CN108849499A - 一种制备羌活人工种子的方法及人工种子的扩繁方法 - Google Patents

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CN108849499A CN201810522135.2A CN201810522135A CN108849499A CN 108849499 A CN108849499 A CN 108849499A CN 201810522135 A CN201810522135 A CN 201810522135A CN 108849499 A CN108849499 A CN 108849499A
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Abstract

本发明公开了一种制备羌活人工种子的方法，包括如下步骤：S1在培养液甲中孵育羌活体细胞胚；培养液甲的制备方法：每升1/10B5培养基中加入1.8～2.2mg 6‑BA、0.9～1.1mg NAA、18～22g蔗糖、0.9～1.1g低分子量壳聚糖、0.9～1.1g草酸和36～44g海藻酸钠；S2将步骤S1得到的体系加入0.9～1.1g/100mLCaCl2水溶液中，孵育，得到羌活人工种子。本发明还保护一种制备羌活人工种子的培养液，为所述培养液甲。本发明可以实现羌活种苗的高效繁育，满足羌活种苗的市场需求，具有重大的推广价值。

Description

一种制备羌活人工种子的方法及人工种子的扩繁方法
技术领域
本发明涉及人工种子培育技术，更具体地说，涉及一种制备羌活人工种子的方法及其专用培养液。
背景技术
羌活(Notopterygium Boissieu)属于伞形科，芹亚科，美味芹族，为我国的特有属之一，其中药典收录的有羌活和宽叶羌活(川羌)等种。羌活之名见《神农本草经》，是我国最早发现和应用的药物之一，有着数千年的药用历史，以根状茎和根入药。
羌活具有抑菌、抗炎、镇痛、抑制血小板聚集及血栓形成、改善血液流变学、增加脑血流量、抗病毒及抗心律失常作用。在临床上主要用于治疗冠心病心绞痛，治疗腹泻，治疗霉菌性***炎、外阴炎，治疗痛经，治疗白癜风，治疗病毒性角膜炎。
羌活耐荫，适于生长在有机质含量高的土壤中，耐寒冷湿润气候，因此多生长在高山、亚高山灌丛、草丛及高山林缘地，土壤以亚高山灌丛草甸土、山地森林土为主，尤以土壤疏松、含腐殖质较多且荫湿的地方分布较多,在肥沃的酸性或中性土生长为佳。羌活生长的地域性较强，在温暖气候环境不宜生长，羌活常与各种杜鹃和柳属植物等伴生。生长周期为3～7年，种植栽培困难，产量有限。而市场需求急剧增加，羌活本身种子少、分布区域自然条件恶劣，自然繁殖率很低，在物种竞争中明显处于弱势，种群较为稀少，加之过采、乱采、私采野生药材严重，致使羌活生态环境受到严重破坏，造成羌活资源数量急剧下降，已成为珍稀濒危物种，列入《中国植物红皮书》中，为国家二级重点保护植物,已经影响到以羌活为主要原材料的中药生产安全。
发明内容
本发明的目的在于开发一种制备羌活人工种子的方法及其专用培养液，满足羌活种苗的市场需求。
为达到上述目的，本发明提供了一种制备羌活人工种子的方法及其专用培养液，包括如下步骤：S1、将1.3×104～1.5×104个羌活体细胞胚放入1400～1600mL培养液甲中并混匀，室温静置孵育2～5分钟；
所述培养液甲的制备方法：每升1/10 B5培养基中加入1.8～2.2mg 6～BA、0.9～1.1mg NAA、18～22g蔗糖、0.9～1.1g低分子量壳聚糖、0.9～1.1g草酸和36～44g海藻酸钠；
所述1/10B5培养基：(NH4)2SO40.134g/L、KNO3 3g/L、NaH2PO4 0.15g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCl2·2H2O 0.15g/L、MnSO4·4H2O 10g/L、ZnSO4·7H2O2g/L、H3BO33g/L、KI0.75g/L、Na2MoO4·2H2O 0.25g/L、CuSO4·5H2O 0.025g/L、CoCl2·6H2O 0.025g/L、Na2-EDTA3.725g/L、FeSO4·7H2O 2.785g/L、维生素B1 1g/L、维生素B6 0.1g/L、烟酸0.1g/L、肌醇1g/L、蔗糖30g/L，加水至1L；
S2、用胶头滴管吸取步骤S1得到的孵育后的体细胞胚，并逐滴滴加在装有2000～4000mL 0.5～1.5g/100mL CaCl2水溶液的烧杯中，室温静置孵育20～40min，弃上清液，得到在CaCl2水溶液中孵育后的体细胞胚，再用无菌去离子水冲洗3～4次，获得羌活人工种子。
优选方式如下：所述步骤S1中，所述孵育的条件为：室温静置孵育3分钟。
优选方式如下：所述步骤S2中，所述孵育的条件为：室温静置孵育30分钟。
优选方式如下：所述步骤S1中，所述培养液甲的制备方法：每升1/10B5培养基中加入2mg 6～BA、1mg NAA、20g蔗糖、1g低分子量壳聚糖、1g草酸和40g海藻酸钠。
优选方式如下：所述步骤S1中，所述培养液甲的pH为6.0。
优选方式如下：所述步骤S1中羌活体细胞胚、所述培养液甲和所述步骤S2中CaCl2水溶液的配比如下：1.5×104个羌活体细胞胚：1500mL培养液甲：3000mL CaCl2水溶液。
优选方式如下：以上任一所述制备羌活人工种子的方法制备所得羌活人工种子的扩繁方法：包括如下步骤：
S21、将步骤S2得到的羌活人工种子置于B5固体培养基上，20～25℃、光照强度2800～3000lx，12小时光照/12小时黑暗，光暗交替静置培养18～20d；
S22、将步骤S21得到的培养后的羌活小苗置于空气湿度90％～95％，光照强度2800～3000lx，20～25℃、12小时光照/12小时黑暗，光暗交替的条件下放在培养基中培养23～25d；
所述B5固体培养基：每升B5液体培养基中加入50g琼脂；
所述B5液体培养基：(NH4)2SO4 1.34g/L，KNO330g/L，NaH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O5g/L，CaCl2·2H2O1.5g/L，MnSO4·4H2O10g/L，ZnSO4·7H2O2g/L，H3BO33g/L，KI0.75g/L，Na2MoO4·2H2O0.25g/L，CuSO4·5H2O0.025g/L，CoCl2·6H2O0.025g/L，Na2-EDTA3.725g/L，FeSO4·7H2O2.785g/L，维生素B1：1g/L维生素B6：0.1g/L，烟酸0.1g/L，肌醇1g/L，蔗糖30g/L，加水至1L。
所述步骤S22所用培养基：取砂子，用水冲洗，然后用5g/100mL多菌灵水溶液拌湿，10分钟后用水冲洗3遍。
本发明可以实现羌活种苗的高效繁育，满足羌活种苗的市场需求，具有重大的推广价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
6～BA的全称为6～苄氨基腺嘌呤，购自上海三杰生物技术有限公司，产品目录号为1214～39～7。
NAA的全称为α～萘乙酸，购自上海三杰生物技术有限公司，产品目录号为86～87～3。
低分子量壳聚糖，分子式为“(C6H11NO4)n”，n＝10～20,分子量为2000～4000道尔顿，购自上海三杰生物技术有限公司，产品目录号为9012～76～4。
B5液体培养基配方见表1。
表1
B5固体培养基：每升B5液体培养基中加入50g琼脂。
1/2B5培养基:(NH4)2SO4,0.67g/L、KNO3 7.5g/L、NaH2PO4 0.75g/L、MgSO4·7H2O2.5g/L、CaCl2·2H2O 0.75g/L、MnSO4·4H2O 10g/L、ZnSO4·7H2O 2g/L、H3BO33g/L、KI0.75g/L、Na2MoO4·2H2O 0.25g/L、CuSO4·5H2O 0.025g/L、CoCl2·6H2O 0.025g/L、Na2-EDTA3.725g/L、FeSO4·7H2O 2.785g/L、维生素B1 1g/L、维生素B6 0.1g/L、烟酸0.1g/L、肌醇1g/L、蔗糖30g/L，余量为水。
1/10B5培养基：(NH4)2SO4,0.134g/L、KNO3 3g/L、NaH2PO4 0.15g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、CaCl2·2H2O 0.15g/L、MnSO4·4H2O 10g/L、ZnSO4·7H2O 2g/L、H3BO33g/L、KI0.75g/L、Na2MoO4·2H2O 0.25g/L、CuSO4·5H2O 0.025g/L、CoCl2·6H2O 0.025g/L、Na2-EDTA3.725g/L、FeSO4·7H2O 2.785g/L、维生素B1 1g/L、维生素B6 0.1g/L、烟酸0.1g/L、肌醇1g/L、蔗糖30g/L，余量为水。
以上任一所述羌活体细胞胚的制备方法可为方法甲，包括如下步骤：
(I)、取羌活无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2，接种到培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
(II)、取步骤(I)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
(III)、取步骤(II)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
(Ⅳ)、将1g步骤(III)得到的胚性愈伤组织加至10ml培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(V)、完成步骤(Ⅳ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(VI)、完成步骤(V)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(VII)、完成步骤(VI)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(VIII)完成步骤(VII)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(IX)将1体积份步骤(VIII)得到的培养体系与2体积份培养基丙混合，23±2℃、12小时光照/12小时黑暗、100rpm振荡培养30天；
所述培养基甲为含0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的B5培养基；所述培养基乙为含0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2B5培养基；所述培养基丙为含0.5mg/LNAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2B5培养基。
步骤(IX)中，所述光照的条件可为1500-2000lx，具体可为1500lx。
以上任一所述羌活体细胞胚的制备方法可为方法乙，包括如下步骤：
(1)将羌活的胚性愈伤组织加至培养基乙中进行培养；所述培养基乙为含0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2B5培养基；
(2)完成步骤(1)后，将培养体系转接至培养基丙中进行培养；所述培养基丙为含0.5mg/LNAA、0.2mM TDZ、0.4mg/LIBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2 B5培养基。
方法乙中，所述羌活的胚性愈伤组织的制备方法如下：取羌活的外植体，接种到培养基甲上，进行培养；所述培养基甲为含0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的B5培养基。
方法乙中，所述羌活的胚性愈伤组织的制备方法如下：
①取羌活的外植体，接种到培养基甲上，培养；
②取步骤①得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；
③取步骤②得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；
所述培养基甲为含0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的B5培养基。
所述羌活的外植体为羌活无菌苗的叶或羌活无菌苗的茎。所述羌活的外植体具体如下：取羌活无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2。所述羌活的外植体具体如下：取羌活无菌苗的茎，切成1cm的茎段。
①、②和③中，所述培养的条件均为：23±2℃黑暗培养25天。
所述步骤(1)具体包括如下步骤：
(1-1)将1g羌活的胚性愈伤组织加至10ml所述培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-2)完成步骤(1-1)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-3)完成步骤(1-2)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-4)完成步骤(1-3)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-5)完成步骤(1-4)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
所述步骤(2)中，所述培养的条件为：23±2℃、12小时光照/12小时黑暗、振荡培养30天。
所述步骤(2)中，培养体系和所述培养基丙的配比为：
1体积份培养体系：2体积份培养基丙。
所述步骤(2)中，所述振荡培养具体可为100rpm振荡培养。
所述步骤(2)中，所述光照的条件可为1500-2000lx，具体可为1500lx。
本发明还包括一种制备羌活人工种子的培养液，为培养液甲；所述培养液甲的制备方法：每升1/10B5培养基中加入1.8-2.2mg 6-BA、0.9-1.1mg NAA、18-22g蔗糖、0.9-1.1g低分子量壳聚糖、0.9-1.1g草酸和36-44g海藻酸钠。所述培养液甲的制备方法具体可：每升1/10B5培养基中加入2mg 6-BA、1mg NAA、20g蔗糖、1g低分子量壳聚糖、1g草酸和40g海藻酸钠。
以上任一所述低分子量壳聚糖为分子量为2000-4000道尔顿的壳聚糖。以上任一所述低分子量壳聚糖的分子式为“(C6H11NO4)n”，n＝10-20。以上任一所述低分子量壳聚糖具体可为购自上海三杰生物技术有限公司，产品目录号为9012-76-4的壳聚糖。
以上任一所述1/10B5培养基具体可为：NH4NO3 165mg/L、KNO3 190mg/L、KH2PO417mg/L、MgSO4·7H2O 37mg/L、CaCl2·2H2O 44mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、H3BO36.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2-EDTA 37.25mg/L、FeSO4·7H2O 27.85mg/L、甘氨酸2mg/L、维生素B10.4mg/L、维生素B60.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、蔗糖30000mg/L，加水至1L。
实施例1、制备体细胞胚
1、制备胚性愈伤组织
(1)取羌活无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2，接种到培养基甲上，20～25℃黑暗培养25天。此时可以观察到从叶片切口处生长出浅黄色愈伤组织，即胚性愈伤组织。
(2)取步骤(1)得到的胚性愈伤组织，接种到培养基甲上，20～25℃黑暗培养25天。
(3)取步骤(2)得到的胚性愈伤组织，接种到培养基甲上，20～25℃黑暗培养25天。
实际操作中，可以持续按照步骤(2)的方法进行继代培养。
培养基甲(固体)：取B5液体培养基，每升加入0.5mg 2,4～二氯苯氧乙酸、30g蔗糖和5g琼脂粉。
2、液体悬浮培养
(1)将1g步骤1的(3)得到的胚性愈伤组织加至10ml培养基乙中，20～25℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
(2)完成步骤(1)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，20～25℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
(3)完成步骤(2)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，20～25℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
(4)完成步骤(3)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，20～25℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
(5)完成步骤(4)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，20～25℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
实际操作中，可以按照步骤(2)的方法进行3-5次继代培养，得到稳定的悬浮细胞体系。
培养基乙(液体)：取1/2B5培养基，每升加入0.5mg 2,4-二氯苯氧乙酸和30g蔗糖的。
3、制备体细胞胚
将1体积份步骤2的(5)得到的培养体系与2体积份培养基丙混合，20～25℃、12小时光照(光照强度为1500lx)/12小时黑暗、100rpm振荡培养30天，此时培养体系中体细胞胚的浓度大于等于15000个/L。
培养基丙(液体)：取1/2B5培养基，每升加入0.5mg NAA(α～萘乙酸)、0.2mmol TDZ(thidiazuron)、0.4mg IBA(3～吲哚甲酸)、0.4mg 6-BA(6～苄氨基嘌呤)和30g蔗糖。
实施例2、按照本发明提供的方法制备羌活人工种子
培养液甲的制备方法(pH6.0)：取1/10B5培养基，每升加入2mg 6～BA、1mg NAA、20g蔗糖、1g低分子量壳聚糖、1g草酸和40g海藻酸钠。
1、将1.5×104个(约10g)实施例1得到的体细胞胚放入1500mL培养液甲中并混匀，室温静置孵育3分钟。
2、用胶头滴管吸取步骤1得到的体系并逐滴滴加在装有3000mL 1g/100mL CaCl2水溶液的烧杯中，室温静置孵育30min，弃上清液，用无菌去离子水冲洗3～4次，获得羌活人工种子。
实施例3、按照现有方法制备羌活人工种子
培养液戊的制备方法：取1/2B5培养基，每升加入30g海藻酸钠。
将实施例1得到的体细胞胚放入培养液戊中并室温浸泡3～4min，然后转移至0.5g/100mL CaCl2水溶液中并室温浸泡3min，弃上清液，用无菌去离子水冲洗3～4次，获得羌活人工种子。
实施例4、制备羌活无菌苗
取100粒实施例2制备的羌活人工种子和100粒实施例3制备的羌活人工种子，分别进行如下步骤：
1、将羌活人工种子置于B5固体培养基上，20～25℃、12小时光照(本实施例中的光照强度为3000lx)/12小时黑暗、静置培养20d(此时，大部分种子形成芽长约3cm的小苗)。
2、完成步骤1后，将小苗移栽到育苗盆中(取砂子，用水冲洗，然后用5g/100mL多菌灵水溶液拌湿，10分钟后用水冲洗3遍，然后分装在育苗盆中)，20～25℃、12小时光照(本实施例中的光照强度为3000lx)/12小时黑暗、空气湿度100％、静置培养25天。
利用本发明提供的方法与现有方法进行对比
表2
萌发率＝完成步骤1时萌发的种子数量/种子总数量×100％。
成苗率＝完成步骤2时成苗的种子数量/种子总数量×100％。
种子总数量＝100。
进行三次重复试验，结果取平均值。
由表2可知，使用本发明方法制备的羌活人工种子萌发率及成苗率大，现有方法制备的羌活人工种子萌发率及成苗率没有本发明的大，所以本发明可以实现羌活种苗的高效繁育，满足羌活种苗的市场需求，具有重大的推广价值。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种制备羌活人工种子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将1.3×104～1.5×104个羌活体细胞胚放入1400～1600mL培养液甲中并混匀，室温静置孵育2～5分钟；
所述培养液甲的制备方法：每升1/10B5培养基中加入1.8～2.2mg 6～BA、0.9～1.1mgNAA、18～22g蔗糖、0.9～1.1g低分子量壳聚糖、0.9～1.1g草酸和36～44g海藻酸钠；
所述1/10 B5培养基：(NH4)2SO40.134g/L、KNO3 3g/L、NaH2PO4 0.15g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、CaCl2·2H2O 0.15g/L、MnSO4·4H2O 10g/L、ZnSO4·7H2O 2g/L、H3BO3 3g/L、KI0.75g/L、Na2MoO4·2H2O 0.25g/L、CuSO4·5H2O 0.025g/L、CoCl2·6H2O 0.025g/L、Na2-EDTA3.725g/L、FeSO4·7H2O 2.785g/L、维生素B1 1g/L、维生素B6 0.1g/L、烟酸0.1g/L、肌醇1g/L、蔗糖30g/L，加水至1L；
S2、用胶头滴管吸取步骤S1得到的孵育后的体细胞胚，并逐滴滴加在装有2000～4000mL 0.5～1.5g/100mL CaCl2水溶液的烧杯中，室温静置孵育20～40min，弃上清液，得到在CaCl2水溶液中孵育后的体细胞胚，再用去离子水冲洗3～4次，获得羌活人工种子。
2.如权利要求1所述制备羌活人工种子的方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述孵育的条件为：室温静置孵育3分钟。
3.如权利要求1所述制备羌活人工种子的方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述孵育的条件为：室温静置孵育30分钟。
4.如权利要求1所述制备羌活人工种子的方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述培养液甲的制备方法：每升1/10B5培养基中加入2mg 6～BA、1mg NAA、20g蔗糖、1g低分子量壳聚糖、1g草酸和40g海藻酸钠。
5.如权利要求1所述制备羌活人工种子的方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述培养液甲的pH为6.0。
6.如权利要求1所述制备羌活人工种子的方法，其特征在于：所述步骤S1中羌活体细胞胚、所述培养液甲和所述步骤S2中CaCl2水溶液的配比如下：1.5×104个羌活体细胞胚：1500mL培养液甲：3000mL CaCl2水溶液。
7.如权利要求1～6任一所述制备羌活人工种子的方法制备所得羌活人工种子的扩繁方法，其特征在于：包括如下步骤：
S21、将步骤S2得到的羌活人工种子置于B5固体培养基上，20～25℃、光照强度2800～3000lx，12小时光照/12小时黑暗，光暗交替静置培养18～20d；
S22、将步骤S21得到的培养后的羌活小苗置于空气湿度90％～95％，光照强度2800～3000lx，20～25℃、12小时光照/12小时黑暗，光暗交替的条件下放在培养基中培养23～25d；
所述B5固体培养基：每升B5液体培养基中加入50g琼脂；
所述B5液体培养基：(NH4)2SO41.34g/L，KNO330g/L，NaH2PO41.5g/L，MgSO4·7H2O5g/L，CaCl2·2H2O1.5g/L，MnSO4·4H2O10g/L，ZnSO4·7H2O2g/L，H3BO33g/L，KI0.75g/L，Na2MoO4·2H2O0.25g/L，CuSO4·5H2O0.025g/L，CoCl2·6H2O0.025g/L，Na2-EDTA3.725g/L，FeSO4·7H2O2.785g/L，维生素B1：1g/L维生素B6：0.1g/L，烟酸0.1g/L，肌醇1g/L，蔗糖30g/L，加水至1L。
所述步骤S22所用培养基：取砂子，用水冲洗，然后用5g/100mL多菌灵水溶液拌湿，10分钟后用水冲洗3遍。
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