CN105274030B - 一种根瘤菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)LX‑JX01及其用途。本发明慢生根瘤菌LX‑JX01菌剂制备方法包括液体DM培养基制备、固体DM培养基制备、菌株活化与根瘤菌培养等步骤。该菌株能与降香黄檀结瘤共生。使用本发明降香黄檀根瘤菌LX‑JX01菌剂栽种降香黄檀苗时，它的根瘤结瘤数比对照提高3823％，根瘤鲜重增加1038％，植株地上部分干重增加47.22％，幼苗高度和植株径粗分别提高1030％和42.3％，因此，本发明的菌剂能够促进降香黄檀的生长。因此，本发明的菌剂在降香黄檀人工林种植上有广阔的应用前景。

Description

一种根瘤菌及其用途

【技术领域】

本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种根瘤菌，还涉及所述根瘤菌的用途。

【背景技术】

根瘤菌可以与豆科植物结瘤共生固氮，根瘤菌通过固定空气中的氮气转化为氨，从而为豆科植物提供氮素营养，而豆科植物为根瘤菌提供养分，两者形成共生体系。由于根瘤菌对豆科植物的侵染具有专一性和有效性，因此需要选育适合豆科植物的根瘤菌才能达到共生效果。接种根瘤菌是国际上公认的生物固氮技术，生物固氮不会对环境造成任何污染，同时改善土壤，促进植物生长，是可持续农业发展的重要措施。

降香黄檀为豆科植物，是国家二级重点保护野生植物，其木材木质坚硬，纹理漂亮，是制作古典硬木家具的上乘材料，其根部心材和树干心材能代降香，供药用，为良好的镇痛剂。另外，在福建、贵州等地还可作为绿化树。多年来我国林业部门在研究“降香黄檀”的育苗工作中投入了大量的人力、物力、财力，虽得以成功，但成活率较低，通过使用根瘤菌剂可以与降香黄檀形成共生固氮体系，提高降香黄檀的成活率并促进植株长势，对今后降香黄檀的人工种植栽培具有重要意义。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种根瘤菌(Rhizobium sp.)LX-JX01。

本发明的另一个目的是提供所述根瘤菌菌剂的制备方法。

本发明的另一个目的是提供所述根瘤菌菌剂的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种根瘤菌(Rhizobium sp.)LX-JX01，该菌株已于2015年8月21日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.11265。

本发明还涉及一种根瘤菌LX-JX01菌剂制备方法。

该制备方法的步骤如下：

A、液体DM培养基制备

将1～3克酵母膏、8～12克蔗糖、1～3克硝酸钾、0.4～0.6克磷酸氢二钾、0.4～0.6克磷酸二氢钾与0.1～0.2克氯化钠溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容到1000ml；再使用无机酸或无机碱将其溶液的pH值调节至6.8～7.2，得到所述的液体DM培养基；

B、固体DM培养基制备

按照每升液体DM培养基为18～20克琼脂，往步骤A制备得到的液体DM培养基加入琼脂，加热至100℃使其琼脂溶解，然后在温度40℃下进行冷却使其DM培养基成为固体状态，于是得到所述的固体DM培养基；

C、菌株活化

将保存于温度4℃冰箱中在固体DM培养基斜面上的菌株CGMCCNo.11265转接到新鲜配制的固体DM培养基平板上，划线出单菌落，然后在温度4℃的冰箱中保存待用；

D、根瘤菌培养

用灭菌接种环从步骤C的固体DM培养基平板上挑取两环单菌落，接种到150ml灭菌液体DM培养基中，在摇床中在温度26～30℃与转速160～200转/分钟的条件下振荡培养70～75小时，通过常规镜检确定无杂菌便得到所述的液体根瘤菌菌剂。

根据本发明的一种优选实施方式，所述的无机酸选自硫酸、盐酸或磷酸；所述的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的液体DM培养基是由1.8～2.2克酵母膏、9～11克蔗糖、1.8～2.2克硝酸钾、0.45～0.55克磷酸氢二钾、0.45～0.55克磷酸二氢钾与0.14～0.16克氯化钠制备得到的。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的液体DM培养基是由2克酵母膏、10克蔗糖、2克硝酸钾、0.5克磷酸氢二钾、0.5克磷酸二氢钾与0.15克氯化钠制备得到的。

本发明还涉及采用所述制备方法制备得到的根瘤菌LX-JX01菌剂。

本发明还涉及所述的根瘤菌LX-JX01菌剂在促进降香黄檀生长中的用途。

本发明还涉及所述的根瘤菌LX-JX01菌剂在降香黄檀育苗中的用途。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种根瘤菌(Rhizobium sp.)LX-JX01，该菌株已于2015年8月21日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.11265。

本发明人于2010年5月从广西凭祥市中国林科院热林中心苗圃中采集了黄壤土样品，从中分离得到一株降香黄檀根瘤菌。

一、根瘤菌的获得

将常规表面消毒的降香黄檀种子经过浸泡、晾干处理后种植到所述的黄壤土中，在60天后植株结瘤固氮。将根瘤取下，采用常规方法进行表面消毒，然后使用常规根瘤菌分离培养基(文献：许月蓉，“分离根瘤菌用的选择培养基”，《土壤》、1988年03期)采用稀释涂布方法从中分离得到根瘤菌。经平板纯化与后续的发酵培养鉴定、回接结瘤验证，确定将一株在固体分离培养基上生长的菌株命名为LX-JX01，该菌株与降香黄檀有共生结瘤固氮的作用，初步确定该菌株是降香黄檀根瘤菌。

二、根瘤菌的鉴定

1、常规镜检

分离得到的降香黄檀根瘤菌经过革兰氏染色法染色结果为阴性。在通常甘露醇固体平板培养基中在恒温28℃的条件下培养7天，可长出肉眼可见的直径约2mm表面光滑、边缘整齐的白色圆形菌落；在摇瓶中在所述的液体DM培养基中培养3d，采用常规镜检，其形态一头空心不着色，其它部分是着色均匀的浅粉色，根据形态特征和习性可以确定它属于慢生型根瘤菌。

2、16S rDNA序列测定：

将分离得到的降香黄檀根瘤菌送到北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序。经过比对，所鉴定的菌株与大豆根瘤菌的相似度为98％，所以断定这个菌株为根瘤菌属。

根瘤菌CGMCC No.11265菌株16S rRNA基因序列测定结果见附录1。

所鉴定的菌株与大豆根瘤菌(Rhizobiumjaponicum)同源性最高。

3、生理生化鉴定

①牛肉膏-蛋白胨检测

将根瘤菌LX-JX01菌株接种到牛肉膏-蛋白胨培养基中在恒温箱中在温度28℃下培养5天。培养液澄清，菌体未见生长，与未接种菌株的对照相同，这表明该菌株不能在牛肉膏-蛋白胨培养基上生长。

牛肉膏-蛋白胨培养基组成如下：5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、1000ml蒸馏水，pH7.2。

在这个步骤以及后续步骤所使用的恒温培养箱是目前市场上销售的产品。

②BTB反应

将根瘤菌LX-JX01菌株在BTB平板上在恒温箱中在温度28℃下培养7天。平板颜色变蓝，说明该菌株在BTB平板上产碱，属于慢生型菌株。

BTB反应培养基组成如下：10g甘露醇、0.8g酵母浸膏粉、0.25g磷酸氢二钾、0.25g磷酸二氢钾、0.2g硫酸镁、0.1g氯化钠、15-20g琼脂、1000ml蒸馏水，1ml以重量计0.25％溴麝香草酚蓝，pH6.8-7.0。

③石蕊牛奶反应

将根瘤菌LX-JX-01菌株接种到石蕊牛奶培养基中，在温度28℃下培养7天，培养基颜色变蓝，并形成乳清环，表明该菌株产碱，属于慢生型菌株。

石蕊牛奶培养基组成如下：100ml脱脂牛奶，4ml2.5％石蕊溶液，低压灭菌。

④3-酮基乳糖反应

根瘤菌LX-JX01菌株的反应呈阴性，菌落周围未出现黄褐色沉淀，表明该菌株为非土壤杆菌。

3-酮基乳糖培养基组成如下：10g乳糖、1g酵母浸膏粉、1000ml蒸馏水、15-20g琼脂，pH7.2。

综合以上鉴定结果表明，根瘤菌菌株CGMCC No11265为大豆慢生型根瘤菌(Rhizobium japonicum)。

本发明涉及一种根瘤菌LX-JX01菌剂制备方法。

该菌剂的制备方法的步骤如下：

A、液体DM培养基制备

将1～3克酵母膏、8～12克蔗糖、1～3克硝酸钾、0.4～0.6克磷酸氢二钾、0.4～0.6克磷酸二氢钾与0.1～0.2克氯化钠溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容到1000ml；再使用无机酸或无机碱将其溶液的pH值调节至6.8～7.2，得到所述的液体DM培养基。

用于根瘤菌常规培养的培养基是YMA(Yeast-Mannitol-Agar)，即酵母粉-甘露醇-琼脂培养基。本发明使用的DM培养基与YMA培养基的差别在于碳源和氮源种类不同，在DM培养基中以蔗糖为碳源，在YMA培养基中以甘露醇为碳源。

所述的无机酸选自硫酸、盐酸或磷酸；所述的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠。

在本发明中所使用的无机酸是无机酸水溶液，无机碱是无机碱水溶液。所述的无机酸或无机碱水溶液的浓度通常是0.1-2.0N。

优选地，所述的液体DM培养基是由1.8～2.2克酵母膏、9～11克蔗糖、1.8～2.2克硝酸钾、0.45～0.55克磷酸氢二钾、0.45～0.55克磷酸二氢钾与0.14～0.16克氯化钠制备得到的。

更优选地，所述的液体DM培养基是由2克酵母膏、10克蔗糖、2克硝酸钾、0.5克磷酸氢二钾、0.5克磷酸二氢钾与0.15克氯化钠制备得到的。

所述的液体DM培养基在采用常规灭菌处理后可以用于其菌株培养。

B、固体DM培养基制备

按照每升液体DM培养基为18～20克琼脂，往步骤A制备得到的液体DM培养基加入琼脂，加热至100℃使其琼脂溶解，然后在温度40℃下进行冷却，使其DM培养基成为固体状态，于是得到所述的固体DM培养基。

固体DM培养基的相关情况与液体DM培养基相同，在此不再赘述。

C、菌株活化

将保存于温度4℃冰箱中在固体DM培养基斜面上的菌株CGMCCNo.11265转接到新鲜配制的固体DM培养基平板上，划线出单菌落，然后在温度4℃的冰箱中保存待用。

D、根瘤菌培养

用灭菌接种环从步骤C的固体DM培养基平板上挑取两环单菌落，接种到150ml灭菌液体DM培养基中，在摇床中在温度26～30℃与转速160～200转/分钟的条件下振荡培养70～75小时，通过常规镜检确定无杂菌便得到所述的液体根瘤菌LX-JX01菌剂。

在这个步骤使用的摇床是目前市场上销售的产品，例如由上海合恒仪器设备有限公司以商品名“合恒”销售的产品。

所得到液体根瘤菌LX-JX01菌剂的根瘤菌LX-JX01含量是采用本技术领域里常规的活菌平板计数的方法。

测定采用本发明方法得到的液体根瘤菌菌剂含有100～200亿个/ml液体根瘤菌LX-JX01。

本发明还涉及采用所述制备方法制备得到的根瘤菌LX-JX01菌剂。

本发明还涉及所述的根瘤菌LX-JX01菌剂在促进降香黄檀生长中的用途。

本发明还涉及所述的根瘤菌LX-JX01菌剂在降香黄檀育苗中的用途。

使用本发明菌剂进行降香黄檀育苗的方法步骤如下：

(1)用清水浸泡降香黄檀种子24小时，晾干后在苗床播种；

(2)育苗，待苗高4-5cm长出真叶后，往其根部施入本发明的根瘤菌剂；

(3)幼苗的成苗期，根瘤菌在降香黄檀根系上结瘤，形成结瘤幼苗；

(4)幼苗田间移栽；

(5)日常管理方法，确保植株成活。

本发明人通过根瘤菌的分离、培养、鉴定等研究，找到一株高效结瘤固氮的降香黄檀慢生型根瘤菌。试验的结果列于图1-5中，这些试验结果表明，应用本发明根瘤菌剂后，可显著提高降香黄檀的成活率可达99％和结瘤率100％，保证其生长中获得更多的氮素营养，促进了降香黄檀在自然环境中的健康成长，有利于在人工种植过程中达到恢复和保护生态环境的目的。

[有益效果]

本发明的有益效果是：本发明的根瘤菌LX-JX01能够提高降香黄檀的结瘤率，保证其生长中获得更多的氮素营养，促进降香黄檀在自然环境中的健康成长。室内及室外试验的结果均表明，应用本发明根瘤菌剂后，可显著提高降香黄檀的成活率和结瘤率，并促进降香黄檀的生长,与对照幼苗相比，本发明的降香黄檀根瘤菌LX-JX01的根瘤结瘤数提高3823％，根瘤鲜重增加1038％，植株地上部分干重增加47.22％，并且幼苗高度和植株径粗分别提高1030％和42.3％，促进了降香黄檀的生长。

根瘤菌(Rhizobium sp.)LX-JX01，该菌株已于2015年8月21日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.11265。

【附图说明】

图1是在降香黄檀种子播种60天后其植株的平均根瘤数目统计结果；

图2是在降香黄檀种子播种60天后其植株的平均根瘤鲜重统计结果；

图3是在降香黄檀种子播种60天后其植株的平均地上部分干重统计结果；

图4是在降香黄檀种子播种60天后其植株的平均地上部分株高统计结果；

图5是在降香黄檀种子播种60天后其植株的平均径粗统计结果。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

实施例1：根瘤菌LX-JX01菌剂制备

该实施例的实施步骤如下：

A、液体DM培养基制备

将1克酵母膏、10克蔗糖、2克硝酸钾、0.4克磷酸氢二钾、0.4克磷酸二氢钾与0.15克氯化钠溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容到1000ml；再使用1.0N硫酸或1.0N氢氧化钠将其溶液的pH值调节至6.8，得到所述的液体DM培养基；

B、固体DM培养基制备

按照每升液体DM培养基为18克琼脂，往步骤A制备得到的液体DM培养基加入琼脂，加热至100℃使其琼脂溶解，然后在温度40℃下进行冷却，使其DM培养基成为固体状态，于是得到所述的固体DM培养基；

C、菌株活化

将保存于温度4℃冰箱中在固体DM培养基斜面上的菌株CGMCC No.11265转接到新鲜配制的固体DM培养基平板上，划线出单菌落，然后在温度4℃的冰箱中保存待用；

D、根瘤菌培养

用灭菌接种环从步骤C的固体DM培养基平板上挑取两环单菌落，接种到150ml灭菌液体DM培养基中，在由无锡久平仪器有限公司以商品名“久平”销售的摇床中在温度26℃与转速180转/分钟的条件下振荡培养70小时，通过常规镜检确定无杂菌便得到所述的液体根瘤菌菌剂。

采用本说明书中描述的活菌平板计数法测定，本实施例制备的液体根瘤菌LX-JX01菌剂每毫升含有100亿个根瘤菌LX-JX01。

实施例2：根瘤菌LX-JX01菌剂制备

该实施例的实施步骤如下：

A、液体DM培养基制备

将3克酵母膏、8克蔗糖、1克硝酸钾、0.6克磷酸氢二钾、0.5克磷酸二氢钾与0.1克氯化钠溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容到1000ml；再使用0.1N硫酸或0.1N氢氧化钠将其溶液的pH值调节至7.0，得到所述的液体DM培养基；

B、固体DM培养基制备

按照每升液体DM培养基为20克琼脂，往步骤A制备得到的液体DM培养基加入琼脂，加热至100℃使其琼脂溶解，然后在温度40℃下进行冷却，使其DM培养基成为固体状态，于是得到所述的固体DM培养基；

C、菌株活化

将保存于温度4℃冰箱中在固体DM培养基斜面上的菌株CGMCCNo.11265转接到新鲜配制的固体DM培养基平板上，划线出单菌落，然后在温度4℃的冰箱中保存待用；

D、根瘤菌培养

用灭菌接种环从步骤C的固体DM培养基平板上挑取两环单菌落，接种到150ml灭菌液体DM培养基中，在由金坛市三和仪器有限公司以商品名“三和”销售的摇床中在温度30℃与转速160转/分钟的条件下振荡培养75小时，通过常规镜检确定无杂菌便得到所述的液体根瘤菌菌剂。

采用本说明书中描述的活菌平板计数法测定，本实施例制备的液体根瘤菌LX-JX01菌剂每毫升含有150亿个根瘤菌LX-JX01。

实施例3：根瘤菌LX-JX01菌剂制备

该实施例的实施步骤如下：

A、液体DM培养基制备

将2克酵母膏、12克蔗糖、3克硝酸钾、0.5克磷酸氢二钾、0.6克磷酸二氢钾与0.2克氯化钠溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容到1000ml；再使用2.0N硫酸或2.0N氢氧化钠将其溶液的pH值调节至7.2，得到所述的液体DM培养基；

B、固体DM培养基制备

按照每升液体DM培养基为19克琼脂，往步骤A制备得到的液体DM培养基加入琼脂，加热至100℃使其琼脂溶解，然后在温度40℃下进行冷却，使其DM培养基成为固体状态，于是得到所述的固体DM培养基；

C、菌株活化

将保存于温度4℃冰箱中在固体DM培养基斜面上的菌株CGMCCNo.11265转接到新鲜配制的固体DM培养基平板上，划线出单菌落，然后在温度4℃的冰箱中保存待用；

D、根瘤菌培养

用灭菌接种环从步骤C的固体DM培养基平板上挑取两环单菌落，接种到150ml灭菌液体DM培养基中，在由常州润华电器有限公司以商品名“润华”销售的摇床中，在温度28℃与转速200转/分钟的条件下振荡培养72小时，通过常规镜检确定无杂菌便得到所述的液体根瘤菌菌剂。

采用本说明书中描述的活菌平板计数法测定，本实施例制备的液体根瘤菌LX-JX01菌剂每毫升含有200亿个根瘤菌LX-JX01。

试验实施例1：本发明液体根瘤菌LX-JX01菌剂应用降香黄檀育苗试验

该试验实施例的实施步骤如下：

试验时间：2015年6月5日至8月5日。

试验地点：领先生物农业股份有限公司阳光温室。

试验方法与材料：

A、种子处理与催芽

①降香黄檀种子在无菌水中浸泡24小时，其种子膨胀，然后将处理的种子捞出晾干，放在灭菌蛭石苗床中(加无菌水保湿)，约20天发芽。待苗长高至4-5厘米，长出真叶时移栽到营养袋中。

②营养袋准备

试验组营养袋：将水份含量为以重量计10％以下的黄壤土通过10目筛子，将筛下黄壤土装入营养袋中，黄壤土的量为营养袋体积的1/3。

对照组营养袋：将直径0.75～1.0mm的蛭石粉装入营养袋中，蛭石粉的量为营养袋体积的1/3。

B、幼苗移植

黄壤土营养袋：

第一试验组(黄壤土营养袋)：从①移取生长接近的降香黄檀苗，用蒸馏水将根部清洗干净，再栽种于试验组营养袋中，每袋栽1株降香黄檀苗。然后每袋注入1mL本发明的液体根瘤菌LX-JX01菌剂，该菌剂浓度为120CUF/mL。将装好的营养袋统一摆放到育苗床中。

第一对照组(黄壤土营养袋，不加液体根瘤菌LX-JX01菌剂)：从①移取生长接近的降香黄檀苗，用蒸馏水将根部清洗干净，再栽种于试验组营养袋中，每袋栽1株降香黄檀苗。将装好的营养袋统一摆放到育苗床中。

蛭石营养袋：

第二组试验组(蛭石营养袋)：从①移取生长接近的降香黄檀苗，用蒸馏水将根部清洗干净，再栽种于试验组营养袋中，每袋栽1株降香黄檀苗。然后每袋注入1mL本发明的液体根瘤菌LX-JX01菌剂，该菌剂浓度为120CUF/mL。将装好的营养袋统一摆放到育苗床中。

第二组对照组(蛭石营养袋，不加液体根瘤菌LX-JX01菌剂)：从①移取生长接近的降香黄檀苗，用蒸馏水将根部清洗干净，再栽种于试验组营养袋中，每袋栽1株降香黄檀苗。将装好的营养袋统一摆放到育苗床中。

试验采用单因素随机区组设计，每个处理20次重复。接种60天后观察降香黄檀苗结瘤及其生长情况。

3、育苗

播种后根据天气情况适时浇水，育苗时间60天，接种处理的种子则形成结瘤苗。结瘤苗形成后，根据对根瘤的常规调查标准测定结瘤数目、根瘤鲜重、地上部分干重、地上部分株高与径粗指标，每组统计20株植株，其结果列于附图中。

在育苗60天后，降香黄檀植株的平均结瘤数目(个)测定结果列于附图1中，这些结果表明，以黄壤土或蛭石为基质时，施加本发明根瘤菌LX-JX01菌剂后，降香黄檀植株的平均结瘤数目均明显高于不施加根瘤菌菌剂的对照处理，提高3823％。

在育苗60天后，降香黄檀植株平均根瘤鲜重(g)测定结果列于附图2中。这些结果表明，以黄壤土和蛭石为基质时，施加本发明根瘤菌LX-JX01菌剂后，降香黄檀植株的平均根瘤鲜重极明显高于不施加根瘤菌菌剂的对照处理，增加1038％。

在育苗60天后，降香黄檀植株的平均地上部分干重(g)测定结果列于图3中。这些结果表明，以黄壤土和蛭石为基质时，施加本发明根瘤菌LX-JX01菌剂后，降香黄檀植株的平均地上部分干重均明显高于不施加根瘤菌菌剂的对照处理，增加47.22％。

在育苗60天后，降香黄檀植株的平均地上部分株高(cm)与植株径粗(cm)测定结果列于图4和图5中，这些结果表明，以黄壤土和蛭石为基质时，施加本发明根瘤菌LX-JX01菌剂后，植株的平均地上部分株高与植株径粗均明显高于不施加根瘤菌菌剂的对照处理，分别提高1030％和42.3％。

4、出苗栽植与管理

营养袋苗长到50厘米左右应尽快移植到造林地。种植时先撕掉薄膜袋，然后放入植穴中，植穴规格可为50cm×50cm×50cm，最后回填土。造林密度为每亩50-60株。移植后要根据情况及时浇水、松土、除草、扩穴和修剪，如果植株得病要及时进行防治，以保证植株成活。

Claims (7)

1. 一种根瘤菌（Rhizobium sp.）LX-JX01，该菌株已于2015年8月21日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.11265。

2.一种根瘤菌LX-JX01菌剂制备方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、液体DM培养基制备

将1～3克酵母膏、8～12克蔗糖、1～3克硝酸钾、0.4～0.6克磷酸氢二钾、0.4～0.6克磷酸二氢钾与0.1～0.2克氯化钠溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容到1000ml；再使用无机酸或无机碱将其溶液的pH值调节至6.8～7.2，得到所述的液体DM培养基；所述的无机酸选自硫酸、盐酸或磷酸；所述的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠；

B、固体DM培养基制备

按照每升液体DM培养基为18～20克琼脂，往步骤A制备得到的液体DM培养基加入琼脂，加热至100℃使其琼脂溶解，然后在温度40℃下进行冷却使其DM培养基成为固体状态，于是得到所述的固体DM培养基；

C、菌株活化

将保存于温度4℃冰箱中在固体DM培养基斜面上的菌株CGMCC No.11265转接到新鲜配制的固体DM培养基平板上，划线出单菌落，然后在温度4℃的冰箱中保存待用；

D、根瘤菌培养

用灭菌接种环从步骤C的固体DM培养基平板上挑取两环单菌落，接种到150ml灭菌液体DM培养基中，在摇床中在温度26～30℃与转速160～200转/分钟的条件下振荡培养70～75小时，通过常规镜检确定无杂菌便得到所述的液体根瘤菌菌剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的液体DM培养基是由1.8～2.2克酵母膏、9～11克蔗糖、1.8～2.2克硝酸钾、0.45～0.55克磷酸氢二钾、0.45～0.55克磷酸二氢钾与0.14～0.16克氯化钠制备得到的。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的液体DM培养基是由2克酵母膏、10克蔗糖、2克硝酸钾、0.5克磷酸氢二钾、0.5克磷酸二氢钾与0.15克氯化钠制备得到的。

5.根据权利要求2-4任一项权利要求所述制备方法制备得到的根瘤菌LX-JX01菌剂。

6.根据权利要求5所述的根瘤菌LX-JX01菌剂在促进降香黄檀生长中的用途。

7.根据权利要求5所述的根瘤菌LX-JX01菌剂在降香黄檀育苗中的用途。