
グ、および配列され、完全なゲノミッククローンを分離するためプローブとして
利用される。前記文献に記載したように、これにより、遺伝子の完全なヌクレオ
チド配列、その発現の分析、および機能的な分析のためのそのタンパク生成物の
製造が順番に可能となる。RPI遺伝子はインビトロ翻訳を伴う核酸ハイブリダ
イゼーションによるmRNA選択によっても同定することができる。この手法に
おいては、断片はハイブリダイゼーションによる相補性mRNAを分離するため
に使用される。そのようなDNA断片は、入手可能な他の種(例えば、マウス、
ヒト)の精製RPI DNAを再現することができる。分離されたmRNAの分
離生成物のインビトロ翻訳生成物の免疫沈降分析または機能分析(例えば、イン
ビトロでの凝集能力、レセプターへの結合)によりmRNAが同定され、したが
って所望の配列を含む相補性DNA断片が同定される。さらに、RPIに対して
特異的な固定された抗体への、細胞から分離されたポリソームの吸着によって特
異的mRNAを選択することができる。放射線標識されたRPI cDNAは、
テンプレートとして選択された(吸着ポリソームからの)mRNAを用いて合成
することができる。放射線標識されたmRNAまたはcDNAは、その後、他の
ゲノミックDNA断片中からRPI DNA断片を同定するためにプローブとし
て使用することができる。分離されたRPIゲノミックDNAの代用としては、
公知の配列からの遺伝子配列そのものの化学合成、またはRPIをコード化する
mRNAに対するcDNAの調製が含まれるがこられに限定されるものではない
。例えば、RPI遺伝子cDNAクローニングのためのRNAは、RPIを発現
する細胞から分離することができる。他の方法も可能であり、本発明の範囲に含
まれるものである。 【0223】 いずれの真核生物細胞も、潜在的にRPI遺伝子の分子クローニングのための
核酸ソースとして作用しうる。RPIをコード化する核酸配列は、霊長類ソース
、昆虫、植物などに加えて、脊椎動物、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ
、ウマ、イヌ、から分離することができる。DNAは、化学合成によって、cD
NAクローニングによって、またはゲノミックDNAもしくはその断片のクロー
ニングによってクローンDNA(例えば、DNAライブラリ)から技術的に一般
的な公知の手法によって得ることができ、所望の細胞から精製される(例えば、
Sambrookら,1989,Molecular Cloning,A L
aboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring
Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor,ニューヨーク;Glover,D.M.(ed.),1985,
DNA Cloning A Practical Approach,MRL
Press,Ltd.,Oxford,イギリス国Vol.I,II.参照)
ゲノミックDNAから誘導されたクローンは、コード化領域に加えて調節および
イントロン領域を含んでいてもよく、cDNAから誘導されたクローンはエクソ
ン配列のみを含むものである。ソースが何であれ、RPI遺伝子は、調製のため
に好適なベクター内に分子的にクローンされるべきである。同定され分離された
遺伝子またはcDNAは、その後、好適なクローニングベクター内に挿入されう
る。技術的に公知の多数のベクター−ホスト系を使用することが可能である。可
能なベクターとしては、プラスミド、変性ウイルスが含まれるがこれらに限られ
るものではない。しかし、ベクター系は使用されるホスト細胞に適合するもので
なければならない。そのようなベクターとしては、ラムダ誘導体のようなバクテ
リオファージ、PBR322もしくはpUCプラスミド誘導体またはBlues
criptベクター(Stratagene)のようなプラスミドが含まれるが
これらに限られるものではない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相
補的な相補末端を有するクローニングベクターへのDNA断片のライゲーション
によって実施することができる。しかし、もしDNAを断片化するために用いら
れる相補的な制限サイトがクローニングベクターには存在しなければ、DNA分
子の末端を酵素的に変性することができる。かわりに,所望のいかなるサイトを
DNA末端へのヌクレオチド配列(リンカー)のライゲーションによって作製す
ることもでき、これらのライゲーションされるリンカーは、制限エンドヌクレア
ーゼ認識配列をコード化する化学合成された特異的なオリゴヌクレオチドを含ん
でいてもよい。代用方法においては、開裂したベクターおよびRPI遺伝子は、
ホモポリマー性テーリングによって変性されてもよい。遺伝子配列の多数のコピ
ーを生成するために、組換え分子を形質転換、形質移入、感染、エレクトロポレ
ーションなどによってホスト細胞中に導入することができる。特殊な実施形態に
おいては、分離されたRPI遺伝子、cDNA、または合成DNA分子を組み込
んだ組換えDNA分子でのホスト細胞の形質転換により、遺伝子の多様なコピー
の製造が可能になる。このように、遺伝子は形質転換物を成長させ、形質転換物
から組換えDNA分子を分離し、必要とあれば分離組換えDNAから挿入された
遺伝子を検索することによって大量に得ることができる。本発明によって提供さ
れるRPI配列は、天然RPIにおいて確認されるものとほぼ同一であるアミノ
酸配列をコード化するヌクレオチド配列、および機能的に同等なアミノ酸を有す
るアミノ酸配列をコード化した配列、それに、他のターゲット誘導体およびその
類似体をコード化する配列を含むがこれらに限られるものではない。 【0224】 RPIをコード化するDANの発現 RPIもしくは機能的に活性な類似体もしくはその断片または誘導体をコード
化するヌクレオチド配列は、好適な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパ
ク質コード化配列の転写および翻訳のために必要な要素を含むベクター、中に挿
入することができる。必要な転写のおよび翻訳のシグナルは、天然RPI遺伝子
またはその側面領域によって供給することができる。種々のホスト−ベクター系
を、タンパク質コード化配列を発現させるために利用することができる。これら
としては、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)に感
染した哺乳類細胞株、ウイルス(バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞株、イ
ーストベクターを含むイーストにような微生物、またはバクテリオファージ、D
NA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換されたバクテリア
が含まれるがこれらに限定されるものではない。ベクターの発現要素は、強度お
よび特異性において異なる。利用されるホスト−ベクター系によって、いくつか
の好適な転写および翻訳要素の一つが使用されうる。特殊な実施形態においては
、ヒトRPI遺伝子、またはヒトRPIの機能的に活性な部分をコード化する配
列が発現される。さらに他の実施形態においては、RPIのドメインを含んでな
るターゲットの断片が発現される。 【0225】 好適な転写および翻訳制御シグナル並びにタンパク質コード化配列からなるキ
メラ遺伝子を含んでなる発現ベクターを構築するために、ベクター内へのDNA
断片の挿入に関して以前に記載されたいかなる方法を用いることもできる。これ
らの方法はインビトロ組換えDNAおよび合成方法並びにインビボ組換え体(遺
伝学的組換え)を含む。RPIおよびペプチド断片をコード化する核酸配列の発
現は、第2核酸配列によって調節され、組換えDNA分子で形質転換されたホス
トにおいてRPIまたはペプチドが発現する。例えば、RPIの発現は、技術的
に公知のいかなるプロモーターまたはエンハンサー要素によっても制御すること
ができる。RPI遺伝子発現を制御するために用いられるプロモーターとしては
、SV40早期プロモーター領域(BernoistおよびChambon,1
981,Nature290304−310)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末
端反復に含まれるプロモーター(Yamamotoら,1980,Cell22 787−797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら,
1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA781441−14
45)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982
,Nature29639−42)、β−ラクタマーゼプロモーターのような原
核細胞発現ベクター(Villa−Kamaroffら,1978,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA753727−3731)、またはtac
プロモーター(DeBoerら,1983,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA8021−25)が含まれるがこれらに限られるものではない。S
cientific American,1980,24274−94記載の組
換えバクテリアから得られた有用なタンパク;ノパリンシンセターゼプロモータ
ー領域(Herrera−Estrellaら,Nature303209−2
13)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Ga
rdnerら,1981,Nucl.Acids Res.92871)および
光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター(Her
rera−Estrellaら,1984,Nature310115−120
)からなる植物発現ベクター;Gal4プロモーター、ADC(alcohol
dehydrogenase)プロモーター、PGK(phosphogly
cerol kinase)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモータ
ー、および組織特異性を示し、膵腺房細胞において活性なトランスジェニック動
物エラスターゼI遺伝子制御領域において活用される以下の動物転写制御領域、
のようなイーストもしくは他の菌類から得たプロモーター要素(Swiftら,
1984,Cell38639−646;Ornitzら,1986,Cold
Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399
−409;MacDonald,1987,Hepatology7425−5
15);膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan
,1985,Nature315115−122)、リンパ球において活性なイ
ムノグロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら,1984,Cell 38 647−658;Adamesら, 1985,Nature318533
−538;Alexanderら,1987,Mol.Cell.Biol.7 1436−1444)、精巣、胸部、リンパ球、および肥満細胞において活性な
マウス***腫瘍ウイルス制御領域(Lederら,1986,Cell4548
5−495)、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert
ら,1987,Genes and Devel.1268−276)、肝臓に
おいて活性なアルファフェトタンパク遺伝子制御領域(Krumlaufら,1
985,Mol.Cell.Biol.51639−1648;Hammerら
,1987,Science23553−58);肝臓において活性なアルファ
1−アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら,1987,Genes
and Devel.1161−171)、脊髄細胞において活性なベータグ
ロビン遺伝子領域(Mogramら,1985,Nature315338−3
40;Kolliasら,1986,Cell4689−94);脳の乏突起膠
細胞において活性なミエリン塩基性タンパク遺伝子制御領域(Readhead
ら,1987,Cell48703−712);骨格筋において活性なミオシン
軽鎖−2遺伝子制御領域(Sani,1985,Nature314283−2
86)、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制
御領域(Masonら,1986,Science2341372−1378)
も参照される。特殊な実施形態においては、操作可能なようにRPIコード化核
酸に結合したプロモーター、1またはそれ以上の複写源、および、場合によって
は1またはそれ以上の選択可能なマーカー(例えば、抗生物質抵抗性の遺伝子)
からなるベクターが使用される。特殊な実施形態においては、発現構成は、3つ
のpGEXベクター(グルタチオンS−トランスフェラーゼ発現ベクター;Sm
ithおよびJohnson,1988,Gene731−40)それぞれのE
coRI制限サイトに、RPIをコードする配列をサブクローニングすることに
よって成される。これにより、正しいリーディングフレームにおいてサブクロー
ンからのRPI生成物の発現が可能になる。RPI遺伝子挿入を含んでなる発現
ベクターは3つの一般的なアプローチ、(a)核酸ハイブリダイゼーション、(
b)マーカー遺伝子機能の存在または欠如、および(c)挿入された配列の発現
、によって同定されうる。第一のアプローチにおいては、発現ベクターに挿入さ
れたRPI遺伝子の存在は、挿入されたRPI遺伝子にホモローグである配列を
含んでなるプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出すること
ができる。第2のアプローチにおいては、組換えベクター/ホスト系は、ベクタ
ー中のRPI遺伝子の挿入によって引き起こされる、あるマーカー遺伝子機能(
例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質抵抗性、形質転換フェノタイプ、バキ
ュロウイルスにおけるオクルージョン体形成など)の存在または欠如に基づいて
同定され、選択される。例えば、もしRPI遺伝子がベクターのマーカー遺伝子
配列内に挿入されれば、RPI遺伝子挿入を含んでなる組換え体はマーカー遺伝
子機能の欠如によって同定することができる。第3のアプローチにおいては、組
換え発現ベクターは組換え体によって発現されるRPI遺伝子生成物を分析する
ことによって同定することができる。そのような分析は、例えば、インビトロ分
析システムにおけるRPIの物理的または機能的な特性、例えば、アンチRPI
抗体との結合に基づくものでありうる。特定の組換えDNA分子が同定および分
離されると、技術的に公知の数種の方法がそれを増殖させるために用いられうる
。好適なホストシステムおよび成長条件が設定されると、組換え発現ベクターは
増殖され、大量に調製される。前記説明したように、使用されうる発現ベクター
としては、いくつかの例を挙げると、以下のベクターおよびその誘導体、ワクシ
ニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス;バキュロ
ウイルスのような昆虫ウイルス;イーストベクター;バクテリオファージベクタ
ー(例えば、ラムダ)、並びにプラスミドおよびコスミドDNAベクター、が含
まれるがこられに限られるものではない。加えて、挿入された配列の発現を調節
する、または所望の特殊な方法で遺伝子生成物を変性し加工するホスト細胞株を
選択することができる。あるプロモーターからの発現は、ある誘導物質の存在下
において上昇させることができる。このように遺伝子工学的に加工されたRPI
の発現を制御しうる。さらに、異なるホスト細胞は、翻訳中のおよび翻訳後の加
工および変性(例えば、タンパクの糖付加、リン酸エステル化)に関する固有で
特異的なメカニズムを有する。発現された外来タンパクに所望の変性および加工
を確保するために、好適な細胞株またはホストシステムを選択することができる
。例えば、糖付加されていないコアタンパク生成物を製造するために、細菌性シ
ステムにおける発現を用いることができる。イーストにおける発現により糖付加
生成物が製造される。哺乳類細胞における発現は、ヘテロローグタンパクの天然
糖付加を確実にするために使用されうる。さらに、ベクター/ホスト発現系が異
なると、加工反応への影響も異なるものとなりうる。組換えタンパクの長期間、
高収率生成のためには安定した発現が好ましい。例えば、差別的に発現されたま
たは経路遺伝子タンパクを安定的に発現する細胞株が設計されてもよい。複写の
ウイルス起源を含む発現ベクターを使用するよりも、好適な発現制御要素(例え
ば、プロモーター、エンハンサー、シーケンサー、転写ターミネーター、ポリア
デニレーションサイトなど)および選択可能なマーカーによって制御されたDN
Aで、ホスト細胞を形質転換する方が好ましい。外来DNAの導入に続いて、設
計された細胞を1〜2日間強化培地において成長させ、その後選択性の培地に切
り替えることができる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に抵抗
力を与え、細胞が安定的にプラスミドをクロモソームと結合させ、成長して、順
にクローニングされ細胞株内に展開されるフォーカスを形成することを可能にす
る。この方法は、差別的に発現されたまたは経路遺伝子タンパクを発現する細胞
株を設計するために好適に使用されうる。そのような設計された細胞株は、差別
的に発現されたまたは経路遺伝子タンパクの内因性活性に影響を及ぼす化合物の
スクリーニングおよび評価において特に有用でありうる。多数の選択システムを
使用することができ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら
,1977,Cell11223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ(Szybalska&Szybalski,1962,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA482026)、およびアデニンフ
ォスフォリボシールトランスフェラーゼ(Lowyら,1980,Cell22 817)遺伝子が、それぞれtk-,hgprt-またはaprt-細胞において 採用されうるがこれらに限られるものではない。また、アンチメタボライト耐性
が、耐性をメトトレキセートに付与するdhfr(Wiglerら,1980,
Natl.Acad.Sci.USA773567;O´Hareら,198 1,Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527)、マイコフ
ェノル酸に耐性を付与するgpt(Mulligan&Berg,1981,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA782072)、アミノグリコシ
ドG−418に耐性を付与するneo(Colberre−Garapinら,
1981,J.Mol.Biol.1501)、ヒグロマイシンに耐性を付与す
るhygro(Santerreら,1984,Gene30147)遺伝子に
対する選別の基礎として用いられうる。他の特殊な実施形態においては、RPI
、断片、類似体、および誘導体が、((異なるタンパクの)ヘテロローグタンパ
ク配列に結合したペプチドを解して結合したタンパク、断片、類似体、または誘
導体からなる)融合体またはキメラタンパク生成物として発現されうる。そのよ
うなキメラ生成物は、所望のアミノ酸配列をコード化する好適な核酸配列を、技
術的に公知の方法を用いて適切なコーディングフレームにおいて互いにライゲー
ションし、技術的に一般的に知られた方法によってキメラ生成物を発現すること
によって成される。かわりに、そのようなキメラ生成物はタンパク合成技術によ
って、例えば、ペプチド合成機の使用によって成すこともできる。cDNAおよ
びゲノミック配列の双方がクローニングされ、発現しうる。 【0226】 RPIの治療上の使用 本発明は治療上の化合物の投与による種々の疾病および疾患の治療並びに予防
を提供する。そのような化合物としては、RPIおよび類似体並びに(断片を含
む)それらの誘導体(例えば、ここに記載したようなもの);その抗体(ここに
記載);RPI、類似体、または誘導体(ここに記載)をコード化する核酸;R
PI遺伝子アンチセンス核酸並びにRPI遺伝子作動薬および拮抗剤が含まれる
がこれらに限られるものではない。ここに記載されたように、本発明の重要な特
性は、リウマチ様関節炎に含まれるRPI遺伝子の同定である。関節炎は、RA
患者の血清に対して関節液において減少するRPIの機能もしくは発現を促進す
る、治療上の化合物を投与することによって治療または予防されうる。関節炎は
、RA患者の血清に対して関節液において増加するRPIの機能または発現を低
下させる治療上の化合物の投与によっても治療または予防されうる。一般的に、
種の起源または(抗体の場合には)種の反応性が患者の化合物と同じ種である化
合物を投与することが好ましい。このように、好ましい実施形態においては、治
療または予防のために、ヒトRPI、誘導体、もしくは類似体、もしくは核酸、
またはヒトRPIに対する抗体がヒト患者に投与される。 【0227】 リウマチ様関節炎の治療および予防 リウマチ様関節炎は、RAを有する被験者の血清に対して関節液において減少
する1もしくはそれ以上のRPIのレベルもしくは機能、または1もしくはそれ
以上のRADFのレベルを促進する(すなわち、増加または供給する)化合物の
投与によって、治療または予防される。そのような化合物の例としては、機能的
に活性で、特にインビトロ分析または動物モデルにおいて活性であることが証明
されるRPI、誘導体、または断片、並びにRPIもしくは機能的に活性な誘導
体またはその断片(例えば、遺伝子治療においての使用のため)をコード化する
核酸が含まれるがこれに限られるものではない。使用されうる他の化合物、例え
ばRPI作動薬は、インビボ分析を用いて同定されうる。リウマチ様関節炎は、
RAを有する被験者の血清に対して関節液において増加量を示す1もしくはそれ
以上のEPIのレベルもしくは機能、または1もしくはそれ以上のRADFのレ
ベルを阻害する(すなわち減少する)化合物の投与によっても治療されまたは予
防される。そのような化合物の例としては、RPIアンチセンスオリゴヌクレオ
チド、リボザイム、またはRPIに対して検出される抗体が含まれるがこれらに
限られるものではない。使用されうる他の化合物、例えば、RPI拮抗薬は、イ
ンビトロ分析を用いて同定できる。特殊な実施形態において、1もしくはそれ以
上のRPIのレベルもしくは機能、または1もしくはそれ以上のRADFのレベ
ルを促進する化合物は、治療的に(RPIレベルもしくは機能、またはRADF
レベルの欠如や減少(通常のまたは好ましいものと比較して)が、RA患者の血
清と比較してRA患者の関節液において同定されたときは予防的にも)投与され
る。他の実施形態においては、RPIのレベルもしくは機能、またはRADFの
レベルを阻害する化合物が治療的に(RPIレベルもしくは機能、またはRAD
Fレベルの増加(通常のまたは好ましいものと比較して)が、RA患者の血清と
比較してRA患者の関節液において同定されたときは予防的に)投与される。そ
のような化合物の投与によるRPI機能もしくはレベルまたはRADFレベルの
変化は、例えば、患者の組織サンプルを得て(例えば、生検で)、インビトロに
おいてRNAもしくはタンパクレベルまたは表現されたRPI RNAもしくは
タンパクの活性を分析することによって容易に同定することができる。「好まし
い技術」も、化合物投与の前後においてRPIまたはRADFのレベルを検出す
るために使用されうる。技術的に一般的な多種の方法がこのように用いられ、キ
ナーゼ分析、RPIを検出および/または視覚化するためのイムノアッセイ(例
えば、ウェスタン法、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
を伴う免疫沈降、免疫細胞化学など)、および/またはRPIをコード化するm
RNAをそれぞれ検出および/または視覚化することによってRPI表現を検出
するためのハイブリダイゼーション分析(例えば、ノーザン法、ドットブロット
、インサイチュハイブリダイゼーション、など)、などが含まれるがこれらに限
られるものではない。本発明の化合物としては、例えば、その化合物が非ステロ
イドの炎症剤(NSAID)(例えば、プレドニゾン、イブプロフェン、フェノ
プロフェン、ケトプロフェン、フルルブプロフェン、インドメタシン、スリンダ
ク、アスピリン、サリチルサリチル酸、ジフルニサル、ナプロキセン、ピロキシ
カム、テノキシカム、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン)ではない条件
の下で、RA RPIまたはRADFプロフィールを通常にまで回復させる小さ
な有機分子、タンパク、ペプチド、抗体、核酸など、金塩、D−ペニシラミン、
ヒドロキシクロロキン、またはサルファサルアジンのような抗マラリア薬、アザ
チオプリン、シクロホスファミド、クロランブシル、メトトレキセート、コルチ
コステロイド、アンチ−CD4モノクローナル抗体、並びにアンチ−CDw52
抗体が含まれるがこれらのいずれいも限られるものではない。 【0228】 遺伝子治療 特殊な実施形態において、RPIまたはそれらの機能的な誘導体をコード化し
た配列を含む核酸は、RPI機能を促進するために遺伝子治療の手法によって投
与される。遺伝子治療は、発現された、または、発現可能な核酸物質を投与する
ことによって行われる治療のことである。本発明のこの実施形態において、該核
酸は、RPI機能を促進することによって治療的効果を仲介する、コードされた
タンパク質を生産する。当業界で使用され得る遺伝子治療の任意の方法が、本発
明に従って使用され得る。模範的な方法を以下に記載する。遺伝子治療方法の一
般的な報告として、Goldspiel等, 1993, Clinical Pharmacy 12488-505; Wuお よびWu, 1991, Biotherapy 387-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol . 32573-596;Mulligan, 1993, Science 260926-932;ならびに、Morga
nおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62191-217; May, 1993, TIBTEC
H 11(5)155-215)が参照される。当業界で周知の使用される組換えDNA技術の 方法は、Ausubel等,(eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, NY;および Kriegler, 1990, Gene Transfer and Express
ion, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYで説明されている。好ましい観
点において、その化合物は、RPIをコード化した核酸、好ましい宿主中でRP
Iまたはそれらの断片もしくはキメラタンパク質を発現する発現ベクターの部分
である前記核酸を含む。特に、このような核酸は、RPIコード領域に操作可能
に(operably)結合したプロモーター、誘導性または構成性および任意に組織特
異的な前記プロモーターを有している。他の特別な実施形態において、核酸分子
が用いられ、その際、RPIコード配列および他の任意の望ましい配列が、ゲノ
ム中の望ましい部位における相同性組換えを促進するような領域の側に配置され
、このようにしてRPI核酸の染色体内発現に供給される(KollerおよびSmithi
es, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 868932-8935; Zijlstra等, 1989, Nat
ure 342435-438)。核酸の患者への運搬が、直接的であれば、患者は直接的に該
核酸または核酸を含むベクターにさらされ、または、間接的であれば、細胞は最
初にインビトロで核酸により形質転換され、次に患者中に移植される。これら二
つのアプローチが、それぞれインビボまたはインビトロの遺伝子治療として知ら
れている。特別な実施形態において、該核酸は直接的にインビボで投与され、発
現され、コード化した生産物を生産する。このような核酸は任意の当業界で周知
の膨大な方法によって行われ、例えばそれを適切な核酸発現ベクターの一部とし
て構築し、細胞内に導入するためにそれを投与する、例えば欠損もしくは弱毒化
レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染(例えば、米国特許第
4,980,286号)、もしくは、裸のDNAの直接注射、もしくは、マイク
ロバーティクル照射(microparticle bombardment)(例えば、a gene gun; Bio
listic, Dupont)、もしくは、脂質または細胞表面受容体またはトランスフェク
ション因子(transfecting agents)、リポゾーム、マイクロパーティクル(mic
roparticles)もしくはマイクロカプセル(microcapsules)によるカプセル封入
によるコーティング、または、核に入ることが知られているペプチドへの結合に
おける投与、受容体仲介エンドサイトーシスを受けるリガンドへの結合における
投与(例えばWuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 2624429-4432)(これらは特 異的に受容体を発現するターゲット細胞に対して使用される)等によって行われ
る。他の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され、該リガンドは紡
錘状(fusogenic)のウイルスペプチドを含み、これによりエンドゾームを破砕 させ、核酸がリソソーム性分解を受けないようにする。さらに他の実施形態にお
いて、該核酸はインビボで、特異的な受容体をターゲットにすることによって細
胞の特異的な取り込みおよび発現に関してターゲットにされる(例えば1992
年4月15日のPCT出願WO92/06180(Wu等);1992年12月2 3日のWO92/22635(Wilson等);1992年11月26日のWO92
/20316(Findeis等);1993年7月22日のWO93/14188(C
larke等),1993年10月14日のWO93/20221(Young)を参照) 。あるいは、該核酸は、細胞内に導入され、宿主細胞の発現のためのDNAと相
同組換えによって結合する(KollerおよびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 868932-8935; Zijlstra等, 1989, Nature 342435-438)。他の実施形
態において、RPIをコードする核酸を含むウイルスベクターが使用される(Mi
ller等, 1993, Meth. Enzymol. 217581-599)。これらのレトロウイルスは、ウ イルスゲノムのパッケージングや宿主細胞DNAへの統合に必要ないレトロウイ
ルス配列を削除することによって改変されてある。遺伝子治療で使用されるRP
Iをコード化した核酸はベクターにクローニングされ、これは患者への遺伝子運
搬を促進する。レトロウイルスベクターに関するより詳細なことは、Boesen等,
1994, Biotherapy 6291-302で見出され、これはmdr1遺伝子を造血幹細胞に 運搬して該幹細胞を化学療法に対して体制を持たせるために、レトロウイルスベ
クターを使用することが説明されている。遺伝子治療におけるレトロウイルスの
使用を説明した他の参考文献として、Clowes等, 1994, J. Clin. Invest. 93644
-651; Kiem等, 1994, Blood 831467-1473;Salmons and Gunzberg, 1993, Huma
n Gene Therapy 4129-141; and GrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. in
Genetics and Devel. 3110-114が挙げられる。アデノウイルスは、呼吸肺細胞 に遺伝子を運搬するための特に有効なベヒクル(vehicles)である。一般的に、
アデノウイルスは呼吸肺細胞に感染し、軽い病気を引き起こす。アデノウイルス
−ベースの運搬システムに関する他のターゲットは、肝臓、中枢神経系、内皮細
胞および筋肉である。アデノウイルスは非***細胞に感染することができる利点
を持つ。KozarskyおよびWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Deve
lopment 3499-503において、アデノウイルス−ベースの遺伝子治療の報告がなさ
れている。Bout等, 1994, Human Gene Therapy 53-10において、アカゲザルの呼
吸肺細胞へ遺伝子を輸送するためにアデノウイルスを使用することが示されてい
る。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例として、 Rosenfeld等,
1991, Science 252431-434; Rosenfeld等, 1992, Cell 68143-155; Mastrange
li等, 1993, J. Clin. Invest. 91225-234; PCT公報WO94/12649;およびWan
g等, 1995, Gene Therapy 2775-783等が見出されている。アデノ関連ウイルス(
AAV)はまた、遺伝子治療における使用が提案されている(Walsh等, 1993, P
roc. Soc. Exp. Biol. Med. 204289-300; U.S. Patent No. 5,436,146)。遺伝
子治療に関する他のアプローチは、例えばエレクトロポレーション(electropor
ation)、リポフェクション(lipofection)、リン酸カルシウム仲介トランスフ
ェクション(calcium phosphate mediated transfection)またはウイルス感染 の方法によって組織培養中に細胞に遺伝子をトランスファーさせることを含む。
通常、トランスファー方法は、選択可能なマーカーを細胞にトランスファーする
ことを含む。該細胞は次に選択され、トランスファーされた遺伝子を取り込み発
現している細胞を分離する。これらの細胞は次に患者に適用される。この実施形
態において、生じた組換え細胞をインビボで投与する前に、この核酸が細胞に導
入される。このような導入は、これらに限定されないが、例えばトランスフェク
ション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含む
ウイルスまたはバクテリオファージベクターの注入、マイクロセル仲介遺伝子ト
ランスファー(microcell-mediated gene transfer)、スフェロプラスト融合(
spheroplast fusion)等の当業界で周知の任意の方法によって行われる。外来遺
伝子を細胞に導入する膨大な技術が当業界で周知であり(例えばLoefflerおよび
Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217599-618; Cohenおよび, 1993, Meth. Enzymol
. 217618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 296992を参照)、本発明により 使用され、受容細胞の必要な開発的、物理的機能が失われない。該技術は、細胞
への核酸の安定したトランスファーを提供し、そのために該核酸は該細胞によっ
て発現可能であり、好ましくは遺伝的であり、その細胞の後代によって発現可能
である。生じた組換え細胞は、当業界で周知のさまざまな方法によって患者に輸
送される。好ましい実施形態において、上皮細胞が、例えば皮下注射によって注
入される。他の実施形態において、組換え皮膚細胞は患者への皮膚移植として適
用できる。組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞、前駆細胞)は、好ましくは静
脈注射によって投与される。使用を考えた細胞の量は、望ましい効果、患者の状
態等に依存しており、当業者によって決定される。遺伝子治療の目的で核酸が導
入された細胞は、任意の望ましい、使用可能な細胞型を含み、これらに限定され
ないが、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞;例え
ばTリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、
顆粒球等の血液細胞;さまざまな幹細胞または前駆細胞、特に造血肝または前駆
細胞、例えば骨髄、臍帯血(umbilical cord blood)、末梢血液、胎児肝等であ
る。好ましい実施形態において、遺伝子治療に用いられる細胞は、患者に対して
事故由来である。組換え細胞が遺伝子治療において使用される実施形態において
、RPIをコード化した核酸は細胞に導入され、該細胞またはそれらの前駆対に
よって発現され、組換え細胞は次に治療効果のためにインビボで投与される。特
殊な実施形態において、肝細胞または前駆細胞が使用される。分離されインビト
ロで維持されうる任意の肝細胞および/または前駆細胞は、本発明のこの実施形
態に従って潜在的に使用され得る(例えば、1994年4月28日のPCT公開
番号WO94/08598号; Stemple and Anderson, 1992, Cell 71973-985; Rheinw
ald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A229;ならびにPittelkowおよびScott, 1986, M
ayo Clinic Proc. 61771を参照)。特異的な実施形態において、遺伝子治療の目
的のために導入された核酸は、例えば核酸の発現が、適切な転写のインデューサ
ーの存在または非存在を制御することによって制御されるような、コード化した
領域に手術的に結合できる誘導性プロモーター(inducible promoter)を含む。 【0229】 RPIアンチセンス核酸 RPIアンチセンス核酸は、少なくとも6ヌクレオチドを有し、好ましくはオ
リゴヌクレオチド(6〜約50オリゴヌクレオチド)である。特定の形態におい
ては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌ
クレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、または少なくとも200ヌクレオ
チドである。オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNAまたはキメラ混合物ま
たは誘導体またはこれらの修飾形態であってもよく、1本鎖であってもまたは2
本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、塩基部分で、糖部分で、またはホ
スフェート主鎖(phosphate backbone)で修飾されてもよい。 【0230】 オリゴヌクレオチドとしては、ペプチド等の他の付随する基(appending group
)、または細胞膜での輸送を容易にする物質(例えば、Letsinger 等., 1989, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553-6556; Lemaitre 等., 1987, Proc. Natl.
Acad. Sci. 84, 648-652; 1988年12月15日に公開された、PCT公報
番号WO 88/09810号を参照)または血液脳関門(例えば、1988年
4月25日に公開された、PCT公報番号WO 89/10134号を参照)、
ハイブリダイゼーションを開始させる切断物質(hybridization-triggered cleav
age agent)(例えば、Krol 等., 1988, BioTechniques 6, 958-976を参照)また
はインターカレーション物質(intercalating agent)(例えば、 Zon, 1988, Pha
rm. Res. 5, 539-549を参照)が挙げられる。 【0231】 本発明の好ましい形態において、RPIアンチセンスオリゴヌクレオチドが、
好ましくは1本鎖のDNAで提供される。オリゴヌクレオチドは、当該分野にお
いて通常既知である置換基でその構造物のいずれかの位置で修飾されてもよい。
RPIアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下に制限されないが、5−フルオ
ロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロ
キシメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン
、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガ
ラクトシルクエオシン(betaD-galactosylqueosine)、イノシン、N6−イソペン
テニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチル
グアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5
−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメ
チルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノ
シルクエオシン(beta-D-mannosylqueosine)、5’−メトキシカルボキシメチル ウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデ
ニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(V)、ウイブトキソシン(wybutoxosine)、シ
ュードウラシル(pseudouracil)、クエオシン(queosine)、2−チオシトシン、5
−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチ
ルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ
酢酸(V)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−
カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、及び2,6−ジアミノプリン
を含む群より選ばれる少なくとも一の修飾塩基部分を有していてもよい。 【0232】 他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一の修飾される糖
部分、例えば、アラビノース、2−フルオロアラビノース、キシルロース、およ
びヘキソースからなる群より選ばれる糖部分からなる。さらなる他の実施形態に
おいては、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート(phosphorothioate)、ホ
スホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホルアミドチオエート(phospho
ramidothioate)、ホスホルアミデート(phosphoramidate)、ホスホルジアミデー ト(phosphordiamidate)、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、 及びこれらのホルムアセタールまたは類似体からなる群より選ばれる少なくとも
一の修飾されるホスフェート主鎖からなる。さらなる他の実施形態においては、
オリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマー
オリゴヌクレオチドは、一般的なβ−単位とは逆に、ストランドが相互に平行に
走る相補的RNAとの特定の2本鎖のハイブリッドを形成する(Gautier 等., 1
987, Nucl. Acids Res. 15, 6625-6641)。 【0233】 オリゴヌクレオチドは、他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショ
ンを開始させる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションを開始させる切断物質
などに共役してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野における既知
の標準的な方法によって、例えば、自動DNA合成器(バイオサーチ(Biosearch
)、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)などから市販されるもの など)の使用によって、合成されてもよい。例としては、ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドはステイン(Stein)らの方法(1988, Nucl. Acids Res. 16, 320
9)によって合成されてもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御さ
れた細孔ガラスポリマー支持体を用いることによって調製できる(Sarin 等., 19
88, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451)。 【0234】 特定の実施形態において、本発明のRPIアンチセンス核酸は、外来の配列か
らの転写によって細胞内で製造される。例えばベクターは、細胞内に吸収される
ようにインビボで導入されてもよく、この細胞内でベクターまたはこの一部が転
写され、本発明のアンチセンス核酸(RNA)が産生される。このようなベクタ
ーは、RPIアンチセンス核酸をコード化する配列を含む。このようなベクター
は、所望のアンチセンスRNAを産生するように転写できる限り、エピソームで
あり続けてもあるいは染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当
該分野における標準的な組換DNA技術方法によって構築できる。ベクターは、
哺乳動物細胞における複製や発現に使用される、プラスミド、ウィルス性、また
は当該分野において既知の他のものであってもよい。RPIアンチセンスRNA
をコード化する配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト、の細胞において作用
することが当該分野において既知であるプロモーターによってできる。このよう
なプロモーターは、誘導性であっても構成性であってもよい。このようなプロモ
ーターとしては、以下に制限されないが、SV40初期プロモーター領域(Berno
ist and Chambon, 1981, Nature 290, 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’の 長い末端繰り返し中に含まれるプロモーター(Yamamoto 等., 1980, Cell 22, 78
7-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner 等., 1981, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 78, 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brins
ter 等., 1982, Nature 296, 39-42)などが挙げられる。 【0235】 本発明のアンチセンスは核酸は、RPI遺伝子、好ましくはヒトのRPI遺伝
子のRNA転写産物の少なくとも一部に相補的な配列を有する。しかしながら、
好ましいものの、完全な相補性は必要ではない。本明細書中で引用される、RN
Aの少なくとも一部分に相補的な配列は、RNAとハイブリッド形成して安定な
デュプレックスを形成できるのに十分な相補性を有する配列を意味する;ゆえに
、2本鎖のRPIアンチセンス核酸の場合では、デュプレックスDNAの1本鎖
を試験してもよい、あるいはトリプレックスの形成を分析してもよい。ハイブリ
ッド形成能は、相補性の度合いやアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。
通常、ハイブリッド形成する核酸が長ければ長いほど、RPIをコード化するR
NAとの塩基のミスマッチ数が多くなるが安定なデュプレックス(または、場合
によってはトリプレックス)を形成する。当業者はハイブリッド形成した複合体
の融点を測定する標準的な方法の使用によってミスマッチの許容できる程度を確
認できる。 【0236】 RPIの治療への使用 アンチセンス核酸 RPIアンチセンス核酸は、有益なRPIをリウマチ様関節炎を患っている患
者の関節液中で過剰に発現させて、リウマチ様関節炎を治療(または予防)する
のに使用できる。好ましい実施形態においては、1本鎖のDNAのアンチセンス
RPIオリゴヌクレオチドを使用する。RPIをコード化するRNAを発現また
は過剰に発現する細胞のタイプは当該分野において既知の様々な方法によって同
定できる。このような細胞のタイプとしては、以下に制限されるものではないが
、白血球(例えば、好中球、マクロファージ、単球)及びレジデント細胞(例え
ば、滑膜細胞)が挙げられる。このような方法としては、以下に制限されるもの
ではないが、RPIに特異的な核酸とのハイブリッド形成(例えば、ノーザンハ
イブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、インサイチュ
(in situ)ハイブリダイゼーション)、ある細胞タイプ由来のRNAのインビト ロでのRPIへの翻訳能を考察する、イムノアッセイなどが挙げられる。好まし
い形態において、患者からの1次組織を、例えば、免疫細胞化学またはin situ ハイブリダイゼーションによって、治療前のRPIの発現について分析できる。 【0237】 製薬上許容できる担体中に有効量のRPIアンチセンス核酸を含む、本発明の
薬剤組成物は、リウマチ様関節炎を有する患者に投与できる。RAの治療に有効
であろうRPIアンチセンス核酸の量は、標準的な臨床テクニックによって決定
されうる。可能である場合には、インビトロで、さらにはヒトに試験及び使用さ
れる前に有用な動物モデルシステムにおいて、治療される腫瘍のタイプのアンチ
センス細胞毒性を測定することが望ましい。特定の実施形態において、RPIア
ンチセンス核酸を含む薬剤組成物は、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプ
セルを介して投与される。本発明の様々な実施形態において、このような組成物
を用いてRPIアンチセンス核酸の一様の放出を達成することは有用である。特
定の実施形態においては、特定の同定可能な腫瘍抗原に対する抗体を介してター
ゲットにされるリポソームを利用することが望ましい(Leonetti 等., 1990, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2448-2451; Renneisen 等., 1990, J. Biol. Ch
em. 265, 16337-16342)。 【0238】 阻害リボザイム及びトリプレックスアプローチ 他の実施形態においては、RAの症状は、RPI遺伝子配列を既知の遺伝子ノ
ックアウト、リボザイムおよび/またはトリプレックス方法を組合わせて使用し
て、RPI遺伝子の発現レベルを減少することによって、RPI遺伝子の発現レ
ベルおよび/またはRPI遺伝子産物の活性を減少することによって、改善され
てもよい。RAの症状を改善する能力を含む、RPI遺伝子の活性、発現または
合成を調節する能力を発揮する化合物の中には、リボザイム及びトリプレックス
分子がある。このような分子は、損なわれていない、または適切である場合には
、変異型ターゲット遺伝子活性のいずれかを減少するまたは阻害するように設計
されてもよい。このような分子の製造及び使用に関する技術は、当業者にはよく
知られている。RPI遺伝子mRNA転写産物を触媒により切断するように設計
されるリボザイム分子を用いて、ターゲット遺伝子mRNAの翻訳及び、ゆえに
RPI遺伝子産物の発現を防止できる。(例えば、1990年10月4日に公開
された、PCT国際公開 WO90/11364号;Sarver 等., 1990, Scienc
e 247, 1222-1225)。 【0239】 リボザイムは、RNAの特異的な切断を触媒できる酵素的RNA分子である。
(書評では、Rossi, 1994, Current Biology 4, 469-471を参照)。リボザイム 作用のメカニズムは、相補的ターゲットRNAへのリボザイム作用分子の配列特
異的なハイブリダイゼーション、さらにはエンドヌクレアーゼによる切断事象(e
ndonucleolytic cleavage event)を含む。リボザイム分子の組成物は、ターゲッ
ト遺伝子mRNAに対して相補的な一以上の配列を含むものでなければならず、
また、mRNA切断に応答性のある既知の触媒配列を含むものでなければならな
い。この配列に関しては、例えば、その全体を参考のために本明細書中に引用さ
れる、米国特許第5,093,246号を参照。部位特異的な認識配列でmRN
Aを切断するリボザイムをRPIをコード化するmRNAを破壊するのに使用で
きるものの、シュモクザメのリボザイム(hammerhead ribozyme)の使用が好まし い。シュモクザメのリボザイムは、ターゲットmRNAと相補的な塩基対を形成
するフランキング領域によって規定される位置でmRNAを切断する。ターゲッ
トmRNAが下記2塩基配列:5’−UG−3’を有することが唯一の必要条件
である。シュモクザメのリボザイムの構築及び製造は、当該分野において既知で
あり、その全体を参考のために本明細書中に引用される、Myers, 1995, Molecul
ar Biology and Biotechnology A Comprehensive Desk Reference, VCH Publish
ers, New York(特に833頁、図4を参照)およびHaseloff and Gerlach, 198
8, Nature, 334, 585-591により詳しき記載される。好ましくは、リボザイムは 、切断認識部位がRPIをコード化するmRNAの5’末端付近に位置する、即
ち、効率を上げかつ非機能性mRNA転写産物の細胞内蓄積を最小限にするよう
に操作される。本発明のリボザイムとしてはまた、テトラヒメナ サーモフィラ
(Tetrahymena thermophila)中に天然に生じ(IVS、またはL−19 IVS RNAとして既知である)、Thomas Cech及び協力者らによって広範に記載さ れたもの(Zaug, 等., 1984, Science, 224, 574-578; Zaug and Cech, 1986,
Science, 231, 470-475; Zaug, 等., 1986, Nature, 324, 429-433; ユニヴァ
ーシティー パテンツ インコーポレイテッド(University Patents Inc.)によ る公開国際特許出願番号WO 88/04300号 ; Been and Cech, 1986, C
ell, 47, 207-216)などのRNAエンドヌクレアーゼ(以降、Cechタイプリ
ボザイム)が挙げられる。 【0240】 Cechタイプリボザイムは、後にターゲットRNAの切断が行われるターゲ
ットRNA配列とハイブリッド形成する8塩基対活性部位を有する。本発明は、
RPIをコード化する遺伝子中に存在する8塩基対活性部位配列をターゲットと
するこれらのCechタイプリボザイムを包含する。アンチセンスアプローチに
おいて、リボザイムは、(例えば、改善された安定性、ターゲッティングなどを
目的として)修飾されたオリゴヌクレオチドから構成されることができ,インビ
ボでRPIを発現する細胞に輸送されなければならない。好ましい輸送方法は、
トランスフェクトされた細胞がRPIをコード化する内因性のmRNAを破壊し
、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するように、強力な構成性p
ol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下でのリボザイムをコード
化するDNA構築物を用いることを含む。リボザイムは、アンチセンス分子と異
なり、触媒性であるので、低細胞内濃度が効率のために必要である。内因性のR
PI発現はまた、ターゲットされた相同的組換を用いてRPI遺伝子またはその
プロモーターを不活性化またはノックアウトすることによって減少できる(例え
ば、Smithies, 等., 1985, Nature 317, 230-234; Thomas and Capecchi, 1987
, Cell 51, 503-512; Thompson 等., 1989, Cell 5, 313-321を参照;これらの
それぞれは、その全体を参考のために本明細書中に引用される)。例えば、内因
性RPI遺伝子(RPIをコード化する遺伝子のコーディング領域または調節領
域のいずれか)に相同するDNAに隣接する変異型の、非機能性RPI遺伝子(
または全く関連のないDNA配列)を、インビボでターゲット遺伝子を発現する
細胞をトランスフェクトするために、選択マーカーおよび/またはネガティブな
選択マーカーと一緒にまたはを用いずに、使用できる。ターゲットされた相同的
組換を介した、DNA構築物の挿入によって、ターゲット遺伝子が不活性化され
る。このようなアプローチは、ES(胚幹)細胞への修飾が不活性ターゲット遺
伝子を有する動物子孫を発生するのに使用できる農業分野に特に適する(例えば
、Thomas and Capecchi, 1987 and Thompson, 1989, 上記を参照)。 【0241】 しかしながら、このアプローチは、組換DNA構築物を適当なウィルスベクタ
ーを用いてインビボで必要な部位に直接投与するまたはターゲットされる場合に
はヒトへの使用に適用されうる。または、内因性のRPI遺伝子の発現は、RP
I遺伝子の調節領域(即ち、RPI遺伝子プロモーターおよび/またはエンハン
サー)に相補性のあるデオキシリボヌクレオチド配列をターゲットとして体内の
ターゲット細胞におけるRPI遺伝子の転写を防止するトリプレックス構造物を
形成することによって抑制されうる。(通常、Helene, 1991, Anticancer Drug
Des., 6(6), 569-584; Helene, 等., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660, 27-3
6; and Maher, 1992, Bioassays 14(12), 807-815を参照)。 【0242】 転写の阻害を目的とするトリプレックス形成に使用される核酸分子は、1本鎖
であり、デオキシヌクレオチドから構成されなければならない。これらのオリゴ
ヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対原則によるトリプレック
ス形成を促進するように設計されなければならず、これは、通常、プリンまたは
ピリミジンのいずれかの相当の大きさのストレッチがデュプレックスの1本鎖に
存在する必要がある。ヌクレオチド配列はピリミジンを基礎としてもよく、これ
により、得られるトリプレックスの3つの会合するストランドにTAT及びGC
C+のトリプレットが生じるであろう。ピリミジンリッチな分子は、1本鎖に平 行な方向にデュプレックスのその1本鎖のプリンリッチな領域に対する塩基の相
補性が提供される。加えて、プリンリッチである、例えば、G残基のストレッチ
を含む、核酸分子が選択されてもよい。これらの分子は、大多数のプリン残基が
、トリプレックスの3ストランドにGGCトリプレットを生じる、ターゲットに
されるデュプレックスの1本鎖上に位置する、GC対リッチなDNAデュプレッ
クスとトリプレックスを形成するであろう。 【0243】 または、3重螺旋の形成のためにターゲットされうる潜在的な配列をいわゆる
スイッチバック核酸分子を作製することによって増やしてもよい。スイッチバッ
ク分子は、デュプレックスの最初の一ストランドと次に他方と塩基対を形成して
、プリンまたはピリミジンのいずれかの相当の大きさがデュプレックスの1スト
ランドに存在する必要性を排除するように、交互の5’−3’、3’−5’様式
で合成される。本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイム、および/また
はトリプレックス分子を利用して変異型遺伝子発現を阻害する場合には、その技
術が、存在する正常なRPI遺伝子産物の濃度が正常な表現型に必要であるより
低い可能性が生じるくらい、非常に効果的に正常なRPI遺伝子アレルによって
産生されるmRNAの転写(トリプレックス)および/または翻訳(アンチセン
ス、リボザイム)を抑制または阻害することが可能である。したがって、このよ
うな場合には、RPI遺伝子活性の実質的に正常なレベルを確実に維持するため
に、正常なRPI遺伝子活性を発揮するRPI遺伝子ポリペプチドをコード化、
発現する核酸分子を、アンチセンス、リボザイム、またはトリプレックス治療が
利用されているどんなものにも感受性のある配列を含まない遺伝子療法を介して
細胞中に導入してもよい。または、RPI遺伝子が細胞外タンパク質をコード化
する場合には、ターゲット遺伝子活性の必要なレベルを維持するために正常なR
PI遺伝子タンパク質を同時に投与する(co-administer)ことが好ましい。 【0244】 本発明のアンチセンスRNA及びDNA、リボザイム、ならびにトリプレック
ス分子は、上記したように、DNA及びRNA分子の合成に関する当該分野にお
ける既知の方法によって調製されてもよい。これらとしては、例えば、固相ホス
ホルアミダイト(phosphoramidite)化学合成などの当該分野で既知のオリゴデオ キシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するに技術が
挙げられる。または、RNA分子を、アンチセンスRNA分子をコード化するD
NA配列のインビトロ及びインビボ転写によって得てもよい。このようなDNA
配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適当なRNAポリメ
ラーゼプロモーターが取り込まれた広範な様々なベクター中に導入されてもよい
。または、使用されるプロモーターによって、構成により(constitutively)また
は誘導により(inducibly)アンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA 構築物を細胞株に安定して導入してもよい。 【0245】 治療または予防のための利用のデモンストレーション 本発明の化合物は、ヒトに使用される前に、所望の治療または予防活性に関し
てインビトロ、次にインビボで試験されることが好ましい。例えば、特定の化合
物の投与が必要であるかどうかを決定するのに使用できるインビトロ分析として
は、患者の組織サンプルを培養液中で成育させ、化合物に晒すあるいは化合物を
投与して、このような化合物の組織サンプルへの効果を観察するインビトロの培
養分析が挙げられる。テスト化合物は、RAを患っている患者のRADFまたは
RPIレベルがRAを患っていない被検者中で見出されるレベルにまで戻るまた
はRAの実験動物モデル(例えば、ラットのアジュバント関節炎)における同様
の変化を作製することができるかについて試験されうる。上記レベルを回復でき
る化合物を、さらなる薬剤発見を目的としたリード化合物(lead compound)とし て使用できる、または治療に使用できる。 【0246】 RADF及びRPIの発現は、好ましい技術、イムノアッセイ、ゲル電気泳動
後可視化、または他の当業者に既知の方法によって分析できる。このような分析
は、RADFまたはRPIの発現量が臨床的病気の代用マーカーとして機能でき
る際には、候補薬剤をスクリーニングするためにまたは臨床的なモニタリング若
しくは薬剤の開発に使用できる。様々な特定の実施形態において、インビトロ分
析は、患者の疾患にかかわる細胞型の代表的な細胞を用いて行なわれ、化合物が
このような細胞型に目的とする効果を有するかどうかを決定できる。治療に使用
される化合物は、以下に限られないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル
、ウサギなどの適当な動物モデルシステムでヒトでの試験の前に試験されうる。
インビボ試験に関しては、ヒトへの投与前に、当該分野において既知のいずれか
の動物モデルシステムを使用してもよい。 【0247】 治療/予防のための投与及び組成物 本発明は、有効量の本発明の化合物び被検者への投与による治療(及び予防)
方法を提供するものである。好ましい形態においては、化合物は実質的に純粋で
ある(例えば、その効果を制限するあるいは望ましくない副作用を産する物質を
実質的に含まない)。被検者は、好ましくは、以下に限られないが、ウシ、ブタ
、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物を含む、動物であり、好ましくは哺乳動
物であり、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態においては、非ヒト哺乳
動物が被検者である。 【0248】 化合物が核酸からなる際に使用できる配合物及び投与方法は上記と同様である
;さらなる適当な配合物及び投与経路は、下記したものから選択できる。様々な
輸送システムが知られており、本発明の化合物を投与するのに使用でき、例えば
、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現できる組換細
胞、レセプターが介するエンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, 1987, J. Bi
ol. Chem. 262,4429-4432を参照)、レトロウィルスまたは他のベクターの一部
としての核酸の構築などがある。導入方法としては、以下に限られないが、皮内
、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられる
。化合物は、いずれかの簡便な経路によって、例えば、輸液または大量注射によ
って、上皮または粘膜皮膚内層(例えば、経口、粘膜、直腸及び腸粘膜など)に
よる吸収によって投与されてもよく、また、他の生物学的に活性のある薬剤と一
緒に投与されてもよい。投与は全身または局所であってもよい。 【0249】 加えて、脳室内及び髄腔内などの、適当な経路によって中枢神経系中に本発明
の薬剤組成物を導入することが望ましい;脳室内注射は例えば、オマヤレザバー
等の、レザバーに取り付けられる、脳室内カテーテルによって容易になる。肺へ
の投与もまた、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアゾール投与剤(aer
osolizing agent)との配合によって、使用されうる。特定の実施形態においては
、治療を必要とする領域に局所的に本発明の薬剤組成物を投与することが望まし
い;これは、例えば、以下に限定されるわけではないが、外科手術中の局所的な
輸液、例えば、外科手術後に創傷被覆剤と組み合わせた、局所的な塗布、注射に
よって、カテーテルによって、坐剤によって、またはインプラントによって、達
成されてもよいが、上記インプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン製
材料からなり、シアラスティック膜(sialastic membrane)等の膜、または繊維な
どが挙げられる。一実施形態においては、投与は、悪性腫瘍または新生物性の若
しくは新生物発生前の組織のある部位(または前の部位)に直接注射することに
よってもよい。他の実施形態においては、化合物が、ベシクル、特にリポソーム
中に輸送されてもよい(Langer, Science 249, 1527-1533 (1990); Treat 等.,
in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Ber
estein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Ber
estein, ibid., pp. 317-327を参照;同書を参照)。さらなる実施形態において
は、化合物が、制御された放出システム中に輸送されてもよい。一実施形態にお
いては、ポンプを使用してもよい(Langer、上記;Sefton, CRC Crit. Ref. Bio
med. Eng. 14, 201 (1987); Buchwald 等., Surgery 88, 507 (1980); Saudek
等., N. Engl. J. Med. 321, 574 (1989)を参照)。他の実施形態においては、
高分子材料を使用してもよい(Medical Applications of Controlled Release,
Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controll
ed Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and
Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. S
ci. Rev. Macromol. Chem. 23, 61 (1983)を参照;また、Levy 等., Science 22
8, 190 (1985); During 等., Ann. Neurol. 25, 351 (1989); Howard 等., J.
Neurosurg. 71, 105 (1989)を参照)。さらなる他の実施形態においては、制御
された放出システムを、全身性の投薬量のフラクションのみを必要とする、治療
のターゲット、即ち、脳の付近に置かれてもよい(例えば、Goodson, in Medica
l Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) を参照)。他の制御された放出システムは、Langer (Science 249, 1527-1533 (
1990))の書評で討論される。 【0250】 本発明の化合物がタンパク質をコード化する核酸である特殊な実施形態におい
ては、核酸が、例えば、レトロウィルスベクター(米国特許第4,980,28
6号を参照)の使用によって、核酸を適当な核酸の発現ベクターの一部として構
築し細胞内になるように投与することによって、または直接注射によって、また
は微粒子の衝撃(例えば、遺伝子ガン;Biolistic, Dupont)の使用によって、 または脂質若しくは細胞表面レセプター若しくはトランスフェクション剤(trans
fecting agent)による被覆によって、または核に入ることが知られているホメオ
ボックス様ペプチド(例えば、Joliot 等., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88, 1864-1868を参照)に結合する核酸を投与することなどによって、インビボ
で投与されてコード化されたタンパク質の発現を促進してもよい。または、核酸
を、細胞内に導入して、相同的組換によって、発現用の宿主細胞DNA内に取り
込んでもよい。 【0251】 本発明はまた、薬剤組成物を提供するものである。このような組成物は治療上
有効な量の化合物及び製薬上許容できる担体からなる。特殊な実施形態において
は、「製薬上許容できる」ということばは、連邦管理局(regulatory agency of
the Federal)、若しくは州政府によって認可されていること、または米国薬局方
もしくは動物、特にヒトへの使用に関して一般的に認知されている他の薬局方に
リストとして挙げられていることを意味する。「担体」ということばは、治療剤
が一緒に投与される希釈液、アジュバント、賦形剤、またはベヒクルを意味する
。このような製薬上の担体は、水ならびに、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ
油等の、石油、動物、植物若しくは合成由来のものなどの、油等の滅菌液体であ
りうる。水は、薬剤組成物を静脈内で投与される場合には好ましい担体である。
食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液もまた、特に注射可能な
溶液用に、液状担体として使用できる。適当な製薬上の賦形剤としては、デンプ
ン、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、
チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレー
ト、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、
グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。 【0252】 本組成物は、必要であれば、少量の湿潤若しくは乳化剤、またはpH緩衝剤を
含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセ
ル、粉末、徐放性配合物などの形態がとられる。組成物は、伝統的な結合剤及び
トリグリセリド等の担体を用いて、坐剤として配合されてもよい。経口用の配合
物は、薬剤グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグ
ネシウム、サッカリンナトリウム(sodium saccharine)、セルロース、炭酸マグ ネシウムなどの標準的な担体を含みうる。適当な製薬上の担体の例は、E.W. Mar
tinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載される。このような組成
物は、患者に適当に投与するための形態を提供できるように適当な量の担体と共
に、好ましくは純粋な形態の、治療上有効な量の本化合物を含むであろう。 【0253】 配合物は、投与の形態に適するものでなければならない。好ましい実施形態に
おいては、本組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適用される薬剤組成物とし
て定常的な方法に従って配合される。具体的には、静脈内投与用の組成物は、滅
菌等張水性緩衝液における溶液である。必要であれば、組成物はまた、可溶化剤
及び注射部位での痛みを和らげるためのリドカイン等の局所麻酔剤を含んでもよ
い。通常、成分は、例えば、一定量の活性物質を表示するアンプル若しくは小袋
(sachette)等の密閉容器における乾燥凍結乾燥粉末若しくは水分のない濃縮液と
して、単位服用量形態(unit dosage form)で別々にまたは一緒に混合してのいず
れかで供給される。組成物を輸液によって投与しようとする際には、組成物を滅
菌した薬剤グレードの水または食塩水を含む輸液用ボトルで調剤されうる。本組
成物を注射によって投与する際には、注射用の滅菌水または食塩水のアンプルを
、投与前に成分を混合するように提供できる。 【0254】 本発明の組成物は、中性または塩形態として配合されてもよい。製薬上許容で
きる塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の塩などの遊離
アミノ基を用いて形成される塩、ならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム
、カルシウム、水酸化第2鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エ
チルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の塩などの遊離カルボキ
シル基を用いて形成される塩が挙げられる。 【0255】 RAの治療に有効であろう本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術によって
決定できる。加えて、インビトロ分析を必要であれば最適な投与範囲を同定する
のを補助するのに使用してもよい。配合物に用いられる正確な投与量はまた、投
与経路、及び病気または疾患の重篤度によって異なり、開業医や各患者の環境の
判断に従って決定されなければならない。しかしながら、静脈内投与に関する適
当な投与量の範囲は、通常、約20〜500mgの活性化合物/kg体重である
。鼻腔内投与に関する適当な投与量の範囲は、通常、約0.01pg/kg体重
〜1mg/kg体重である。有効な投与量は、インビトロまたは動物モデル試験
システムから派生される線量効果曲線から外挿されてもよい。坐剤は、通常、0
.5質量%〜10質量%の範囲の活性成分を含む;経口用配合物は、好ましくは
、10%〜95%の活性成分を含む。 【0256】 本発明はまた、本発明の薬剤組成物の一以上の成分を充填する一以上の容器か
らなる薬剤パックまたはキットを提供するものである。必要であれば、製剤また
は生物学的製品の製造、使用または販売を調節する政府の機関(governmental ag
ency)によって規定される形態の通知をこのような容器につけてもよく、この通 知はヒトへの投与のための製造、使用及び販売の政府機関(agency of manufactu
re, use or sale)による認可を反映するものである。 【0257】 実施例 RAによる患者の血清及び関節液由来のタンパク質 下記の参考プロトコルを用いて、リウマチ様関節炎(RA)の患者からのまた
はRAでない患者(即ち、痛風、変形性関節症、または外傷性の滑膜炎の患者)
からの血清及び関節液中のタンパク質を、等電点電気泳動さらにはSDS−PA
GEによって分離し、比較した。各サンプルは2連で流した。 【0258】 サンプル調製 タンパク質の分析を、受け取ったままのサンプルで行なった(Pierce BCA Cat
# 23225)。300μgの全タンパク質に相当する容積の血清を分取し、等容の1
0%(w/v)SDS(Fluka 71729)、2.3%(w/v)のジチオトレイトー ル(BDH 443852A)を添加した。このサンプルを95℃で5分間加熱した後、20 ℃に冷却した。次に、125μlの以下の緩衝液をサンプルに加えた:8M 尿
素(BDH 452043w)、4% CHAPS(Sigma C3023)、65mM ジチオトレイト
ール(DTT)、2%(v/v) リゾライト(Resolytes) 3.5−10(BDH
44338 2x)。この混合物をボルテックスして、15℃で13000rpmで5分 間、遠心し、上清を等電点電気泳動によって分析した。 【0259】 等電点電気泳動 等電点電気泳動(IEF)を、製造社の指示に記載される方法に従って、イム
ノビリン(登録)ドライストリップキット(Immobiline DryStrip Kit)(Pharmaci
a BioTech)を用いて行なった、Instructions for Immobiline DryStrip Kit, Ph
armacia, # 18-1038-63, Edition AB(その全体を参考のために本明細書中に引 用される)を参照。固定化pHグラジエント(IPG)ストリップ(18cm、
pH 3〜10 非線形ストリップ;Pharmacia Cat. # 17-1235-01)を、イン モビリンドライストリップユーザーズマニュアル(Immobiline DryStrip Users M
anual)に記載されるようにして、8M 尿素、2%(w/v) CHAPS、1
0mM DTT、2%(v/v) リゾライト(Resolytes) 3.5−10(BDH
44338 2x)の溶液中に20℃で一晩、再度水和させた。IEFに関しては、50 μlの上清(上記と同様にして調製)をストリップにのせて、カップ−ローディ
ング単位(cup-loading unit)をストリップの塩基性末端に置いた。次に、のせら
れたゲルを鉱油(Pharmacia 17-3335-01)で被覆して、電圧を、ファルマシアEP
S3500XLパワーサプライ(Pharmacia EPS3500XL power supply)(Cat 19-35
00-01)を用いて、即座に下記プロフィールに従ってストリップにかけた: 初期電圧=300Vで2時間、 300V〜3500Vの直線ランプを3時間、 3500Vで19時間維持。 【0260】 このプロセスのすべての段階で、電流制限は12ゲルで10mAに設定し、ワ
ット数の制限は5Wにセットした。温度は泳動中20℃に維持した。 【0261】 6.3 ゲル平衡及びSDS−PAGE ゲル平衡及びSDS−PAGE 1.1 最終の19時間の段階の後、ストリップを即座に取り出し、下記組成の第一の
溶液中に20℃で10分間浸漬した:6M 尿素;2%(w/v) DTT;2
%(w/v) SDS;30%(v/v) グリセロール(Fluka 49767);0. 05M トリス/HCl、pH6.8(Sigma Cat T-1503)。これらのストリップ
を第一の溶液から取り出し、下記組成の第二の溶液中に20℃で10分間浸漬し
た:6M 尿素;2%(w/v) ヨードアセトアミド(Sigma I-6125);2%(
w/v) SDS;30%(v/v) グリセロール(Fluka 49767);0.05 M トリス/HCl、pH6.8。第二の溶液から取り出した後、ストリップを
、以下に詳述するように修飾した、Hochstrasser 等., 1988, Analytical Bioch
emistry 173:412-423(その全体を参考のために本明細書中に引用される)に従 ってSDS−PAGE用の支持ゲルにのせた。 【0262】 6.4 支持ゲルの調製 支持ゲルの調製 ゲルを、下記寸法の2枚のガラス板間に注いだ:23cm幅×24cm長(後
ろの板);中央の19cmに2cm深さのノッチを有する23cm幅×24cm
長(前の板)。SDS−PAGEゲルの共有結合を促進するために、後ろの板を
エタノールにおける0.4% γ−メタクリル−オキシプロピルトリメトキシシ
ラン溶液(バインドシラン(商標)(BindSilaneTM); Pharmacia Cat. # 17-1330
-01)で処理した。前の板を、ゲルの付着を抑制するために、レペルシラン(商標
)(RepelSilaneTM)(Pharmacia Cat. # 17-1332-01)で処理した。過剰の試薬を水
で洗浄することによって除去し、板を乾燥させた。この段階で、ゲルに関する同
定として、および板の被覆面を同定するマーカーとして、粘着性のバーコードを
ゲルマトリックスと接触しないような位置に後ろの板につけた。 【0263】 乾燥させた板を13ゲルサンドイッチの収容能力のあるキャスティングボック
ス中に集めた。各サンドイッチの上部と下部の板を1mm厚で2.5cm幅のス
ペーサーによって間隔をあけた。ゲル重合後にサンドイッチを分離しやすくする
ために、これらのサンドイッチにアセテートシートを挟み込んだ。次に、Hochst
rasser 等.、前掲に従って、キャスティングを行なった。 【0264】 9〜16%の直線のポリアクリルアミド勾配を、アンゲリクグラジエントキャ
スティングシステム(Angelique gradient casting system)(Large Scale Biolog
y)を用いて、前の板のノッチのレベルから2cm下の点まで伸ばすように、キャ
ストした。ストック溶液は下記のとおりであった。アクリルアミド(水において
40%)は、セルヴァ(Serva)(Cat. # 10677)からであった。架橋剤は、全出発 モノマー含量の2.6%(w/w)の濃度の、PDA(BioRad 161-0202)であっ た。ゲルバッファーは、0.375M トリス/HCl、pH8.8であった。
重合触媒は0.05%(v/v) TEMED(BioRad 161-0801)であり、開始 剤は0.1%(w/v) APS(BioRad 161-0700)であった。SDSはゲル中 には含ませず、積重ねゲルは使用しなかった。キャストゲルを20℃で一晩、重
合させた後、6mlのゲルバッファーの入った密閉ポリエチレンバッグ中に4℃
で貯蔵し、4週間以内に使用した。 【0265】 6.5 SDS−PAGE SDS−PAGE 1.1 0.5%(w/v) アガロース(Fluka Cat 05075)の溶液を泳動用バッファ ー(0.025M トリス、0.198M グリシン(Fluka 50050)、1%(w /v) SDS、微量のブロモフェノールブルーを補足)中で調製した。このア
ガロース懸濁液を、アガロースが溶解するまで、攪拌しながら70℃に加熱した
。支持された第二のDゲルの上部をアガロース溶液で満たし、平衡化したストリ
ップをアガロース中に置き、ゲルが第二のDゲルとよく接触するまでパレットナ
イフでゆるやかに軽くたたいた。ゲルを、Amess 等., 1995, Electrophoresis 1
6:1255-1267(その全体を参考のために本明細書中に引用される)によって記載 されるのと同様にして、第二のD泳動タンクに置いた。タンクを、活性ゲル領域
を効率的に冷却できるように、バッファーのレベルがポリアクリルアミドを含む
第二のDゲルの領域の上部よりちょうど高くなるまで、泳動用バッファー(上記
と同様)で満たした。泳動用バッファーをゲルによって形成される上部のバッフ
ァーコンパートメントに加えた後、コンソートE−833パワーサプライ(Conso
rt E-833 power supply)を用いて電圧をゲルに即座にかけた。1時間、ゲルを2
0mA/ゲルで泳動した。ワット数の制限は、6ゲルを含むタンクで150Wに
設定し、電圧の制限は600Vに設定した。次に、1時間後、ゲルを、ブロモフ
ェノールブルーのラインがゲルの低部から0.5cmになるまで、前記と同様の
電圧及びワット数の制限にして、40mA/ゲルで泳動した。温度は、泳動中1
0℃に維持された。 【0266】 6.6 染色 染色 電気泳動の泳動(run)が完了したら、ゲルを即座に固定用のタンクから取り出 した。ゲルカセットの上板を注意深く取り除き、ゲルを底板にくっつかせたまま
にした。次に、このゲルのついた底板を、12ゲルを収容できる、染色装置中に
置いた。ゲルを、40%(v/v) エタノール(BDH 28719)、10%(v/v ) 酢酸(BDH 100016X)、50%(v/v) 水(MilliQ-Millipore)の固定用溶 液中に完全に浸漬し、この溶液をゲル上で連続して循環させた。一晩インキュベ
ーション後、固定用溶液をタンクから抜き、ゲルを、7.5%(v/v) 酢酸
、0.05%(w/v) SDS、92.5%(v/v) 水中に30分間、浸
漬することによって下塗した(prime)。さらに、下塗用溶液を抜き、ゲルを染色 用溶液に4時間完全に浸漬することによって染色した。蛍光染料の溶液は、製造
社の指示に従って希釈用シプロレッド(Sypro Red)(Molecular Probes, Inc., Eu
gene, Oregon)によって調製した;この希釈溶液を0.4μmフィルターで真空 下で濾過した。 【0267】 6.7 ゲルのイメージング 電気泳動の泳動(run)が完了したら、ゲルを即座に固定用のタンクから取り出 した。ゲルカセットの上板を注意深く取り除き、ゲルを底板にくっつかせたまま
にした。次に、このゲルのついた底板を、12ゲルを収容できる、染色装置中に
置いた。ゲルを、40%(v/v) エタノール(BDH 28719)、10%(v/v ) 酢酸(BDH 100016X)、50%(v/v) 水(MilliQ-Millipore)の固定用溶 液中に完全に浸漬し、この溶液をゲル上で連続して循環させた。一晩インキュベ
ーション後、固定用溶液をタンクから抜き、ゲルを、7.5%(v/v) 酢酸
、0.05%(w/v) SDS、92.5%(v/v) 水中に30分間、浸
漬することによって下塗した(prime)。さらに、下塗用溶液を抜き、ゲルを染色 用溶液に4時間完全に浸漬することによって染色した。蛍光染料の溶液は、製造
社の指示に従って希釈用シプロレッド(Sypro Red)(Molecular Probes, Inc., Eu
gene, Oregon)によって調製した;この希釈溶液を0.4μmフィルターで真空 下で濾過した。 【0268】 ゲルのイメージング 1.1 コンピューターで解読可能な出力を、以下のような修飾を加えて、製造社の指
示に従って、ストームスキャナー(Storm scanner)(Molecular Dynamics, Sunnyv
ale, California)で蛍光で染色されたゲルを撮影する(imaging)ことによって作 った(その全体を参考のために本明細書中に引用される、Storm User's Guide,
1995, Version 4.0, Part No. 149-355を参照)。ゲルを染色液から取り出して 、水で簡単に洗浄し、1000VのPMTセッティングで、及び200μmの解
像度で、レッドフルオレセンスモード(Red Fluorescence mode)で、ストームス キャナー(Storm scanner)で撮影した。ゲルはガラス板に強固に結合したので、 ゲルを撮影中にスキャナーベッドに接触させ続けた。ゲルとスキャナーベッドと
の間の不均一な接触から生じる干渉パターンを防止するために、水のフィルムを
ゲルの下に導入して、エアーポケットができないように注意した。さらに、ゲル
を、ゲル中で検出される他の特徴のX、Y座標を決定するための参照ポイント(
M1及びM2と称する)を提供するためにゲルと一緒に撮影される2個の蛍光ボ
タンを備えたフレーム中に置いた。マッチしたフレームを、ゲルの正確な配列を
保存するためにロボットゲル切出し器に置いた。撮影後、ゲルを少量の染色用溶
液を含むポリエチレンバッグ中に密閉した後、4℃で貯蔵した。 【0269】 6.8 データのデジタル解析 データを、下記により詳細に記載されるように、米国特許出願番号08/98
0,574号、セクション5.4及び5.5(その全体を参考のために本明細書
中に引用される)に記載されるのと同様にして処理した。 【0270】 6.8.1 ディテクター出力のコンピューター解析 データのデジタル解析 データを、下記により詳細に記載されるように、米国特許出願番号08/98
0,574号、セクション5.4及び5.5(その全体を参考のために本明細書
中に引用される)に記載されるのと同様にして処理した。 【0271】 ディテクター出力のコンピューター解析 スキャナーからの出力をまず、メラニー(登録)II 2D PAGE分析プ
ログラム(MELANIE II 2D PAGE analysis program)(Release 2.2, 1997, BioRad
Laboratories, Hercules, California, Cat. # 170-7566)を用いて処理すること
によって、登録ポイントM1及びM2を自動的に検出し;イメージを自動的に縁
を切り落とし(即ち、ゲルの境界、例えば、参照フレームの外側にあるスキャン
されたイメージの領域由来のシグナルを除去する);ダストによるアーチファク
トをフィルターで取り除き(filter out);特徴を検出、定量し;さらにGIFフ
ォーマットでイメージファイルを作製した。特徴を以下のパラメーターで検出し
た。 【0272】 なめらかさ(Smooths)=2、 ラプラシアン閾値(Laplacian threshold) 50、 部分閾値(Partials threshold) 1、 飽和度=100、 とがり(Peakedness)=0、 最小周界(Minimum Perimeter)=10。 【0273】 6.9 pI及びMW値の割り当て(Assignment) pI及びMW値の割り当て イメージを、グロス異常を有する、またはローディング若しくは全体のイメー
ジ強度(image intensity)が低すぎる、または解像度が低すぎる、または2連が 類似していない場合のイメージを却下するために評価した。2連のうちの一方の
イメージが却下された場合、2連に属する他方のイメージもまたイメージの質に
かかわらず却下された。却下されたサンプルを繰り返し分析のために予定表に組
み込まれた(scheduled)。 【0274】 ランドマーク同定を用いて、イメージ中に検出された特徴のpI及びMW値を
測定した。このプロセスは、所定の生物学的なサンプル中に発見されることが期
待される特定のタンパク質の同定に係るものである。これらの共通のタンパク質
はサンプル毎に等しい等電点及び分子量を発揮するため、これらを標準として使
用できる;このプロセスはまた、可能性のあるゲルの変動またはゆがみを修正す
る。 【0275】 正常な血清ゲルのデータセットから、ゲルを第一のマスターゲル(Primary Mas
ter Gel)として任意に選んだ。次に、ランドマーク特徴を、この第一のマスター
ゲル中に検出される特徴を正常なヒトの血清の2次元電気泳動ですでに同定され
た特徴と比較することによって同定した。(Bjellqvist 等., 1993, Electropho
resis 14:1357-1365を参照;その全体を参考のために本明細書中に引用される)
。 【0276】 PL1〜PL12及びPL15〜pL16と称する、14個のランドマーク特
徴が第一のマスターゲルで同定された。これらのランドマーク特徴を図1に示し
、表XIIに示されるpIおよび/またはMW値を割り当てた。 【0277】 【表22】 【0278】 可能な限り多くのこれらのランドマークを、データセットの各ゲルイメージで
同定した。 【0279】 次に、マスターゲルのすべての特徴は、すでにpI値を割り当てられた2種の
最も近いランドマークに対する(メラニー II ソフトウェア(MELANIE II so
ftware)を用いた)直線的な内挿/外挿によってpI値を割り当てられ、すでに MW値を割り当てられた2種の最も近いランドマークのMWに対する(メラニー
II ソフトウェア(MELANIE II software)を用いた)直線的な内挿/外挿に よってMW値を割り当てられた。これらの特徴はまた、モレキュラークラスター
インデックス(またはMCI)として既知の独特の数で標識された。 【0280】 第二のマスターゲル(Secondary Master gel)を、RAの血清及びRAの関節液
双方のゲルについて選んだ。これらのゲルの特徴を、メラニー II 2D P
AGE(MELANIE II 2D PAGE)(Release 2.2)ユーザーマニュアル(The Melanie Gr
oup, Geneva, Switzerland)のセクションA、頁8〜10に記載されるのと同様 にして、メラニー II ソフトウェアと共に供給されるアルゴリズムを用いて
、マスターゲルの共通する特徴と対にした。すでに対になった特徴を相当するM
CIに、ゆえに関連するpI及びMW値に結び付ける。これらの第二のマスター
ゲルに存在する対をなさなかった特徴は、ランドマークのpI及びMWに関して
(メラニー II ソフトウェア(MELANIE II software)を用いた直線的な内挿 /外挿によってpI及びMW値を割り当てられた。次に、さらなる独特な項目を
、これらの特徴に関するMCIで作製した。 【0281】 6.9.1 プロフィールの構築 プロフィールの構築 データセットのすべてのゲルをここで第一の及び第二のマスターゲルに,マッ
チさせ、対の特徴をモレキュラークラスターインデックスの相当する項目に結び
つけた。 【0282】 次に、2連のゲルをランドマークにより並べ、マッチングプロセスを2連のゲ
ルにおける同じスポットの対になるように行なった。これにより、対のスポット
が分離の再現性を示し、また、アーチファクトをフィルターで取り除く(filter
out)ので、次に測定される等電点及び分子量が正確であるという保証が増大した
。 【0283】 各タンパク質スポットの強度の測定結果を採取し、保存した。各タンパク質ス
ポットは、同定コードが割り当てられ、マスターゲルでのスポットにマッチさせ
た。 【0284】 分析のこの概念の結果、各同定されたスポットについて:1)独特な任意の同
定コード、2)X、Y座標、3)等電点、4)分子量、5)シグナル値、6)各
前記測定結果に関する標準偏差、及び7)このスポットがマッチするマスターゲ
ルでのスポットのMCIに対するポインターを含むデジタルプロフィールが、単
一の血清または関節液サンプルに代表されるゲルの各2連セットに関して、得ら
れた。ラボラトリーインフォーメーションマネージメントシステム(Laboratory
Information Management System)(LIMS)によって、このプロフィールは、
ゲルプロフィールのデータベースのコンピューター分析によって同定されるタン
パク質が検索できるように、そこから生じた実際の保存されたゲルにまでトレー
ス可能であった。このLIMSによって、プロフィールをオリジナルのサンプル
または患者にまでトレースすることもできた。 【0285】 6.9.2 サンプル間の交差試験 1.1.1 プロフィールが得られたら、分析を、興味のあるタンパク質の選択に向けた。
プロフィールにおけるそれぞれの有意な特徴にインデックス、すべてのゲルにお
ける特徴を同定し、特徴の上記(1)〜(7)のパラメーターに対するポインタ
ーとして機能する「モレキュラークラスターインデックス」(MCI)を割り当
てた。分子クラスターテーブルを各サンプルタイプ(例えば、RA血清及びRA
関節液)に関するマスターゲルから得た。同じタイプのすべての他のサンプルか
らのゲルを関連する第一及び第二のマスターゲルとマッチさせた。次に、各サン
プルに関するデジタルプロフィールに、各マッチした特徴について、マスタープ
ロフィールの上記特徴に割り当てられたMCIを加えることによって、注釈をつ
けた。 【0286】 6.9.3 プロフィールの示差分析 各サンプルセット(関節液または血清)内で、プロフィールを分析して、少な
くとも50%のプロフィールで存在するこれらの特徴を同定、選択した。次に、
これらの選択された特徴を、関節液の特徴のセット及び血清の特徴のセットで集
めた。さらに、各特徴セットのマッチング特徴を比較して、関節液及び血清間で
平均強度で少なくとも2倍の差を示すこれらの特徴を同定した。続いて、同様の
特徴をRAを持たない被検者からの関節液及び血清サンプルで試験した。RAの
関節液サンプルと比べてRA血清では差別的に存在するが非RAの関節液サンプ
ルと比べると非RA血清とは異ならずに存在する特徴を、リウマチ様関節炎−診
断特徴(Rheumatoid Arthritis-Diagnostic Feature)(RADF)として同定し た。 【0287】 6.10 選択されたタンパク質の回収及び分析 選択されたタンパク質の回収及び分析 RADFのタンパク質をロボットで切出して、処理することによって、トリプ
シンペプチドを得た;これらのペプチドの部分的なアミノ酸配列を、de novoシ ークエンシング(de novo sequencing)を用いて、質量分析によって決定した。 【0288】 6.11 結果 結果 1.1 これらの初期実験によって、RAの患者からの血清に対して関節液中で増大す
る12種の特徴及び減少する10種の特徴が同定された。各RADFは、RAの
被検者からの血清に対して関節液においてのみ差別的に存在するが、RAを持た
ない被検者からの血清に対して関節液では異ならずに存在した。 【0289】 部分的なアミノ酸配列をこれらのRADFで差別的に存在するRPIについて
決定した。公的なデータベースのコンピューター分析によって、これらの部分的
に配列が決定されたタンパク質のうち21種が当該分野において既知であり、5
種は試験された公的なデータベースには記載されていなかったことが分かった。
表VIIIから、数種のRPIは同じタンパク質のイソ型であることが示される
。例えば、RPI−1及びRPI−11はトランスフェリンのイソ型である。こ
れらのイソ型は、翻訳後プロセッシング(例えば、グリコシレーション、リン酸
化、アシル化または最小タンパク質分解(minimal proteolysis))における相違 から生じると考えられる。 【0290】 7. 実施例: RAを有する及び有さない患者の血清由来のタンパク質 リウマチ様関節炎(RA)を有する患者からの及びRAを有さない患者からの
血清におけるタンパク質を等電点電気泳動さらにはSDS−PAGEによって分
離し、比較した。 【0291】 分析は、実施例7の比較をRA患者からの血清及び非RA患者からの血清の間
で行なった以外は、実施例6に記載されるのと同様にして行なった。 【0292】 7.1 結果 これらの初期実験によって、非RAの患者からの血清と比較してRAの患者か
らの血清で増大する12種の特徴及び減少する9種の特徴が同定された。これら
のRADFの詳細は表III及びIVに記載される。各RADFは、非RAの血
清に対してRAの血清中で差別的に存在した。 【0293】 部分的なアミノ酸配列をこれらのRADFで差別的に存在するRPIについて
決定した。公的なデータベースのコンピューター分析によって、これらの部分的
に配列が決定されたタンパク質のうち17種が当該分野において既知であり、4
種は試験された公的なデータベースには記載されていなかったことが分かった。
表XIから、数種のRPIは同じタンパク質のイソ型であることが示される。例
えば、RPI−44及びRPI−45はトランスフェリンのイソ型である。これ
らのイソ型は、翻訳後プロセッシング(例えば、グリコシレーション、リン酸化
、アシル化または最小タンパク質分解(minimal proteolysis))における相違か ら生じると考えられる。 【0294】 さらに、表VIII〜XIから、RPI−2、RPI−6、RPI−7、RP
I−14、RPI−23、RPI−25、RPI−31、及びRPI−37は免
疫グロブリンイソ型の代表であることが示される。特にRPI−2は、IgG軽
鎖のイソ型の代表である。換言すると、好ましい技術を用いて、RAと特に関連
し、この病気と関連するオリゴクローナルな体液性免疫反応(oligoclonal humor
al immune response)に反映すると考えられる免疫グロブリンのイソ型の規定さ れるサブセットを同定した。これらの免疫グロブリンのイソ型(及びこの断片や
これに対する抗体など)は診断、予後、治療のためのモニタリング及び薬剤の開
発に有用である。 【0295】 本発明は、具体的に記載された実施形態によって概念を限定されるものではな
く、本発明の一概念の詳細な説明と解する。真に、本明細書中に示され記載され
たものに加えて本発明の様々な修飾が前記説明および添付図面から当業者に明ら
かになるであろう。このような修飾は、添付の特許請求の範囲の概念に含まれる
ものである。 【0296】 本明細書において引用されたすべての公報は、その全体を参考のために本明細
書中に引用される。 【図面の簡単な説明】 【図1】 図1は、正常ヒト血清の二次元電気泳動から得られたイメージであり、これは
PL1〜PL16をデザインした、14個のランドマーク特徴を同定したことを
付記する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C07K 16/18 G01N 33/15 Z
G01N 33/15 33/50 Z
33/50 33/68
33/68 A61K 37/00
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML,
MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K
E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E
A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ
,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA
,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU,
CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,G
E,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS
,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,
LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M
N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU
,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,
TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,Z
W
(72)発明者 パレク,ラジェシュ,ビクー
イギリス国,オキソン オーエックス14
3ワイエス,アビンドン,アビンドン サ
イエンス パーク,バートン レイン,ザ
クアッドラント 10,オックスフォード
グリコサイエンセス (ユーケー) リ
ミテッド
(72)発明者 パテル,ザコルブハイ,パーショタンブハ
イ
イギリス国,オキソン オーエックス14
3ワイエス,アビンドン,アビンドン サ
イエンス パーク,バートン レイン,ザ
クアッドラント 10,オックスフォード
グリコサイエンセス (ユーケー) リ
ミテッド
(72)発明者 タウンセンド,ロバート,レイド
イギリス国,オキソン オーエックス14
3ワイエス,アビンドン,アビンドン サ
イエンス パーク,バートン レイン,ザ
クアッドラント 10,オックスフォード
グリコサイエンセス (ユーケー) リ
ミテッド
Fターム(参考) 2G045 AA25 AA40 CA25 CA26 DA36
DA77 FB03 FB05 JA01
4C084 AA02 BA03 CA25 DC50 NA14
ZA962 ZB152 ZB262
4C085 AA13 AA14 BB14 CC04 CC05
DD22 DD23 EE01
4C086 AA01 AA02 EA01 MA01 MA04
MA07 NA14 ZA96 ZB15
4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76
EA22 EA50 FA72 FA74 HA05
HA06 HA07 HA15 HA16
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項1】 サンプル中の所定の一の特徴若しくは複数の特徴の相対的な
発生量が被検者のRAの存在若しくは不存在を示すものである、 (a)2次元電気泳動によって被検者からの血清若しくは血漿のサンプルを分析
して、特徴の2次元アレイを得; (b)その相対的な発生量がRAの存在若しくは不存在と相関する少なくとも一
の所定の特徴について、該サンプルにおける各所定の特徴の発生量をRAをもた
ない一人以上のヒトからの血清若しくは血漿における該所定の特徴の発生量と比
較することを含む、 被検者におけるRAのスクリーニング、診断若しくは予後に関するまたは被検者
に投与される抗RA薬剤若しくは治療の効果をモニターする方法。 【請求項2】 血清若しくは血漿サンプルと比較した場合の関節液サンプル
中の所定の一の特徴若しくは複数の特徴の相対的な発生量が被検者のRAの存在
若しくは不存在を示すものである、 (a)2次元電気泳動によって被検者からの関節液のサンプルを分析して、特徴
の2次元アレイを得; (b)2次元電気泳動によって被検者からの血清若しくは血漿のサンプルを分析
して、特徴の2次元アレイを得; (c)その相対的な発生量がRAの存在若しくは不存在と相関する少なくとも一
の所定の特徴について、関節液のサンプルにおける各所定の特徴の発生量を血清
若しくは血漿のサンプルにおける該所定の特徴の発生量と比較することを含む、
被検者におけるRAのスクリーニング、診断若しくは予後に関するまたは被検者
に投与される抗RA薬剤若しくは治療の効果をモニターする方法。 【請求項3】 一以上の発現参照特徴(ERF)に対するサンプル中の所定
の一の特徴若しくは複数の特徴の強度が被検者のRAの存在若しくは不存在を示
すものである、 (a)2次元電気泳動によって被検者からの関節液、血清若しくは血漿のサンプ
ルを分析して、特徴の2次元アレイを得; (b)その強度がRAの存在若しくは不存在と相関する少なくとも一の所定の特
徴について、該サンプルにおける各所定の特徴の強度を該被検者からの関節液、
血清若しくは血漿における該一以上の所定の発現参照特徴(ERF)の強度と比
較することを含む、 被検者におけるRAのスクリーニング、診断若しくは予後に関するまたは被検者
に投与される抗RA薬剤若しくは治療の効果をモニターする方法。 【請求項4】 (a)2次元電気泳動によって被検者からの関節液、血清若
しくは血漿のサンプルを分析して、等電点及び電気泳動移動度に従って複数のタ
ンパク質を分離し;および (b)下記のRA診断特徴(RADF):RADF−1、RADF−2、RAD
F−3、RADF−4、RADF−5、RADF−6、RADF−7、RADF
−8、RADF−9、RADF−10、RADF−11、RADF−12、RA
DF−13、RADF−14、RADF−15、RADF−16、RADF−1
7、RADF−18、RADF−19、RADF−20、RADF−21、RA
DF−22、RADF−23、RADF−24、RADF−25、RADF−2
6、RADF−27、RADF−28、RADF−29、RADF−30、RA
DF−31、RADF−32、RADF−33、RADF−34、RADF−3
5、RADF−36、RADF−37、RADF−38、RADF−39及びR
ADF−40の少なくとも一を定量的に検出することを含む、 被検者におけるRAのスクリーニング、診断若しくは予後に関するまたは被検者
に投与される抗RA薬剤若しくは治療の効果をモニターする方法。 【請求項5】 該段階(a)は等電点電気泳動さらにはドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を含む、請求項1、
2、3または4に記載の方法。 【請求項6】 (a)被検者からの関節液、血清若しくは血漿のサンプルに
おいて、下記RA診断タンパク質イソ型(RPI):RPI−1、RPI−2、
RPI−3、RPI−4、RPI−5、RPI−6、RPI−8、RPI−9、
RPI−10、RPI−11、RPI−12、RPI−13、RPI−14、R
PI−15、RPI−16、RPI−17、RPI−18、RPI−19、RP
I−20、RPI−21若しくはRPI−22、RPI−23、RPI−24、
RPI−25、RPI−26、RPI−27、RPI−28、RPI−29、R
PI−30、RPI−31、RPI−32、RPI−33、RPI−34、RP
I−35、RPI−36、RPI−37、及びRPI−38の少なくとも一を定
量的に検出することを含む、 被検者におけるRAのスクリーニング、診断若しくは予後に関するまたは被検者
に投与される抗RA薬剤若しくは治療の効果をモニターする方法。 【請求項7】 該定量的に検出する段階はサンプルの少なくとも一のアリコ
ートを試験することからなり、該試験する段階は、 (a)アリコートを予め選択されるRPIに対して免疫特異的である抗体と接触
させ;および (b)結合が該抗体及び該アリコートにおける少なくとも一の物質との間に起こ
るか否かを検出することを含む、 請求項6に記載の方法。 【請求項8】 該抗体はモノクローナル抗体である、請求項7に記載の方法
。 【請求項9】 該定量的に検出する段階は複数のアリコートを複数の抗体で
試験することを含む、請求項7に記載の方法。 【請求項10】 該抗体はモノクローナル抗体である、請求項9に記載の方
法。 【請求項11】 以下の分離されたRA診断タンパク質イソ型(RPI):
RPI−1、RPI−2、RPI−3、RPI−4、RPI−5、RPI−6、
RPI−8、RPI−9、RPI−10、RPI−11、RPI−12、RPI
−13、RPI−14、RPI−15、RPI−16、RPI−17、RPI−
18、RPI−19、RPI−20、RPI−21またはRPI−22、RPI
−23、RPI−24、RPI−25、RPI−26、RPI−27、RPI−
28、RPI−29、RPI−30、RPI−31、RPI−32、RPI−3
3、RPI−34、RPI−35、RPI−36、RPI−37、またはRPI
−38の一を含む調製物。 【請求項12】 請求項11の調製物を含むキット。 【請求項14】 請求項11の複数の調製物を含むキット。 【請求項15】 分離されたヒトのタンパク質を含む調製物であって、該タ
ンパク質は下記配列:VAAIEHFGRまたはVAALEHFGRの一方を有
するペプチドを含む調製物。 【請求項16】 該タンパク質は約5.98の等電点(pI)及び約52,
631の見かけの分子量(MW)を有する、請求項15に記載の調製物。 【請求項17】 該pIは5.98の10%以内であり、該MWは52,6
31の10%以内である、請求項16に記載の調製物。 【請求項18】 該pIは5.98の5%以内であり、該MWは52,63
1の5%以内である、請求項17に記載の調製物。 【請求項19】 該pIは5.98の1%以内であり、該MWは52,63
1の1%以内である、請求項18に記載の調製物。 【請求項20】 分離されたヒトのタンパク質を含む調製物であって、該タ
ンパク質は下記配列:DSGADISまたはDSGADLSの一方を有するペプ
チドを含む調製物。 【請求項21】 該タンパク質は約5.36の等電点(pI)及び約24,
124の見かけの分子量(MW)を有する、請求項20に記載の調製物。 【請求項22】 該pIは5.36の10%以内であり、該MWは24,1
24の10%以内である、請求項21に記載の調製物。 【請求項23】 該pIは5.36の5%以内であり、該MWは24,12
4の5%以内である、請求項22に記載の調製物。 【請求項24】 該pIは5.36の1%以内であり、該MWは24,12
4の1%以内である、請求項23に記載の調製物。 【請求項25】 分離されたヒトのタンパク質を含む調製物であって、該タ
ンパク質は下記配列:NVIDAPHARまたはNVLDAPHARの一方を有
するペプチドを含む調製物。 【請求項26】 該タンパク質は約5.96の等電点(pI)及び約158
,868の見かけの分子量(MW)を有する、請求項25に記載の調製物。 【請求項27】 該pIは5.96の10%以内であり、該MWは158,
868の10%以内である、請求項26に記載の調製物。 【請求項28】 該pIは5.96の5%以内であり、該MWは158,8
68の5%以内である、請求項27に記載の調製物。 【請求項29】 該pIは5.96の1%以内であり、該MWは158,8
68の1%以内である、請求項28に記載の調製物。 【請求項30】 下記RA診断タンパク質イソ型(RPI):RPI−1、
RPI−2、RPI−3、RPI−4、RPI−5、RPI−6、RPI−8、
RPI−9、RPI−10、RPI−11、RPI−12、RPI−13、RP
I−14、RPI−15、RPI−16、RPI−17、RPI−18、RPI
−19、RPI−20、RPI−21またはRPI−22、RPI−23、RP
I−24、RPI−25、RPI−26、RPI−27、RPI−28、RPI
−29、RPI−30、RPI−31、RPI−32、RPI−33、RPI−
34、RPI−35、RPI−36、RPI−37、及びRPI−38の一に免
疫特異的に結合できる抗体。 【請求項31】 請求項30の抗体を含むキット。 【請求項32】 請求項30の複数の抗体を含むキット。 【請求項33】 治療上有効な量の下記RA診断タンパク質イソ型(RPI
):RPI−12、RPI−13、RPI−14、RPI−15、RPI−16
、RPI−17、RPI−18、RPI−19、RPI−20、RPI−21、
RPI−22、RPI−23、及びRPI−24の一以上を含む薬剤組成物。 【請求項34】 治療上有効な量の下記RA診断タンパク質イソ型(RPI
):RPI−1、RPI−2、RPI−3、RPI−4、RPI−5、RPI−
6、RPI−8、RPI−9、RPI−10、またはRPI−11の一に免疫特
異的に結合する抗体を含む薬剤組成物。 【請求項35】 治療上有効な量の下記RA診断タンパク質イソ型(RPI
):RPI−1、RPI−2、RPI−3、RPI−4、RPI−5、RPI−
6、RPI−8、RPI−9、RPI−10、若しくはRPI−11の一に免疫
特異的に結合する抗体の断片または誘導体、該抗体の結合ドメインを含む断片ま
たは誘導体;および製薬上許容できる担体を含む薬剤組成物。 【請求項36】 治療上有効な量の下記RA診断タンパク質イソ型(RPI
):RPI−12、RPI−13、RPI−14、RPI−15、RPI−16
、RPI−18、RPI−19、RPI−21、RPI−22、RPI−23、
もしくはRPI−24の一をコード化する核酸をRAの治療または予防の必要な
被検者に投与することを含むRAの治療または予防方法。 【請求項37】 治療上有効な量の下記RA診断タンパク質イソ型(RPI
):RPI−1、RPI−2、RPI−3、RPI−4、RPI−5、RPI−
6、RPI−8、RPI−9、またはRPI−11の一以上の機能を阻害する核
酸をRAの治療または予防の必要な被検者に投与することを含むまたは予防方法
。 【請求項38】 該核酸はRPIアンチセンス核酸またはリボザイムである
、請求項37の方法。 【請求項39】 被検者におけるRAのスクリーニング、診断若しくは予後
におけるまたは被検者に投与される抗RA薬剤若しくは治療の効果をモニターす
るための請求項4に記載の一以上のRADFの使用。 【請求項40】 被検者におけるRAのスクリーニング、診断若しくは予後
におけるまたは被検者に投与される抗RA薬剤若しくは治療の効果をモニターす
るための請求項6に記載の一以上のRPIの使用。 【請求項41】 被検者におけるRAのスクリーニング、診断若しくは予後
におけるまたは被検者に投与される抗RA薬剤若しくは治療の効果をモニターす
るための請求項6に記載のRPIに対して免疫特異的な少なくとも一の抗体の使
用。 【請求項42】 該少なくとも一の抗体はモノクローナル抗体である、請求
項41に記載の使用。 【請求項43】 被検者におけるRAのスクリーニング、診断若しくは予後
におけるまたは被検者に投与される抗RA薬剤若しくは治療の効果をモニターす
るための請求項15〜29のいずれか1項に記載のタンパク質の使用。 【請求項44】 RAの予防または治療に使用される薬剤の調製における請
求項33に記載の少なくとも一のRPIの使用。 【請求項45】 RAの予防または治療に使用される薬剤の調製における請
求項34に記載の少なくとも一の抗体の使用。 【請求項46】 RAの予防または治療に使用される薬剤の調製における請
求項35に記載の抗体の断片または誘導体の使用。 【請求項47】 RAの予防または治療に使用される薬剤の調製における請
求項36に記載の核酸の使用。 【請求項48】 RAの予防または治療に使用される薬剤の調製における請
求項37に記載の核酸の使用。
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