CN118222548A - 一种耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种耐盐耐葡萄糖的β‑葡萄糖苷酶B0‑BG36及其应用。属于基因工程技术领域。该β‑葡萄糖苷酶是在新疆克拉玛依盐碱地土壤未培养微生物宏基因组中鉴定出的一个GH1家族的新的β‑葡萄糖苷酶基因b0‑bg36，并通过克隆以及异源表达获取了β‑葡萄糖苷酶B0‑BG36，B0‑BG36具有很高的酶活性，在高温、不同pH条件、金属离子和抑制剂的作用下均可以有效保持酶活性，尤其对盐和葡萄糖具有很高的耐受性。本发明还提供了该β‑葡萄糖苷酶的基因及其应用打破了现有技术胞内生产β‑葡萄糖苷酶的模式，解决了现有β‑葡萄糖苷酶酶活性低，且易受末端产物葡萄糖抑制的问题。

Description

一种耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是一种耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36及其应用。

背景技术

纤维素(cellulose)作为植物细胞壁的主要成分，是由葡萄糖组成的不溶于水及一般有机溶剂的多糖，在自然界中分布广泛。是世界上现存最多的可再生生物质资源，但由于纤维素的结构复杂，目前这一巨大资源尚未得到有效利用。

纤维素酶是能够将纤维素降解，并将其转化为葡萄糖的一类酶的总称。包括内切-1,4-β-葡聚糖酶(内切-葡聚糖酶，EC 3.2.1.4)，外切-1,4-β-葡聚糖酶(纤维素生物水解酶，EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。β-葡萄糖苷酶是纤维素完全生物转化的必需酶，它能水解纤维二糖生成葡萄糖，解除产物纤维二糖对内切-葡聚糖酶和外切-葡聚糖酶的抑制作用，是纤维素降解的限速酶。β-葡萄糖苷酶应用广泛，能用于食品、化妆品、生物燃料和制药等行业，近年来随着木质纤维素乙醇的发展，β-葡萄糖苷酶受到越来越多的关注。β-葡萄糖苷酶普遍存在于大多数微生物中，但是许多微生物产生的β-葡萄糖苷酶为胞内酶，产量很低，易受末端产物葡萄糖的抑制；且由于实验室纯培养技术条件的限制，99％以上的微生物无法培养，因此极大的限制了β-葡萄糖苷酶的发展。

未培养微生物是地球上最大的尚未开发的生物资源。宏基因组技术不依赖于微生物培养，可以直接从环境DNA中获得大多数基因的核苷酸序列。因此，宏基因组技术在未培养的极端环境微生物中提取β-葡萄糖苷酶方面具有很大的潜力。

因此，如何利用宏基因组技术，提供一种耐盐、耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36及其应用，该β-葡萄糖苷酶是利用宏基因组技术从新疆克拉玛依盐碱地土壤宏基因组中鉴定出了一个GH1家族新的β-葡萄糖苷酶基因b0-bg36，并将其导入大肠杆菌中进行克隆以及异源表达获取的，具有很高的酶活性，在高温、不同pH条件、金属离子和抑制剂的作用下均可以有效保持酶活性，尤其对盐和葡萄糖具有很高的耐受性。打破了现有技术胞内生产β-葡萄糖苷酶的模式，解决了现有β-葡萄糖苷酶酶活性低，且易受末端产物葡萄糖抑制的问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36，所述β-葡萄糖苷酶B0-BG36的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的再一目的在于提供一种编码上述耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的再一目的在于提供β-葡萄糖苷酶B0-BG36的基因在编码β-葡萄糖苷酶B0-BG36中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种表达载体，该表达载体含有编码β-葡萄糖苷酶B0-BG36的基因。

本发明的再一目的在于提供一种含有上述表达载体的微生物。

本发明的再一目的在于提供上述耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36在纤维素降解中的应用。

本发明的再一目的在于提供上述耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36在食品、饲料、纺织或纤维素乙醇制备中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用宏基因组技术，在新疆克拉玛依盐碱地土壤未培养微生物宏基因组中鉴定出了一个GH1家族的新的β-葡萄糖苷酶基因b0-bg36，并通过克隆以及异源表达获取了β-葡萄糖苷酶B0-BG36，是一个耐盐耐受葡萄糖的新型β-葡萄糖苷酶，有较强的pH耐受性及金属离子耐受性，比较嗜热嗜酸，在食品、饲料、纺织和纤维素乙醇生产等领域具有潜在的运用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1：B0-BG36与邻近β-葡萄糖苷酶蛋白序列的***发育树；

图2：SDS-PAGE胶图分析重组β-葡萄糖苷酶B0-BG36，注1.蛋白Marker；2.E.coliDH5α/pSHY211-B0-BG36总蛋白；3.纯化后的B0-BG36蛋白质；

图3：温度和pH值对重组β-葡萄糖苷酶B0-BG36酶活性和稳定性的影响；

图4：葡萄糖对重组β-葡萄糖苷酶B0-BG36及工业纤维素酶活性的影响；

图5：NaCl对重组β-葡萄糖苷酶B0-BG36活性的影响；

图6：以纤维二糖为底物的B0-BG36的Lineweaver-Burk双倒数图；

图7：以α-乳糖一水合物为底物的B0-BG36的Lineweaver-Burk双倒数图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中所用菌株、质粒如下：

E.coliDH5α：购买于深圳康体生命科技有限公司，用于β-葡萄糖苷酶基因的克隆和表达宿主；

载体质粒：使用本实验室自主构建的组成型表示载体pSHY211用于重组质粒的构建，pSHY211构建过程于2023年9月发表于Scientifc Reports(Yin et al.,2023)文章引用信息为Yin,YR.,Li,XW.,Long,CH.et al.Characterization ofa GH10 extremelythermophilic xylanase from the metagenome ofhot spring for prebioticproduction.Sci Rep 13,16053(2023)。

实施例1

样品采集及宏基因组DNA提取及测序

样品采自新疆克拉玛依盐碱地土壤，冻于冰中，并进行富集培养，根据操作说明书，使用PowerSoil Kit(MOBIO dnasy PowerSoil Kit,New York,NY,USA)提取宏基因组DNA，从测序公司返回的宏基因组数据库中预测到一个GH1家族的β-葡萄糖苷酶功能基因，大小为1344bp，命名为b0-bg36，其核苷酸序列：

>b0-bg36

ATGGAATCAAAGATATTTCCAAAGAACTTTATATGGGGAACAGCTACGGCATCATACCAGATAGAAGGTGCCTGGAAAGAAGACGGGAAAGGGGAGTCCATCTGGGACCGTTTTACCCATATCCCCGGGAAGATATATAATGATGATAATGGGGATGTTGCCTGCGATCATTATCATCGATATGAAGAAGACGTTAAACTTATGAAGGAATTGGGGATTAAATCCTATAGGCTTTCCCTCTCCTGGCCAAGGCTTTTTCCTGACGGGACGGGTGAACCTAATCAAAAGGGAGTAGAATTCTACAAAAAGCTCATTACCATGATTAAGGAAAATGGAATTGTCCCCTGCGTAACATTATTCCACTGGGATCTGCCCCAGAAGTTACAGGAAAAAGGTGGATGGGCAAACAGAGATTCTGTTCAATGGTTTGAGGACTATGCCAGATTTGTCTTTGAACAGTTTGGGGATCAAGTACCGTATTGGATCACCCATAACGAGCCGTATGTGACCAGTTTTATGGGACATTGGAGAGGCGTCTTTGCTCCAGGCATTTCAGATATTTCTACTGGCATATTAACAGCACATCACTTGCTTCTTTCTCATGGAAGGGCAGTGGCAGCTTATCGAGAAATGGGTTTTACGGGGGACATAGGAATTACTTTGAATCTTTCACCTTTTTACACACTTACAGACAAAGAGGAAGATAAAAGAGCTGCTCGTCTGGAAGATGGACATTTAAACAGATGGTTTCTAGATCCTGTTTTAAAGGGGAAGTATCCTGAGGACATGATAGATTTTTATAGCACCAAGGAAGGAATTACGCTACCGGAATTTTCCGAAGAGGACATGAAAACCATTAGCATTCCGACTGATTTTCTAGGATTGAATTACTATTTTGGCTCATATCTTGCAAAAGGAGATAGCTGGCCATTTGGAAGCCAATGGGTGGATGCAGGATACCAAAAAACCGAGATGGGATGGAATATTACGCCGGAAGCTTTTTACGACTTACTGGTACGCCTTCACAAGGAATATGACGGCGTGAAAATCGTAGTGACAGAAAACGGCATGGCTGTTAATGATCGTGTAGATAGAAATGGAGAAGTGAAGGACTTTGATAGAATAGACTATCTATACACTCACTTTGAGCAGGCCCATAGAGCTATAAATGAAGGGGTTAATTTGGCTGGATACTACGTATGGTCACTCATGGATAACTTTGAGTGGGCAAGTGGATATTCAAAGCGTTTTGGGCTTATTCATATTAACTATAAGACACTGAAAAGAACACCGAAAGAGAGTTTTTACTGGTATAAGACGGTAATAGAAAAGAACGGATTATAG,SEQ ID NO.1.

实施例2

基因扩增、克隆表达、重组子筛选以及B0-BG36的表达、分离纯化和鉴定

(1)基因扩增：针对β-葡萄糖苷酶基因b0-bg36，设计引物b0-bg36-F和b0-bg36-R，对该基因进行PCR扩增，扩增完成后利用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用DNA胶回收试剂盒回收产物。

PCR扩增条件：95℃预变性3min，98℃变性15s，60℃退火20s、72℃延伸30s，32个循环，最后72℃继续延伸5min

引物序列：

b0-bg36-F:5'-CATCATCATCATCATCATGAAATGGAATCAAAGATATTTCCA-3',SEQ IDNO.2

b0-bg36-R:5'-GTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGTAATCCGTTCTTTTCTATTACC-3',SEQ IDNO.3

下划序列代表与先前用EcoR I和Hind III酶切的pSHY211载体的同源重组片段。

(2)重组质粒的制备：利用pEASY-Uni无缝克隆与组装试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，中国，货号：CU101-01)将胶回收后的PCR产物与pSHY211载体进行连接，获得重组质粒pSHY211-B0-BG36；

(3)基因的克隆表达：将重组质粒pSHY211-B0-BG36导入感受态E.coli DH5α菌株进行克隆及表达；

(4)重组子的筛选：采用双层平板法对含有重组质粒的大肠杆菌克隆进行筛选，第一层培养基(LB培养基，含50μg/mL卡那霉素，2％琼脂)在37℃下培养大肠杆菌克隆16h；然后加入第二层培养基(PBS缓冲液，含1％琼脂糖，1‰七叶苷，1％溶菌酶，含50μg/mL卡那霉素)，完全覆盖住克隆子，37℃孵育2h后，观察大肠杆菌克隆子的菌落颜色，筛选具有黑褐色水解圈的重组大肠杆菌克隆，即为重组子E.coli DH5α/pSHY211-B0-BG36。

(5)B0-BG36的表达、分离纯化和鉴定：

将E.coli DH5α/pSHY211-B0-BG36接种于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板中活化，活化后挑取单菌落置于100mL LB液体培养基中，在37℃下以180rpm连续振荡培养8h。再转移到25℃，180rpm，继续震荡培养12h。培养结束后，于4℃、12000r/min离心20min收集菌体，超声破碎菌体细胞。再次离心后，采用Ni-NTA层析法进行重组蛋白纯化，采用Bradford法测量蛋白质浓度，利用SDS-PAGE电泳对酶的蛋白大小进行鉴定分析，使用BLASTx和BLASTp在线软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对其DNA和蛋白质序列进行分析，并使用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测其信号肽，ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)对其理论等电点和分子量进行预测。通过MEGA 7软件采用最大似然方法(ML)和泊松校正模型构建***发育树(图1)。

经分析，β-葡萄糖苷酶B0-BG36的氨基酸序列如下：

>B0-BG36

MESKIFPKNFIWGTATASYQIEGAWKEDGKGESIWDRFTHIPGKIYNDDNGDVACDHYHRYE

EDVKLMKELGIKSYRLSLSWPRLFPDGTGEPNQKGVEFYKKLITMIKENGIVPCVTLFHWDLP

QKLQEKGGWANRDSVQWFEDYARFVFEQFGDQVPYWITHNEPYVTSFMGHWRGVFAPGIS

DISTGILTAHHLLLSHGRAVAAYREMGFTGDIGITLNLSPFYTLTDKEEDKRAARLEDGHLNR

WFLDPVLKGKYPEDMIDFYSTKEGITLPEFSEEDMKTISIPTDFLGLNYYFGSYLAKGDSWPF

GSQWVDAGYQKTEMGWNITPEAFYDLLVRLHKEYDGVKIVVTENGMAVNDRVDRNGEVKD

FDRIDYLYTHFEQAHRAINEGVNLAGYYVWSLMDNFEWASGYSKRFGLIHINYKTLKRTPKESFYWYKTVIEKNGL，SEQ ID NO.4.

结果分析：

根据蛋白序列比对发现，B0-BG36与Clostridiaceae bacterium来源的GH1家族β-葡萄糖苷酶(NLU52715.1)相似性为62.05％，与Clostridia bacterium来源的β-葡萄糖苷酶(MBZ4645305.1)相似性为63.33％，与Petroclostridiumsp.来源的β-葡萄糖苷酶(MDK2809480.1)相似性也为63.33％。

在ExPASy网站(https://web.expasy.org/compute_pi/)预测的B0-BG36理论等电点(pI)和分子量(Mw)分别为5.45和51.98kDa。该基因在E.coli DH5α中表达，并使用Ni螯合亲和柱纯化具有His标记N-末端的重组蛋白。经SDS-PAGE电泳分析后发现重组β-葡萄糖苷酶B0-BG36的蛋白分子量与理论预测的一致，说明已获得重组目的蛋白(图2)。

实施例3

(1)纯化后β-葡萄糖苷酶B0-BG36最适温度和温度耐受

在pH 7的条件下，于不同温度(10-75℃)下测定纯化后的β-葡萄糖苷酶的相对酶活，设定5℃为一个梯度，测定最适反应温度。

热稳定性分析通过将纯酶溶液在不同温度(50℃、55℃和60℃)下分别孵育60min，每隔20min取样一次，测定B0-BG36的酶残余活性。

结果分析：在最适pH值下，B0-BG36在45-60℃之间表现出较高的活性，活性维持在40％以上，以纤维二糖和α-乳糖一水合物为底物时的最适温度都为55℃，酶活性都是到65℃时迅速下降，在65℃时以α-乳糖一水合物为底物的酶活性几乎丧失。而以纤维二糖为底物的酶活性在75℃时才失活(图3中A)以纤维二糖为底物时，55℃的半衰期是36min，酶在50℃下孵育60min酶的残余活性在70％以上，而60℃下孵育20min后酶失去活性(图3中C)。

(2)最适反应pH和pH稳定性

用不同pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0)和不同pH值的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(8.0、8.6、9.0、9.6、10.0)，与B0-BG36在最适温度中进行酶促反应，记录其最适pH。为分析pH稳定性，将酶于4℃在不同pH值(3.0-10.0)的缓冲液中分别孵育12和24小时后测定重组酶在各pH值处理下的残留酶活性，以评估其pH稳定性。

结果分析：B0-BG36在以纤维二糖和α-乳糖一水合物为底物时最适pH都为5.0，以纤维二糖为底物时的最佳pH值范围为4.6至8.6，pH适应范围较广且稳定(图3中B)。而以α-乳糖一水合物为底物在不同pH值下时，酶的稳定性较差，酶活性随pH值的升高而迅速降低。以纤维二糖为底物，在4℃下不同pH缓冲液中，B0-BG36孵育12h和24h后酶活性在5-10的pH范围内是稳定的，基本维持在60％以上，特别是碱性条件下具有较强的耐碱性，在pH为10.0时活性保持在75％以上(图3中D)。

(3)不同金属离子和抑制剂对重组酶的影响

在反应体系中分别加入不同的金属离子(K⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Mn²⁺、Pb²⁺和Ni²⁺)终浓度为1mM和10mM，及化学试剂[乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、吐温-80(Tween-80)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、乙醇(Ethanol)终浓度为1％、0.1％，在最适反应条件下进行酶促反应，记录这些添加物对酶活性的影响，实验结果如表1所示。

表1金属离子和化学试剂对B0-BG36酶活性的影响

结果分析：B0-BG36对金属离子的耐受性强，虽然随着离子浓度的增加，对酶活性有一定的影响，但是大多数金属离子对其酶活性无明显抑制作用。该重组酶在10mM和1mM离子浓度下，55℃中孵育30min后，绝大部分离子中酶的残余活性还能保持在80％以上。在参与实验的11种离子中，Ag⁺对其的抑制性最强，在10mM浓度下对酶活性有强烈的抑制作用，使酶几乎失活。高浓度(1％)SDS完全抑制了B0-BG36酶活性，其他化学试剂存在时，酶活性随着溶剂浓度的增加而降低。除了Tween-80和SDS在1％浓度时对酶活性有强烈抑制作用，其余化学试剂对B0-BG36的酶活性都没有太大影响。总的来说，B0-BG36在大多数金属离子和化学试剂中是稳定的，酶活性不受它们的影响。

(4)葡萄糖浓度对酶活性的影响

使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)作为底物，将10μL的B0-BG36和10μL的工业纤维素酶(终浓度为1mg/mL，含有β-葡萄糖苷酶组分)加入到含有10mM pNPG(15μL)的125μL不同浓度(0mM、500mM、1000mM、1500mM、2000mM、2500mM、3000mM、3500mM、4000mM)的葡萄糖溶液中，以不加酶的为对照组。B0-BG36在55℃下孵育10分钟，工业纤维素酶在50℃下孵育10分钟后，通过加入450μL 1M的Na₂ CO₃终止反应，使用酶标仪在405nm处测定其吸光值。

结果分析：以1mM pNPG为底物测定B0-BG36和工业纤维素酶的葡萄糖耐受性，在没有外源葡萄糖的情况下测定B0-BG36和工业纤维素酶的活性，并将其设置为100％。当0mM＜添加的葡萄糖浓度≤2500mM时，葡萄糖能够激活B0-BG36的活性，特别是当葡萄糖浓度为500mM时，酶活性被激活到222.3％，IC50为3302.5mM。B0-BG36在4000mM葡萄糖存在下还具有30％以上的活性。而葡萄糖对工业纤维素酶的活性具有很大的抑制作用，当添加的葡萄糖浓度为500mM时，纤维素酶的相对活性降到30％以下，葡萄糖浓度为1000mM时，酶几乎失活。本研究的新型重组β-葡萄糖苷酶B0-BG36与工业纤维素酶相比，对葡萄糖具有很高的耐受性，是进一步研究和工业应用理想的耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶(图4)。

(5)盐浓度对重组酶的影响

为测定盐浓度对B0-BG36酶活力的影响，在55℃、pH 5.0下使用不同盐浓度缓冲液检测不同盐浓度对酶液的影响。配置不同浓度的NaCl溶液(0mM，500mM，1000mM，1500mM，2000mM，2500mM，3000mM)，分别溶解在1mL缓冲液中，以未添加NaCl的反应混合物作为对照(100％)。

结果分析：如图5所示，B0-BG36在高浓度NaCl(0-3000mM)溶液中表现出较好的酶活性，500mM NaCl存在时保留了80％以上的活性，1000mM NaCl存在下保留了30％以上的活性，随着盐浓度的增加酶活性逐渐下降。

(6)底物特异性和动力学参数测定

向酶反体系中加入不同的底物(纤维二糖、4-硝基苯基-D-吡喃萄糖苷、α-乳糖一水合物、龙胆二糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、棉子糖、蔗糖、羧甲基纤维素钠、微晶、山毛榉木聚糖、玉米芯木聚糖)置于最适反应条件下测定水解产物的生成量。

动力学参数的测定，分别使用不同浓度的纤维二糖和α-乳糖一水合物(0.2％-2％)在最适温度和pH下分别反应5min和10min，利用Michaelis Menten方程计算B0-BG36的动力学参数(Vmax和Km)，画出Lineweaver-Burk双倒数图。

表2：β-葡萄糖苷酶B0-BG36对不同底物的水解能力

结果分析：B0-BG36对4-硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的水解活性最高(7.7±4.7U/mg)，其余的是纤维二糖(2.5±4.2U/mg)、α-乳糖一水合物(1.8±3.5U/mg)，龙胆二糖(0.9±1.8U/mg)，而对其余底物(麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、棉子糖、蔗糖、羧甲基纤维素钠、微晶、山毛榉木聚糖、玉米芯木聚糖)都无水解活性(表2)。这一结果表明，B0-BG36优先作用于人工合成底物pNPG，之后依次是纤维二糖、α-乳糖一水合物、龙胆二糖。该重组酶除了能水解天然底物纤维二糖外，还能水解人工合成的底物，说明能水解多种底物，是多功能酶。

纤维二糖是存在于自然环境中的天然底物，所以成为主要的研究对象。以纤维二糖为底物，得到B0-BG36在与底物反应10min后的Lineweaver-Burk双倒数图，以此计算该重组酶对纤维二糖的Km值是31.39mM，Vmax是10.45μmol/min/mg(图6)，当以α-乳糖一水合物为底物时得到的Km值为109.12mM，Vmax为23.87μmol/min/mg(图7)，这意味着其对纤维素二糖具有高亲和力，这可能是由于酶的特异性决定的，也就是说在漫长的进化过程中，微生物来源的β-葡萄糖苷酶与天然底物，如纤维二糖的接触更多，而不是与一些人工合成底物。

(7)β-葡萄糖苷酶的酶活测定

以纤维二糖为底物测定β-葡萄糖苷酶活性。将10μL酶液加入到90μL含有1％(w/v)纤维二糖的缓冲液中，在最适条件下反应10min，后置于-80℃下冷冻5min终止反应。随后取10μL反应混合液于96孔板上，再分别加入200μL葡萄糖氧化酶-过氧化物酶检测试剂盒缓冲液，于37℃孵育10min，使用酶标仪在492nm处测定其吸收值。相同方法，使用葡萄糖标准品绘制标准曲线，用于计算葡萄糖浓度。β-葡萄糖苷酶活性的一单位(U)定义为每分钟水解纤维二糖释放2μmol葡萄糖所需的酶量。每组实验均进行三个重复。

结果分析

以纤维二糖为底物测定β-葡萄糖苷酶活性，通过计算得出β-葡萄糖苷酶的酶活力为2.5±4.2U/mg(表2)。

说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶B0-BG36的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种编码权利要求1所述耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求2所述的基因在编码权利要求1所述的耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36中的应用。

4.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的编码耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36的基因。

5.一种含有权利要求4所述表达载体的微生物。

6.一种权利要求1所述的耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36在纤维素降解中的应用。

7.一种权利要求1所述的耐盐耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶B0-BG36在食品、饲料、纺织或纤维素乙醇制备中的应用。