CN108707572B - 一株高产灵菌红素海洋细菌分离鉴定与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株海洋细菌分离鉴定及其应用。该海洋细菌命名为Notoacmeibacter marinus IMDGXO 109，保藏号为CCTCC NO：M 2018148；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年03月22日。通过本申请的操作步骤能提高该菌种目的产物灵菌红素的产率和稳定性，所产的代谢产物纯度高、安全性好，可以应用于医药行业。

Description

一株高产灵菌红素海洋细菌分离鉴定与应用

【技术领域】

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株高产灵菌红素海洋细菌分离鉴定与应用。

【背景技术】

微生物所产次级代谢产物不是其在生长和繁殖所必须的物质(色素、抗生素、毒素、和激素等)，但对人类活动有着非常重要的研究价值和意义。灵菌红素广泛存在于自然界中，具有抗菌、抗肿瘤、抗疟疾和免疫抑制等多种生物活性，因此，在医药药品行业等具有很好的应用价值和市场前景。

目前，国内外有关海洋细菌产灵菌红素的微生物，新型菌株的筛选报道较少。国内外对灵菌红素的研究主要集中在沙雷氏菌发酵工艺的优化及其在免疫学功能等方面有着比较丰富的研究。但沙雷氏菌并非优秀的生产菌种，且是一种条件致病菌，灵菌红素其产量比较低且受到分离纯化技术的影响，难以实现工业大规模的发酵和生产。因此，从自然界筛选生产单一结构灵菌红素的新型菌株，并鉴定其在***分类学上的归属且菌株能高产灵菌红素的研究。

【发明内容】

鉴于上述内容，一株高产灵菌红素海洋细菌分离鉴定与应用。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一株高产灵菌红素海洋细菌，所述该海洋细菌命名为NotoacmeibactermarinusIMDGXO 109，保藏号为CCTCC NO：M 2018148；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年03月22日。

进一步说明，所述该菌株在LA培养基或NA培养基上生长良好，菌落呈红色，株菌属于革兰氏阳性菌，大小为0.3～0.7×0.8～3.1μm，表面光滑，游动型短杆菌，无气丝，有鞭毛。

如上的高产灵菌红素海洋细菌的分离鉴定方法，由以下具体步骤得到：梯度稀释筛选、纯培养纯化、16S rDNA鉴定。

如上的一种高产灵菌红素海洋细菌的发酵产物，所述发酵产物为灵菌红素，具体通过以下方法制备得到：

(1)将从海洋生物中分离得到的细菌进行活化，待菌体生长到对数期时，于培养基中，于27～29℃、170～190r/min下振荡，发酵培养20～28h，得到发酵培养液；

(2)将发酵液离心后所得红色菌体，IMDGX0109菌株所产色素为胞内色素，采用质量分数为20％-30％的有机试剂丙酮浸泡过夜；

(3)将步骤(2)所得红色菌体用磁力搅拌器在室温下避光搅拌30min，离心至菌体无色，收集丙酮萃取液，接着使用旋转蒸发仪浓缩得到色素粗提物；

(4)将所得色素粗提物用按照体积比为1:3的三氯甲烷和去离子水混合萃取并浓缩得到纯化后的色素提取物，整个过程在避光状态下进行处理。

进一步说明，所述纯化后的色素提取物的产量达到0.632g/L以上，纯度达到98％以上。

进一步说明，所述改良Isp2培养基的配制方法为：首先称取葡萄糖2g/L、酵母提取物2g/L、麦芽提取粉2g/L溶于蒸馏水中，并在121℃下高压灭菌20min。

与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供的一株具备高产灵菌红素类化合物的海洋细菌IMDGX0109，该菌株是从海洋生物共附生微生物中分离筛选得到的，工艺简单，菌种对环境友好；

2.该菌株分离于海洋生物，生产周期短，灵菌红素产量高且稳定，纯度高、安全性好易提取，便于扩大培养，可作为药品加以开发利用，具有重要的市场价值和意义。

【附图说明】

图1为本申请海洋细菌IMDGX0109菌落形态；

图2为本申请海洋细菌IMDGX0109菌株培养24h；

图3为本申请海洋细菌IMDGX0109发酵提取物的HPLC半制备型柱子色谱分离图；

图4为本申请海洋细菌IMDGX0109发酵提取物的液相色谱图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

1、保藏信息：

本实施例提供一株海洋细菌IMDGX0109，该菌株已做保藏，保藏号：CCTCC NO：M2018148；保藏地点：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2018年03月22日。

2、来源与纯化保藏：

菌株是从北部湾海域的粗糙滨螺或者北海涠洲岛采集的海绵Pseudoceratinasp.生物表面分离纯化得到的，分离纯化的具体过程如下：

(1)将采自广西北海滩涂上的粗糙滨螺表面用无菌水冲洗3遍，用质量分数为75％的乙醇进行表面消毒，切开取出螺肉，用无菌手术刀对组织进行切碎，称取1g，放入研磨器中充分研磨，加入2mL无菌水与样品混匀，待用；

(2)将研磨液作为初始的组织悬液，再依次稀释成10^-1～10^-4共4个浓度梯度；

(3)吸取不同浓度的稀释液各100μL涂布于5种不同的分离培养基上，每种培养基设置2个平行，放置在28℃的培养箱中，恒温培养3～21d，直到有可辨认的单菌落长出；

(4)在ISP4分离培养基上有红色菌落长出，灭菌竹签挑取单菌落在纯化培养基(改良ISP2培养基)上进行纯化，最后获得纯菌株(如图1)，纯化后菌株用冻存管-80℃保藏并编号；

(5)经过16S rDNA鉴定，改菌株属于革兰氏阴性菌，菌体大小为0.3～0.7×0.8～3.1μm，短杆状，有鞭毛。

3、发酵产物的制备：

具体步骤如下：

(1)将低温保藏菌种使用活化培养基活化后，用接种环挑取1环接种于种子液中培养24h(如图2)，再转接至活化培养基中进行扩大培养。发酵条件为250mL规格的锥形瓶装液量100mL，放置摇床培养，温度27℃，转速为170rpm/min，培养时间20h，得到发酵培养液；

其中，活化培养基为改良Isp2培养基的配制方法为：首先称取葡萄糖2g/L、酵母提取物2g/L、麦芽提取粉2g/L溶于蒸馏水中，并在121℃下高压灭菌20min；

(2)将发酵液离心后所得红色菌体，IMDGX0109菌株所产色素为胞内色素，采用质量分数为20-30％的有机试剂丙酮浸泡过夜，磁力搅拌器在室温下避光搅拌30min，离心至菌体无色，收集丙酮萃取液，旋转蒸发仪浓缩得到色素粗提物；

最后，将所得色素粗提物再次用三氯甲烷和去离子水(V/V＝1:3)混合萃取并浓缩，整个过程在避光状态下进行处理；

(3)用薄层色谱将步骤(2)所得色素粗提物初步纯化：将配置好的展开剂加入到层析缸中预饱10min后，将点好样的硅胶板放入到层析缸中，当溶剂到达前沿线时取出薄层板，等到溶剂自然晾干或用电吹风吹干后，观察色素的分离情况，总结出最佳的展开***；

(4)根据步骤(3)TLC试验结果，摸索出适合分离制备所采用的柱色谱体系(色谱见图3、液相色谱图见图4)：

①装柱(湿法装柱)：将30-40倍样品重量的硅胶(200-300目)放入烧杯中，加入适量石油醚，用玻璃棒搅拌均匀后，将硅胶石油醚混合液倒入柱中，边倒边搅使硅胶均匀沉降。用3～4倍柱体积的石油醚冲柱，压实硅胶柱，最后在石油醚液面高出硅胶液面1～2cm时关掉开关；

②上样(干法上样)：用三氯甲烷将粗提物溶解，同时用研钵棒研磨使样品变成均匀的粉末状，用三角漏斗将样品均匀加入层析柱中，在样品上层加少许脱脂棉防止样品随流动相在硅胶柱中不均匀的分离；

③洗脱：加入洗脱剂(不同比例的石油醚-丙酮体系)进行梯度洗脱，使用减压柱进行减压分离，分离过程中色素样品呈暗红色条带，易区分；

柱规格：φ90×400mm。

载体：硅胶200-300目。

流动相(梯度减压洗脱)：石油醚：丙酮＝20:0

石油醚：丙酮＝15:1

石油醚：丙酮＝92:8

石油醚：丙酮＝85:15

石油醚：丙酮＝80:20

④浓缩：将收集的流份于旋转蒸发仪中35℃减压浓缩，浓缩所得样品用甲醇溶解于棕色西林瓶中，并按照TLC法检测，根据所得结果将成分极性相近的流份合并，置于4℃冰箱中避光保存。

(5)经色谱柱纯化的样品用甲醇溶解，稀释后通过HPLC进一步分离纯化。

经过检测纯化后的产量达到0.634g/L。

实施例2：

与实施例1的制备步骤基本相同，不同点是发酵产物的制备步骤的步骤(1)中的发酵条件为温度28℃，转速为180rpm/min，培养时间23h，得到发酵培养液。

经过检测纯化后的产量达到0.656g/L。

实施例3：

与实施例1的制备步骤基本相同，不同点是发酵产物的制备步骤的步骤(1)中的发酵条件为温度29℃，转速为190rpm/min，培养时间28h，得到发酵培养液。

经过检测纯化后的产量达到0.635g/L。

对照组1：

与实施例1的制备方法相同，不同点是，发酵产物制备中的活化培养基为ISP 2的培养基：酵母膏4.0g、麦芽汁10.0g、葡萄糖4.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000ml，pH 7.0。

检测一：

将上述实施例1-3与对照组1制备分离纯化得到的色素鉴定为灵菌红素，检测灵菌红素的产量和浊度，每个实施例或对照组三个平行，平均检测3次后的均值见过见表1。

表1

由上可知，改良的活化培养基，相比较ISP 2的培养基进行驯化培养，对菌株产灵菌红素的能力也有明显提高。

检测二：

上述实施例1-3与对照组1发酵处理的步骤(1)中发酵后的菌液10000rpm离心3min，取0.5ml上清液加入4.5ml的碱性甲醇混合均匀后静置20min，以空白碱性甲醇为对照测其在535nm处的吸光度，离心后的菌体中加入3ml的酸性甲醇，充分振荡后使得菌体中的领军红色全部释放出来，10000rpm离心3min后去上清液，以空白的酸性甲醇为对照测其在535nm处的吸光度，记录上清液和菌体内的灵菌红色的含量，每组三个平行，平均检测3次后的均值，结果见表2；

表2

从表2看，经过本申请的活化培养基培养(实施例1-3)后的上清液中的灵菌红素的含量远远高于对照组1，高出了5倍；

本申请的活化培养基培养(实施例1-3)后的菌体中的灵菌红素的含量远远低于对照组1，说明采用本申请的技术方案能够促进菌株在发酵产生发酵物的时候将菌株体内的灵菌红素分解出去，进而能提高菌株产目的产物的产率。

试验三：

内毒素含量的检测，采用《中华人民共和国药典》2015版1143细菌内毒素检查法的凝胶法进行检测：对菌体进行活化培养基培养得到的发酵液，在对数期后，过24小时后对发酵液中进行人工破碎后，随机三次取样进行菌株内毒素含量的检测的平均值，检测的结果将表3

表3

组别	内毒素含量/EU/ml
		实施例1	0.055±0.004
实施例2	0.032±0.005
		实施例3	0.044±0.004
对照组1	0.456±0.004

由上表看，本申请中的培养基能够延长菌种从对数期到达稳定期的时间，从上的数据可知，本申请能够降低菌种产生内毒素的含量，从而不会影响发酵液中的有毒代谢物质，从而能够提升菌种继续代谢目的产物的目的。

该菌发酵得到的灵菌红素产物可以应用于医药行业中。灵菌红素能对抗一系列的癌细胞，如肺，结肠，肾和***的癌细胞系；还具有免疫抑制活性是一种具有潜在的免疫抑制活性作用的新药；该菌发酵得到的灵菌红素产物对金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门菌、白色念球菌和铜绿假单胞菌、福氏志贺菌、枯草杆菌、大肠杆菌具有良好的抑菌作用，从而能应用在抑制该类菌引起的各种疾病的药品中。

将实施例1-3制备获得的纯化后的色素提取物、相比市面售(对照组)分别溶于乙酸乙酯配置成浓度为1.5g/L，将配置好的溶液涂抹在滤纸上，分别放置在仅含有金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的培养基的中心，常规培养，观察抑菌圈的直径大小，每个水平三组试验。

表4

组别	金黄色葡萄球菌	枯草杆菌	大肠杆菌	铜绿假单胞菌
					实施例1	15±2	13±2	16±2	18±1
实施例2	18±1	16±2	20±1	23±3
					实施例3	16±1	15±3	17±2	17±3
对照组	8±2	7±3	8±3	9±4

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一株高产灵菌红素海洋细菌（Notoacmeibacter marinus）IMDGXO 109，其特征在于：所述海洋细菌的 保藏号为CCTCC NO：M 2018148；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年03月22日。

2.根据权利要求1所述高产灵菌红素海洋细菌，其特征在于：所述菌株在LA培养基或NA培养基上生长良好，菌落呈红色，株菌属于革兰氏阳性菌，大小为0.3~0.7×0.8~3.1 μm，表面光滑，游动型短杆菌，无气丝，有鞭毛。

3.采用权利要求1所述的高产灵菌红素海洋细菌制备的发酵产物，其特征在于：所述发酵产物为灵菌红素，具体通过以下方法制备得到：

（1）将细菌IMDGXO 109进行活化，待菌体生长到对数期时，于改良Isp2培养基中，于27~29℃、170~190 r/min下振荡，发酵培养20~28h，得到发酵培养液；所述改良Isp2培养基的配制方法为：首先称取葡萄糖2g/L、酵母提取物2g/L、麦芽提取粉2g/L溶于蒸馏水中，并在121℃下高压灭菌20min，即可；

（2）将发酵液离心后所得红色菌体，IMDGXO 109菌株所产色素为胞内色素，采用质量分数为20%-30%的有机试剂丙酮浸泡过夜；

（3）将步骤（2）所得红色菌体用磁力搅拌器在室温下避光搅拌30min，离心至菌体无色，收集丙酮萃取液，接着使用旋转蒸发仪浓缩得到色素粗提物；

（4）将所得色素粗提物用按照体积比为1:3的三氯甲烷和去离子水混合萃取并浓缩得到纯化后的色素提取物，整个过程在避光状态下进行处理。

Images