CN108823105A - 具有抗三七根腐病作用的真菌及其用途 - Google Patents

具有抗三七根腐病作用的真菌及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株对三七有益生作用并能防治三七根腐病的真菌小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)及其菌剂，属生物农药技术领域。该菌株分离于三年生健康三七根部土壤，经过鉴定为小孢头束霉真菌，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15382。所述的小孢头束霉真菌菌株分生孢子悬液或菌株发酵液，不仅可显著降低三七根腐病的发生率，还可以一定程度上促进三七的生长，孢头束霉真菌菌株分生孢子悬液或菌株发酵液也可与有机肥混合制成菌肥使用。具有良好的生态应用前景。

Description

具有抗三七根腐病作用的真菌及其用途
技术领域：
本发明涉及一种生防菌小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)及其应用，具体涉及一株对三七生长具有益生作用的小孢头束霉真菌及其在防治三七根腐病中的应用，属生物农药技术领域。
背景技术：
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen(Sanqi))，为伞形目五加科人参属多年生草本植物，是一种药食同源的植物，具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效。三七广泛应用于跌打损伤、冠心病、心绞痛、脑血管后遗症、高血压等疾病的治疗中。三七为我国中药产业的支柱品种，但由于连年大面积单一种植，加之三七为多年生宿根草本植物，性喜温暖阴湿，因此病害问题十分突出，特别是根腐病问题，目前已严重限制了三七种植业的发展。由于根腐病的发生因素复杂，与根际微生态***所有因素都密切相关，其中根际微生物是该***的重要核心因素，真菌病原菌主要包括：柱孢菌、尖孢镰刀菌、茄腐镰孢菌、立枯丝核菌、轮枝孢霉菌、茎点霉菌，细菌病原菌以假单胞菌为主。
三七根腐病主要是通过药剂防治，农药的长期使用会造成环境污染、生态***破坏、病原菌抗药性产生，甚至给三七带来农药残留和重金属污染等危害，因此合理降低农药使用，找到绿色、环境友好型的防控方式，对防治三七根腐病有重要的意义。三七植物根际寄居着大量与植物生长密切相关的微生物类群，与植物交互营养、代谢物、信号传导作用频繁，影响植物对碳、氮、磷、硫等土壤元素组成、有机物组成、土壤团聚体形成及植物的抗病性。因此通过施加益生微生物，对根际微生态环境的合理调控，改善三七根际环境，抑制病原微生物繁殖的生物防治手段在药品的安全性、药材种植的可持续性方面有巨大的应用潜力。
发明内容：
本发明的目的在于：针对目前三七根腐病严重发生，且农药、轮作、土壤的化学处理等防治措施效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一种高效防治三七根腐病及促进三七生长的小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)菌株及其应用。
具体技术方案如下：
本发明提供了一株小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)，经过形态学和分子生物学研究鉴定为Cephalotrichum microsporum。在所述菌株在葡萄糖马铃薯琼脂培养基PDA上培养，菌落整体呈黑色、粉状，菌丝大部分表生，少量埋生，背面观察菌落中心为黑色，最外周呈灰色；所述PDA培养基组成为：100-200g去皮马铃薯水提物，葡萄糖5～20g，琼脂粉10-20g，加水至1L，pH自然。配置后于121℃灭菌30分钟。
本发明还提供了所述小孢头束霉真菌在促进三七或人参生长和根腐病防控中的应用。
所述小孢头束霉真菌在促进三七或人参生长和根腐病防控中的应用中，通过使用小孢头束霉真菌菌株分生孢子悬液或菌株发酵液或两者联合使用对三七或人参进行灌根处理。
菌株分生孢子悬液通过如下方法制备：将所述的菌株接种于PDA培养基平皿中，20-40℃倒置培养7-14天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，所述的孢子悬液的浓度为：1.0×104-1.0×108个/mL。
菌株发酵液通过如下方法制备：将所述的菌株接种于PDA培养基平皿中，20-40℃倒置培养7-14天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，所述的孢子悬液的浓度为：1.0×104-1.0×108个/mL。取孢子悬浮液接种于发酵培养基PDB中，26-28℃，120-150r/min，培养7-10天。
菌株发酵液通过如下方法制备：将所述的菌株接种于PDA培养基平皿中，20-40℃倒置培养7-14天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，所述的孢子悬液的浓度为：1.0×104-1.0×108个/mL。取孢子悬浮液接种于发酵培养基PDB中，26-28℃，120-150r/min，培养7-10天。使用等体积乙酸乙酯萃取发酵液3-4遍，收集浓缩萃取液，备用。
所述的PDA培养基为：土豆100g～400g,葡萄糖5g～20g琼脂10g～20g,定容至1L蒸馏水中，PH自然，121℃灭菌30min。
所述的PDB培养基为：土豆100g～400g,葡萄糖5g～20g,定容至1L蒸馏水中，PH自然，121℃灭菌30min。
所述的生防真菌小孢头束霉真菌在促进三七生长及防治三七根腐病中的应用，方法如下：
可在三七成株期灌根使用，显微镜下计数，稀释孢子液到1.0×104-1.0×108个/mL浓度，每株使用50ml。连续使用2-3次，每次间隔30天。该菌剂也可与有机肥混合配制成菌肥使用。
可在三七成株期灌根使用，发酵液稀释102-104倍施用，每株使用50ml。连续使用2-3次，每次间隔30天。该菌剂也可与有机肥混合配制成菌肥使用。
本发明有益效果：
本发明筛选出的生防真菌小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)菌株分生孢子悬液或菌株发酵液能够明显抑制三七致病真菌腐皮镰孢、柱孢、链格孢等的生长，并且促进三七植株生长。由于是生物制剂，因此没有化学农药使用带来的一系列问题，对减少农业污染且有效防治三七根腐病大有益处。本发明生防真菌小孢头束霉真菌分离自三年生健康三七根部土壤，其与三七土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势。
本发明生防真菌菌株培养条件简单，遗传稳定，易于工业化生产扩大，具有良好的开发应用前景。
本发明的小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)已在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间：2018年01月29日，保藏编号为CGMCC NO.15382。
附图说明：
图1为小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)菌落形态。
图2为小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)发酵液对三七的促生作用。
图3为小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)发酵液对三七防病效果。
具体实施方式：
为了更好的理解本发明，下面附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制，下面实施例中所述的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)CGMCC No.15382的获得：
从云南省采集三年生健康三七根际土壤，将土样除去石块后称取5g，放入盛有45mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，此即10-1的土壤悬液；逐级稀释至10-2、10-3、10-4、10-5后，分别取各稀释液涂布于分离平板，倒置，26℃培养7～14d。培养观察，单菌落长出后转接到PDA培养基上培养，即获得了菌株CGMCC No.15382。
实施例2小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)CGMCC No.15382的鉴定
1形态特征观察
将培养7-10天的菌株Cephalotrichum microsporum CGMCC No.15382打开平皿盖，在白色背景下拍照。菌落整体呈黑色、粉状，菌丝大部分表生，少量埋生，背面观察菌落中心为黑色，最外周呈灰色(图1)。
2ITS序列分析
液氮研磨法提取菌株基因组DNA后，采用引物：ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，进行PCR扩增。凝胶电泳后送生物工程(上海)有限公司测序，序列全长为553bp(见SEQ)。将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对，发现与CGMCC No.15382同源性较高的菌株属于Cephalotrichum microsporum，并且在NCBI上提交了菌株序列号为MH040912。根据以上形态特征分析及ITS分析，将菌株初步鉴定为Cephalotrichum microsporum类群。
实施例3小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)发酵液对三七的促生作用
将所述的菌株接种于PDA培养基平皿中，26℃倒置培养7-10天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，所述的孢子悬液的浓度为：1.0×104-1.0×108个/mL。取孢子悬浮液接种于发酵培养基PDB中，26-28℃，120-150r/min，培养7-10天，发酵液稀释100倍，备用。田间二年生三七植物由云南省苗乡三七科技园提供。以蒸馏水作为对照，每组三个重复，每个重复接种100株三七苗，每株三七苗灌根50mL。分别于灌菌后3、6、9、12、18、30d采集三七根样品进行根系酶活力、POD酶、SOD酶活力测定。根系活力测定方法为氯化三苯基四氮唑(TTC)法，参照张志良《植物生理学实验指导第三版》。SOD酶活与POD酶活的测定方法参照SOD试剂盒和POD试剂盒说明书(苏州科铭生物技术有限公司)。
通过以上测量指标，运用Graphpad软件进行显著性差异分析，结果如图2，结果显示，菌株Cephalotrichum microsporum发酵液可以提高三七根系活力、三七抗逆酶POD和SOD酶活力，对三七有促生作用。
实施例4小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)发酵液对三七防病效果
将所述的菌株接种于PDA培养基平皿中，26℃倒置培养7-10天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，所述的孢子悬液的浓度为：1.0×104-1.0×108个/mL。取孢子悬浮液接种于发酵培养基PDB中，26-28℃，120-150r/min，培养7-10天，发酵液稀释100倍，备用。田间二年生三七植物由云南省苗乡三七科技园提供。
以蒸馏水作为对照，每组三个重复，每个重复接种100株三七苗，每株三七苗灌根50mL。回植三七90d后，测定三七植株根腐病发病情况。三七根腐病发病程度参考檀根甲等《植物病害防治效果和保产率的计算》的方法分为4级。0级：根无病；1级：病斑占根表面积的20％以下；2级：病斑占根表面积的21％～40％；3级：斑占根表面积的41％～65％，外观受严重影响；4级：病斑占根表面积的66％以上或完全腐烂。
病情指数和防效分别按照下列公式计算：
病情指数＝[∑(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)]×100％
防效＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％
小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)发酵液组与CK组相比，发酵液组三七根腐病发病植株数目较CK组的少，且发病程度较CK组轻。经计算得：发酵液组的病情指数为：10％，CK的病情指数为：34％，如图3；防效为70.59％，显示出良好的防病效果。
实施例5小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)分生孢子悬液对三七防病效果
将所述的菌株接种于PDA培养基平皿中，26℃倒置培养7-10天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，所述的孢子悬液的浓度为：1.0×104-1.0×108个/mL，备用。田间二年生三七植物由云南省苗乡三七科技园提供。以蒸馏水作为对照，每组三个重复，每个重复接种100株三七苗，每株三七苗灌根50mL。回植三七90d后，测定三七植株根腐病发病情况。以实施例4的统计方法计算病情指数，经计算得：菌株分生孢子悬液的病情指数为：12％，CK的病情指数为：34％，菌株分生孢子悬液对三七根腐致病具有较好的拮抗作用。
实施例6小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)发酵液乙酸乙酯萃取液抑菌测试
采用96孔板-比浊法，将Cephalotrichum microsporum发酵液乙酸乙酯萃取液对三七致病菌(Fusarium solani,Cylindrocarpon didynum)作拮抗测试。发酵液萃取物作用终浓度为0.5mg/ml。真菌将孢子从斜面洗下制成孢子悬浮液，血球计数板计数，稀释至孢子浓度107cfu/ml。吸取上述稀释好的孢子悬浮液0.5ml加入50ml液体PDB培养基中，混匀成混悬液。空白对照组(CK)：198μl混悬液；DMSO对照组：198μl混悬液+2ul DMSO；阳性对照组：198μl混悬液+2μl G418；实验组：198μl混悬液+2μl发酵液萃取物(Extract)，每组三个平行。将96孔板置于28℃培养箱中培养，48h后600nm处测量OD值。结果发酵液萃取物对Fusarium solani抑制率48.05±0.42％,对Cylindrocarpon didynum抑制率42.44±0.37％，与空白对照组存在显著性差异。活性筛选实验结果表明，菌株Cephalotrichummicrosporum的发酵液对三七根腐致病菌具有较好的拮抗作用。
序列表
<110> 沈阳药科大学 文山学院 文山苗乡三七股份有限公司
<120> 具有抗三七根腐病作用的真菌及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 553
<212> DNA
<213> Cephalotrichum microsporum
<400> 1
ccgaagttac cttcaaaacc cactgtgaac cttacctctt gccgcgttgt ctcggcggga 60
ggcggtgggc gtcgcgcgcc cctagcgggc cgtgccgctc ccgtccccgc cggcggcgcc 120
aaactctaaa tttacagcgg actgtacgtt ctgatttaca aaaaaaacaa gttaaaactt 180
tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg atgaaaaacg cagcgaaatg cgataagtaa 240
tgtgaattgc agaattcagt gaaccatcga atctttgaac gcacattgcg cccggcagta 300
atctgccggg catgcctgtc cgagcgtcat ttctgccctc gagcgagttc cagcatctag 360
gtgctggtgc tcgcccggcg ttggggcact acggtagagc cctgtgctgt ccgtaggccc 420
tgaaatgaag tggcggtcct gccgcggcgc cccctgcgta gtataacagc tcgcttcggg 480
acccggtgga ggccagccgt caaacctata ttctctaagt ttgacctcgg atcaggtagg 540
gttacccgct gaa 553

Claims (10)

1.小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)，其特征在于，保藏编号为：CGMCCNo.15382。
2.权利要求1所述的小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)在防治三七或人参根腐病中的应用。
3.权利要求1所述的小孢头束霉真菌(Cephalotrichum microsporum)在促进三七或人参生长中的应用。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，使用小孢头束霉真菌的菌株分生孢子悬液或菌株发酵液对三七进行灌根处理。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菌株分生孢子悬液通过如下方法制备：将所述的小孢头束霉真菌菌株接种于PDA培养基平皿中，20-40℃倒置培养7-14天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，所述的孢子悬液的浓度为：1.0×104-1.0×108个/mL。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菌株发酵液通过如下方法制备：将所述的菌株接种于PDA培养基平皿中，20-40℃倒置培养7-14天，活化菌株，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成孢子悬浮液，显微镜下计数孢子浓度，所述的孢子悬液的浓度为：1.0×104-1.0×108个/mL；取孢子悬浮液接种于发酵培养基PDB中，20-40℃，120-150r/min，培养7-10天。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，菌株发酵液通过如下方法制备：将权利要求6所得的培养液使用等体积乙酸乙酯萃取发酵液3-4遍，收集浓缩萃取液，备用。
8.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的PDA培养基为：土豆100g～200g,葡萄糖5g～20g,琼脂10g～20g,定容至1L蒸馏水中，PH自然，121℃灭菌30min；所述的PDB培养基为：土豆100g～200g,葡萄糖5g～20g,定容至1L蒸馏水中，PH自然，121℃灭菌30min。
9.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，将在三七或人参苗期或者成株期灌根使用；连续使用2-3次，每次间隔30天。
10.如权利要求1-9任何一项所述的应用，其特征在于，所述的小孢头束霉真菌单独作用或与有机肥混合使用。
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