CN105316255B - 一种土壤有益微生物混合发酵的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种土壤有益微生物混合发酵的方法。方法的步骤为：1)分别在PDA、YPD、营养琼脂培养基上活化菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌，将活化好的三株菌转接到相应的液体培养基上制备种子液。2)三株菌分别以10％的接种量接种至混合发酵培养基中，根据种子液有效活菌数与OD₆₀₀值之间的关系，控制地衣芽孢杆菌比其他两株菌的有效活菌数高一个数量级。本发明混合发酵培养基配方简单，降低了生产成本，提高了设备利用率，适宜于发酵产品的规模化生产；发酵产品具有改善土壤菌群平衡，促生增产的作用，同时可以复配有机物料、土壤改良剂等生产生物肥料和生物农药。

Description

一种土壤有益微生物混合发酵的方法

技术领域

本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一种土壤有益菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌混合发酵的方法。

背景技术

随着农业集约化发展、政策的支持以及人们对绿色有机产品的诉求，现代农业迅速发展的同时也遇到了许多棘手的问题，诸如土壤板结、土传病害严重、连作障碍、作物品质下降等。大量的化肥农药施入土壤，影响了生态环境和人类健康，而微生物产品正是解决这些问题的必由之路，尤其是在人类面临能源危机、资源紧缺、环境污染等背景下(李俊，2006)。微生物产品在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，以及提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用(葛成，2007)。

许多重要的生化过程靠单种微生物是不能完成或只能微弱进行(林静，2004)。复合微生物制剂含有多种有益微生物菌群，有效菌群可在植物根际优势繁殖，改善了植物根际微生态环境，其代谢产物及分泌物能刺激作物生长，提高对土壤养分的吸收能力(李阜棣，1996)。单菌株由于其代谢类型、呼吸类型及作用功能单一，对环境适应能力弱，很难在土壤中成为优势菌群。而混合有益菌由于菌群组成多样，具有对环境适应能力强，应用范围广，促生增产效果明显等优点。因此，利用微生物之间的协同作用，构建多菌型微生物制剂是生物肥料行业研究的热点。

土壤有益微生物淡紫拟青霉能够产生几丁质酶和丝氨酸蛋白酶，在植物线虫病、有害昆虫、植物病原菌的防治等方面均有特别的功效(李芳，2004；Alvarez，2000)。Bakalivanov(1966)发现，淡紫拟青霉可以产生吲哚乙酸，具有促生增产的作用。地衣芽孢杆菌能够促进土壤中有机物腐殖化，增强土壤肥效，改善土壤板结，提高土壤保温、蓄水和蓄能性能，抑制病原菌繁殖，降低植物病害等，广泛应用于农业部登记的微生物肥料产品中(胡云广，2011)。东方伊萨酵母(Kurtzman等人在2008年提出将伊萨酵母归入毕赤酵母，Issatchenkia orientalis东方伊萨酵母，名称已变更为Pichia kudriavzevii库德里阿兹威毕赤酵母)可作为生防制剂用于拮抗果蔬采后病菌(林晓敏，2015)。相关研究表明，淡紫拟青霉和地衣芽孢杆菌单独和有机肥复配均具有抗病促生效果(刘会清，2011)。中国专利201010540183.8公开了一种速效多菌种微生物复合冲施肥及其制备方法，添加有酵母菌、地衣芽孢杆菌等土壤益生菌，但其制备方法为各菌株单独发酵后按比例混合。中国专利201410617387.5公开了一种用于种植水稻和玉米的微生物菌粉，添加的有益微生物涉及到地衣芽孢杆菌和酵母菌等，但对于发酵工艺没有特别的说明。中国专利200910038426.5公开了一种多功能生物复混肥、其制备方法和应用，添加的有益微生物涉及到三种芽孢杆菌，采用传统单独液体发酵的形式。

发明内容

本发明的目的是提供一种淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌混合发酵的方法及其应用。

方法的步骤为：

1)分别在活化菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌，将活化好的三株菌转接到相应的液体培养基上制备种子液。

其中，淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)优选为三炬03号菌株、保藏机构：中国典型培养物保藏中心，保藏地点：湖北省武汉市，.武汉大学；保藏时间2010年6月30日，保藏编号CCTCC NO:2010165；

东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)优选三炬-06菌株，保藏机构：中国典型培养物保藏中心，保藏地点：湖北省武汉市，.武汉大学；保藏时间2012年11月21日；保藏编号CCTCC NO:2012470

地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)优选三炬-10菌株，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点，北京市朝阳区，中国科学院微生物研究所，保藏时间2015年4月24日；保藏编号为CGMCC No.10741。

淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌分别优选采用PDA、YPD以及营养琼脂培养基活化。其中：

PDA培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，自然pH；YPD培养基成分为：酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，自然pH；营养琼脂培养基成分为：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，自然pH。

淡紫拟青霉经接种后，培养4～6d收集孢子，用生理盐水洗涤孢子制备孢子悬液，用无菌水调节孢子悬液至OD₆₀₀为0.2，以10％的接种量将孢子悬液接种到液体培养基中，28℃、180rpm培养2d，制得淡紫拟青霉种子液，经稀释涂板计数与OD₆₀₀值的测量，得出淡紫拟青霉种子液有效活菌数(亿/mL)与OD₆₀₀值之间的关系为：y＝0.3386x-0.0318，R²＝0.9803。

东方伊萨酵母经过接种后，培养1～2d从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三角瓶，摇匀稀释，测得OD₆₀₀为0.2，以10％的接种量接于10mL的液体培养基28℃、160rpm培养2d，制备东方伊萨酵母种子液，经稀释涂板计数与OD₆₀₀值的测量，得出东方伊萨酵母种子液有效活菌数(亿/mL)与OD₆₀₀值之间的关系为：y＝0.6703x-0.0717，R²＝0.9927。

地衣芽孢杆菌经过接种后，培养2～3d从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三角瓶，摇匀稀释，测得OD₆₀₀为0.2，以10％的接种量接于10mL的液体培养基30℃、160rpm培养2d，制备地衣芽孢杆菌种子液，经稀释涂板计数与OD₆₀₀值的测量，得出地衣芽孢杆菌种子液有效活菌数(亿/mL)与OD₆₀₀值之间的关系为：y＝2.1695x-0.0659，R²＝0.9976。

2)三株菌分别以5-20％的接种量接种至混合发酵培养基中，根据种子液有效活菌数与OD₆₀₀值之间的关系，控制地衣芽孢杆菌比其他两株菌的有效活菌数高一个数量级。优选地，地衣芽孢杆菌接种量为0.1-0.5亿个/ml发酵液，其它两株菌分别为0.01-0.05亿个/ml发酵液。培养基成分为：蔗糖10～20g/L、大豆粉10～20g/L、磷酸二氢钾1～3g/L、微量元素0～0.5g/L，起始pH值6.2-6.8。其中微量元素为氯化钙或硫酸锌或不加。培养基成分最优为：蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙0.1g/L，起始pH值6.5。

3)28℃、180rpm混合发酵3d。

目前，还没有文献报道淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌混合发酵的方法。不同属的微生物培养所需的营养物质不尽相同，同时培养容易产生拮抗作用。除了考虑不同种属微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、无机元素、微量元素、水和氧气等。对于大规模发酵生产，还须重视培养基原料的价格和来源。传统做法是将不同菌株在各自不同的生长环境中活化、逐级发酵后离心收集菌体，将各发酵产物混合制成多菌混合产品，具有制备工艺复杂，成本高，应用受到限制等缺点。

本发明的优点是，将三种土壤有益菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌混合发酵，发酵方法简易高效，发酵过程中发酵液的pH比较稳定；三种菌株能够相互协同又不产生拮抗作用，在培养基中生长良好，发酵3d后各功能菌有效活菌数≥2亿/mL；混合发酵培养基配方简单，降低了生产成本，提高了设备利用率，适宜于发酵产品的规模化生产；混合发酵菌剂具有改善土壤菌群平衡，减少化肥农药施用的作用；混合发酵菌剂使用安全，对环境无污染。

三种菌的混菌发酵方法，一方面为发酵产品的规模化生产提供了方法，另一方面，发酵产品可以和有机物料(腐熟的畜禽粪便、沼渣、蔗渣、泥炭、秸秆等)复配生产生物有机肥以及和微量元素、土壤改良剂等复配生产生物复混肥，同时也可以作为生物农药。本发明的混菌发酵方法为产品的实际生产应用打下了基础。

附图说明

图1三株菌在基础培养基上的菌落形态。

图2不同碳源对三株菌有效活菌数的影响。

图3不同氮源对三株菌有效活菌数的影响。

图4不同无机盐对三株菌有效活菌数的影响。

图5不同微量元素对三株菌有效活菌数的影响。

图6三株菌在混合培养时互不拮抗。

具体实施方式

下面实例将进一步说明本发明方法的可行性和应用效果。

实施例1混合培养基配方优化

以牛肉膏3g/L、蛋白胨12g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸锌0.1g/L为基础培养基，培养条件为起始pH值6.5、28℃、180rpm振荡3d。通过镜检和培养基平板涂布都能观察到三株菌，图1为基础培养基上三株菌的菌落形态，表明该基础培养基适合三株菌的培养。

分别以20g/L的添加量用蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉替代基础培养基中的葡萄糖，考察它们对混合培养的三株菌的有效活菌数的影响，如图2所示，以可溶性淀粉为碳源时，三株菌的总有效活菌数最高，其后依次是蔗糖、麦芽糖、葡萄糖。可溶性淀粉与蔗糖、麦芽糖对有效活菌数的影响差异不显著，综合考虑成本，选择蔗糖为碳源。

分别以15g/L的添加量用麸皮、大豆粉、酵母粉替代基础培养基中的牛肉膏和蛋白胨，考察它们对混合培养的三株菌的有效活菌数的影响，如图3所示，以牛肉膏和蛋白胨为氮源时，三株菌的总有效活菌数最高，其后依次是大豆粉、酵母粉、麸皮。牛肉膏和蛋白胨与大豆粉对有效活菌数的影响差异不显著，综合考虑成本，选择大豆粉为氮源。

分别以1g/L的添加量用氯化钠、硫酸镁替代基础培养基中的磷酸二氢钾，考察它们对混合培养的三株菌的有效活菌数的影响，如图4所示，以磷酸二氢钾为无机盐时，三株菌的总有效活菌数最高，其后依次是硫酸镁、氯化钠。因此选择磷酸二氢钾作为培养基中的无机盐来源。

分别以0.1g/L的添加量用硫酸铜、硫酸亚铁、氯化钙替代基础培养基中的硫酸锌，考察它们对混合培养的三株菌的有效活菌数的影响，如图5所示，以硫酸锌为微量元素时，三株菌的总有效活菌数最高，其后依次是氯化钙、硫酸铜、硫酸亚铁。硫酸锌和氯化钙对有效活菌数的影响差异不显著，综合考虑成本，选择氯化钙作为培养基中的微量元素来源。

分别选择最优的碳源、氮源、无机盐和微量元素按L₉(3)⁴设计四因素三水平正交试验，9个组合，重复3次。

表1培养基优化正交试验因素及水平(单位：g/L)

试验结果可知，大豆粉的极差最大，是影响三株菌有效活菌数的重要因子，其次依次是磷酸二氢钾、蔗糖，最后是氯化钙，由有效活菌数考察各因子水平值，最佳培养基组合为A₂B₃C₃D₃，即蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙0.1g/L。

表2培养基优化正交试验设计与结果

实施例2菌株特定培养基和混合发酵培养基的培养效果比较

东方伊萨酵母经过活化后用从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三角瓶，摇匀稀释至OD₆₀₀为0.2，以10％的接种量分别接种于以下三种已知可培养东方伊萨酵母的液体培养基和本发明的混合发酵液体培养基中，28℃、180rpm培养48h，取样检测有效活菌数。

表3三种已知东方伊萨酵母的培养基和本发明混合发酵培养基配方

地衣芽孢杆菌经过活化后从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三角瓶，摇匀稀释至OD₆₀₀为0.2，以10％的接种量接种于以下三种已知可培养地衣芽孢杆菌的液体培养基和本发明的混合发酵液体培养基中，28℃、180rpm培养48h，取样检测有效活菌数。

表4三种已知地衣芽孢杆菌的培养基和本发明混合发酵培养基配方

淡紫拟青霉涂板平板5d收集孢子，用生理盐水洗涤孢子制备孢子悬液，摇匀稀释至OD₆₀₀为0.2，以10％的接种量将孢子悬液接种于以下三种已知可培养淡紫拟青霉的液体培养基和本发明的混合发酵液体培养基中，28℃、180rpm培养72h取样检测有效活菌数。

表5三种已知淡紫拟青霉的培养基和本发明混合发酵培养基配方

在控制相同接种量的前提下，东方伊萨酵母在A、B、C、D四种不同培养基中培养24h后，有效活菌数分别为2.6、0.6、4、1.9亿/mL，地衣芽孢杆菌在A、B、C、D四种不同培养中培养48h后，有效活菌数分别为0.89、0.02、0.25、1.2亿/mL，淡紫拟青霉在A、B、C、D四种不同培养中培养72h后，有效活菌数分别为0.2、0.15、0.25、8.3亿/mL。结果显示，三种微生物均可以在本发明的混合发酵培养基上良好生长，本发明培养基也适合只需生产一种菌的需求。综合考虑培养基原料的价格和来源，本发明的混合发酵培养基配方为三菌的大规模应用提供了必要的前提条件。

实施例3混合发酵接种量的质控

为了控制混合发酵体系各种菌的初始接种有效活菌数，使各种菌的初始有效活菌数在已知可控范围，结合种子液有效活菌数与OD₆₀₀值之间的关系，制作了三株菌种子液有效活菌数与OD₆₀₀值之间的标准曲线。

淡紫拟青霉经接种后，培养4～6d收集孢子，用生理盐水洗涤孢子制备孢子悬液，用无菌水调节孢子悬液至OD₆₀₀为0.2，以10％的接种量将孢子悬液接种到液体培养基中，28℃、180rpm培养2d，制得淡紫拟青霉种子液，经稀释涂板计数与OD₆₀₀值的测量，得出淡紫拟青霉种子液有效活菌数(亿/mL)与OD₆₀₀值之间的关系为：y＝0.3386x-0.0318，R²＝0.9803。

东方伊萨酵母经过接种后，培养1～2d从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三角瓶，摇匀稀释，测得OD₆₀₀为0.2，以10％的接种量接于10mL的液体培养基28℃、160rpm培养2d，制备东方伊萨酵母种子液，经稀释涂板计数与OD₆₀₀值的测量，得出东方伊萨酵母种子液有效活菌数(亿/mL)与OD₆₀₀值之间的关系为：y＝0.6703x-0.0717，R²＝0.9927。

地衣芽孢杆菌经过接种后，培养2～3d从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三角瓶，摇匀稀释，测得OD₆₀₀为0.2，以10％的接种量接于10mL的液体培养基30℃、160rpm培养2d，制备地衣芽孢杆菌种子液，经稀释涂板计数与OD₆₀₀值的测量，得出地衣芽孢杆菌种子液有效活菌数(亿/mL)与OD₆₀₀值之间的关系为：y＝2.1695x-0.0659，R²＝0.9976。

三株菌种子液分别以10％的接种量接种至混合发酵培养基中，根据种子液有效活菌数与OD₆₀₀值之间的关系，对种子液进行合理的稀释，控制地衣芽孢杆菌比其他两株菌的有效活菌数高一个数量级，可显著提高混菌发酵终点的有效活菌数。混菌发酵时控制各菌株有效活菌数的比例，有利于各菌之间互相协同，达到最优的发酵效果。

实施例4三株菌在混合培养时互不拮抗

分别在PDA、YPD、营养琼脂培养基上活化菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌，将活化好的三株菌转接到相应的液体培养基上制备种子液。

通过划线点接法，将沾有东方伊萨酵母和地衣芽孢杆菌种子液的灭菌牙签交叉划线于本发明的混合发酵培养基平板上，同时在中间区域点接100μL的淡紫拟青霉种子液，如图6所示。培养基成分为：蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙0.1g/L，琼脂20g/L，起始pH值6.5。

28℃培养2～3d，观察三种菌株间的相互作用。

如图6所示，土壤有益微生物淡紫拟青霉、地衣芽孢杆菌、东方伊萨酵母可以在本专利发明的混合发酵培养基中良好生长，互不拮抗。利用混合培养生产三菌发酵产品是可行且乐观的。

实施例5混菌液态发酵和各菌株单独发酵的比较

1)分别在PDA、YPD、营养琼脂培养基上活化菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌，将活化好的三株菌转接到相应的液体培养基上制备种子液。

2)分别在不同的摇瓶中接入东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌、淡紫拟青霉，及在同一摇瓶中同时接入三株菌的种子液，在28℃，180rpm的摇床中培养。每种菌的种子液接种量皆为10％，混合发酵摇瓶中根据种子液有效活菌数与OD₆₀₀值之间的关系，控制地衣芽孢杆菌比其他两株菌的有效活菌数高一个数量级。培养3d，每隔24h取样检测pH、有效活菌数。培养基成分为：蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙0.1g/L，起始pH值6.5。

3)其中东方伊萨酵母用YPD培养基平板计数，地衣芽孢杆菌用营养琼脂计数，淡紫拟青霉用孟加拉红培养基计数。

测定结果如表6所示，混合发酵培养与单独发酵相比，地衣芽孢杆菌有效活菌数在72h时增加到52亿/mL，说明三菌的发酵产物对地衣芽孢杆菌的生长有促进作用；淡紫拟青霉的生长呈现递增的趋势，在72h时，有效活菌数已经达到3.2亿/mL。而发酵液的pH值变动幅度不大，说明三菌混合发酵比较稳定。

表6土壤有益微生物混菌发酵和单独发酵有效活菌数的比较

注：淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌分别简称为淡紫、地衣、东方。

实施例6不同微量元素对混合发酵有效活菌数的影响

1)分别在PDA、YPD、营养琼脂培养基上活化菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌，将活化好的三株菌转接到相应的液体培养基上制备种子液。

2)混合发酵培养基成分为：蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氢钾1g/L、微量元素0.1g/L，起始pH值6.5。添加微量元素为氯化钙时为配方1，添加微量元素为硫酸锌时为配方2，不加微量元素为配方3。在三种培养基配方摇瓶中接入三株菌，每种菌的种子液接种量皆为10％，未做种子液有效活菌数质控，28℃，180rpm的摇床中培养3d，终点取样检测pH、有效活菌数。

3)其中东方伊萨酵母用YPD培养基平板计数，地衣芽孢杆菌用营养琼脂计数，淡紫拟青霉用孟加拉红培养基计数。

测定结果如表7所示，含有不同微量元素的3种摇瓶中，三株菌均能正常生长，发酵终点时各有效活菌数≥2亿/mL。

表7不同微量元素配方中三菌有效活菌数及pH的比较

注：淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌分别简称为淡紫、地衣、东方。

实施例7土壤有益微生物发酵产物对油麦菜的促生增产作用

1)分别在PDA、YPD、营养琼脂培养基上活化菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌，将活化好的三株菌转接到相应的液体培养基上制备种子液。

2)淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌，三株菌的种子液有效活菌数根据有效活菌数与OD之间的标准曲线，控制在地衣芽孢杆菌比其他两菌株的有效活菌数高一个数量级，分别以10％的接种量接种至混合发酵培养基中，培养基成分为：蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙0.1g/L，起始pH值6.5。

3)28℃、180rpm混合发酵3d，收集发酵产物。

4)供试植物为油麦菜，选择长势一致的幼苗进行盆栽试验，试验设4个处理，重复5次，每盆5～6株，试验处理设计如表8。

表8油麦菜盆栽试验处理设计

5)各处理置于具有避雨、通风、调温的功能的温室中，统一进行日常喷雾浇水，分别于10d、20d、30d、40d后测定株高、根长和鲜量。测定结果分析如表9。施用发酵菌液的处理1与其他对照处理相比，在各个采样期能够显著提高油麦菜的生物量。而处理2(常规施肥+灭活菌液)与处理3(常规施肥)，前30d取样，两处理间鲜重差异不显著，第40d，处理2的生物量显著高于处理3。

表9不同处理下油麦菜生物量随时间的变化

Claims (8)

1.一种土壤有益微生物混合发酵的方法，其特征在于，方法步骤为：

1)分别活化菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌，将活化好的三株菌转接到相应的液体培养基上制备种子液；

2)三株菌分别以5-20％体积比的接种量接种至混合发酵培养基中，混合发酵培养基成分包括蔗糖10～20g/L、大豆粉10～20g/L、磷酸二氢钾1～3g/L、微量元素0.1～0.5g/L，起始pH值6.2-6.8,微量元素为氯化钙或硫酸锌；

3)混合发酵。

2.根据权利要求1所述的一种土壤有益微生物混合发酵的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)为三炬03号菌株，保藏编号为CCTCCNO:2010165，所述的东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)为三炬-06菌株，保藏编号为CCTCC NO:2012470，所述地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)为三炬-10菌株，保藏编号为CGMCC No.10741。

3.根据权利要求1所述的一种土壤有益微生物混合发酵的方法，其特征在于：所述步骤2)中，根据种子液有效活菌数与OD₆₀₀值之间的关系，控制地衣芽孢杆菌比其它两株菌的有效活菌数高一个数量级。

4.根据权利要求3所述的一种土壤有益微生物混合发酵的方法，其特征在于：地衣芽孢杆菌接种量为0.1-0.5亿个/ml发酵液，其它两株菌分别为0.01-0.05亿个/ml发酵液。

5.根据权利要求1所述的一种土壤有益微生物混合发酵的方法，其特征在于：所述步骤2)中，混合发酵培养基成分为：蔗糖10～20g/L、大豆粉10～20g/L、磷酸二氢钾1～3g/L、微量元素0.1～0.5g/L，起始pH值6.5，所述微量元素为氯化钙。

6.根据权利要求1所述的一种土壤有益微生物混合发酵的方法，其特征在于：混合发酵培养基为：蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙0.1g/L，起始pH值6.5。

7.根据权利要求1所述的一种土壤有益微生物混合发酵的方法，其特征在于：所述步骤3)中，20-30℃、150-250rpm混合发酵2～3d。

8.根据权利要求1所述的一种土壤有益微生物混合发酵的方法在制备生物肥和生物农药中的应用。