CN110643608B - 一种具有花药组织特异性的启动子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有花药组织特异性的启动子。本发明公开的具有花药组织特异性的启动子为下述a)或b)或c)：a)3′端至少含有序列表中序列1的第1‑1698位核苷酸序列，并且从序列1的第1698位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的3′端延长，得到长度为1698至2025bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。本发明的启动子可用于外源基因在花药中的特异性表达以及雄性不育系和恢复系的创建，具有广泛的应用前景。

Description

一种具有花药组织特异性的启动子

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种具有花药组织特异性的启动子。

背景技术

植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调。启动子是重要的顺式作用元件，它是位于结构基因5’端上游区域调控基因转录的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，确保转录精确而有效地起始，在转录调控中起关键作用。根据其驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型启动子和特异性启动子：组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转录；特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子，其中组织特异性启动子可启动下游基因在某些特定的器官或组织部位表达；而诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很低，但在某些特定的逆境信号的刺激下，转录活性能够显著地提高。

外源DNA序列可以通过连接到特定的启动子从而启动其在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型的强启动子，比如花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子和玉米的Ubiquitin-1启动子，然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间(发育阶段特异性)或空间(组织器官特异性)不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高产生代谢负担而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。

近年来，通过基因工程调控植物花粉育性、创造植物雄性不育系及其恢复系已在一些作物上获得成功，为作物杂种优势的利用开创了新的前景。目前利用基因工程创造雄性不育的策略主要是利用花粉发育的特异启动子与外源基因嵌合，构建表达载体，转化植物来阻断花粉发育的过程从而达到雄性不育的目的。植物花粉或花药启动子的驱动活性和特异性决定了通过基因工程手段调控花粉育性、创造植物不育系及恢复系的成败。目前已知的驱动活性高且特异性良好的植物花粉或花药特异启动子还相对较少，因此，黄瓜花药特异性表达启动子的克隆和功能分析对于在蔬菜作物中利用基因工程调控花粉育性、创造植物雄性不育系有着重要的作用，从而为蔬菜育种杂种优势的充分利用奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有启动子活性的DNA分子。

本发明提供的DNA分子来源于番茄，其名称是pS1NP，为下述a）或b）或c）：

a）3′端至少含有序列表中序列1的第1-1698位核苷酸序列，并且从序列1的第1698位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的3′端延长，得到长度为1698至2025bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；

b）与a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；

c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

所述严格条件是在2×SSC，0.1% SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min 0.5×SSC，0.1% SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的DNA分子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的DNA分子核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的DNA分子核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%、95%以上的同一性。

所述DNA分子的第一位核苷酸可为序列1的第1位。

所述DNA分子可为序列表中序列1所示的DNA片段。

本发明还提供了含有所述DNA分子的生物材料，所述生物材料为下述B1）至B19）中的任一种：

B1）含有所述DNA分子的表达盒；

B2）含有所述DNA分子的重组载体；

B3）含有B1）所述表达盒的重组载体；

B4）含有所述DNA分子的重组微生物；

B5）含有B1）所述表达盒的重组微生物；

B6）含有B2）所述重组载体的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B8）含有所述DNA分子的转基因植物细胞系；

B9）含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B10）含有B2）所述重组载体的转基因植物细胞系；

B11）含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系；

B12）含有所述DNA分子的转基因植物组织；

B13）含有B1）所述表达盒的转基因植物组织；

B14）含有B2）所述重组载体的转基因植物组织；

B15）含有B3）所述重组载体的转基因植物组织；

B16）含有所述DNA分子的转基因植物器官；

B17）含有B1）所述表达盒的转基因植物器官；

B18）含有B2）所述重组载体的转基因植物器官；

B19）含有B3）所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，所述表达盒可由所述DNA分子、所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因。

所述重组载体中，由所述DNA分子启动目的基因的表达。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将pC1301IgT载体的NcoⅠ和HindⅢ的识别序列间的DNA片段替换为pS1NP-tail片段得到的重组载体，所述pS1NP-tail按照如下方法制备：以启动子pS1NP的PCR产物为模板，以序列表中序列4和5所示的两条单链DNA为引物进行PCR扩增得到的产物（记为pS1NP-tail）。

所述目的基因具体为GUS基因。

上述表达盒或重组载体可以通过原核显微注射法、胚胎干细胞介导法、逆转录病毒载体法、***介导的基因转移、核移植转基因法、体细胞核移植法、线粒体介导法等常规生物学方法转化动物器官或组织或细胞，得到转基因植物物细胞或组织或器官。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、所述转基因植物组织和所述转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了所述DNA分子在作为启动子中的应用。

所述启动子可为组织特异性启动子。

所述组织可为花药组织。

本发明所述的“启动子”是指一种DNA调控区域，其通常包含能指导RNA聚合酶II在特定编码序列的合适转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子还可包含其它识别序列，这些识别序列通常位于TATA盒的上游或5’端，通常被称为上游启动子元件，起调控转录效率的作用。本领域技术人员应该知晓，虽然已经鉴定了针对本发明公开的启动子区域的核苷酸序列，但是分离和鉴定处于本发明鉴定的特定启动子区域的 TATA 盒上游区域的其它调控元件也在本发明的范围内。因此，本文公开的启动子区域通常被进一步界定为包含上游调控元件，例如用于调控编码序列的组织表达性和时间表达功能的那些元件、增强子等。以相同的方式，可以鉴定、分离出使得能在目标组织（例如雄性组织）中进行表达的启动子元件，将其与其它核心启动子一起使用，以验证雄性组织优先的表达。核心启动子指起始转录所需的最小限度的序列，例如被称为TATA盒的序列，这是编码蛋白质的基因的启动子通常都具有的。因此，可选地，pS1NP启动子可与其自身的或来自其它来源的核心启动子关联使用。

核心启动子可以是任何一种已知的核心启动子，例如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子(美国专利No.5，352，605)、泛素启动子(美国专利No.5，510，474)、IN2核心启动子(美国专利No.5，364，780)或玄参花叶病毒启动子。

所述基因启动子的功能可以通过以下方法进行分析：将启动子序列与报告基因可操作性连接，形成可转化的构建体，再将该构建体转入植株中，在获得转基因后代中，通过观察报告基因在植物各个组织器官中的表达情况来确认其表达特性；或者将上述构建体亚克隆进用于瞬时表达实验的表达载体，通过瞬时表达实验来检测启动子或其调控区的功能。

用来测试启动子或调控区域功能的适当表达载体的选择将取决于宿主和将该表达载体引入宿主的方法，这类方法是本领域普通技术人员所熟知的。对于真核生物，在载体中的区域包括控制转录起始和控制加工的区域。这些区域被可操作地连接到报告基因，所述报告基因包括YFP、UidA、GUS基因或荧光素酶。包含位于基因组片段中的推定调控区的表达载体可以被引入完整的组织，例如阶段性花药，或引入愈伤组织，以进行功能验证。

启动子的活性和强度可以根据其驱动的报告基因的mRNA或蛋白质的表达量来测定。报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来确定目的基因的表达调控特性。常用的报告基因有β-葡萄糖苷酸酶基因GUS和绿色荧光蛋白基因GFP。本发明通过GUS报告基因来检测启动子的活性和表达特性。根据GUS基因检测所用的底物不同，有三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵敏度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞转入了GUS 基因，并表达出了GUS酶蛋白，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使各组织细胞中有GUS表达活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性的强弱。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。

本发明还提供了所述DNA分子或所述生物材料在以下（a）至（e）中任一项中的应用：

（a）培育植物品种或品系；

（b）培育授粉受精能力增强植物品种或品系；

（c）培育授粉受精能力消弱的植物品种或品系；

（d）培育雄性不育植物品种或品系；

（e）在植物中启动目的基因表达中的应用。

本发明还提供了目的基因在植物花药中特异性表达的方法，所述方法包括：将含有所述的DNA分子和目的基因的表达盒导入植物中，实现目的基因在植物花药中的特异表达。

所述植物可为双子叶植物（如拟南芥）或单子叶植物。

所述目的基因可为异源核苷酸序列，以使转化的植株获得雄性不育的表型。所述异源核苷酸序列可编码促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，更具体的如α淀粉酶基因、生长素rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素，或者可选自原核调控***，还可以是显性的雄性不育基因。

扩增所述DNA分子全长或部分片段的引物对，也属于本发明的保护范围。

所述引物对可为由序列表中序列2和序列3所示的两条单链DNA组成的引物对，也可为由序列表中序列4和序列5所示的两条单链DNA组成的引物对。

本发明的所提供的具有启动子活性的DNA分子可用于外源基因在花药中的特异性表达，从而避免该外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响，还可以用于植物花药生长发育相关基因的功能分析和鉴定；可用于雄性不育系和恢复系的创建；并可应用于花粉败育实验中，从而避免由植物转基因漂移或花粉逃逸所带来的生物安全问题，对植物雄性不育系和恢复系的创造具有重要意义。

附图说明

图1为花药特异性启动子pS1NP序列分析。

图2为花药特异性启动子pS1NP验证表达载体T-DNA图谱。

图3为根组织GUS染色结果。

图4为茎组织GUS染色结果。

图5为叶组织GUS染色结果。

图6为花组织GUS染色结果。

图3-6中，A为阴性对照，B为阳性对照植株，C为阳性转基因植株。图6中D为阳性转基因植株花组织压片结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

KOD Plus和10×KOD Plus buffer为东洋纺（上海）生物科技有限公司产品。

实施例1、花药特异性启动子pS1NP序列分析

本实施例提供了一个来源于Micro-Tom番茄（美国泛美种子公司）的具有花药特异性启动子活性的DNA片段，将其命名为启动子pS1NP，其序列为序列表中序列1。将花药特异性启动子pS1NP序列及其下游的ATG输入到植物启动子元件分析网站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和PLACE（https://sogo.dna.affrc.go.jp），结果分析后得到如图1所示。加粗的ATG为翻译起始位点，上方显示+1的加粗的A为转录起始位点，虚线方框为TATA Box，实线方框为CAAT Box。

1、引物设计

花药特异性启动子pS1NP引物如下：

pS1NP-F（上游引物）：5’- GGTTGGGTCTGAAGGTTTTAGCGG -3’（序列表中序列2）。

pS1NP-R（下游引物）：5’- TTTGTTTAATTAATTTAATATATTT -3’ （序列表中序列3）。

2、PCR克隆与鉴定

CTAB法提取Micro-Tom番茄材料的DNA，以该DNA为模板，采用步骤1中设计的启动子引物pS1NP-F和pS1NP-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增体系如表1所示。PCR扩增程序如下：94℃ 2min；94℃ 15s，55℃ 30s，68℃2min30s，35个循环；68℃ 10min。

表1、PCR反应体系

组分	体积（μl）
		DNA模板（100ng/μl）	1
上游引物	1.5
		下游引物	1.5
MgSO<sub>4</sub>	2
		10×KOD Plus buffer	5
dNTPs	5
		KOD Plus	1
H<sub>2</sub>O	33
		总计	50

将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（Axygen，AP-GX-250）回收，将回收的产物连接亚克隆载体pEASY®-Blunt Simple Cloning Kit（北京全式金生物技术有限公司，CB111-01）,转入Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell（北京全式金生物技术有限公司，CD501-01）进行转化，挑取单克隆摇菌进行测序。测序结果表明：PCR扩增产物的核苷酸序列与序列1完全一致。

3、功能鉴定

3.1、花药特异性启动子pS1NP验证表达载体的构建

以步骤2中启动子pS1NP的PCR产物为模板，以pS1NP-GUS-F和pS1NP-GUS-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物（记为pS1NP-tail）；引物如下：

pS1NP-GUS-F：5’- agtcgacctgcaggcatgcaGGTTGGGTCTGAAGGTTTTAGCGG -3’ （序列表中序列4）；

pS1NP-GUS-R：5’- aaatttaccctcagatctacTTTGTTTAATTAATTTAATATATT -3’ （序列表中序列5）；

将pCAMBIA1301载体质粒（CAMBIA 公司）用NcoⅠ和HindⅢ双酶切得到线性化大片段，然后与步骤3中PCR产物用重组酶（pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，北京全式金生物技术有限公司）进行重组，得到重组载体，将序列正确的重组载体记为pCAMBIA1301-pS1NP-tail，即为花药特异性启动子pS1NP验证表达载体，其T-DNA图谱如图2所示，该重组载体含有序列表中序列1所示的DNA片段。

3.2、植物转化与功能验证

利用热激法将pCAMBIA1301-pS1NP-tail转入农杆菌GV3101菌株中后，利用农杆菌介导的花序侵染法对拟南芥进行遗传转化，得到转基因植株。

按照上述方法，利用pCAMBIA1301载体替换pCAMBIA1301-pS1NP-tail进行遗传转化，得到阳性对照植株。

通过PCR鉴定筛选含有序列表中序列1所示DNA片段的转基因植株，记为阳性转基因植株。所用引物为上文pS1NP-GUS-F和pS1NP-GUS-R。

以野生型拟南芥为阴性对照、以阳性对照植株为阳性对照，分别选取阳性转基因植株的根、茎、叶、花进行GUS染色，检测阳性转基因植株中的GUS基因表达情况。

染色结果如图3-图6显示。野生型拟南芥的根（图3中A）、茎（图4中A）、叶（图5中A）、花（图6中A）中均没有GUS基因的表达。阳性对照植株的根（图3中B）、茎（图4中B）、叶（图5中B）、花（图6中B）中均有GUS基因的表达。阳性转基因植株的根（图3中C）、茎（图4中C）、叶（图5中C）中均没有GUS基因的表达，但在花的花药（图6中C和D）中有GUS基因特异性表达。这表明，本发明的启动子pS1NP具有花药组织表达特异性。

序列表

<110> 潍坊兴旺生物种业有限公司

<120> 一种具有花药组织特异性的启动子

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2025

<212> DNA

<213> 番茄（Tomato）

<400> 1

ggttgggtct gaaggtttta gcggttcaaa atttaagcgg agataaaaat tactaggtga 60

ttcttctcat ctgttctacc tttgatagat agagtgaata taactagtca agataccaaa 120

aaaactgact gaacaccaat tatcattaaa ccaaaaggag gttggttgaa acataaaata 180

tgaacaataa ttaataaaca caattgtgac ctcaaactca aaatagagag agattgagtt 240

atgtggatga agatgaatta gtacacatgg aaatattggt gagtttaatt tctctcatta 300

taatcttcag ctactcaaaa cagttgttac aatatctcat taaaacaata aaacgtaacc 360

attaccaata ccctacatag atcgcaataa acattagtta tgaaattcgt cactgataac 420

aacttgtaac gaacgagatt ttgtagcata agttgtctat ttacatattt cattgttgat 480

aagagatgtt tataatcctc cctaactaaa acttatatac taccttcata tagtagatta 540

gtaaaatcaa tgtatatgtg ttgctggaac cgaattacca tggtcaagct aaaatatgtg 600

catgtacata tttatatata aaaaaaatat atatcattga gactaaagtt caaagctaaa 660

gattcagaaa ttggacacaa cattaatatt aaggccatta aattgacgga ttgagttaaa 720

attaggcaat agtaaaatga attgagttaa taaatgaaac aatcattgat acgtcggaat 780

gttatttgat aaatattact cccttttaat tcaatttgtt tgcgtttcat ttttagtcgg 840

tcccaaaaaa tgatacattt ctatattaac attttaacta tataaaatgt ctattttact 900

tttaatgaaa tgatttacag ccacataaat ttttatcgtt tattttgcac acgagtttta 960

aaagtctttc ttttttaaaa ctgtatcaaa tcaaactatc tcacataaaa tgagactgag 1020

ggagtaggtc ataattcaac ccacctaata tttacgtgcc tattcgatga gcttatagct 1080

tctgtcttat aagtcaaaag tcgtaagtta tatatcttaa cttataactt ctgaattaaa 1140

aatgagtatt cataagcacc ttctgaatca tactgacata acaaagatgc ttacaaatta 1200

ctgacttaaa aatacttaaa ataagtcaat ttaaatagat atcaaatttt aaatcatttg 1260

tttaattgag tacctaataa aacaatcttt tcttatatta tgactatata taataatatg 1320

ataaacaaac gatattattt taaaaatatt taaacgaagt tccttatata gatcaatcta 1380

aatggcatat caacatgtca tttatctatt caaacctaga tagatttaac gagttataat 1440

tttatgagtt agttatcccc ctcacgttat attaaatcca aattttataa tatctacact 1500

ttctcaataa ttattataat aataatttcc ttcacacaaa tgtgtggcat ttgatagaat 1560

taaaagtgac aaaactcata atgattatgt gaaagaaaat aaaagagaac aagatgtttc 1620

ctatttaatt aaaatcttac aactaccttc tccccctctc ccttgcctta tctactacca 1680

taataaataa aatagtactt ataatatata gttttttttt tctttattca aattctacac 1740

atattttttt ggacctaact agtcattttc tttcttcctt tatataattt ctccaaatca 1800

ctattatata gttctacttc tttctcaaat attcaagaaa ttcacaattc ctgcattttc 1860

ttgttcctta aaattatata ctgaaaattc tattaaggaa cattttgtgt tttccaaatt 1920

aattgccgtc caaattgttt gaattttact atataacatc ttttttttct ttctactttt 1980

ccatcaatct taagatcatt aaatatatta aattaattaa acaaa 2025

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggttgggtct gaaggtttta gcgg 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttgtttaat taatttaata tattt 25

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtcgacctg caggcatgca ggttgggtct gaaggtttta gcgg 44

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaatttaccc tcagatctac tttgtttaat taatttaata tatt 44

Claims (8)

1.DNA分子，为序列表中序列1所示的DNA片段。

2.含有权利要求1所述DNA分子的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；

B2)含有权利要求1所述DNA分子的重组载体；

B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物；

B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；

B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物。

3.权利要求1所述DNA分子在作为启动子中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述启动子为组织特异性启动子。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述组织为花药组织。

6.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述生物材料在以下(a)至(e)中任一项中的应用：

(a)培育植物品种或品系；

(b)培育授粉受精能力增强植物品种或品系；

(c)培育授粉受精能力消弱的植物品种或品系；

(d)培育雄性不育植物品种或品系；

(e)在植物中启动目的基因表达中的应用。

7.目的基因在植物花药中特异性表达的方法，包括：将含有权利要求1所述的DNA分子和目的基因的表达盒导入植物中，实现目的基因在植物花药中的特异表达。

8.扩增权利要求1所述DNA分子全长的引物对。

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