CN105684900B - 一种制备构树人工种子的方法及其专用培养液 - Google Patents

一种制备构树人工种子的方法及其专用培养液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种本发明的目的是提供一种制备构树人工种子的方法及其专用培养液。本发明首先提供了一种制备构树人工种子的方法，包括如下步骤：(a1)在培养液丁中孵育构树体细胞胚；培养液丁的制备方法：每升1/10MS培养基中加入1.8‑2.2mg 6‑BA、0.9‑1.1mg NAA、18‑22g蔗糖、0.9‑1.1g低分子量壳聚糖、0.9‑1.1g草酸和36‑44g海藻酸钠；(a2)将步骤(a1)得到的体系加入0.9‑1.1g/100mL CaCl2水溶液中，孵育，得到构树人工种子。本发明还保护一种制备构树人工种子的培养液，为所述培养液丁。本发明可以实现构树种苗的高效繁育，满足构树种苗的市场需求，具有重大的推广价值。

Description

一种制备构树人工种子的方法及其专用培养液
技术领域
本发明涉及一种制备构树人工种子的方法及其专用培养液。
背景技术
构树又称楮树，Broussoneti Papyrifera(L)Vent，属桑科植物的落叶乔木，各种类型的土壤几乎都能生长，极少病虫害，耐干冷，耐湿热，根系发达，是保护生态环境和水土保持的一种优良树种。构树的树冠较大，对空气中汽车尾气和其它类型的霾尘等吸附能力较强，因此还是环境绿化及行道树的常用树种。构树全身都能利用：树皮纤维洁白、细长，是制造铜版纸等高档纸的原料和纺织原料，价值高，市场需求量大；树杆是生产纸张、纤维板的好原料；树叶含有丰富的粗蛋白、氨基酸、微量元素，是制备优质青储饲料的原料；树叶中含有黄酮等活性成分，具有降糖和血脂的用途。采用高密度栽培技术种植构树，亩产韧皮纤维200公斤，树杆1500公斤，优质饲料树叶1500公斤。目前，环境绿化造林和经济农业等对于构树种苗的需求非常大，每年将达到2000万株。
目前构树的种苗制备主要靠扦插和组培苗供应。扦插存在着季节性、场地占用面积大、效率低、劳动强度大等问题。常规组培方法存在着人工成本高、劳动量大、成本高等问题。因此，采用效率更高、成本更低、劳动量更小的生物技术进行构树种苗的快速繁殖与生产具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备构树人工种子的方法及其专用培养液。
本发明首先提供了一种制备构树人工种子的方法，包括如下步骤：
(a1)在培养液丁中孵育构树体细胞胚；
培养液丁的制备方法：每升1/10MS培养基中加入1.8-2.2mg 6-BA、0.9-1.1mgNAA、18-22g蔗糖、0.9-1.1g低分子量壳聚糖、0.9-1.1g草酸和36-44g海藻酸钠；
(a2)将步骤(a1)得到的体系加入0.9-1.1g/100mL CaCl2水溶液中，孵育，得到构树人工种子。
所述步骤(a1)中，所述孵育的条件为：室温静置孵育3分钟。
所述步骤(a2)中，所述孵育的条件为：室温静置孵育30分钟。
所述培养液丁的制备方法具体可：每升1/10MS培养基中加入2mg 6-BA、1mg NAA、20g蔗糖、1g低分子量壳聚糖、1g草酸和40g海藻酸钠。
所述培养液丁的pH具体可为6.0。
所述CaCl2水溶液具体可为1g/100mL CaCl2水溶液。
所述制备构树人工种子的方法中，所述构树体细胞胚、所述培养液丁和所述CaCl2水溶液的配比如下：1.5×104个构树体细胞胚：1500mL培养液丁：3000mL CaCl2水溶液。
所述步骤(a2)中，还包括如下步骤：进行所述孵育后，弃上清并用无菌去离子水冲洗。
本发明还提供了一种构树扩繁方法，包括如下步骤(b1)：将以上任一所述方法制备的构树人工种子置于MS固体培养基上，20-25℃、光暗交替培养。所述光暗交替培养具体可为12小时光照/12小时黑暗。所述光照的光照强度具体可为3000lx。所述培养具体可为静置培养。所述培养的时间具体可为20天。
所述构树扩繁方法还可包括如下步骤(b2)：完成步骤(b1)后，将小苗置于20-25℃、光暗交替的条件下培养。所述光暗交替具体可为12小时光照/12小时黑暗。所述光照的光照强度具体可为3000lx。所述培养时的空气湿度具体可为100％。所述培养采用的培养基质的制备方法为：取砂子，用水冲洗，然后用5g/100mL多菌灵水溶液拌湿，10分钟后用水冲洗3遍。所述培养的时间具体可为25天。
以上任一所述构树体细胞胚的制备方法可为方法甲，包括如下步骤：
(Ⅰ)取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2，接种到培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
(Ⅱ)取步骤(Ⅰ)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
(Ⅲ)取步骤(Ⅱ)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，23±2℃黑暗培养25天；
(Ⅳ)将1g步骤(Ⅲ)得到的胚性愈伤组织加至10ml培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(Ⅴ)完成步骤(Ⅳ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(Ⅵ)完成步骤(Ⅴ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(Ⅶ)完成步骤(Ⅵ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(Ⅷ)完成步骤(Ⅶ)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(Ⅸ)将1体积份步骤(Ⅷ)得到的培养体系与2体积份培养基丙混合，23±2℃、12小时光照/12小时黑暗、100rpm振荡培养30天；
所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基；所述培养基乙为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；所述培养基丙为含0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。
步骤(Ⅸ)中，所述光照的条件可为1500-2000lx，具体可为1500lx。
以上任一所述构树体细胞胚的制备方法可为方法乙，包括如下步骤：
(1)将构树的胚性愈伤组织加至培养基乙中进行培养；所述培养基乙为含0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培养基；
(2)完成步骤(1)后，将培养体系转接至培养基丙中进行培养；所述培养基丙为含0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的1/2MS培养基。
方法乙中，所述构树的胚性愈伤组织的制备方法如下：取构树的外植体，接种到培养基甲上，进行培养；所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。
方法乙中，所述构树的胚性愈伤组织的制备方法如下：
①取构树的外植体，接种到培养基甲上，培养；
②取步骤①得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；
③取步骤②得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；
所述培养基甲为含0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉的MS培养基。
所述构树的外植体为构树无菌苗的叶或构树无菌苗的茎。所述构树的外植体具体如下：取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2。所述构树的外植体具体如下：取构树无菌苗的茎，切成1cm的茎段。
①、②和③中，所述培养的条件均为：23±2℃黑暗培养25天。
所述步骤(1)具体包括如下步骤：
(1-1)将1g构树的胚性愈伤组织加至10ml所述培养基乙中，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-2)完成步骤(1-1)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-3)完成步骤(1-2)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-4)完成步骤(1-3)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天；
(1-5)完成步骤(1-4)后，将1体积份培养体系与1体积份所述培养基乙混合，23±2℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
所述步骤(2)中，所述培养的条件为：23±2℃、12小时光照/12小时黑暗、振荡培养30天。
所述步骤(2)中，培养体系和所述培养基丙的配比为：
1体积份培养体系：2体积份培养基丙。
所述步骤(2)中，所述振荡培养具体可为100rpm振荡培养。
所述步骤(2)中，所述光照的条件可为1500-2000lx，具体可为1500lx。
本发明还保护一种制备构树人工种子的培养液，为培养液丁；所述培养液丁的制备方法：每升1/10MS培养基中加入1.8-2.2mg 6-BA、0.9-1.1mg NAA、18-22g蔗糖、0.9-1.1g低分子量壳聚糖、0.9-1.1g草酸和36-44g海藻酸钠。所述培养液丁的制备方法具体可：每升1/10MS培养基中加入2mg 6-BA、1mg NAA、20g蔗糖、1g低分子量壳聚糖、1g草酸和40g海藻酸钠。
以上任一所述低分子量壳聚糖为分子量为2000-4000道尔顿的壳聚糖。以上任一所述低分子量壳聚糖的分子式为“(C6H11NO4)n”，n＝10-20。以上任一所述低分子量壳聚糖具体可为购自上海三杰生物技术有限公司，产品目录号为9012-76-4的壳聚糖。
以上任一所述1/10MS培养基具体可为：NH4NO3165mg/L、KNO3190mg/L、KH2PO417mg/L、MgSO4·7H2O 37mg/L、CaCl2·2H2O 44mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、H3BO36.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2-EDTA 37.25mg/L、FeSO4·7H2O 27.85mg/L、甘氨酸2mg/L、维生素B10.4mg/L、维生素B60.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、蔗糖30000mg/L，余量为水。
以上任一所述构树具体可为大连中植环境生物科技有限公司培育的快活林品牌杂交构树。
本发明可以实现构树种苗的高效繁育，满足构树种苗的市场需求，具有重大的推广价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本实施例中所用的构树为大连中植环境生物科技有限公司培育的快活林品牌杂交构树。
6-BA的全称为6-苄氨基腺嘌呤，购自上海三杰生物技术有限公司，产品目录号为1214-39-7。
NAA的全称为α-萘乙酸，购自上海三杰生物技术有限公司，产品目录号为86-87-3。
低分子量壳聚糖，分子式为“(C6H11NO4)n”，n＝10-20,分子量为2000-4000道尔顿，购自上海三杰生物技术有限公司，产品目录号为9012-76-4。
MS液体培养基配方见表1。
表1
MS固体培养基：每升MS液体培养基中加入50g琼脂糖。
1/2MS培养基：NH4NO3825mg/L、KNO3950mg/L、KH2PO485mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO36.2mg/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2-EDTA 37.25mg/L、FeSO4·7H2O 27.85mg/L、甘氨酸2mg/L、维生素B10.4mg/L、维生素B60.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、蔗糖30000mg/L，余量为水。
1/10MS培养基：NH4NO3165mg/L、KNO3190mg/L、KH2PO417mg/L、MgSO4·7H2O 37mg/L、CaCl2·2H2O 44mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO36.2mg/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、Na2-EDTA 37.25mg/L、FeSO4·7H2O 27.85mg/L、甘氨酸2mg/L、维生素B10.4mg/L、维生素B60.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、蔗糖30000mg/L，余量为水。
实施例1、制备体细胞胚
1、制备胚性愈伤组织
(1)取构树无菌苗的叶片，切成0.5×0.5cm2，接种到培养基甲上，20-25℃黑暗培养25天。此时可以观察到从叶片切口处生长出浅黄色愈伤组织，即胚性愈伤组织。
(2)取步骤(1)得到的胚性愈伤组织，接种到培养基甲上，20-25℃黑暗培养25天。
(3)取步骤(2)得到的胚性愈伤组织，接种到培养基甲上，20-25℃黑暗培养25天。
实际操作中，可以持续按照步骤(2)的方法进行继代培养。
培养基甲(固体)：取MS液体培养基，每升加入0.5mg 2,4-二氯苯氧乙酸、30g蔗糖和5g琼脂粉。
2、液体悬浮培养
(1)将1g步骤1的(3)得到的胚性愈伤组织加至10ml培养基乙中，20-25℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
(2)完成步骤(1)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，20-25℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
(3)完成步骤(2)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，20-25℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
(4)完成步骤(3)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，20-25℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
(5)完成步骤(4)后，将1体积份培养体系与1体积份培养基乙混合，20-25℃、黑暗、100rpm振荡培养25天。
实际操作中，可以按照步骤(2)的方法进行3-5次继代培养，得到稳定的悬浮细胞体系。
培养基乙(液体)：取1/2MS培养基，每升加入0.5mg 2,4-二氯苯氧乙酸和30g蔗糖的。
3、制备体细胞胚
将1体积份步骤2的(5)得到的培养体系与2体积份培养基丙混合，20-25℃、12小时光照(光照强度为1500lx)/12小时黑暗、100rpm振荡培养30天，此时培养体系中体细胞胚的浓度大于等于15000个/L。
培养基丙(液体)：取1/2MS培养基，每升加入0.5mg NAA(α-萘乙酸)、0.2mmol TDZ(thidiazuron)、0.4mg IBA(3-吲哚丁酸)、0.4mg 6-BA(6-苄氨基嘌呤)和30g蔗糖。
实施例2、按照本发明提供的方法制备构树人工种子
培养液丁的制备方法(pH6.0)：取1/10MS培养基，每升加入2mg 6-BA、1mg NAA、20g蔗糖、1g低分子量壳聚糖、1g草酸和40g海藻酸钠。
1、将1.5×104个(约10g)实施例1得到的体细胞胚放入1500mL培养液丁中并混匀，室温静置孵育3分钟。
2、用胶头滴管吸取步骤1得到的体系并逐滴滴加在装有3000mL 1g/100mL CaCl2水溶液的烧杯中，室温静置孵育30min，弃上清液，用无菌去离子水冲洗3-4次，获得构树人工种子。
实施例3、按照现有方法制备构树人工种子
培养液戊的制备方法：取1/2MS培养基，每升加入30g海藻酸钠。
将实施例1得到的体细胞胚放入培养液戊中并室温浸泡3-4min，然后转移至0.5g/100mL CaCl2水溶液中并室温浸泡3min，弃上清液，用无菌去离子水冲洗3-4次，获得构树人工种子。
实施例4、制备构树无菌苗
取100粒实施例2制备的构树人工种子和100粒实施例3制备的构树人工种子，分别进行如下步骤：
1、将构树人工种子置于MS固体培养基上，20-25℃、12小时光照(本实施例中的光照强度为3000lx)/12小时黑暗、静置培养20d(此时，大部分种子形成芽长约3cm的小苗)。
2、完成步骤1后，将小苗移栽到育苗盆中(取砂子，用水冲洗，然后用5g/100mL多菌灵水溶液拌湿，10分钟后用水冲洗3遍，然后分装在育苗盆中)，20-25℃、12小时光照(本实施例中的光照强度为3000lx)/12小时黑暗、空气湿度100％、静置培养25天。
萌发率＝完成步骤1时萌发的种子数量/种子总数量×100％。
成苗率＝完成步骤2时成苗的种子数量/种子总数量×100％。
种子总数量＝100。
进行三次重复试验，结果取平均值。
萌发率和成苗率的结果见表2。
表2

Claims (10)

1.一种制备构树人工种子的方法，包括如下步骤：
(a1)在培养液丁中孵育构树体细胞胚；
所述培养液丁的制备方法：每升1/10MS培养基中加入1.8-2.2mg 6-BA、0.9-1.1mgNAA、18-22g蔗糖、0.9-1.1g低分子量壳聚糖、0.9-1.1g草酸和36-44g海藻酸钠；
(a2)将步骤(a1)得到的体系加入0.9-1.1g/100ml CaCl2水溶液中，孵育，得到构树人工种子；
所述低分子量壳聚糖为分子量为2000-4000道尔顿的壳聚糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(a1)中，所述孵育的条件为：室温静置孵育3分钟。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(a2)中，所述孵育的条件为：室温静置孵育30分钟。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述培养液丁的制备方法：每升1/10MS培养基中加入2mg 6-BA、1mg NAA、20g蔗糖、1g低分子量壳聚糖、1g草酸和40g海藻酸钠。
5.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述培养液丁的pH为6.0。
6.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述构树体细胞胚、所述培养液丁和所述CaCl2水溶液的配比如下：1.5×104个构树体细胞胚：1500ml培养液丁：3000ml CaCl2水溶液。
7.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(a2)中，还包括如下步骤：进行所述孵育后，弃上清并用无菌去离子水冲洗。
8.一种构树扩繁方法，包括如下步骤(b1)：将权利要求1至7中任一所述方法制备的构树人工种子置于MS固体培养基上，20-25℃、光暗交替培养。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(b2)：完成步骤(b1)后，将小苗置于20-25℃、光暗交替的条件下培养。
10.一种制备构树人工种子的培养液，为培养液丁；
所述培养液丁的制备方法：每升1/10MS培养基中加入1.8-2.2mg 6-BA、0.9-1.1mgNAA、18-22g蔗糖、0.9-1.1g低分子量壳聚糖、0.9-1.1g草酸和36-44g海藻酸钠；
所述低分子量壳聚糖为分子量为2000-4000道尔顿的壳聚糖。
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