CN101836586B - 竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法，包括茎尖丛生芽诱导、丛生芽继代增殖、生根培养和试管苗移栽共四个步骤，分别对诱导培养基、增殖培养基、生根培养基和移栽基质等进行了优化，所得方法茎尖丛生芽诱导率高；丛生芽继代增殖倍数高且玻璃化率低；芽苗生根率达100％，根系健壮且有侧芽萌发；移栽成活率高，且芽苗健壮，生长快；本发明方法周期短，成本低，完全能满足竹根姜大面积规模化栽培的需要，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种种苗繁育方法，特别涉及一种竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法。
背景技术
姜(Zingiber officinale Rosc.)为姜科姜属多年生宿根草本，不仅是一种重要的调味植物，且具有解表、驱寒湿、抗肿瘤、抗氧化等多种药用功效，出口量大、经济效益好，近年来发展很快。由于开花和结籽障碍，姜以根状茎为繁殖材料，在长期的无性繁殖过程中，易受病原物侵染，导致种性退化，产量和品质降低。
竹根姜为我国特产地方姜种，具有肉质脆嫩、纤维少、品质优等特点，在四川、重庆等省市广泛种植，市场需求量极大。但由于竹根姜不耐旱涝，而西南地区气温高、雨量充足，导致其容易大面积感染青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)而引发姜瘟病，严重影响了竹根姜的产业化发展。
目前，利用茎尖脱毒与组织培养技术获得脱毒组培种苗是解决上述问题的根本途径。近年来，有关姜茎尖脱毒与组织培养的研究已有文献报道，但大多数报道为脱毒程序及组培体系建立等理论方面的成果，并未见形成产业化规模。而迄今为止，有关竹根姜的茎尖脱毒与工厂化繁育的研究尚未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法。
为达到此目的，本发明的竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法，包括以下步骤：
a、茎尖丛生芽诱导：取竹根姜嫩芽，经消毒灭菌后，剥取茎尖作为外植体；将茎尖接种于诱导培养基在光照条件下进行丛生芽诱导培养，获得丛生芽；所述诱导培养基以MS培养基作为基本培养基，并添加浓度为30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的琼脂、浓度为2.0mg/L的细胞***素和浓度为0.1mg/L的生长素，pH为5.6～6.2；
b、丛生芽继代增殖：将步骤a所得丛生芽转接至增殖培养基在光照条件下进行丛生芽继代增殖培养，获得继代增殖丛生芽；所述增殖培养基以MS(1/3NH4NO3)培养基作为基本培养基，并添加浓度为30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的琼脂、浓度为1.5mg/L的细胞***素和浓度为0.1mg/L的生长素，pH为5.6～6.2；所述MS(1/3NH4NO3)培养基中硝酸铵的浓度为MS培养基中硝酸铵浓度的1/3，其余组分及其浓度与MS培养基相同；
c、生根培养：当步骤b所得继代增殖丛生芽生长至3～4cm高时，将丛生芽切成单芽，转接至生根培养基在光照条件下进行生根培养，获得试管苗；所述生根培养基以1/2MS培养基作为基本培养基，并添加浓度为20g/L的蔗糖、浓度为6g/L的卡拉胶、浓度为0.5～1.0mg/L的细胞***素和浓度为0.2mg/L的生长素，pH为5.6～6.2；所述1/2MS培养基所含组分种类与MS培养基相同，但各组分的浓度仅为MS培养基中浓度的1/2；
d、试管苗移栽：将步骤c所得试管苗移栽入体积比为3∶7的珍珠岩-泥炭土混合基质中培养，即得脱毒组培种苗。
进一步，步骤a～c所述培养温度为25±1℃，光照强度为1500～2500lux，光照时间为每天12～16小时；
进一步，步骤a～c所述光照强度为1500lux，光照时间为每天12小时；
进一步，步骤b是将丛生芽分割至含有2～3个芽丛，再将其茎基部0.5cm以上部分切除，形成微型团块转接至增殖培养基，接种时先弃去培养基表面的水层，并使芽切口露出培养基表面。
本发明的有益效果在于：本发明***地进行了竹根姜茎尖丛生芽诱导、丛生芽继代增殖、生根培养和试管苗移栽等研究工作，建立并优化了竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法：茎尖丛生芽诱导率高；丛生芽继代增殖倍数高且玻璃化率低；芽苗生根率达100％，根系健壮且有侧芽萌发；移栽成活率高，且芽苗健壮，生长快；本发明方法周期短，成本低，完全能满足竹根姜大面积规模化栽培的需要，具有良好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为种姜萌芽；
图2为茎尖初代培养；
图3为培养四代后增殖芽丛；
图4为生根培养；
图5为试管苗规模化移栽。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明以竹根姜为实验材料，***地进行了茎尖丛生芽诱导、丛生芽增殖、生根培养和试管苗移栽等研究工作，建立并优化了竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法。
1、茎尖丛生芽诱导培养基的优化
取重庆文理学院花卉研究所温室大棚中通过催芽获得的竹根姜嫩芽(图1)，用水洗净，消毒灭菌，无菌条件下剥取直径不大于1mm的茎尖作为外植体(图2)，分别接种于6种不同激素浓度配比的诱导培养基，在光照条件下进行丛生芽诱导培养，获得初代丛生芽；诱导培养基以MS培养基作为基本培养基，并添加浓度为30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的琼脂、浓度为1.5、2.0或3.0mg/L的6-BA和浓度为0.1或0.2mg/L的NAA，pH为5.8；培养温度为25±1℃，光照强度为1500lux，光照时间为每天12小时；观察不同激素浓度配比的诱导培养基对竹根姜茎尖丛生芽诱导的影响，统计发芽数和芽生长情况。
结果见表1。由表1可知，不同激素浓度配比的诱导培养基对茎尖丛生芽的诱导影响较大。当NAA浓度为0.2mg/L时，随着6-BA浓度的增加，茎尖丛生芽的诱导率逐渐升高，但当6-BA.浓度增加至3.0mg/L时，诱导芽叶片偏黄且开始出现玻璃化现象；当NAA浓度为0.1mg/L时，随着6-BA浓度的增加，茎尖丛生芽的诱导率先升高再下降，当6-BA浓度增加至3.0mg/L时，诱导芽弱小且出现较严重的玻璃化现象。上述结果表明，茎尖丛生芽的诱导培养基中应添加相对较低浓度的激素，且6-BA和NAA的比例控制在15～20∶1较好，综合考虑诱导率和芽生长情况，本发明优选在诱导培养基中添加浓度为2.0mg/L的6-BA和浓度为0.1mg/L的NAA。
表1不同激素浓度配比的诱导培养基对竹根姜茎尖丛生芽诱导的影响
2、丛生芽继代增殖培养基的优化
将初代丛生芽转接至3种不同硝酸铵浓度的增殖培养基，在光照条件下进行继代增殖培养，获得继代增殖丛生芽；增殖培养基分别以MS培养基、MS(1/2NH4NO3)培养基(其中硝酸铵的浓度仅为MS培养基中硝酸铵浓度的1/2，其余组分及其浓度与MS培养基相同)、MS(1/3NH4NO3)培养基(其中硝酸铵的浓度仅为MS培养基中硝酸铵浓度的1/3，其余组分及其浓度与MS培养基相同)作为基本培养基，并添加浓度为30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的琼脂、浓度为1.5mg/L的6-BA和浓度为0.1mg/L的NAA，pH为5.8；培养温度为25±1℃，光照强度为1500lux，光照时间为每天12小时；观察不同硝酸铵浓度的增殖培养基对竹根姜丛生芽继代增殖和玻璃化的影响，每种培养基接种芽数为30，实验重复3次，40天后统计增殖芽数和玻璃化苗数。
结果见表2。由表2可知，不同硝酸铵浓度的增殖培养基对丛生芽继代增殖的影响较小，随着硝酸铵浓度的逐渐降低，增殖倍数逐渐下降但变化很小；但不同硝酸铵浓度的增殖培养基对丛生芽玻璃化的影响较大，全量浓度的硝酸铵玻璃化率高达20.96％，1/3浓度的硝酸铵玻璃化率最低为4.57％；本发明还曾用含有更低浓度硝酸铵的增殖培养基进行丛生芽增殖培养，发现随着硝酸铵浓度的进一步降低，芽苗长势变弱；因此，综合考虑增殖倍数、玻璃化率和芽苗长势，本发明的增殖培养基优选以MS(1/3NH4NO3)培养基作为基本培养基(图3)。
表2不同硝酸铵浓度的增殖培养基对竹根姜丛生芽继代增殖和玻璃化的影响
3、生根培养基的优化
将继代增殖丛生芽中生长健壮、株高为3～4cm的芽苗转接至5种不同激素浓度配比的生根培养基，在光照条件下进行生根培养，获得试管苗；生根培养基以1/2MS培养基(所含组分种类与MS培养基相同，但各组分的浓度仅为MS培养基中浓度的1/2)作为基本培养基，并添加浓度为20g/L的蔗糖、浓度为6g/L的卡拉胶、浓度为0、0.5或1.0mg/L的6-BA和浓度为0、0.1或0.2mg/L的NAA，pH为5.8；培养温度为25±1℃，光照强度为1500lux，光照时间为每天12小时；观察不同激素浓度配比的生根培养基对竹根姜生根的影响，每种培养基接种芽苗数为30，20天后统计生根数和芽苗生长情况。
结果见表3。由表3可知，竹根姜诱导生根较容易，在生根培养基中单独添加6-BA或NAA均能诱导芽苗生根，但效果较差，当培养基中只加入NAA时，芽苗叶片有黄化现象出现且几乎不萌发侧芽；当培养基中只加入6-BA时，生根率较低且根质量不理想；因此，本发明优选在生根培养基中添加浓度为0.5～1.0mg/L的6-BA和浓度为0.2mg/L的NAA(图4)。
表3不同激素浓度配比的生根培养基对竹根姜生根的影响
4、试管苗移栽基质的优化
将试管苗分别移栽至5种不同基质中培养，获得脱毒组培种苗；5种基质分别为：①珍珠岩；②体积比为1∶9的珍珠岩-泥炭土混合物；③体积比为3∶7的珍珠岩-泥炭土混合物；④体积比为5∶5的珍珠岩-泥炭土混合物；⑤泥炭土；每周施用1次氮磷钾总质量百分含量为25％的氮磷钾三元复混肥(N15P5K5，即氮的质量百分含量为15％，磷和钾的质量百分含量各为5％)，施用浓度为0.1％(g/mL)，基质湿度约为70％，光照强度为2000～3000lux；观察不同移栽基质对竹根姜试管苗成活和生长的影响，每种基质移栽苗数为50，实验重复3次，40天后统计成活数和植株长势。
结果见表4。由表4可知，试管苗在5种不同移栽基质中的成活率均超过70％，但不同基质之间试管苗成活率及生长情况差异较大，其中，以基质③的移栽成活率最高达96.67％，且芽苗健壮，叶色正常，侧芽及新叶萌发快。推测其原因在于：珍珠岩缝隙较大，通透性好，有一定保水能力，但营养较差，单独以其为基质时，试管苗营养吸收较少，导致新根恢复较慢，植株生长较差；泥炭土有一定通透性，保水性好，营养较丰富，单独以其为基质时，试管苗根部易积水，导致烂根现象出现；而将珍珠岩与泥炭土合理配比，可以在保持通透、湿润的同时，又提供充足的有机养分，使新根和植株快速恢复，提高成活率。因此，本发明优选基质③为试管苗移栽基质(图5)。
表4不同移栽基质对竹根姜试管苗成活和生长的影响
5、其它条件的优化
实验中还发现，切割工艺和光照条件对竹根姜丛生芽继代增殖和玻璃化也有较大影响。在进行丛生芽继代增殖时，应将丛生芽分割至含有2～3个芽丛，再将其茎基部0.5cm以上部分切除，形成微型团块转接至增殖培养基上繁殖，注意芽切口不能浸没在培养基中，且接种时要先弃去培养基表面的水层，这样可以提高增殖倍数，减少玻璃化现象的产生。在强光照射条件下，竹根姜丛生芽多代培养后叶片边缘黄化枯萎，这可能与生姜喜弱光，不耐强光的生长习性有关。实验发现，将丛生芽置散射光(光照强度为1500～2500lux)下培养不会出现黄化现象。
6、优化的竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法
综合上述实验结果，优化的竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法，包括以下步骤：
a、茎尖丛生芽诱导：取竹根姜嫩芽，经消毒灭菌后，剥取茎尖作为外植体；将茎尖接种于诱导培养基，在光照条件下进行丛生芽诱导培养，获得丛生芽；所述诱导培养基以MS培养基作为基本培养基，并添加浓度为30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的琼脂、浓度为2.0mg/L的6-BA和浓度为0.1mg/L的NAA，pH为5.8；培养温度为25±1℃，光照强度为1500lux，光照时间为每天12小时；
b、丛生芽继代增殖：将步骤a所得丛生芽转接至增殖培养基(将丛生芽分割至含有2～3个芽丛，再将其茎基部0.5cm以上部分切除，形成微型团块转接至增殖培养基，接种时先弃去培养基表面的水层，并使芽切口露出培养基表面)，在光照条件下进行丛生芽继代增殖培养，获得继代增殖丛生芽；所述增殖培养基以MS(1/3NH4NO3)培养基作为基本培养基，并添加浓度为30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的琼脂、浓度为1.5mg/L的6-BA和浓度为0.1mg/L的NAA，pH为5.8；培养温度为25±1℃，光照强度为1500lux，光照时间为每天12小时；
c、生根培养：当步骤b所得继代增殖丛生芽生长至3～4cm高时，将丛生芽切成单芽，转接至生根培养基，在光照条件下进行生根培养，获得试管苗；所述生根培养基以1/2MS培养基作为基本培养基，并添加浓度为20g/L的蔗糖、浓度为6g/L的卡拉胶、浓度为0.5～1.0mg/L的6-BA和浓度为0.2mg/L的NAA；培养温度为25±1℃，光照强度为1500lux，光照时间为每天12小时；
d、试管苗移栽：将步骤c所得试管苗移栽入体积比为3∶7的珍珠岩-泥炭土混合基质中培养，即得脱毒组培种苗。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (4)
1.竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、茎尖丛生芽诱导：取竹根姜嫩芽，经消毒灭菌后，剥取茎尖作为外植体；将茎尖接种于诱导培养基在光照条件下进行丛生芽诱导培养，获得丛生芽；所述诱导培养基以MS培养基作为基本培养基，并添加浓度为30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的琼脂、浓度为2.0mg/L的6-BA和浓度为0.1mg/L的NAA，pH为5.6～6.2；
b、丛生芽继代增殖：将步骤a所得丛生芽转接至增殖培养基在光照条件下进行丛生芽继代增殖培养，获得继代增殖丛生芽；所述增殖培养基以MS·1/3NH4NO3培养基作为基本培养基，并添加浓度为30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的琼脂、浓度为1.5mg/L的6-BA和浓度为0.1mg/L的NAA，pH为5.6～6.2；所述MS·1/3NH4NO3培养基中硝酸铵的浓度为MS培养基中硝酸铵浓度的1/3，其余组分及其浓度与MS培养基相同；
c、生根培养：当步骤b所得继代增殖丛生芽生长至3～4cm高时，将丛生芽切成单芽，转接至生根培养基在光照条件下进行生根培养，获得试管苗；所述生根培养基以1/2MS培养基作为基本培养基，并添加浓度为20g/L的蔗糖、浓度为6g/L的卡拉胶、浓度为0.5～1.0mg/L的6-BA和浓度为0.2mg/L的NAA，pH为5.6～6.2；所述1/2MS培养基所含组分种类与MS培养基相同，但各组分的浓度仅为MS培养基中浓度的1/2；
d、试管苗移栽：将步骤c所得试管苗移栽入体积比为3∶7的珍珠岩-泥炭土混合基质中培养，即得脱毒组培种苗。
2.根据权利要求1所述的竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法，其特征在于：步骤a～c所述培养温度为25±1℃，光照强度为1500～2500lux，光照时间为每天12～16小时。
3.根据权利要求2所述的竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法，其特征在于：步骤a～c所述光照强度为1500lux，光照时间为每天12小时。
4.根据权利要求1所述的竹根姜脱毒组培种苗工厂化繁育方法，其特征在于：步骤b是将丛生芽分割至含有2～3个芽丛，再将其茎基部0.5cm以上部分切除，形成微型团块转接至增殖培养基，接种时先弃去培养基表面的水层，并使芽切口露出培养基表面。
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