CN103119447A

CN103119447A - 癌症磷脂组学

Info

Publication number: CN103119447A
Application number: CN2011800455995A
Authority: CN
Inventors: J·V·M·斯威纳恩; J·马歇尔斯; E·M-J·E·L·玛里恩; M·R·巴加迪
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Priority date: 2010-09-24
Filing date: 2011-09-23
Publication date: 2013-05-22
Also published as: US9400274B2; GB201016139D0; EA201370063A1; BR112013006528A2; WO2012038525A1; US20140220613A1

Abstract

本发明涉及用于癌症分析的脂质组生物标志物的鉴定，并且提供了预后和预测性方法及试剂盒，所述方法及试剂盒，通过使用磷脂(PL)谱分析，用于癌症诊断和亚型分型和用于诊断和/或预测受试者中的肿瘤的进展及其对脂质代谢靶向疗法或其它类型的疗法的反应，其中完整的体液来源或肿瘤来源的磷脂种类的组合的酰基链长度的变化表示延长表型。

Description

癌症磷脂组学

技术领域

总地来说，本发明涉及用于癌症分析的脂质组学(lipidome)生物标志物的鉴定，并且其通过利用磷脂(PL)谱分析，提供了用于癌症诊断和亚型分型(subtyping)以及用于预测肿瘤的发展及其对受试者中的脂质代谢靶向的或其它类型的疗法的应答的预后和预测方法以及试剂盒，其中完整的体液来源的或肿瘤来源的磷脂种类的酰基链长度的变化表示延长表型(elongation phenotype)。更具体地，其中相同头基类别中具有相同饱和水平但不同酰基链长度的磷脂种类的相对表达水平的变化表示更具侵袭性的延长表型。所述延长表型,单独地或与脂质生成表型组合地,与癌症的存在、特定癌症亚型的存在、更具侵袭性的表型的存在、或对脂质生成酶的抑制剂、延长酶(elongase)或其它类型的疗法(包括酪氨酸激酶靶向疗法)的反应性的存在相关。此外，本发明总的涉及，基于延长和脂质生成表型对癌症进行表型分型，以将此与生物学样品，更具体地癌症样品的生物学状况相联系，以鉴定癌症的发病率、分期或行为。

本发明的背景

已公认，癌症是不受控制的细胞生长，其形成肿瘤并最终可能入侵其他组织(转移)。癌症影响所有年龄的人群，它是人死亡的主要原因，而其中肺癌、胃癌、结肠直肠癌和肝癌是最致命的。男性中最常出现的癌症是***癌，而女性中则是乳腺癌。

全球每年有1100万人被诊断出患有癌症。将近700万人死于这种疾病。许多癌症类型的治疗选择和介入治疗的成功率很大程度上取决于诊断时的疾病阶段。在许多情况下，早期检出是非常重要的，因为它能大大提高治疗的成功率。用于早期检测和更好的诊断的筛查计划和工具具有极大的重要性。然而，这也增加了潜伏和无临床意义的肿瘤的检出率。这带来了过度治疗的巨大风险，并且因此成为巨大的临床困境（因为对于病情进展，没有有效的测试法）。另一方面，为数不少的患者将发展出临床转移疾病，或在临床分期时已存在潜伏性转移。此外，肿瘤通常对指定类型的治疗产生不同的反应，并且通常获得对治疗的抗性。这些情况凸显了对用于治疗决策和追踪观察(以进行更个性化和更适当的治疗)的可靠标准和工具的需求。

目前，许多癌症的癌症诊断、癌症亚型分型和治疗决策主要是基于组织病理学TNM(肿瘤、***、转移)***、原发肿瘤的组织学分化程度以及免疫组织化学。由于这些***只提供基于少数参数的肿瘤的特定图片，因此，肿瘤特征内多参数的以分子为基础的深刻见解无疑将有助于更准确地预测进展和治疗反应，并且有助于选择更合适的主要和/或辅助性治疗方案。分子解析方法的最新进展在这方面具有重大前景，并且有能力彻底改变诊断和治疗癌症的方式。

迄今为止，在癌症的多参数分子表征和分期方面所作的大部分努力都在DNA、RNA或蛋白质水平上进行(筛检基因组突变、高通量基因组或外来体(exosome)测序、表观遗传学分析、转录组分析或蛋白谱分析(protein profiling))。例如，基因表达谱分析可以预测***癌(G.V.等人,J.CHn.Invest.113:913-923(2004))及乳腺癌(Van′tVeer等人Nature415:530-536(2002))的临床结果。

尽管如此，更下游的变化可能是更显著的，因为它们代表了细胞调节的更终末端点，整合了各种(epi)遗传、调控和环境因素。在这方面，特别令人感兴趣的是，膜脂质构成的改变。

作为分隔和划分细胞内容物的屏障，细胞膜作为独特的界面发挥功能，在所述界面上，集中并且调控了许多细胞过程(包括信号传导、营养物质的运输、细胞***、呼吸、细胞死亡机制等等)。越来越多的证据显示，膜脂质，特别是磷脂种类的改变在该调控中发挥了核心作用(Marguet D,Lenne PF,Rigneault H,He HT(2006)Dynamics in theplasma membrane:how to combine fluidity and order.EMBO J 25:3446-3457)。

磷脂是一种复杂的细胞脂质类别，其包含头基(胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇等等)和1至4个脂肪酰基链，所述脂肪酰基链在长度和不饱和键(双键)的数目方面可能不同，导致数百种不同的种类。这些脂质的构建模块可以通过循环获得，但有些也可以从头合成。大多数细胞表达了能动态地修饰脂质结构的精细途径。这可以显著地改变它们的化学性质，并局部地调整膜的生物化学和生物物理特性。

越来越多的证据表明，肿瘤中的磷脂代谢与正常组织显著不同。大多数正常组织都通过循环来获得大部分所需要的脂质，然而肿瘤细胞则通常重新合成大部分其脂质(Brusselmans,K.和Swinnen,J.V.(2009)The lipogenic switch in Cancer.In Mitochondria andCancer,KK Singh和L.C.Costello,Eds,Springer,New York,USApp.39-59)。这一点可由下述来说明：脂质生成酶例如脂肪酸合酶在肿瘤中，特别是在那些预后不良的肿瘤中显著过量表达。该脂质生成途径的激活涉及酶调节的所有层次的改变(遗传变化、增强的转录和翻译、蛋白质的稳定和磷酸化、变构调节和基质通量)，并且出现在各种常见致癌事件的下游(PTEN的丧失、Akt的活化、BRCA1的丧失、类固醇激素作用、肿瘤相关缺氧等等)(Swinnen,J.V.,Brusselmans,K.和Verhoeven,G.(2006).Increased lipogenesis in cancer cells:new players,novel targets.Curr Opin Clin Nutr Metab Care9,358-365)。

相反地，其它肿瘤类型或肿瘤亚型似乎激活脂肪酸的摄取机制(例如通过表达脂蛋白脂肪酶)(Kuemmerle NB,Rysman E,Lombardo PS,Flanagan AJ,Lipe BC,Wells WA,Pettus JR,Froehlich HM,MemoliVA,Morganelli PM,Swinnen JV,Timmerman LA,Chaychi L,FricanoCJ,Eisenberg BL,Coleman WB,Kinlaw WB.Lipoprotein lipaselinks dietary fat to solid tumor cell proliferation.Mol CancerTher.2011Mar;10(3):427-36)。除了为细胞增殖提供脂肪酸外，增加的脂肪酸合成对摄取的影响一直不清楚。除了脂肪酸重新合成和摄取的改变外，还有证据表明，脂质代谢发生了其它改变，包括磷脂酶，COX2，和ELOVL7(参与饱和长链脂肪酸的延长的酶)的表达的改变(Novel lipogenic enzyme ELOVL7is involved in prostate cancergrowth through saturated long-chain fatty acid metabolism.Tamura K,Makino A,Hullin-Matsuda F,Kobayashi T,Furihata M,Chung S,Ashida S,Miki T,Fujioka T,Shuin T,Nakamura Y,Nakagawa H.Cancer Res.2009Oct15;69(20):8133-40)。除了其在***癌的类固醇激素合成所需的胆固醇酯的产生中的作用外，其和ELOVL家族的其它成员所导致的癌症进展的延长的变化程度、其对膜磷脂组成的影响以及其在癌症发展和进展中的作用仍然不清楚。

先前已描述了膳食脂肪酸和患上癌症的风险之间的相关性。例如，特别地，n-6多不饱和脂肪酸(Godley,P.,Campbell,M.,Gallagher,P.,等人(1996).Biomarkers of Essential Fatty Acid Consumptionand Risk of Prostatic Carcinoma.Cancer Epidemiology,Biomarkers & Prevention 5,889-895)、饱和脂肪酸(棕榈酸；Harvei等人,1997)(肉豆蔻酸；等人,2003)，及单饱和脂肪酸(棕榈油酸；Harvei,S.,Bjerve,K.,Tretli,S.,等人(1997).Prediagnostic level of fatty acids in serum phospholipds:omega-3 and omega-6fatty acids and the risk of prostate cancer.In.J.Cancer71,545-551)的增加的摄取已显示与增加的患癌风险相关。此外，还已显示，膳食脂肪酸与肿瘤的侵袭性有关。例如Crowe等人表明，棕榈酸(饱和脂肪酸)与低度恶性(低侵袭性)的***癌呈正相关，而肉豆蔻酸(饱和脂肪酸)以及亚麻酸和二十碳五烯酸(均是n-3多不饱和脂肪酸)与高度恶性(侵袭性)的***癌呈正相关(Crowe,F.,Allen,N.,Appleby,P.,等人(2008)Fatty acidcomposition of plasma phospholipids and risk of prostate cancerin a case-control analysis nested within the EuropeanProspective Investigation into Cancer and Nutrition.Am.J.Clin.Nutrition88:1353-1363)。

除了膳食脂肪酸与癌症预测/预后的这些已知的相关性外，我们现已发现，癌症的发展通常伴随磷脂的酰基链长度的变化，特别地伴随至少一个头基类别内较长的磷脂种类的分数的相对增加(当与较短的磷脂种类的分数相比较时)。

我们证明，此类变化影响癌细胞的增殖和侵袭性。我们还显示，酰基链长度受癌症治疗例如受酪氨酸激酶抑制剂例如伊马替尼调节。这些发现表明，膜磷脂谱分析可用于诊断、预后及预测和随防性试验的开发，以评估受试者的肿瘤的发展和治疗反应。其还有助于受益于靶向脂质代谢酶本身的治疗(包括脂质生成、延长以及其它脂质代谢过程的抑制剂)的患者的选择和追踪观察。

将这种磷脂谱用作诊断性/预测性/预后性生物标志物将导致更个性化的医疗，其中诊断和治疗更加相互依赖，并且基于肿瘤将如何发展及响应特定治疗的分子证据。这些进展将允许医生根据患者的个体需求定制治疗。它还避免了因过度治疗而导致的过度的病态和副作用(即，使患者在非侵袭性或过于晚期的疾病的情况下免于接受侵入性手术过程)，并且优化了现有资源的使用。

发明概述

本发明的目的是，提供一种用于诊断和/或预测人受试者中的肿瘤的进展的体外方法，所述方法包括：测定肿瘤相对于正常组织的至少1种头基类别(head group class)的完整磷脂种类的相对表达水平；其中在所述至少一种头基类别内具有相同饱和水平但不同酰基链长度的磷脂种类的相对表达水平的改变表示更具侵袭性的延长表型。

在其它实施方案中，根据本发明的体外方法还包括：测定至少1种单不饱和磷脂种类和至少1种多不饱和磷脂种类的表达水平；以及，其中所述至少1种单不饱和磷脂种类的相对表达水平的升高和所述至少1种多不饱和磷脂种类的相对表达水平的降低表示，更具侵袭性的脂质生成表型；并且其中在至少一种头基类别内具有相同饱和水平但不同酰基链长度的磷脂种类的相对表达水平的改变表示，更具侵袭性的延长表型。

在具体的实施方案中，本发明提供了根据本发明的体外方法，其中在至少一个头基类别内，与较短链的磷脂种类相比较，较长链的磷脂种类的相对增加表示更具侵袭性的延长表型。

在其它实施方案中，磷脂种类选自：甘油磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、心磷脂和磷酸肌醇(phosphoinositide);优选磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和/或磷酸肌醇磷脂种类。

在优选实施方案中，所述至少一种头基类别内的磷脂种类选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和/或磷酸肌醇磷脂种类，特别是磷脂酰丝氨酸。

在进一步的实施方案中，单不饱和磷脂是具有一个或两个单不饱和脂肪酰基链的磷脂酰胆碱(PC)，选自：PC28:1、PC30:1、PC30:2、PC32:1、PC32:2、PC34:1、PC34:2、PC36:1、PC36:2、PC38:1、PC38:2、PC40:1和PC40:2，优选PC34:1。

在进一步的实施方案中，多不饱和磷脂是多不饱和磷脂酰胆碱(PC)，选自PC32:3、PC34:2、PC34:3、PC34:4、PC36:2、PC36:3、PC36:4、PC36:5、PC36:6、PC38:2、PC38:3、PC38:4、PC38:5、PC38:6、PC38:7、PC40:2、PC40:3、PC40:4、PC40:5、PC40:6、PC40:7、PC40:8、PC42:2、PC42:3、PC42:4、PC42:5、PC42:6、PC42:7、PC42:8、PC42:9、PC42:10、PC42:11、PC44:2、PC44:3、PC44:4、PC44:5、PC44:6、PC44:7、PC44:8、PC44:9、PC44:10、PC44:11和PC44:12，优选PC36:3、PC38:3、PC36:4、PC38:4、PC40:4、PC36:5、PC38:5、PC40:5，最优选PC36:4或PC38:4。

在另一个优选实施方案中，单不饱和磷脂是单不饱和磷脂酰胆碱(PC)PC34:1；而多不饱和磷脂是多不饱和磷脂酰胆碱(PC)PC36:4或PC38:4。

在优选实施方案中，较短链的磷脂种类选自PC30:0、PC32:1、PC34:1、PC32:2、PC34:2、PC34:3、PC36:4、PC36:5、PC38:6;PE32:1、PE34:1、PE34:2、PE36:3、PE36:4、PE36:5、PE38:6、PE38:7、PE40:8、PS34:1、PS36:1、PS34:2、PS36:3、PS36:4、PS38:4、PS38:5、PS38:6、PS40:7;PI32:0、PI34:0、PI30:1、PI34:2、PI36:3、PI36:4、PI38:5和PI38:6;特别是PC34:1、PC34:2、PE34:1、PE34:2、PE36:4、PS34:1、PS36:1、PS34:2、PS36:4、PS38:4、PI32:0、PI34:0和PI36:4。

根据本发明的体外方法特别适用于选自如下的肿瘤：***癌；肾癌例如CCRC;乳腺癌；肺癌；结肠癌；胃癌；卵巢癌；子宫内膜癌；肝癌；食道癌；膀胱癌；口腔癌；甲状腺癌；胰腺癌；视网膜癌和皮肤癌；优选***癌或肾癌。

在其它实施方案中，根据本发明的体外方法还包括，测量肿瘤样品相对于正常样品的侵袭性脂质生成表型(lipogenic phenotype)的一个或多个其它生物标志物的相对表达或磷酸化/活化，并且其中所述一个或多个其它生物标志物的相对表达的增加表示，更具侵袭性的脂质生成表型。特别地，所述侵袭性脂质生成表型的所述一个或多个其它生物标志物可选自FASN(脂肪酸合酶)、ACCA(乙酰CoA羧化酶α)和ACLY(ATP柠檬酸裂合酶)的表达。

特别地，可通过ESI-MS/MS或质谱的任意其它形式测定磷脂种类的表达水平。

本发明还涉及，根据本发明的体外方法用于诊断和/或预测受试者的肿瘤的进展的用途，包括用于评估受试者的肿瘤的进展和治疗反应的诊断、预后、预测和追踪观察测试的开发。其还有助于受益于靶向脂质代谢酶本身的治疗(包括脂质生成、延长和其它脂质代谢过程的抑制剂)的患者的选择和追踪观察。

此外，本发明提供了脂肪酰基链长度延长的抑制剂用于治疗癌症的用途。

最后，本发明提供了用于进行根据本发明的体外方法的试剂盒，所述试剂盒包括：用于完整磷脂的ESI-MS/MS样品制备的试剂，特别是抗氧化剂、溶剂和标准物。

附图说明

图1.来自14个***癌患者的***肿瘤相对于正常***组织的PL种类的相对变化的热图和聚类。按照脂质类别(PC、PE、PS和PI)对磷脂进行排序。在每一个PL类别内，按照不饱和程度对种类进行排序，并且在每一个(不)饱和的亚类内，按照它们的链长度对种类进行排序。浅灰色至白色方块表示与正常组织相比较，肿瘤组织的PL种类的减少，而深灰色至黑色方块代表增加，如由比例尺(Log2)指示的。线纹方块表示缺失值。聚类分析将患者分成两个大组(A和B)和若干亚组。

图2:13个***癌患者的***肿瘤相对于正常***组织的磷脂种类的平均相对变化(log2)。根据脂质类别(PC、PE、PS和PI)对磷脂进行排序。聚类分析将患者分为2大组。聚簇A：9个具有脂质生成表型的患者(图2A);聚簇B：4个无脂质生成表型的患者(图2B)。

图3:***肿瘤相对于正常***组织的磷脂酰基链长度的变化。为了最佳地显示酰基链长度的变化，将肿瘤和匹配的正常组织中的磷脂种类相对于每一个(不)饱和的亚类的最短磷脂种类(其被设置为0(Log2))的相对丰度的变化作图。浅灰色至白色方块表示磷脂比率的相对减少，而深灰色至黑色方块代表增加，如由比例尺指示的(Log2)。线纹方块表示缺失值。

图4:具有4-7个不饱和键的PS种类的延长。计算肿瘤和匹配的正常组织的磷脂种类相对于每一个(不)饱和的亚类的最短磷脂种类(其被设置为0(Log2))的相对丰度的变化。将所有患者的平均值作图。

图5:具有1-3个不饱和键的PS种类的延长谱。计算肿瘤和匹配的正常组织的磷脂种类相对于每一个(不)饱和的亚类的最短磷脂种类(其被设置为0(Log2))的相对丰度的变化。将聚簇D'(A)和聚簇D''(B)中的患者的平均值作图。对于聚簇D'中的患者，观察到具有1-3个不饱和键的PS种类的额外延长，对于聚簇D''中的患者未观察到该现象。

图6:PI种类的总体延长。计算肿瘤和匹配的正常组织的磷脂种类相对于每一个(不)饱和的亚类的最短磷脂种类(其被设置为0(Log2))的相对丰度的变化。将所有患者的平均值作图。

图7.聚簇D''中的患者的具有1-4个不饱和键的PC和PE种类的延长的减少。计算肿瘤和匹配的正常组织的磷脂种类相对于每一个(不)饱和的亚类的最短磷脂种类(其被设置为0(Log2))的相对丰度的变化。将聚簇D''中的患者的平均值作图。

图8.患者P.8880的所有头基类别的酰基链长度的总体增加。计算肿瘤和匹配的正常组织的磷脂种类相对于每一个(不)饱和的亚类的最短磷脂种类(其被设置为0(Log2))的相对丰度的变化。

图9.ccRCC相对于匹配的正常肾皮质(n=20)的磷脂谱的变化。条块代表20个ccRCC患者的ccRCC相对于对照的每一个种类的平均比率(表示为log2)。对于每一个头基类别(PC、PE、PS和PI:分别地图框A、B、C、D)，按照它们的不饱和程度给脂质种类排序，在每一个具有相同数目的不饱和键的脂质亚类(通过虚线分隔亚类)内，按照从短至长的组合酰基链长度给脂质种类排序。在4个不同的头基类别中，特别地在链非常长的多不饱和种类中观察到酰基链延长的显著增加。

图10.从肾癌患者的手术前尿样品分离的外来体的磷脂酰基链长度的变化(相对于手术后样品)。为了最佳地显示酰基链长度的变化，将从手术前尿样品分离的外来体的磷脂种类相对于每一个(不)饱和的亚类的最短磷脂种类(其被设置为0(Log2))的相对丰度的变化(相对于手术后样品)作图。条块代表10个患者的平均值。

图11.用0.1微摩尔伊马替尼(imatinib)处理72小时的GIST T1细胞中的磷脂酰基链长度的变化。在3对样品中进行脂质谱分析。曲线显示不同磷脂头基类别(PC、PE、PI和PS)的伊马替尼/对照的比率(表示为log2)。按照它们的不饱和程度给脂质种类排序，并且在每一个具有相同数目的不饱和键的脂质亚类(通过虚线分隔亚类)内，按照从短至长的组合酰基链长度给脂质种类排序。

图12.soraphen处理的MDA-MB-231乳腺腺癌细胞相对于对照(媒介物处理的)细胞的磷脂酰基链组成的变化。在3对样品中进行脂质谱分析。曲线显示不同磷脂类别的soraphen/对照的比率(表示为log2)。在每一个用虚线标记的区域内，酰基链长度从左至右增加。在4个不同的类别中，当用soraphen处理细胞时，观察到较长的脂质种类的明显减少。

图13.用soraphen处理的RCC4细胞相对于对照(媒介物处理的)细胞的磷脂酰基链组成的变化。在3对样品中进行脂质谱分析。曲线显示不同磷脂头基类别(PC、PE、PI和PS)的soraphen/对照的比率(表示为log2)。按照它们的不饱和程度给脂质种类排序，并且在每一个具有相同数目的不饱和键的脂质亚类(通过虚线分隔亚类)内，按照从短至长的组合酰基链长度给脂质种类排序。在4个不同的头基类别中，在soraphen处理的细胞中观察到酰基链延长的显著抑制，如通过较短脂质种类的相对增加和较长脂质种类的伴随减少所显示的。

发明详述

本发明的目的是，提供用于诊断和/或预测受试者的肿瘤的进展的体外方法，所述方法包括：测定肿瘤相对于正常组织的一种或多种头基类别的完整磷脂种类的相对表达水平；其中至少一种单不饱和磷脂的相对表达水平的升高及至少一种多不饱和磷脂的相对表达水平的降低表示更具侵袭性的脂质生成表型；和其中在所述相同头基类别内具有相同饱和水平但不同酰基链长度的磷脂种类的相对表达水平的变化表示更具侵袭性的延长表型。

在其它目的中，根据本发明的体外方法还包括，测定肿瘤样品和正常样品中至少一种单不饱和磷脂和至少一种多不饱和磷脂的表达水平；并且其中所述至少一种单不饱和磷脂种类的相对表达水平的升高和所述至少一种多不饱和磷脂种类的相对表达水平的降低表示更具侵袭性的脂质生成表型；和其中在至少一个头基类别内，具有相同饱和水平但不同酰基链长度的磷脂种类的相对表达水平的改变表示更具侵袭性的延长表型。

在其它实施方案中，本发明的方法包括测定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种单不饱和磷脂的相对表达水平。

在其它实施方案中，本发明的方法包括测定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种多不饱和磷脂的相对表达水平。

“m/z”是质荷比(Mass over charge)[I.T.Jolliffe,Principalcomponent analysis,第2版New York:Springer,2002.和M.Ringn 　er,“What is principal component analysis？”NatBiotechnol,第26卷,no.3,pp.303-4,Mar 2008]

在本申请的含义上，“测定”是确定一种或多种分子种类在生物体或生物样品中的存在或不存在的分析或方法。定量测定还测量其靶分析物在样品中的量。

在本发明的含义上，“总离子流”为由促成谱的不同离子携带的单独的离子流的总和[A.D.McNaught和A.Wilkinson,Compendiumof chemical terminology:IUPAC recommendations,第2版Oxford:Blackwell Science,1997.[在线]可获得的:http://goldbook.iupac.org/index.html]。从数学观点来看，所有离子的总和包括质谱(无论离子种类)或在质谱曲线上的积分。

在本申请的含义上，“电离效率(Ionization efficiency)”为形成的离子的数目对电离过程中使用的电子或光子的数目的比率[A.D.McNaught和A.Wilkinson,Compendium of chemical terminology:IUPAC recommendations,第2版，Oxford:Blackwell Science,1997.[在线]可获得的:http://goldbook.iupac.org/index.html]。

在本申请中，“质量”或“m/z”意指质荷比，“质量范围”或“m/z范围”意指质荷比的范围。线性动态范围为在其上离子信号与分析物浓度呈线性相关的范围。质量准确度(mass accuracy)是m/z测量误差对真实m/z的比率。质量分辨力(mass resolving power)是区分两个略微不同的m/z的峰的能力的量度。

光谱分析是用于估量给定的化学(原子、分子或离子的)种类的浓度或量的光谱技术。在该情况下，进行此类测量的仪器是分光计、分光光度计或摄谱义(spectrograph)。

质谱仪是用于测定分析物样品或分子的元素组成和/或用于阐明分子例如肽和其它化合物的化学结构的装置。质谱法原理由下述组成：电离分析物的化合物以产生带电分子或分子片段，利用势能(例如在静态或动态磁场或电场下)转运此类离子和测量其质荷(m/z)比。

“电喷雾电离”(ESI)是在质谱法中用于产生离子的技术。其在从大分子产生离子方面特别有用，因为其克服了此类分子在电离时片段化的倾向。使用ESI的质谱法被称为电喷雾电离质谱法(ESI-MS)或，较少见地，电喷雾质谱法(ES-MS)。电喷雾电离是用于将液相色谱与质谱偶联的选择的离子源。分析可通过将从LC柱洗脱的液体直接给料至电喷雾来联机(online)进行，或通过收集有待随后在经典的纳米电喷雾-质谱装置中进行分析的级分来脱机(offline)进行。

如本文中所用的，“肿瘤”被定义为异常生长的细胞块。可用于本发明的肿瘤包括但不限于，***癌、肾癌例如CCRC、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肝癌、食道癌、膀胱癌、口腔癌、甲状腺癌、胰腺癌、视网膜和皮肤癌，优选为***癌或肾癌。

“肿瘤样品”是指，在从具有所述肿瘤的受试者切除肿瘤之前或之后从癌症患者获得的样品。所述样品可直接取自肿瘤，例如活检组织(biopsy)。其还可包括体液来源的样品，例如血液、血清或尿；包括获自所述体液来源的样品的分离物，例如外来体。

正常样品是指，用于测定基线表达水平的获得的样品。因此，正常样品可通过许多方法获得，包括从非癌变细胞或组织，例如，从受试者肿瘤或癌细胞周围的细胞；从没有癌症的受试者；从未被怀疑有患癌风险的受试者；或从源于此类受试者的体液、细胞或细胞系获得。正常样品还包括先前建立的标准，例如先前已表征的癌细胞系。因此，可以将根据本发明进行的任何测试或测定与已建立的标准相比较，而无需每次比较都获取正常样品。

样品可以是从受试者分离的任何组织、细胞、细胞提取物、血清、全血、血浆浓缩物、外来体级分、来自血浆/血液的任何级分的沉淀物、体液等(例如从患有癌症的受试者或从健康志愿者分离的样品)。“样品”还可以是在实验条件下创建的细胞或细胞系，其不是直接分离自受试者。受试者可以是人、大鼠、小鼠、非人灵长类动物、猫科动物等。

例如，外来体可以从癌症患者的尿液、血液或血清样品中提取。由于所述外来体的膜代表了它们所到达的癌细胞的细胞膜，因此，这些外来体的磷脂谱分析，相比起直接从癌组织取得的磷脂谱分析，是很好的替代方式，并且更重要的是，这是一种侵入性低得多的方法。这使得可以更容易地随着时间的推移追踪肿瘤的进展，而无需每一次都进行肿瘤活检。所述外来体可以例如通过芯片实验室技术进行分离，这允许随后分析磷脂谱，从而允许高通量的筛选。在后者中，外来体(微囊泡)可以根据先前出版物，通过选择性沉淀，亲和纯化，或通过差速离心法(Valadi H,Ekstrom K,Bossios A,Sjostrand M,Lee JJ,Lotvall JO.Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAsis a novel mechanism of genetic exchange between cells.Nat CellBiol2007;9:654-659-Zhang Y,Liu D,Chen X,Li J,Li L,BianZ,Sun F,Lu J,Yin Y,Cai X,Sun Q,Wang K,Ba Y,Wang Q,WangD,Yang J,Liu P,Xu T,Yan Q,Zhang J,Zen K,Zhang CY.Secretedmonocytic miR-150enhances targeted endothelial cell migration.Mol Cell2010;39:133-144)进行分离。简言之，在以2000g和17000g离心除去细胞和其他碎片后，以200,000g离心上清液70分钟(所有步骤以4℃进行)。从沉淀收集外来体，并将其再次悬浮于PBS中。用流式细胞术测定外来体在超速离心后的存在。为了确认囊泡具有正确的大小，使用1微米珠粒(Invitrogen)设置流式细胞仪门控，产生用于以下文所述的微流体芯片的微囊泡。

通过使用本发明的体外方法，将能预测肿瘤的存在以及肿瘤的进展，即，肿瘤发展成侵袭性肿瘤表型的潜力，或预测或追踪观察肿瘤响应抗癌疗法的潜力。所述抗癌疗法包括本领域已知的任何疗法，例如但不限于化疗、分子靶向疗法、脂质代谢靶向疗法、免疫疗法、放疗等。

具有侵袭性脂质生成表型的肿瘤是指，内源性重新产生脂肪酸并且使患者具有较差预后的肿瘤，即，相比起使患者拥有良好存活预后的肿瘤，对抗癌疗法较无响应和/或更可能恶化或转移的肿瘤。

具有延长表型的肿瘤是指，显示任意脂质种类的个别或组合的酰基链长度的变化的肿瘤，所述变化使得该肿瘤在细胞增殖、侵袭性等方面更具侵袭性或较不具有侵袭性。具体地，所述变化涉及在一个或多个头基类别内(更具体地在选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰肌醇磷脂种类的一种或多种头基类别中，具体地在磷脂酰丝氨酸磷脂类别中)，与较短的磷脂种类相比，较长的磷脂种类的相对增加。

磷脂是作为细胞膜的主要组分且可以形成脂双层的一类脂质。磷脂由亲水头基和疏水尾组成。头基通常包含磷酸基团和简单有机分子例如磷脂酰胆碱中的胆碱，并且通过甘油结合至通常由二脂酰甘油酯组成的尾。二脂酰甘油酯由通过酯键共价连接至甘油分子的2个脂肪酸链组成。脂肪酸是拥有至少4个碳原子的无支链脂肪族尾的羧酸，取决于双键的存在，其可以是饱和的或不饱和的。饱和脂肪酸是在其脂肪族尾中不含双键的脂肪酸，单不饱和脂肪酸是在其脂肪族尾中含有正好一个双键的脂肪酸，而多不饱和脂肪酸在其脂肪族尾中具有2、3、4、5、6、7或更多个双键。基于亲水头基的组成，磷脂被进一步分类成头基类别例如甘油磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、心磷脂和磷酸肌醇。如根据下文中的实施例将是很显然的，在本发明的方法内，在此类头基类别内测定延长的差异。

根据本发明的磷脂特别地选自：甘油磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、心磷脂和磷酸肌醇，更特别地选自磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷酸肌醇。

磷脂的表达水平是指，完整磷脂的水平，如利用任何合适的方法所测定的，例如通过ESI-MS/MS进行分析。在所述方法中，磷脂将基于电离种类的强度来鉴定，所述强度表示为相对于脂质标准而测定的绝对值，或表示为个别磷脂相对于所有测量的磷脂的摩尔百分数，或个别磷脂的强度水平相对于所有测量的磷脂的总强度水平的百分比。

磷脂的相对表达水平是指，肿瘤样品中的磷脂表达水平相较于正常样品中的磷脂表达水平的差异。在一些实施方案中，相对表达水平可以在不同的时间点被确定，如在治疗之前、期间及之后。相对表达水平可以以任何合适的方(例如log2)式来表示。

如果log2值高于约0，则认为磷脂的相对表达水平升高，反之如果log2值低于约0，则认为其下降。在其它实施方案中，如果log2值高于约0.1、0.2、0.3、0.4或0.5，则认为脂肪酸的相对表达水平升高，反之如果log2值低于约-0.1、-0.2、-0.3、-0.4或-0.5，则认为脂肪酸的相对表达水平下降。

在本发明的备选实施方案中，通过测定例如具有相同不饱和程度的种类中较长的酰基链长度对较短的酰基链长度或组合的酰基链长度的比率来给磷脂组成的变化进行评分，其中朝向较长(或在一些情况下，较短)的酰基链长度的转变表示更具侵袭性的延长表型。此外，还可通过测定样品中单不饱和磷脂对多不饱和磷脂的比率来给磷脂组成的变化评分，其中肿瘤样品相比于正常样品的单不饱和对多不饱和磷脂的比率的增加表示肿瘤的更具侵袭性的脂质生成表型。

在其它实施方案中，根据本发明的单不饱和磷脂为单不饱和磷脂酰胆碱(PC)，选自：PC30:1、PC32:1、PC34:1、PC36:1和PC38:1，优选PC34:1。

在其它实施方案中，多不饱和磷脂为多不饱和磷脂酰胆碱(PC),选自：PC32:3、PC34:2、PC34:3、PC34:4、PC36:2、PC36:3、PC36:4、PC36:5、PC36:6、PC38:2、PC38:3、PC38:4、PC38:5、PC38:6、PC38:7、PC40:2、PC40:3、PC40:4、PC40:5、PC40:6、PC40:7、PC40:8、PC42:2、PC42:3、PC42：4、PC42:5、PC42:6、PC42:7、PC42:8、PC42:9、PC42:10、PC42:11、PC44:2、PC44:3、PC44:4、PC44:5、PC44:6、PC44:7、PC44:8、PC44:9、PC44:10、PC44:11和PC44:12;优选PC36:3、PC38:3、PC36:4、PC38:4、PC40:4、PC36:5、PC38:5、PC40:5；最优选PC36:4和/或PC38:4。

在优选实施方案中，单不饱和磷脂为单不饱和磷脂酰胆碱(PC)PC34:1，而多不饱和磷脂为多不饱和磷脂酰胆碱(PC)PC36:4和/或PC38:4。

在本发明的具体实施方案中，较短链的磷脂种类为，所有可测量的、具有相同头基和相同数目的不饱和键但具有比平均(组合的)酰基链长度短的酰基链长度的磷脂种类。在本发明的更具体实施方案中，较短链的磷脂种类选自PC30:0、PC32:1、PC34:1、PC32:2、PC34:2、PC34:3、PC36:4、PC36:5、PC38:6;PE32:1、PE34:1、PE34:2、PE36:3、PE36:4、PE36:5、PE38:6、PE38:7、PE40:8、PS34:1、PS36:1、PS34:2、PS36:3、PS36:4、PS38:4、PS38:5、PS38:6、PS40:7;PI32:0、PI34:0、PI30:1、PI34:2、PI36:3、PI36:4、PI38:5和PI38:6；更特别地PC34:1、PC34:2、PE34:1、PE34:2、PE36:4、PS34:1、PS36:1、PS34:2、PS36:4、PS38:4、PI32:0、PI34:0和PI36:4。

在其它实施方案中，除了测定磷脂的表达外，还可测定侵袭性脂质生成表型的其他生物标志物的相对表达水平，例如但不限于FASN(脂肪酸合酶)、ACCA(乙酰CoA羧化酶α)及ACLY(ATP柠檬酸裂合酶)的表达或磷酸化/活化。具有侵袭性脂质生成表型的肿瘤可例如通过单不饱和磷脂的相对表达水平的升高、多不饱和磷脂的相对表达水平的降低，以及侵袭性脂质生成表型的一个或多个其他生物标志物的表达的增加来鉴定。或者，具有侵袭性脂质生成表型的肿瘤可例如通过肿瘤样品相较于正常样品的单不饱和对多不饱和磷脂的比率的升高，以及侵袭性脂质生成表型的一个或多个其他生物标志物的表达的增加来鉴定。

本发明还涉及，根据本发明的体外方法用于诊断和/或预测受试者的肿瘤的进展的用途。

下文实施例中提供的数据表明，延长表型牵涉肿瘤的发展、侵袭性和攻击性，并且所述延长表型的抑制剂在癌症(特别是其中牵涉延长的那些癌症类型)的治疗中是有益的。本发明因而还提供了脂肪酰基链长度延长的抑制剂用于治疗癌症的用途。

最后，本发明提供了用于进行根据本发明的体外方法的试剂盒，所述试剂盒包含用于磷脂(其用于脂质分析)的样品制备的试剂，尤其是用于体液分级分离、组织匀浆、脂质提取的工具、抗氧化剂、溶剂和/或标准(物)。

在具体的实施方案中，所述试剂盒包括微流体芯片，以及可将微囊泡固定于涂覆有分子或试剂的表面的涂覆表面，所述分子或试剂具有对于所述微囊泡的亲和力或能够结合微囊泡颗粒。

适用于涂覆选择的表面材料的、对微囊泡具有亲和力的任何分子皆可被使用。对微囊泡具有亲和力的分子是指，该分子能够共价或非共价地结合存在于微囊泡上的分子。优选地，所述存在于微囊泡上的分子为膜结合分子。优选，使用对微囊泡具有亲和力的分子。优选，亲和力以解离常数来表示。优选，使用对微囊泡的解离常数低于0.1nM，更优选低于10nM的分子。更优选，使用对微囊泡的解离常数低于10^-15M的分子。在另一个优选实施方案中，使用解离常数介于0.1-10nM之间的对于微囊泡的亲和力。测定亲和力的方法在本领域是已知的。优选，使用如Johnson等人.Journal of Molecular Biology368(2):434-449中所描述的方法。

任何适合于使用对微囊泡具有亲和力的涂层进行固定的表面都可被使用。优选的表面由材料(包括玻璃、云母、塑料、金属或陶瓷材料)制成。用于涂覆对(糖)-蛋白、细胞膜或一般生物分子具亲和力的表面的各种方法是已知的。一般来说，这类方法使用共价或非共价地结合特定生物分子的反应性基团。例如，涂覆氨丙基甲硅烷的载片可用于蛋白质的非共价吸附。涂覆环氧基硅烷的载片在pH值为5-9时能与赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸和羟基发生反应。涂覆醛的载片在pH7-10驱动Schiff碱反应的情况下，能够与赖氨酸及精氨酸发生反应。本领域技术人员知晓，如何选择适合于与所选择的表面材料组合使用的正确涂层和测试对微囊泡的亲和力。

通过向包含微囊泡的流体施加层流，将所产生的涂覆表面与所述微囊泡接触。所述流体可以是能与微囊泡相容的任何流体。相容意指，微囊泡的完整性保持无损，也就是说，至少用于本发明方法中的磷脂存在于微囊泡内。优选，所述流体包括血浆、细胞培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、磷酸盐缓冲的钾、或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)。

层流是一种流动状态，其特征在于高动量扩散，低动量对流，压力和速度与时间无关。所述层流的特征在于，其雷诺数低于2000且高于0。优选，层流的雷诺数介于0至1000，更优选介于0至500，最优选介于0至100。本领域技术人员知晓如何实现层流。任何能够将流体以层流形式施加至所述涂覆表面的方法皆能被采用。优选的层流是在一个方向上呈线性的层流。优选的层流是能针对流体装置的功能优化接触面积、接触时间和流动速度的层流。更优选的层流是通过包含功能化壁的通道的层流。

优选，使用其中对于微囊泡的亲和力是特异性的方法。特异性亲和力的有利方面在于，减少不需要的分子或微粒的结合。优选方法是，其中将亲和接头共价或非共价地连接至表面的方法。亲和接头是能够共价或非共价地结合至结合伴侣(从而产生所述亲和接头与所述结合伴侣的复合物)的分子。所述结合伴侣可以是能够结合至微囊泡的分子或其可以是存在于微囊泡上且能够直接与所述亲和接头相互作用的分子。有关亲和接头及其结合伴侣的实例是：链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和生物素；抗体和抗原；配体和受体、凝集素和糖类、蛋白A和/或蛋白G-免疫球蛋白恒定区，以及标签肽序列和标签抗体。术语亲和接头和结合伴侣是指它们的功能。因此，取决如何使用上述亲和接头-结合伴侣组合，所述术语可互换使用。例如，如果生物素结合至表面的话，它便是亲和接头，或者当其结合至微囊泡时，它便是结合伴侣。将亲和接头结合至表面的任何方法都可被采用。将亲和接头结合至涂覆表面的方法将视表面材料和亲和接头的性质而有所不同。本领域技术人员能够选择适合于所选的表面材料和亲和接头的类型的正确方法。将亲和接头结合至表面的方法已为本领域技术人员熟知。将抗体结合至金属或硅表面的方法在本领域是公知的。优选的方法描述于Bioelectrochemistry Volume 66,Issues 1-2,April 2005,Pages111-115。将抗体结合至玻璃表面的方法也是已知的，并且描述于JColloid Interface Sci.2002 Aug 1;252(1):50-6中。在具体的实施方案中，亲和接头选自抗体种类、蛋白质、适体、选择性限制微囊泡通过的表面，以及选择性粘附至微囊泡的表面；其中蛋白质特别地选自凝集素或其他糖结合化合物；而其中凝集素特别地选自GNA、NPA、伴刀豆蛋白A或蓝藻抗病毒蛋白。

在更具体的实施方案中，所述层流采用微流体学技术来施加。术语微流体学技术是指，用于操纵流体流动(其特征长度尺度在达到1毫米的测微计范围内)的设备、***和方法(关于更完整的综述，参见：Manz,A.和Becker.H.(Eds.),Microsystem Technology inChemistry and Life Sciences,Springer-Verlag Berlin HeidelbergNew York,ISBN 3-540-65555-7)。有利方面在于，微流体***具备比常规宏观***更快速执行操作的能力，而且消耗少得多的化学品和流体。

在本发明的具体实施方案中，所述层流通过使用微流体芯片来产生。优选地，所述微流体芯片包含至少一个具有入口和出口的微流体通道，其中所述至少一个微流体通道在所述微流体芯片表面上具有至少一个间隙，以使得所述至少一个通道能够与表面接触。所述微流体芯片的有利方面在于，它使得所述微流体通道内的流体能够与表面直接接触。优选，所述入口和/或出口被置于所述微流体芯片的表面，该表面不同于包含所述微流体通道间隙的表面。其有利方面是，这将允许所述微流体芯片与所述表面之间的夹紧，同时保持所述入口和/或出口的通路。在优选实施方案中，在所述微流体芯片中提供了小孔，以便能用螺钉或其他方式将表面附着至微流体芯片。其有利方面是，可将表面附着至微流体芯片以实现接触，这防止流体从所述微流体通道中泄漏。使用微流体通道的有利方面是，通道的几何形状允许可控地诱导层流。优选，所述通道具有小于1mm的高度。其有利方面是，所述涂覆表面上方的所述流体的表面体积比得到优化。在另一优选实施方案中，涂覆区上的通道高度小于微流体装置其他部位的通道高度。其有利方面是，所述涂覆区上方的所述流体的表面体积比得到优化，同时维持流通。更优选，所述通道高度低于0.5毫米。其有利方面是，这个高度对拥有血浆粘度的流体是最佳的。优选，所述通道具有小于1毫米的宽度。其有利方面是，这导致接触所述流体的所述涂覆表面拥有最小的接触面积。优选地，所述的最小接触面积小于所述涂覆表面的面积。

优选，所述最小接触面积介于100和10000平方微米间。在优选实施方案中，所述最小接触面积小于1平方毫米。其有利方面是，这限制了表面区域的检查时间，且增加了每表面面积所收集的囊泡的浓度。更优选，所述最小接触面积介于1平方微米和0.1平方毫米间。

如本领域领域人员所知道的，上述通道还可包含过滤器，它允许小于微囊泡的颗粒通过。在该方法中，微囊泡将收集在所述过滤器的表面上，随后改变流动方向，以重悬浮所述微囊泡。此方法还可包括，将所述微囊泡重悬浮于流体中，然后使包含所述微囊泡的所述流体接触所述涂覆表面的步骤。因此，在更进一步的实施方案中，本文所使用的微流体芯片还可包含泵送***。任何适合于将流体泵送至微流体回路内的***都可以被采用。实例描述于PHYSICS AND APPLICATIONSOF MICROFLUIDICS IN BIOLOGY David J.Beebe,Glennys A.Mensing,Glenn M.Walker Annual Review of Biomedical Engineering,2002年8月,第4卷,第261-286页中。

当在本发明的方法中使用微流体芯片时，微囊泡可使用成像技术来检测。其有利方面是，它能测量一个或多个参数，包括但不限于颗粒几何形状、形状、粗糙度、光散射或微囊泡的尺寸，或可确定分子是否存在于微囊泡表面或内部。该方法可以使用任何成像方法。优选的成像方法包括，荧光显微镜检查，包括内反射荧光显微镜检查，电子显微镜检查(EM)，共聚焦显微镜检查，光散射或表面等离子显微镜检查，拉曼光谱法，椭偏测量术/反射计测量术，红外光谱法或原子力显微镜检查(AFM)或其组合。

通过参考随后的实验细节可更好地理解本发明，但本领域技术人员易于理解，这些都只是举例说明本发明，并且本发明在此后的权利要求中更全面地描述。此外，在整个本申请中，引用了多个出版物。这些出版物的公开内容通过引用并入本申请，以更全面地描述本发明所属领域的现有技术水平。

实施例

下面的实施例举例说明了本发明。本领域技术人员基于这些实施例，可以想到其他实施方案。

实施例1:利用PC、PE、PS和PI谱在***肿瘤患者的扩展组中进行磷脂谱分析

方法

组织采集

***肿瘤组织和匹配的正常样品获自因局部***癌而曾接受根治性耻骨后***切除术的患者。使用6或8mm直径冲孔活检仪器取出***组织样本。将样品速冻于液氮中，并保存在-80℃，用于脂肪、蛋白质和RNA提取。对包埋在Tissue-Tek OCT(Miles Inc,Westhaven,CT.)中的组织的邻近区域进行组织学分析，以鉴定出正常组织和肿瘤组织。处理连续切片，以进行苏木精和伊红染色。对癌症样品进行Gleason评分，并评估它们所含有的癌症的百分比。

DNA浓度的测定

DNA浓度的测定用于标准化添加至用于脂质分析的样品的标准和运行溶液的量。样品在均质缓冲液(pH7.4的5x10-2M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液；2M NaCl及2x 10-3M EDTA)中进行超声处理及稀释。鲱鱼的***DNA(Promega,Madison,WI；0-5μg DNA/125μl)用于在均质缓冲液中形成不同的稀释度，以产生标准曲线。随后，将样品在37℃温育1小时以促进裂解。随后，添加2μg/ml的Hoechst33258试剂(Calbiochem,La Jolla,CA)。

使用荧光计(Fluostar SLT,BMG Labtech,Offenburg,Germany)测量样品DNA和鲱鱼***DNA的含量。激发：355ηm；发射：460ηm。根据标准曲线的数据计算出每个样品的DNA含量。

脂质提取

用Dounce匀浆器在800μl PBS中匀浆约40mg的组织，以制备样品的脂质提取物。留出100μL的等分以进行DNA分析。剩余700μl被转移至具有聚四氟乙烯衬垫的玻璃管中，然后加入900μl 1NHCl:CH₃OH 1:8(v/v)、800μl CHCl₃及500μg的抗氧化剂2,6-二-叔-丁基-4-甲基苯酚(BHT)(Sigma,St.Louis,MO)。根据原始样品的DNA量加入适当的脂质标准(每mg DNA：150ηmol PC26:0；50ηmolPC28:0；150ηmol PC 40:0；75ηmol PE 28:0；8.61ηmol PI 25:0及3ηmol PS 28:0)。在旋转摇床上混合5分钟和进行相分离(在4℃以17300g高速离心5分钟)后，使用Pasteur玻璃移液器采集较低的有机级分，并使用Savant Speedvac spd111v(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)进行蒸发。将其余的脂质沉淀于-20℃下储存。

质谱分析

对于质谱分析(MS)，取决于原始组织样品的DNA量(1μL运行溶液/1μg DNA)，在运行溶液(CH₃OH:CHCl₃:NH₄OH;90:10:1.25,v/v/v)中重建脂质沉淀。在配有用于自动化样品注射的Advion TriVersarobotic nanosource(Advion Biosciences,Ithaca,NY)的混合四极杆线性离子阱质谱仪(4000QTRAP system;Applied Biosystems,Foster City,CA)上通过电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)来分析PL种类。测量前，在运行溶液中稀释样品。以1/30的稀释度进行磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷酯酰肌醇(PI)种类以及磷脂酰乙醇胺(PE)种类的测量。

对于PC、PE、PS和PI种类，分别以下述碰撞能、以正离子和负离子扫描模式记录PL谱：对于先驱离子(prec.)184，为50eV；对于中性丢失(nl.)141，为35eV；对于nl.87，为-40eV；以及对于prec.241，为-55eV。为了进行个别种类的定量，以MRM模式运行***。通常情况下，对于每个谱，使用3分钟的信号平均。就碳同位素效应修正数据，并将数据表示为相同PL家族的总的可测量PL种类的百分数。仅将占据超过相同家族的测量的磷脂的总量的0.1%的PL种类示于图中。

聚类分析

使用Cluster3.0软件的平均连锁聚类算法进行聚类分析[Eisen,M.B.,P.T.Spellman,P.O.Brown和D.Botstein,Cluster analysisand display of genome-wide expression patterns.Proc Natl AcadSci USA,1998.95(25):p.14863-8.]。使用Java TreeView 1.1.5软件可视化聚类结果[Saldanha,A.J.,Java Treeview--extensiblevisualization of microarray data.Bioinformatics,2004.20(17):p.3246-8.]。

结果

肿瘤样品的表征

为了研究癌组织相对于正常组织以及个体患者的肿瘤组织之间的PL谱的变化，从14个因局部***癌而曾接受根治性耻骨后***切除术的***癌患者获取约40mg的***肿瘤组织和邻近正常***组织。通过组织学检查验证，所有的肿瘤组织样品包含至少80％的肿瘤组织。所有肿瘤具有3+3或3+4的Gleason分级(表1)。

表1.每一个肿瘤样品的癌组织的百分数和Gleason分级。

患者 ID 肿瘤百分数 Gleason分级

患者 1 100 3+4

患者 2 95 3+4

患者 3 100 3+3

患者 4 90 3+3

患者 5 95 3+3

患者 6 95 3+3

患者 7 95 3+4

患者 8 80 3+3

患者 9 90 3+3

患者 10 85 3+3

患者 11 80 3+3

患者 12 85 3+3

患者 13 85 3+4

患者 14 80 3+3

磷脂谱分析法的优化

为了查看完整的PL种类，我们使用由Prof.R.Derua及Prof.E.Waelkens(Department of Molecular Cell Biology,K.U.leuven)合作内部开发的基于质谱的方法。该方法基于Brügger等人[Brugger,B.,G.Erben,R.Sandhoff,F.T.Wieland和W.D.Lehmann,Quantitative analysis of biological membrane lipids at the lowpicomole level by nano-electrospray ionization tandem massspectrometry.Proc Natl Acad Sci USA,1997.94(6):p.2339-44.]及Milne等人[Milne,S.,P.Ivanova,J.Forrester,和H.AlexBrown,Lipidomics:an analysis of cellular lipids by ESI-MS.Methods,2006.39(2):p.92-103.]所描述的方案，并且经改造以适合在配有Triversa robotic纳米流/离子源装置(用于自动化样品注射)的ABI 4000 QTRAP质谱仪上使用。

由于该方案是针对培养的细胞的PL分析而开发的，因此我们对其进行改造以适用于临床样品。简言之，匀浆法通过改变起始材料的量和通过改进Dounce匀浆过程(冲程数)来进行优化。MS法通过改变脂质提取物的稀释度来进行优化。

***癌组织和匹配的正常组织的磷脂谱分析

为了以鸟枪法直接从总脂质提取物检测个别类别的磷脂，以串联质谱(MS/MS)分析进行不同的先驱离子和中性丢失扫描。该方法使得能够聚焦在特定类别的脂质上、减少光谱的复杂性，并消除基线噪声。

分析四个主要的PL类别：PC、PE、PS及PI。在先驱离子扫描(m/z184，对应于MS/MS模式中片段化后的磷酸胆碱头基峰值)中以正离子模式检测PC种类。在正离子模式下通过碰撞诱导的分解来检测PE种类，产生对应于磷酸乙醇胺的nl.的离子。分别就nl.87和prec.241以负离子模式扫描测量PS和PI。

在同位素修正后，以多反应监测(MRM)模式进行种类的定量，关注于最丰富的PL种类。这些种类列于表2中。

为了进行酰基链长度的变化与不饱和度的最佳鉴定，脂质种类的量不以绝对值来表示，而是表示为一个磷脂类别(例如PC)中所有可测量的种类的百分数。为了避免因电离效率差异而产生的误差，将百分数的差异表示为癌组织的数值相较于匹配的正常组织的数值的比率。使用log2标度来平衡两个方向(增加和减少)上的差异。为了避免因背景噪声而产生的误差，不考虑占据一个PL家族的所有种类的总强度的0.1%以下的种类。

图1的灰色调热图显示了例如，取自14个***癌患者的***肿瘤相对于正常***组织的PL种类的相对变化。在14个患者的13个中，在PL谱中观察到明显的差异。有趣的是，在不同患者间观察到不同的变化模式。某些变化(诸如PS40:8的增加)在所有患者中被观察到。大多数其他变化只限于特定患者亚组(诸如PE38:0的增加)。为了更好地显示出不同患者间的PL谱的差异和相似性，进行聚类分析。这揭示出重复性变化并且将患者分为2个大组，所述大组可进一步分成亚组。

其平均倍数增加/减少示于图2A的聚簇A(患者3、4、5、6、7、9、10、11及13)的特征在于，完全饱和的PL种类明显减少，(在两个酰基链中总共)具有一个或两个不饱和键的种类有所增加，以及具有超过3个不饱和键的PL种类有所减少。该模式在PC级分中表现得最明显，并且被称为“脂质生成谱”，因为它在很大程度上可通过脂质生成的切换来进行解释(Brusselmans,K.和Swinnen,J.V.(2009))。除了该脂质生成表型外，延长表型对于聚簇A也是明显的，并且在磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸磷脂种类中特别明显。对于磷脂酰肌醇，对于具有2、3或4个不饱和键的脂质种类可观察到朝向较长的酰基链的明显转变，并且对于磷脂酰丝氨酸，对于具有4、5和6个不饱和键的脂质种类观察到所述转变。

基于这些观察，可将聚簇A进一步分成3个亚组(如图1中所显示的):

o聚簇A1(患者9、10、11和13)包含其中脂质生成谱最明显并且在所有PL家族中清楚可见的肿瘤。在PE级分中，还观察到朝向较短的酰基链的额外转变。PS和PI级分显示朝向较长的酰基链的总体转变。

o聚簇A2(患者3、4、5和6)在PC种类上显示了与聚簇A1的高度相似性，但改变较不明显。其它PL家族中的更不饱和的种类也显示更有限的减少，并且甚至在PE和PS级分中显示增加。

o聚簇A3(患者7)在PC种类上显示脂质生成谱，但在其它PL家族中显示较不明显的改变。

聚簇B(患者1、2、8和14)包含不具有明显的脂质生成谱、但具有清楚可辨的延长表型(图2B)的肿瘤，并且可进一步分成2个亚组：

o聚簇B1(患者2、8和14)显示在很大程度上与聚簇A相反的、与脂质生成表型相关的PL变化模式。然而，所有患者都在至少一种磷脂类别上显示酰基链长度的增加(图1)。对于患者2和14，磷脂酰肌醇的延长表型最明显，而对于患者8，磷脂酰丝氨酸的延长表型最明显。

o聚簇B2(患者1)在下述方面是显著的：其在所有PL类别中显示酰基链延长的增加。

患者12在肿瘤与正常组织之间几乎未显示PL谱的变化，不能被分类在聚簇A或B中。

实施例2:其它***肿瘤患者的延长表型的进一步分析

为了进一步分析观察到的延长表型，从21个因局部***癌而曾接受根治性耻骨后***切除术的***癌患者采集***肿瘤组织和匹配的正常组织。所有肿瘤样品经组织学检查验证，包含至少75%的***腺癌。

表2.每一个肿瘤样品的癌组织的百分数和Gleason分级。

从癌组织和匹配的正常组织提取脂质，并使用鸟枪脂质组学方法(shotgun lipidomics approach)，通过电喷雾串联质谱分析所述脂质。使用的提取和分析法的详细信息可见于实施例1中。以MRM模式定量4个主要类别(PC、PE、PS和PI)的完整磷脂种类。正常组织的谱都是相似的，虽然个别种类的相对分布在样品间可发生变化。为了使因这些个体间差异而引起的混杂效应降至最低，将每一个癌组织的脂质谱与其匹配的正常组织相比较。观察到癌组织相对于正常组织的磷脂谱的显著变化。为了更好地可视化和解释这些变化，我们将单个种类的差异表示为，癌组织相对于匹配的正常组织的总的测量的脂质种类的摩尔百分数的比率。该比较显示了癌组织相对于正常组织以及个体肿瘤间的共同及独特变化的程度。

重复性变化(Recurrent change)包括导致热图的棋盘格样外观(checkered board-like appearance)的酰基链长度的改变。为了更好地展现此类变化，我们在图3中表达了肿瘤组织和匹配的正常组织中每一个磷脂种类相对于各个(不)饱和的亚类的最短磷脂种类的相对丰度，以最佳地显示酰基链长度的变化。这将患者分为聚簇D和E并且显示了酰基链延长的变化的复杂重复性模式。最显著的是，多不饱和PS(组合的两个酰基链中4至7个不饱和键)中朝向较长的酰基链的转变(PS42:4和PS40:4相对于PS38:4,分别地p<0.01和0.05；PS42:5相对于PS38:5,p<0.01,PS44:6和PS42:6相对于PS38:6,p<0.01;PS44:7相对于PS40:7,p<0.01)(图4)。在21个患者的17个中发现了该转变。在具有1至3个不饱和键的PS中观察到酰基链长度的更可变的变化。这些变化将聚簇D分成2个亚聚簇，聚簇D'和D''。在聚簇D'中，观察到具有1至3个不饱和键的PS种类的链长度的另外的相对增加(PS40:3相对PS38:3,p<0.05;PS42:2,PS40:2,PS38:2和PS36:2相对PS34:2,p<0.05;PS40:1,PS38:1和PS36:1相对PS34:1,p<0.05)(图5a)。此类变化不存在于D''中(图5b)。聚簇E未显示明显的酰基链长度的变化模式。还在PI种类中发现了酰基链长度的增加(PI38:2和PI36:2相对PI34:2,p<0,01;PI40:4相对PI36:4,p<0.0001;PI40:5相对PI38:5,p<0.0001;PI40:6相对PI38:6,p<0.0001)(图6)。在一个患者亚组中(主要在聚簇D''中)，在肿瘤中还存在朝向具有1至4个不饱和键的PC和PE种类的减小的链长度的倾向(图7)。在患者P.8880中发现最显著的链延长表型，所述患者在所有头基类别中显示几乎普遍存在的酰基链长度的增加(图8)。

实施例3:利用PC、PE、PS和PI谱在透明细胞肾细胞癌患者的扩展组中进行磷脂谱分析

材料和方法

组织采集。透明细胞肾肿瘤组织(n=20)和匹配的正常皮质(n=20)样品获自因透明细胞肾细胞癌(ccRCC)而曾接受开放根治性肾切除术的患者。将样品于液氮中快速冷冻，于-80℃下贮存以用于脂质和蛋白质提取。通过组织样品的新鲜冷冻组织切片的HE染色确认了正常组织和肿瘤组织。

用于脂质提取和磷脂分析的方法的详细描述可见于实施例1中。图中仅显示其强度大于5倍空白对照的强度的磷脂种类。

结果

ccRCC样品相对于匹配的正常组织的磷脂分析显示了磷脂谱的显著差异，特别是在酰基链长度方面。酰基链的显著延长，特别地非常长链的多不饱和脂肪酰基链的显著延长存在于几乎所有ccRCC样品中。该延长表型在磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)头基类别中最显著(图9)。

这些数据表明，肾样品的磷脂组学分析具有基于酰基链长度的变化来检测透明细胞肾细胞癌的存在的潜力。

实施例4:来自尿的外来体级分的磷脂组学分析用于肾癌的非侵入性检测/诊断的评估

目前可获得的癌症诊断工具的共同不利方面是，需要获得肿瘤样品。因此，本实施例的目的是，确定是否可通过侵入性较小的方法，通过测定获自尿液或血液血清样品的外来体的磷脂谱来诊断癌症和评估肿瘤的进展。

方法

在进行肿瘤手术切除之前和之后，从肾癌患者采集尿液和血液血清样品。通过差速超速离心来制备外来体级分。通过透射电子显微镜以及利用抗flotillin和转铁蛋白受体的抗体的western印迹分析(deGassartet al.,2003)来监测外来体的存在和纯度。在添加适当的脂质标准和抗氧化剂后，使用内部改进的Bligh-Dyer方案从外来体和原发肿瘤组织提取脂质。在配备有基于Advion TriVersa NanoMate喷嘴芯片的输注***(用于从96孔板自动注射样品)的混合三重四极杆线性离子阱(hybrid triple quadrupole linear ion trap)(4000QTRAP)***上利用电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)分析脂质种类。使用内部开发的用于检测和定量所有主要磷脂种类的方案，以MRM模式分析样品。

结果

来自手术切除前(存在肿瘤)和手术切除后(不存在肿瘤)的肾癌患者的尿液的外来体的磷脂分析显示，相比于手术后(不存在肿瘤)的尿液，来自手术前(存在肿瘤)的尿液的外来体的磷脂谱具有显著变化，包括朝向较长的酰基链种类的显著转变。这些变化在很大程度上与原发性肿瘤的变化相关，并且表明，可仅基于来自尿液外来体的磷脂谱在尿样中检测肿瘤的存在(图10)。外来体是被细胞释放入体液包括尿液的基于膜的微囊泡(Al-Nedawiet al.,2009)。许多报导指出，癌细胞特别活跃地产生大量外来体(Al-Nedawiet al.,2009;AethlonMedical,2010)。与之一致地，癌症患者的外来体水平通常高达健康对照的10倍。此外，由于癌症通常是多病灶性的，因此基于一个活检组织的数据可能不能反映整个肿瘤的状况，从而不能精确地预测疾病的结果。相反地，循环外来体反映整个肿瘤的情况，其是易于获得的并且是顺从度好的、侵入性较小的生物标志物分析。此处，我们证明，尿液样品的外来体级分的磷脂组学具有检测/诊断肾癌的存在的潜力。这些数据提供了用于肾癌检测/诊断(基于来自尿样的外来体级分的磷脂谱的变化)的非侵入性筛查试验的原理验证。

实施例5:用于评估治疗反应的磷脂组学分析的评估

方法

用0.1微摩尔伊马替尼处理GIST T1细胞。72小时后，在添加适当的脂质标准和抗氧化剂后，使用内部改进的Bligh-Dyer方案提取脂质。在配备有基于Advion TriVersa NanoMate喷嘴芯片的输注***(用于从96孔板自动注射样品)的混合三重四极杆线性离子阱(4000QTRAP)***上利用电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)分析脂质种类。使用内部开发的、用于检测和定量所有主要磷脂种类的方案以MRM模式分析样品。

结果

在伊马替尼处理后，伊马替尼-反应性GIST T1细胞的磷脂分析显示磷脂谱的显著变化。特征性变化包括，酰基链的适度延长，这导致每一个亚类的具有相同数目的不饱和键的种类内磷脂种类从最短链朝向较长链转变，通常还伴随最长种类的相对减少，特别是在PC、PS和一些PI种类中(参见图11)。这些数据表明，对伊马替尼的反应性伴随有磷脂谱的重大变化。它们还提供了下述的原理验证：磷脂谱分析可用于追踪肿瘤的治疗反应性。

实施例6:脂肪酰基链延长的抑制减弱癌细胞的增殖

材料和方法

细胞培养

将肾癌细胞系RCC4VHL(Von Hippel Lindau)(阳性和阴性)培养于补充有10%胎牛血清、1%PSG和0.5mg/ml G418的高级DMEM中。将细胞培养于37℃、5%CO₂的加湿培养箱中。在接种后的第二天，用100nm soraphen或媒介物(对照)处理细胞72小时。

结果

为了评估脂肪酰基链延长和该过程的化学抑制剂的影响，用soraphen处理人肾细胞癌细胞系RCC4。为了证明soraphen在该模型中选择性抑制酰基链延长，从soraphen和媒介物处理的细胞提取脂质，并利用串联质谱分析所述脂质。当用soraphen处理细胞时，脂质谱显示从较长至较短的脂质种类的显著转变，这表明酰基链延长的抑制(图12)。此外，这些数据显示，酰基链延长和所得的磷脂的酰基链长度的增加刺激肿瘤生长，促进肿瘤的进展。这些数据还表明，延长过程的抑制剂可用于减缓肿瘤生长并且可具有用于抗肿瘤治疗的潜力。

实施例7:脂肪酰基链延长的抑制减小癌细胞的侵袭性

材料和方法

细胞培养

将人乳腺腺癌细胞MDA-MB-231(获自美国典型培养物保藏中心)培养在补充有10%胎牛血清的DMEM-F12中，并且培养在37℃，5%CO₂的加湿培养箱中。接种后第2天，用100nm soraphen或媒介物(对照)处理细胞72小时。

利用共聚焦显微镜评估明胶分解活性

用soraphen或媒介物处理MDA-MB-231细胞72小时。使经处理的细胞接受胰蛋白酶处理，并将其在8孔Lab-Tek^TM II Chamber Slide^TM中接种在含有25μg/ml

的

基质(Invitrogen)的顶部。计数细胞，以每孔10,000个细胞的密度接种细胞。24小时后，将细胞在3.7%的于磷酸缓冲盐溶液中的甲醛中固定10分钟。利用Olympus Fluoview FV1000仪进行共聚焦显微镜检查。在488nm处激发样品，在515nm处记录发射光。使用ImageJ软件1.45e版(National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)，将荧光强度定量为平均灰度值(mean gray value)。

结果

脂肪酸延长的抑制减小癌细胞的侵袭性

从soraphen和媒介物处理的细胞提取脂质，利用串联质谱分析所述脂质。当用soraphen处理细胞时，脂质谱显示从较长至较短的脂质种类的显著转变(图13)。

参考文献

Al-Nedawi K．，Meehan G．，Rak J．，Microvesicles：messengersand mediators of tumor progression，2009Cell CycleJul 1;8(13)2014—2018

Brugger，B．，G．Erben，R．Sandhoff，F．T．Wieland，and W．D．Lehmann，Quantitative analysis of biological membranelipids at the low picomole level by nano-electrosprayionization tandem mass spectrometry．Proc Natl AcadSci USA，1997．94(6)：p．2339-44

Brusselmans，K．，and Swinnen，J．V．(2009)The lipogenicswitch in Cancer．Mitochondria and Cancer KK Singh andL．C．Costello，Eds，Springer，New York，USA pp．39-59

Crowe，F．，Allen，N．，Appleby，P．，et al．(2008)Fattyacid composition of plasma phospholipids and risk ofprostate cancer in a case-control analysis nestedwithin the European Prospective Investigation intoCancer and Nutrition．Am．J．Clin．Nutrition88：1353-1363

de Gassart A．，Geminart C．，Fevrier B．，Raposo G．，VidalM．，Lipid raft associated protein sorting in exosomes，Blood，2003 Dec 15;102(13)4336-44

Eisen，M．B．，P．T．Spellman，P．O．Brown，and D.Botstein，Cluster analysis and display of genome-wide expressionpatterns．Proc Natl Acad Sci U S A，1998．95(25)：p．14863-8

Gennadi V.Glinsky，Anna B．Glinskii，Andrew J．Stephenson，Robert M．Hoffman，William L．Gerald．Geneexpression profiling predicts clinical outcome ofprostate cancer．Journal Clinical investigation 113：913—923(2004)

Gering J．P．，Quaroni L．，Chumanov G．，Immobilization ofantibodies on glass surfaces through sugar residues．JColloid Interface Sci．2002Aug1;252(1)：50-6．

Godley，P．，Campbell，M．，Gallagher，P．，et al．(1996)．Biomarkers of Essential Fatty Acid Consumption andRisk of Prostatic Carcinoma．Cancer Epidemiology，Biomarkers ＆ Prevention5，889—895

Harvei S．，Bjerve K．S．，Tretli S．Jellum E．，Robsahm T．E．，Vatten L．，Prediagnostic level of fatty acids in serumphospholipids:omega-3 and omega-6 fatty acids and therisk of prostate cancer．Int．J．Cancer．1997(71)，545—551

Johnson R．J．，McCoy J．G．，Bingman C．A．，Philips G．N．，Raines R．T．，Inhibition of human pancreaticribonuclease by the human ribonuclease inhibitorprotein．2007 Journal of Molecular BiologY 368(2)：434—449

Kuemmerle NB，Rysman E，Lombardo PS，Flanagan AJ，Lipe BC，Wells WA，Pettus JR，Froehlich HM，Memoli VA，Morganelli PM，Swinnen JV，Timmerman LA，Chaychi L，Fricano CJ，Eisenberg BL，Coleman WB，Kinlaw WB．Lipoprotein lipase links dietary fat to solid tumorcell proliferation．Mol Cancer Ther．2011Mar;10(3)：427—36

Mannelli I．，Minunni M．，Tombelli S．，Wang R．，Spiriti M．，Mascini M．，Direct immobilisation of DNA probes forthe development of affinity biosensors．Bioelectrochemistry Volume 66，Issues 1-2，April 2005，Pages 111—115

S．，Pietinen P．，Virtanen M．J．，Salminen I．，Albanes D．，Giovannucci E．，Virtamo J．，Fatty acidsand risk of prostate cancer in a nested case—controlstudy in male smokers．Cancer Epidemology，Biomarkers& Prevention，2003(12)1422-1428

Manz，A．and Becker．H．(Eds．)，Microsystem Technology inChemistry and Life Sciences，Springer—Verlag BerlinHeidelberg New York，ISBN3—540—65555—7

Marguet D，Lenne pF，Rigneault H，He HT(2006)Dynamics inthe plasma membrane：how to combine fluidity andorder．EMBO J 25：3446—3457

Milne et al[Milne，S．，P．Ivanova，J．Forrester，and H．Alex Brown，Lipidomics:an analysis of cellular lipidsby ESI-MS．Methods，2006．39(2)：p．92—103．]

Saldanha，A．J．，Java Treeview--extensible visualization ofmicroarray data．Bioinformatics，2004．20(17)：p．3246—8

Swinnen，J．V．，Brusselmans，K．，and Verhoeven，G．(2006)．Increased lipogenesis in cancer cells:new players，novel targets．Curr Opin Clin Nutr Metab Care 9，358—365

Tamura K，Makino A，Hullin—Matsuda F，Kobayashi T，Furihata M，Chung S，Ashida S，Miki T，Fujioka T，Shuin T，Nakamura Y，Nakagawa H．Novel lipogenicenzyme ELOVL7is involved in prostate cancer growththrough saturated long-chain fatty acid metabolism．Cancer Res．2009Oct15;69(20)：8133—40．)

Valadi H，Ekstrom K，Bossios A，sjostrand M，Lee JJ，Lotvall JO．Exosome-mediated transfer of mRNAs andmicroRNAs is a novel mechanism of genetic exchangebetween cells．Nat Cell Biol2007;9：654—659

van’t Veer LJ，Dai H，van de Vijver MJ，He YD，Hart AA，Mao M，peterse HL，van der Kooy K，Marton MJ，Witteveen AT，Schreiber GJ，Kerkhoven RM，Roberts C，Linsley PS，Bernards R，Friend SH．Gene expressionprofiling predicts clinical outcome of breast cancerNature．2002Jan31;415(6871)：530-6．

Zhang Y，Liu D，Chen X，Li J，Li L，Bian Z，Sun F，Lu J，Yin Y，Cai X，Sun Q，Wang K，Ba Y，Wang Q，Wang D，Yang J，Liu P，Xu T，Yan Q，Zhang J，Zen K，Zhang CY．Secreted monocytic miR-150 enhances targetedendothelial cell migration．Mol Cell 2010;39：133-144

Claims

1.一种用于诊断和/或预测肿瘤在人受试者中的进展的体外方法，所述方法包括：测定肿瘤相对于正常样品的至少一个头基类别的完整磷脂种类的相对表达水平；并且其中在所述至少一个头基类别中具有相同饱和水平但不同酰基链长度的磷脂种类的相对表达水平的变化指示所述肿瘤的进展。

2.权利要求1的体外方法，其还包括测定至少一种单不饱和磷脂种类和至少一种多不饱和磷脂种类的表达水平；并且其中所述至少一种单不饱和磷脂种类的相对表达水平的升高和所述至少一种多不饱和磷脂种类的相对表达水平的降低表示更具侵袭性的脂质生成表型。

3.权利要求1至3中任一项的体外方法，其中在至少一个头基类别中与较短链的磷脂种类相比较，较长链的磷脂种类的相对增加表示更具侵袭性的延长表型。

4.权利要求1至3中任一项的体外方法，其中所述磷脂种类选自甘油磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、心磷脂和磷酸肌醇。

5.权利要求3的体外方法，其中至少一个头基类别中的磷脂种类选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；特别是磷脂酰丝氨酸。

6.权利要求2的体外方法，其中所述单不饱和磷脂种类为具有一个或两个单不饱和脂肪酰基链的磷脂酰胆碱(PC)，其选自：PC28:1、PC30:1、PC30:2、PC32:1、PC32:2、PC34:1、PC34:2、PC36:1、PC36:2、PC38:1、PC38:2、PC40:1和PC40:2，特别地PC34:1。

7.权利要求2或6的任一项的体外方法，其中所述多不饱和磷脂为多不饱和磷脂酰胆碱(PC)，其选自PC32:3、PC34:2、PC34:3、PC34:4、PC36:2、PC36:3、PC36:4、PC36:5、PC36:6、PC38:2、PC38:3、PC38:4、PC38:5、PC38:6、PC38:7、PC40:2、PC40:3、PC40:4、PC40:5、PC40:6、PC40:7、PC40:8、PC42:2、PC42:3、PC42:4、PC42:5、PC42:6、PC42:7、PC42:8、PC42:9、PC42:10、PC42:11、PC44:2、PC44:3、PC44:4、PC44:5、PC44:6、PC44:7、PC44:8、PC44:9、PC44:10、PC44:11和PC44:12,特别是PC36:3、PC38:3、PC36:4、PC38:4、PC40:4、PC36:5、PC38:5、PC40:5，更特别是PC36:4或PC38:4。

8.权利要求2、6或7的体外方法，其中所述单不饱和磷脂为单不饱和磷脂酰胆碱(PC)PC34:1；并且其中所述多不饱和磷脂为多不饱和磷脂酰胆碱(PC)PC36:4和/或PC38:4。

9.权利要求3或4的任一项的方法，其中所述较短链的磷脂种类为具有相同头基和相同数目的不饱和键、但具有比平均(组合的)酰基链长度短的酰基链长度的磷脂种类，例如选自PC30:0、PC32:1、PC34:1、PC32:2、PC34:2、PC34:3、PC36:4、PC36:5、PC38:6;PE32:1、PE34:1、PE34:2、PE36:3、PE36:4、PE36:5、PE38:6、PE38:7、PE40:8、PS34:1、PS36:1、PS34:2、PS36:3、PS36:4、PS38:4、PS38:5、PS38:6PS40:7;PI32:0、PI34:0、PI30:1、PI34:2、PI36:3、PI36:4、PI38:5和PI38:6。

10.权利要求3或4的任一项的方法，其中所述较短链的磷脂种类选自PC34:1、PC34:2、PE34:1、PE34:2、PE36:4、PS34:1、PS36:1、PS34:2、PS36:4、PS38:4、PI32:0、PI34:0和PI36:4。

11.权利要求1至10的任一项的方法，其还包括：测量肿瘤样品相对于正常样品的侵袭性脂质生成表型的一个或多个其它生物标志物的相对表达或磷酸化/活化；并且其中所述一个或多个其它生物标志物的相对表达的增加表示更具侵袭性的脂质生成表型。

12.权利要求11的方法，其中侵袭性脂质生成表型的一个或多个其它生物标志物选自FASN、ACCA和ACLY。

13.权利要求1至12的任一项的方法，其中磷脂的表达水平通过利用ESI-MS/MS分析磷脂来测定。

14.权利要求1至13的任一项所述的预后或预测性体外方法用于诊断和/或预测肿瘤在受试者中的进展的用途。

15.脂肪酰基链长度延长的抑制剂用于治疗癌症的用途。

16.权利要求1至13的任一项的方法，或权利要求14或15的任一项的用途，其中所述肿瘤或癌症选自***癌、肾癌例如CCRC、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肝癌、食道癌、膀胱癌、口腔癌、甲状腺癌、胰腺癌、视网膜和皮肤癌，优选***癌或肾癌。

17.用于进行权利要求1至13的任一项所述的体外方法的试剂盒，其包括：用于从待分析的样品分离的磷脂的基于ESI-MS/MS或其它MS的样品制备的试剂。

18.权利要求17的试剂盒，包括抗氧化剂、溶剂和标准。

19.权利要求17的试剂盒，其包括微流体芯片和用于将微囊泡/外来体固定至用分子或试剂涂覆的表面的涂覆表面，所述分子或试剂具有对于所述微囊泡/外来体的亲和力或能够结合微囊泡颗粒。

20.权利要求17的试剂盒，其中具有对于所述微囊泡的亲和力或能够结合微囊泡颗粒的分子或试剂是包括抗体种类、蛋白质、适体、选择性限制微囊泡通过的表面以及具有对微囊泡的选择性附着的表面的组中的一种或多种。

21.权利要求20的试剂盒，其中所述蛋白质选自凝集素或其它糖结合化合物。

22.权利要求21的试剂盒，其中所述凝集素选自GNA、NPA、伴刀豆球蛋白A或蓝藻抗病毒蛋白。

23.权利要求19至22的任一项的试剂盒，其中所述微流体芯片包括权利要求19-22中定义的涂覆表面。