CN108853026A - 一种兽用穿心莲内酯散 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种兽用穿心莲内酯散,所述穿心莲内酯散的原料包括:3wt%穿心莲内酯,0.9wt%亚硫酸氢钠,余量为淀粉辅料;将穿心莲内酯与亚硫酸氢钠进行反应,形成亚硫酸氢钠穿心莲内酯和穿心莲内酯的混合物,配以淀粉辅料,制得所述穿心莲内酯散。本发明产品具有抗菌、消炎的作用,对细菌性痢疾有特殊疗效,可以有效解决家畜肠道问题。
Description
技术领域
本发明涉及新兽药技术领域,尤其涉及一种用于治疗家畜肠道疾病的兽用复方穿心莲内酯散。
背景技术
仔猪由于自身消化能力和抗逆能力差,在断奶时极易引发断奶应激,造成食欲差、消化功能紊乱、腹泻、生长缓慢、饲料利用率低、精神状态以及外貌表现不佳等现象,给生产造成很大损失。营养作为首要的应激原,会对仔猪肠道健康产生不良的影响,主要表现为:腹泻率增加,肠道通透性增加;消化和吸收能力低下,肠绒毛受损,消化酶活性降低;免疫功能下降;肠道微生物菌群发生改变,有益菌菌群比例下降,有害菌菌群比例上升等。断奶仔猪由于断奶应激的出现,会使紧密连接蛋白的表达量下调,细胞间的Occludin蛋白重新分配;杯状细胞数量增多,黏液分泌量下降,更加有利于有害菌的黏附;黏膜免疫促炎性因子表达量上调,引发炎症反应,损害黏膜屏障;黏膜微生物区系也会随之改变。由于仔猪断奶时消化道承受着更大的压力,腹泻成为早期断奶综合征最主要的表现,也因此该类病症常常伴随着损害肠道健康,影响饲料利用率。
在生产中为缓解断奶应激,除了控制好环境条件外,主要通过营养途径和药物预防来实现。像抗生素、高锌、益生菌、低聚寡糖、酶制剂、抗菌肽、酸化剂、中草药饲料添加剂等,它们通过改善仔猪肠道pH值,激活内源酶,调动、激发和强化自身免疫***等方式,达到提高仔猪生长性能、有效降低仔猪腹泻的目的。
抗生素从上世纪开始被大量地用作治疗和预防细菌性疾病的药物,对控制畜禽传染性疾病和维护现代养殖业的健康发展作出了极其重要的贡献。抗生素一方面可以通过神经内分泌***促进动物的生长发育,另一方面还可以通过抑制或杀灭致病菌,减少机体有害感染,从而维护动物健康生长。另外有报道称,抗生素可以改变动物肠壁厚度,增加膜的通透性,更加有利于营养物质的吸收,从而促进机体生长发育。但长期使用抗生素会造成抗药性致病菌甚至超级细菌的出现,还会残留在畜产品和环境中,引起人体产生大量耐药菌株而失去对某些疾病的抵抗力。
高剂量氧化锌作为防治仔猪腹泻、促进仔猪生长的有效手段,在生产实践和研究中均表明,在断奶仔猪日粮中添加药理剂量的高锌对仔猪具有促生长效应。同时,高锌可以提高肠道消化酶活性,改善仔猪消化道的组织结构,调节肠道微生物区系,增加小肠抗菌肽的基因表达,降低组胺的释放和促进肠道损伤修复等作用,是预防控制仔猪腹泻、促进动物生长的普遍措施。但高剂量氧化锌通过家畜体内消化吸收后,经粪便***进入环境后,使土壤中锌积累而污染环境,严重危害着畜禽个体及生态环境的健康发展。
益生菌是指摄入动物体内参与肠道微生物平衡的具有直接通过增强动物对肠内有害微生物群落的抑制作用,或者通过增强非特异性免疫功能来预防疾病,而间接起到促进动物生产作用和提高饲料转化率的活性微生物培养物。益生菌的作用机理是形成优势有益菌群,与有害菌争夺附着点、营养及氧,竞争性地抑制有害菌群扩大,并且代谢产物含有机酸和溶菌酶等,使消化道pH值降低,不利于有害菌群生长,从而起到防病抗病的效果。但在病原菌占绝对优势时,益生菌不能达到抗生素类药物的使用效果。多数益生菌是以活菌体直接饲喂,在生产、运输、储存中易失活。菌群对宿主有选择性,对低水平日粮动物和初生动物明显,对高水平日粮动物效果一般。
低聚寡糖是指2~10个单糖通过糖苷键连接形成直链或支链的一类低分子糖,寡糖在自然界内广泛存在,能用于饲料的不多,主要包括:甘露寡糖、果寡糖、异麦芽寡糖、乳寡糖、木寡糖等,动物肠胃中没有水解低聚寡糖的酶***,但是寡糖可以选择性地促进有益菌(主要是双歧杆菌)的增殖,从而抑制肠道内有害菌的生长,减少动物病害发生的机会。低聚寡糖与病原菌在肠道上的受体非常相似,可以竞争性地与病原结合,使之不能生长到肠壁,失去致病能力。但低聚寡糖是一类间接提高免疫力的物质,本身没有杀菌作用,只是为有益菌提供养分或者为病原菌提供标靶,只能辅助抗病、防病;同时寡糖类物质易吸潮,不利于储存或均匀添加,且使用成本较高。
酶制剂是一类具有生物催化性的蛋白质。幼畜肠道在断奶时尚处于发育阶段,消化***还未发育完全,消化酶分泌不足、活力低下,需要补充外源酶辅助消化植物性蛋白和多糖。饲用酶制剂具有改善营养消化吸收、消除抗营养因子和促进肠道健康的作用。与低聚寡糖相似,酶制剂也不直接参与攻击病原菌,大多数作用是减少病原菌的生长基质;在优质日粮情况下,不论是提高畜禽生产率,还是抗病效果,都不明显。
抗菌肽是宿主防御***产生的一类对抗外界病原菌感染的肽类活性物质,是其免疫***的主要组成部分。抗菌肽的作用机理有人认为是在病原菌的细胞膜上穿孔形成离子通道,造成细胞膜结构破坏,引起胞内离子大量流失,细胞不能保持正常的渗透压而死亡;也有报道认为抗菌肽可以抑制细菌的呼吸作用,而导致其死亡。广谱和不产生耐药性是其主要特点,对真核细胞没有作用。由于抗菌肽分子量小,分离提纯困难,天然资源有限,化学合成与基因工程是主要获得手段,但是在微生物中直接表达抗菌肽基因,可能对宿主产生毒害而不能合成足够量的表达产物。除了杆菌肽以外,大多处于实验室研究阶段,转化成生产力的较少,
中草药属纯天然物质,有促进动物生长,增强其体质、促进新陈代谢、提高生产性能、抗应激和防治疾病等作用。迄今发现有200多种中草药含有多方面的免疫活性物质,能增强动物机体的免疫功能;400多种中草药有杀菌、抑菌作用;50多种中草药对病毒有灭活抑制作用。但中草药饲料添加剂创新性不高,品种重复使用或组合较多,有些原料对幼畜存在不适应性,在加工精制方面需要技术提升。由于复方中草药的功效成分非常复杂,某些成分可能对其他饲料添加剂发生副作用,且添加量较大,起效慢。由于中草药饲料添加剂配方不明确、工艺粗糙、质量检测无依据,导致产品疗效参差不齐。而植物提取物是以药用植物为原料,按照对提取的最终产品的用途的需要,经过物理化学提取分离过程,定向获取和富集药用植物中的某一种或多种有效成分,而不改变其有效成分主体结构而形成的产品。目前植物提取物主要用于提高机体免疫力、抗菌、消炎,提高畜禽生产性能。如糖萜素、杜仲叶提取物、博落回提取物和山花黄芩提取物散等。
穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees的干燥地上部分。秋初茎叶茂盛时采割,晒干。别名榄核莲、一见喜、四芳草、圆锥须药草等。其味苦,性寒,归肺、胃、大肠、小肠经。具有抗菌、消炎、抗病毒、解热、增强免疫等作用。临床应用于治疗上呼吸道感染、急性支气管炎、肺炎、菌痢等。被誉为“中药抗菌素”。
穿心莲的化学成分主要为内酯类和黄酮类。内酯类主要含于穿心莲叶中,成分主要有穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯甙、14-去氧-12-甲氧基穿心莲内酯、14-去氧-11-氧化穿心莲内酯及穿心莲宁。黄酮类化合物主要含于穿心莲根中,系多甲氧基黄酮。全草内酯含量在2%~5%。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明申请人提供了一种兽用穿心莲内酯散。本发明产品具有抗菌、消炎的作用,对细菌性痢疾有特殊疗效,可以有效解决家畜肠道问题。
本发明的技术方案如下:
一种兽用穿心莲内酯散,所述穿心莲内酯散的原料包括:3wt%穿心莲内酯,0.9wt%亚硫酸氢钠,余量为淀粉辅料;将穿心莲内酯与亚硫酸氢钠进行反应,形成亚硫酸氢钠穿心莲内酯和穿心莲内酯的混合物,配以淀粉辅料,制得所述穿心莲内酯散。
所述穿心莲内酯按干燥品计算,含穿心莲内酯为95.0%~101.0%;所述穿心莲内酯散中亚硫酸氢钠穿心莲内酯的含量不少于2.5wt%,穿心莲内酯的含量不少于0.2%。
所述亚硫酸氢钠为亚硫酸氢钠与焦亚硫酸钠的混合物,按二氧化硫计算,为61.5%~67.4%。所述淀粉辅料为玉米淀粉。
一种穿心莲内酯散的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:
(1)取穿心莲内酯30g,加入20倍量70%乙醇加热溶解,制得溶液A备用;
(2)往溶液A中加入9g亚硫酸氢钠,加热回流30分钟,过滤,收集滤液;
(3)对滤液进行减压回收乙醇,浓缩得到相对密度为1.20~1.25(室温)的清膏;
(4)对清膏进行喷雾干燥,加入淀粉辅料,混匀,制成1000g穿心莲内酯散。
本发明有益的技术效果在于:
本发明采用的穿心莲在畜禽养殖中的应用主要体现在以下几个方面:1、作为饲料添加剂使用,可以提高饲料的营养成分,增加肉鸡体重,降低饲养中的死亡率,具备一定的保健效果。利用复方穿心莲能够提高畜禽的饲料报酬和生长速度,以及种禽的出壳率、产蛋率和育成率,进而提高生产效益。2、增强机体免疫力,穿心莲能显著提高肉鸡的新城疫HI抗体滴度水平,且有一定的剂量依赖性。穿心莲能提高机体抗体效价,有延缓免疫器官萎缩的作用,能影响法氏囊的发育,促进B淋巴细胞的生长,有不同程度促进胸腺发育的功能,维持机体特异性与非特异性免疫功能。3、在防治畜禽疾病中,穿心莲注射液对仔猪黄白痢、肺炎以及肠炎具有较好的治疗效果。以穿心莲为成分的复方制剂对鸡大肠杆菌病、传染性喉气管炎、鸡白痢等均具有很好的疗效。
穿心莲内酯是二萜内酯类化合物,是穿心莲的主要有效成分之一,具有清热解毒、凉血消肿的功能。穿心莲内酯为酯类结构,在沸乙醇中溶解,在甲醇或乙醇中略溶,极微溶于氯仿,在水或***中几乎不溶。
穿心莲内酯具有多种药理作用,但其水溶性较差,味极苦,添加仔猪饲料中会降低适口性,且口服生物活性较低,临床上长期添加使用成本较高,不利于产品推广。因此研究开发一种水溶性较高、生物活性较强的穿心莲内酯药剂对解决家畜肠道问题是十分必要的。通过对其结构的修饰,增强其活性,以提高其治疗的专属性。本发明将穿心莲内酯与亚硫酸氢钠加成成盐,给穿心莲内酯添加一个亲水基团,提高其水溶性,可增强生物活性,降低苦味,改善其适口性。根据相关文献报道,穿心莲内酯与亚硫酸氢钠进行加成反应,主要是在穿心莲内酯结构中Δ12的碳双键上进行1:1加成。
穿心莲被誉为“中药抗生素”,其主要活性物质----穿心莲内酯具有抗菌、消炎、抗病毒、免疫调节、保肝利胆等作用。通过预实验研究结果表明,穿心莲内酯用于仔猪断奶后的保育阶段可减少仔猪腹泻发病率,促进仔猪生长。考虑其在仔猪饲料中的添加量及原料成本,将其配制成以穿心莲内酯计,含量为3%的中药散剂。
现代药理研究表明,穿心莲内酯具有抗菌消炎、抗病毒、免疫调节、保肝利胆等作用。1、抗菌作用,穿心莲内酯对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链球菌和白酵母等具有较强的抑菌活性,其对细菌性痢疾的疗效较氯霉素优。研究发现亚抑菌浓度的穿心莲内酯能显著影响乳酸脱氢酶的释放、肌动蛋白细胞骨架的聚合,进而减少由禽病原性大肠杆菌(APEC-O78)诱导的鸡Ⅱ型肺细胞粘附程度,并显著影响APEC-O78毒力因子的表达及自诱物质的活性。2、抗炎作用,穿心莲内酯通过抑制NF-kB与DNA连接来发挥抗炎作用,进而降低前炎症蛋白如COX-2的表达。动物实验表明,皮下或腹腔注射穿琥宁或灌服穿心莲内酯,对由二甲苯、醋酸、组织胺所致的小鼠皮肤或腹腔毛细血管通透性增大、大鼠蛋清性足肿及巴豆油性肉芽囊渗液均具有显著的抑制作用。3、免疫调节作用,穿心莲内酯可以促进免疫活性细胞的增殖,增强巨噬细胞的吞噬作用和游走指数,提高CD3、CD4、CD8细胞的比例,增强免疫功能。穿心莲内酯能提高豚鼠单核巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率及提高人外周血中自然杀伤(NK)细胞杀伤K562细胞的活性,促进杀伤(LAK)细胞的生长、增加细胞表型,延长LAK细胞的杀伤效应时间,还能诱导人外周血单核细胞产生干扰素(IFN)-α、IFN-γ、肿瘤坏死因子α(TNF-α),药理作用与类白细胞介素(rIL2)、IFN-α等细胞因子的生物效应有相似之处,且与之有协同作用。这些效应因子在体内与巨噬、NK等细胞协同作用形成一个网络,从而提高机体的免疫功能。4、保肝利胆作用,腹腔注射穿心莲内酯可使大鼠胆汁流量明显增加。穿心莲内酯可以对抗四氯化碳、四丁基过氧化物、半乳糖胺和乙酰氨基酚造成的肝毒作用,显著降低脂质过氧化酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶等的水平。
附图说明
图1为淀粉火焰试验;
图2为穿心莲内酯散火焰试验;
图3为亚硫酸氢钠穿心莲内酯薄层图;
图中:G为穿心莲内酯散;S为亚硫酸氢钠穿心莲内酯;左图点样量分别为10μl、5μl,右图点样量分别为1μl;
图4为亚硫酸氢钠穿心莲内酯薄层图;
图中:G为穿心莲内酯散;S为亚硫酸氢钠穿心莲内酯;点样量分别为2μl、4μl;
图5为穿心莲内酯薄层图;
图中:G为穿心莲内酯散;S为穿心莲内酯;点样量分别为4μl、6μl;
图6为穿心莲内酯散薄层图;
图中:G1为穿心莲内酯散;S1为亚硫酸氢钠穿心莲内酯;S2为穿心莲内酯;点样量分为2μL、4μL;
图7为穿心莲内酯薄层图;
图中:G为穿心莲内酯散;S1为亚硫酸氢钠穿心莲内酯;S2为穿心莲内酯;点样量分别为4μL、6μL;
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明进行具体描述。
穿心莲内酯,含量:98.19%,批号:1603141,购自四川恒瑞通达生物科技有限公司;亚硫酸氢钠,批号:1601041,购自山东聊城安信药用辅料有限公司;无水葡萄糖,批号:201603151,购自山东西王药业有限公司;乳糖,批号:20160102,购自浙江高茂生物科技有限公司;玉米淀粉,批号:20160412,购自山东大宗生物开发股份有限公司。
实施例1
取穿心莲内酯30g,加20倍量70%乙醇加热溶解,再加入9g亚硫酸氢钠加热回流30分钟,滤过,滤液减压回收乙醇,浓缩至相对密度为1.20(室温)的清膏,调整进风温度为170℃,进样速率为5L/h,进行喷雾干燥,加入玉米淀粉,混匀,制成1000g,即得所述兽用穿心莲内脂散。
穿心莲内酯散是以穿心莲有效成分----穿心莲内酯及其加成产物为主要成分,辅配玉米淀粉混合而成的中药散剂。在鉴别项中主要根据亚硫酸氢钠穿心莲内酯和穿心莲内酯的理化性质来制定,采用钠离子火焰反应对亚硫酸氢钠穿心莲内酯进行鉴别(图1),采用薄层色谱法分别鉴别亚硫酸氢钠穿心莲内酯和穿心莲内酯,通过对供试品制备方法、展开***、显色方法等条件的研究,最终得出的薄层鉴别方法鉴别出的斑点清晰,重现性好。
采用高效液相色谱法测定亚硫酸氢钠穿心莲内酯和穿心莲内酯的含量。在含量测定方法中,亚硫酸氢钠穿心莲内酯在5.34~171μg/ml范围内有良好的线性关系,线性方程为:y=0.1077x-0.0368,r=1,平均回收率为98.05%;穿心莲内酯在9.85~157.53μg/ml范围内有良好的线性关系,线性方程为:y=0.0658x+0.057,r=0.9999,平均回收率为98.24%。
实施例2
取穿心莲内酯30g,加20倍量70%乙醇加热溶解,再加入9g亚硫酸氢钠加热回流30分钟,滤过,滤液减压回收乙醇,浓缩至相对密度为1.25(室温)的清膏,调整进风温度为170℃,进样速率为5L/h,进行喷雾干燥,加入玉米淀粉,混匀,制成1000g,即得所述兽用穿心莲内脂散。
实施例3
取穿心莲内酯30g,加20倍量70%乙醇加热溶解,再加入9g亚硫酸氢钠加热回流30分钟,滤过,滤液减压回收乙醇,浓缩至相对密度为1.24(室温)的清膏,调整进风温度为170℃,进样速率为5L/h,进行喷雾干燥,加入玉米淀粉,混匀,制成1000g,即得所述兽用穿心莲内脂散。
测试例:
测试例1稳定性
以穿心莲内酯散的性状、鉴别、外观均匀度、水分、粒度、亚硫酸氢钠穿心莲内酯和穿心莲内酯含量为考察指标,实施例1~3所得穿心莲内酯散分别进行了加速试验、光加速试验和长期试验,观察相关指标变化情况;试验结果分别如表1~9所示。
表1实施例1穿心莲内酯散加速试验结果
注:鉴别①“+”表示供试品溶液显钠离子火焰反应;鉴别②“+”表示供试品溶液所显主斑点的位置和颜色与对照品溶液的主斑点相同;鉴别③“+”表示供试品溶液所显主斑点的位置和颜色与对照品溶液的主斑点相同;外观均匀度要求供试品呈现均匀的色泽,无花纹与色斑,判为符合规定。以下同上。
表2实施例2穿心莲内酯散加速试验结果
表3实施例3穿心莲内酯散加速试验结果
表4实施例穿心莲内酯散强光试验结果
表5实施例2穿心莲内酯散强光试验结果
表6实施例3穿心莲内酯散强光试验结果
表7实施例1穿心莲内酯散长期试验结果
表8实施例2穿心莲内酯散长期试验结果
表9实施例3穿心莲内酯散长期试验结果
结果分别研究结果表明,穿心莲内酯散在市售包装下,在高温高湿环境下加速放置6个月,穿心莲内酯散的性状未发生明显变化,鉴别均能检出相应斑点,外观均匀度符合规定,水分由5.8上升到6.4,粒度均能通过4号筛,亚硫酸氢钠穿心莲内酯含量由2.75%下降到2.70%,穿心莲内酯含量由0.24%下降到0.21%。在高温高湿环境中加速试验,有效成分含量降低,建议将穿心莲内酯散保存于“密封,置阴凉处”。
在强光照试验中,将穿心莲内酯散装入无色透明容器内,放置在光照强度为4500±500Lx的环境中10天,穿心莲内酯散的性状未发生变化,鉴别均能检出相应斑点,外观均匀度符合规定,水分变化不明显,粒度均能通过4号筛,亚硫酸氢钠穿心莲内酯含量由2.75%下降到2.74%,穿心莲内酯含量由0.24%下降到0.23%,说明短期的强光照对穿心莲内酯散理化性质影响不大。
穿心莲内酯散在市售包装下,在温度为25℃±2℃,相对湿度为60%±10%的环境内进行长期稳定性试验,放置12个月后,穿心莲内酯散的性状未发生变化,鉴别均能检出相应斑点,外观均匀度符合规定,水分由5.8上升到6.3,粒度均能通过4号筛,亚硫酸氢钠穿心莲内酯含量由2.75%下降到2.72%,穿心莲内酯含量由0.24%下降到0.22%,其各项指标变化不显著,均在可控范围内,因此继续进行长期稳定性试验。通过稳定性试验研究,穿心莲内酯散在市售包装情况下,储藏条件为“密封,置阴凉处”保存。
测试例2质量测定
(1)性状
分别称取三批次实施例1~3穿心莲内酯散各1g,置于光滑玻璃纸上,平铺约5cm2,将其表面压平,在明亮处观察,本品为白色粉末,鼻闻无味道,口尝略微有苦味。根据多批样品的实际情况描述为“本品为白色的粉末;无臭,微苦。”
(2)鉴别
(2.1)钠离子火焰反应
参照2015版《中国药典》四部0301钠盐鉴别试验。取本品1g,置于25ml量瓶中,加水溶解,超声处理5min,放冷,用水定容至刻度,作为供试品溶液;再取玉米淀粉1g,按照与供试品相同的方法处理,作为阴性对照溶液。取铂丝,用盐酸湿润后,蘸取供试品,在无色火焰中燃烧。供试品火焰颜色显鲜黄色,而阴性对照品火焰无色,此方法可以对穿心莲内酯散中亚硫酸氢钠穿心莲内酯进行钠离子专属性鉴别,见图1~2。
(2.2)亚硫酸氢钠穿心莲内酯TLC鉴别
参照莲必治注射液中亚硫酸氢钠穿心莲内酯的薄层鉴别方法,取本品1g,置于50ml量瓶中,加甲醇40ml,超声处理20min,放冷,用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,精密量取续滤液20ml,浓缩至1ml,作为供试品溶液。另取亚硫酸氢钠穿心莲内酯对照品适量,加甲醇制成每1ml含10mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各5~10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-丙酮-乙醇-水(5:5:5:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以2%3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液-5%氢氧化钾乙醇溶液的等量混合液(临用配制),热风吹至斑点显色清晰,立即在日光下检视。结果显示点样量为10μl时斑点拖尾严重,点样量为5μl时色谱图上斑点较大,说明点样量过多,见图3。将点样量减少至1μl,按同样的方法进行薄层色谱法试验,最终的色谱图显示斑点仍较大,见图3,说明制备的供试品和对照品溶液浓度均要降低。
同时降低供试品和对照品溶液浓度,具体方法如下:取本品1g,置于25ml量瓶中,加甲醇20ml,超声处理20min,放至室温,用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液;另取亚硫酸氢钠穿心莲内酯对照品适量,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各2~4μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-丙酮-乙醇-水(5:5:5:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以2%3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液-5%氢氧化钾乙醇溶液的等量混合液(临用配制),热风吹至斑点显色清晰。结果在色谱图中供试品与亚硫酸氢钠穿心莲内酯在相应位置上,有相同颜色的斑点,此方法可以对穿心莲内酯散中亚硫酸氢钠穿心莲内酯进行专属性鉴别,因此纳入标准中,见图4。
(2.3)穿心莲内酯TLC鉴别
参照2015年版《中国药典》一部中“穿心莲”的薄层鉴别方法,取本品1g,置于50ml量瓶中,加甲醇溶解,超声处理20min,放至室温,用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,精密量取续滤液20ml,浓缩至1ml作为供试品溶液。取穿心莲内酯对照品适量,加甲醇制成每lml含lmg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取供试品溶液与对照品溶液各4~6μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(4:3:0.4)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视,结果在色谱图中供试品与穿心莲内酯在相应位置上,有相同颜色的斑点;喷以2%3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液-5%氢氧化钾乙醇溶液的等量混合液(临用配制),热风吹至斑点显色清晰,结果供试品的斑点不够清晰,说明供试品需增加点样量。因此,将供试品溶液制备方法调整为:取本品1g,置于25ml量瓶中,加甲醇20ml,超声处理20min,放至室温,用甲醇定容至刻度,滤过,滤液浓缩至2ml作为供试品溶液。按相同的方法重新进行穿心莲内酯的薄层色谱试验,结果在色谱图中供试品与穿心莲内酯在相应位置上,有相同颜色的斑点;喷以2%3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液-5%氢氧化钾乙醇溶液的等量混合液(临用配制),热风吹至斑点显色清晰,在日光下检视。结果在色谱图中供试品与穿心莲内酯在相应位置上,有相同颜色的斑点,但斑点不稳定,显色后要立即观察。此方法可以对穿心莲内酯散中穿心莲内酯进行专属性鉴别,因此纳入标准中,见图5。
通过上述实验可以知道,亚硫酸氢钠穿心莲内酯与穿心莲内酯在薄层鉴别过程中所喷的显色剂都为2%3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液-5%氢氧化钾乙醇溶液的等量混合液,我们尝试验证是否能在一块薄层板上同时鉴别出样品中的亚硫酸氢钠穿心莲内酯与穿心莲内酯,按照以下步骤进行:取本品1g,置于25ml量瓶中,加甲醇20ml,超声处理20min,放至室温,用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液。另取亚硫酸氢钠穿心莲内酯对照品和穿心莲内酯对照品适量,分别加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述三种溶液各2~4μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-丙酮-乙醇-水(5:5:5:1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以2%3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液-5%氢氧化钾乙醇溶液的等量混合液(临用配制),热风吹至斑点显色清晰,在日光下检视。结果在色谱图中供试品与亚硫酸氢钠穿心莲内酯在相应位置上,有相同颜色的斑点;穿心莲内酯对照品在更高处对应有紫色斑点,但供试品在该位置无斑点,见图6(左图),推测是由于供试品溶液中穿心莲内酯含量较低造成的。在此基础上将供试品浓缩20倍,重复上述实验,结果在色谱图中供试品与亚硫酸氢钠穿心莲内酯和穿心莲内酯在相应位置上,均有相同颜色的斑点,但供试品色谱中亚硫酸氢钠穿心莲内酯斑点拖尾严重,见图6(右图)。通过实验可以看出,由于供试品中亚硫酸氢钠穿心莲内酯与穿心莲内酯含量相差较多,在进行薄层鉴别时,不能同时控制两者的点样浓度为最佳浓度,因此运用该方法不能同时鉴别出供试品中的亚硫酸氢钠穿心莲内酯与穿心莲内酯。
重新选择方法,按照以下步骤进行:取实施例1产品1g,置于25ml量瓶中,加甲醇20ml,超声处理20min,放至室温,用甲醇定容至刻度,滤过,滤液浓缩至2ml作为供试品溶液。另取亚硫酸氢钠穿心莲内酯对照品和穿心莲内酯对照品适量,分别加甲醇制成每lml含lmg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取标准品溶液各4~6μl,供试品溶液6~8μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(4:3:0.4)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视,结果在色谱图中供试品与穿心莲内酯在相应位置上,有相同颜色的斑点,而亚硫酸氢钠穿心莲内酯无斑点,见图7(左图);喷以2%3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液-5%氢氧化钾乙醇溶液的等量混合液(临用配制),热风吹至斑点显色清晰,立即在日光下检视。结果在色谱图中供试品与穿心莲内酯在相应位置上,有相同颜色的斑点,且斑点清晰,而亚硫酸氢钠穿心莲内酯无斑点,见图7(右图)。通过实验可以看出,亚硫酸氢钠穿心莲内酯在该条件下不能展开,故运用此方法也不能同时鉴别出供试品中亚硫酸氢钠穿心莲内酯与穿心莲内酯。最终确定,对穿心莲内酯散中亚硫酸氢钠穿心莲内酯和穿心莲内酯按照最初实验得出的方法分别进行专属性鉴别,并纳入标准中。
测试例3药理毒理研究
(1)穿心莲内酯散的主要药效学研究
称取穿心莲内酯散50.33g,加纯化水100ml溶解,11000r/min离心10min,取上清液减压浓缩至10ml,无菌过滤后即得(以亚硫酸氢钠穿心莲内酯计)137.4mg/ml的药液。称取硫酸粘杆菌素0.01024g,用无菌生理盐水配制成71.21μg/ml的药液,无菌过滤后备用。取吲哚美辛片,用无菌生理盐水制成2.5mg/ml的药液。置于4℃中保存。
(1.1)供试菌液的制备
试验前将菌种经培养、复壮,挑去单个菌落接种到10ml营养肉汤培养基中,置于37℃恒温培养箱中10~12h。将原菌液以10-1倍稀释,分别稀释至10-8,各菌液分别取10-6、10-7、10-8的浓度用微量加样器取100μl加到营养琼脂平板上,用涂菌棒均匀推散在培养基表面,每个浓度涂3个平板,将平板置于37℃恒温培养箱中,大肠杆菌和沙门氏菌分别于培养后12h和24h观察,计算菌落数,根据稀释浓度计算出原菌液浓度,稀释到试验所需的浓度备用。
(1.2)MIC的测定
取无菌带硅胶塞的中试管12支,每支试管内加2ml营养肉汤培养基,于第1支试管中加入供试药液2ml,混合均匀后,吸出2ml加入到第2支试管中,混合均匀,依次类推稀释至第10支试管,吸取2ml弃去。然后用微量加样器取浓度为1×105cfu/ml的供试菌液100μl加到第1~11支试管中,第12支试管作为阴性对照。将试管置于37℃恒温培养箱中,大肠杆菌和沙门氏菌分别于培养后12h和24h观察,取出试管置于日光下观察。有菌生长的试管中营养肉汤培养基浑浊,无菌生长的试管中营养肉汤培养基澄清。实施例1制得的穿心莲内酯散对猪常见致病菌的MIC值如表10所示。
表10
注:“+”表示浑浊,“-”表示澄清。
由表10可知,穿心莲内酯散对2种猪致病菌均有不同程度的抑制作用,其对猪霍乱沙门菌抑菌作用较强,其MIC为8.59mg/ml,对猪大肠埃希氏菌抑菌作用稍弱,其MIC为17.17mg/ml。
(1.3)抗炎试验,昆明种小鼠50只,随机分为5组,每组10只,雌雄各半,分别为实施例1所得穿心莲内酯散(高、中、低)剂量组,药物(吲哚美辛)对照组和阳性对照组。穿心莲内酯散(高、中、低)剂量组分别按137.4mg/kg、68.7mg/kg、34.35mg/kg灌胃给药,药物对照组按12.5mg/kg灌服吲哚美辛,阳性对照组灌服等容积清水,各组小鼠每天给药1次,连续给药3天。末次给药1h后,每组小鼠右耳双面涂以二甲苯30μl,左耳不涂作为自身对照,30min后对小鼠进行摘眼球采血,分离血清,用于测定血清中的TNF-α。然后将小鼠颈椎脱臼处死,立即沿耳廓基线剪下双耳,用直径6mm打孔器分别于左右两耳相同部位打下耳片,立即用电子天平称重两耳片重量。计算耳肿胀度和肿胀抑制率。试验结果如表11、12所示。
肿胀度=右耳片质量-左耳片质量
肿胀抑制率=(阳性对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/阳性对照组平均肿胀度×100%
血清TNF-α含量按照试剂盒说明书测定。
表10穿心莲内酯散对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
注:大写字母不同表示差异极显著P<0.01;小写字母不同表示差异显著P<0.05。
表11穿心莲内酯散对小鼠血清中炎性因子水平的影响
注:大写字母不同表示差异极显著P<0.01;小写字母不同表示差异显著P<0.05。
由表10和表11可知,与阳性对照组比较,穿心莲内酯散各剂量组和吲哚美辛组均能极显著降低致炎小鼠的耳肿胀度和血清炎症因子TNF-α的水平(P<0.01)。
(2)穿心莲内酯散的急性毒性研究
预实验采用给予大鼠经口灌服5000mg/kg的穿心莲内酯加成物(穿心莲内酯散原料)未观测到大鼠不良反应。正式试验选用20只大鼠,经口灌服5000mg/kg的穿心莲内酯加成物,一次给药后观察14天,观察大鼠的临床表征和死亡情况,试验结束后剖杀,进行眼观病理学检查。研究结果表明:穿心莲内酯散对大鼠实际无毒,使用安全。
(2)长期毒性研究
选用4周龄清洁级Wistar大鼠80只,雌雄各半,体重为100±20g。随机分为4组,即穿心莲内酯加成物高剂量组(2000mg/kg·bw)、中剂量组(1000mg/kg·bw)和低剂量组(500mg/kg·bw),另设一个对照组。连续灌胃给药30天。观察临床表现,计算体重及饲料利用率,分析血常规和血液生化指标,进行病理组织学检查,将所得结果与对照组进行差异性比较。研究结果表明:穿心莲内酯散在临床上应用是安全的,其临床用药的安全范围较大。
Claims (5)
1.一种兽用穿心莲内酯散,其特征在于,所述穿心莲内酯散的原料包括:3wt%穿心莲内酯,0.9wt%亚硫酸氢钠,余量为淀粉辅料;将穿心莲内酯与亚硫酸氢钠进行反应,形成亚硫酸氢钠穿心莲内酯和穿心莲内酯的混合物,配以淀粉辅料,制得所述穿心莲内酯散。
2.根据权利要求1所述的穿心莲内酯散,其特征在于,所述穿心莲内酯按干燥品计算,含穿心莲内酯为95.0%~101.0%;所述穿心莲内酯散中亚硫酸氢钠穿心莲内酯的含量不少于2.5wt%,穿心莲内酯的含量不少于0.2%。
3.根据权利要求1所述的穿心莲内酯散,其特征在于,所述亚硫酸氢钠为亚硫酸氢钠与焦亚硫酸钠的混合物,按二氧化硫计算,为61.5%~67.4%。
4.根据权利要求1所述的穿心莲内酯散,其特征在于,所述淀粉辅料为玉米淀粉。
5.一种权利要求1所述穿心莲内酯散的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
(1)取穿心莲内酯30g,加入20倍量70%乙醇加热溶解,制得溶液A备用;
(2)往溶液A中加入9g亚硫酸氢钠,加热回流30分钟,过滤,收集滤液;
(3)对滤液进行减压回收乙醇,浓缩得到相对密度为1.20~1.25(室温)的清膏;
(4)对清膏进行喷雾干燥,加入淀粉辅料,混匀,制成1000g穿心莲内酯散。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109942520A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-06-28 | 大理金明动物药业有限公司 | 穿心莲内酯磺化物及其制备方法与应用 |
CN111189944A (zh) * | 2020-03-11 | 2020-05-22 | 济南广盛源生物科技有限公司 | 一种同时鉴别三味拳参口服液中苦参和穿心莲的方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101148441A (zh) * | 2007-06-12 | 2008-03-26 | 孙克 | 亚硫酸氢钠穿心莲内酯及其制备方法 |
CN101362740A (zh) * | 2007-08-08 | 2009-02-11 | 李宏 | 亚硫酸氢钠穿心莲内酯的合成方法 |
WO2011048479A2 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-28 | Maqui New Life S.A. | Compositions that include anthocyanidins and methods of use |
CN103622960A (zh) * | 2013-12-11 | 2014-03-12 | 胡少平 | 兽用复方穿心莲内酯制剂 |
CN103622951A (zh) * | 2012-08-27 | 2014-03-12 | 康阳润和(北京)医药科技有限公司 | 莲必治口服液体制剂其制备方法 |
-
2018
- 2018-08-21 CN CN201810952728.2A patent/CN108853026A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101148441A (zh) * | 2007-06-12 | 2008-03-26 | 孙克 | 亚硫酸氢钠穿心莲内酯及其制备方法 |
CN101362740A (zh) * | 2007-08-08 | 2009-02-11 | 李宏 | 亚硫酸氢钠穿心莲内酯的合成方法 |
WO2011048479A2 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-28 | Maqui New Life S.A. | Compositions that include anthocyanidins and methods of use |
CN103622951A (zh) * | 2012-08-27 | 2014-03-12 | 康阳润和(北京)医药科技有限公司 | 莲必治口服液体制剂其制备方法 |
CN103622960A (zh) * | 2013-12-11 | 2014-03-12 | 胡少平 | 兽用复方穿心莲内酯制剂 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109942520A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-06-28 | 大理金明动物药业有限公司 | 穿心莲内酯磺化物及其制备方法与应用 |
CN109942520B (zh) * | 2019-04-10 | 2023-08-01 | 大理金明动物药业有限公司 | 穿心莲内酯磺化物及其制备方法与应用 |
CN111189944A (zh) * | 2020-03-11 | 2020-05-22 | 济南广盛源生物科技有限公司 | 一种同时鉴别三味拳参口服液中苦参和穿心莲的方法 |
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