CN108660194A - 一种帕金森病致病基因突变筛查检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种帕金森病致病基因突变筛查检测方法，包括以下步骤：(1)将合成的MIPs探针，加dd H2O配成浓度为100μM的探针溶液；(2)使用移液器吸取(1)中每条探针溶液1μl，置于1.5ml的新EP管中，充分混匀，在管壁使用Marker笔标记为mixed‑MIPs；(3)配置MIPs探针磷酸化激活体系，将mixed‑MIPs进行激活；(4)mixed‑MIPs探针稀释；(5)配制MIPs靶向捕获反应体系；(6)配制MIPs酶切反应体系；(7)PCR扩增反应；(8)聚丙烯酰胺凝胶电泳与磁珠纯化；(9)混合文库进行高通量测序；(10)Sanger测序验证；通过本发明的帕金森病致病基因突变筛查检测方法，可以完成对帕金森病18个PD致病基因突变筛查，对潜在PD患者的超早期诊断、PD发病机制研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及帕金森病致病基因突变筛查检测技术领域，具体是一种帕金森病致病基因突变筛查检测方法。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)，为一种常见的神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases)，患病率高，国内外流行病学调查显示65岁以上的老年人群中PD的患病率约为1～2％，80岁以上老年人群患病率高达4％。我国现有约250万名PD患者，随着我国人口老龄化及人均寿命的延长，预计到2030年，我国将有约500万名PD患者，占世界PD患者总数的57％。PD患者隐袭起病，早期临床表现多不明显，给临床工作中早期诊断带来很大困难，而当患者出现典型的帕金森症状进行临床诊断时，此时患者多已进入疾病中晚期，已错过最佳干预治疗期，给患者及家庭带来沉重负担。因此，对PD的病因和发病机制的探讨，以便更好地对PD进行早期诊断与及早防治将显得迫切而必要。
PD主要临床表现包括运动迟缓(bradykinesia)、静止性震颤(rest tremor)、肌强直(rigidity)等运动症状和嗅觉障碍(hyposmia)、快动眼期睡眠行为障碍(Rapid eyemovement sleep behavior disorder,RBD)、焦虑/抑郁(anxiety/depression)、自主神经功能障碍(autonomic nervous dysfunction)等非运动症状(non-motor symptoms)。其病理特征主要是中脑黑质多巴胺能神经元变性缺失和残留神经元胞体中路易小体(Lewybody)、路易轴突(Lewy neurities)的形成。至今，PD的病因及发病机制仍不十分明确，现多认为老年化因素(aging)、遗传因素(genetic factors)和环境因素(environmentalfactors)及其共同作用而参与疾病发生。
自上世纪90年代鉴定了PD的第一个致病基因-SNCA以来，遗传因素对PD的贡献受到越来越多关注。目前，遗传因素在PD发病机制研究、药物研发、疾病早期诊断/预警研究等方面提供了新思路。至今，在致病基因研究方面，已有20个遗传性PD致病基因被明确：其中SNCA、UCH-L1、LRRK2、HTRA2、GIGYF2、VPS35、EIF4G1、DNAJC13、CHCHD2及TMEM230基因与常染色体显性(autosomal dominant，AD)遗传性PD相关；Parkin、DJ-1、PINK1、ATP13A2、PLA2G6、FBXO7、DNAJC6、SYNJ1和VPS13C基因与常染色体隐性(autosomal recessive,AR)遗传性PD相关；RAB39B与X连锁(X-linked)遗传性PD有关。上述致病基因的发现，为解析PD患者病因提供了新思路。
分子倒置探针(Molecular Inversion Probes,MIPs)是一种操作简单、成本很低的方法。2007年，Prof.Jay Shendure团队首次建立MIPs技术，对基因组序列中感兴趣区域的序列进行捕获、富集，并对捕获后的文库进行高通量测序及测序数据分析，分析结果肯定了MIPs技术在靶向捕获中的特异性及准确性。MIPs技术的成功研发为靶向捕获提供了新的选择，这种新型多重靶向捕获测序方法，将构建测序文库与高通量测序有机结合的同时，大大降低了靶向捕获测序的成本。该方法操作简便，结合成本很低的特点，为大样本基因组序列变异筛查、疾病罕见变异研究提供了新选择，并广泛应用到疾病遗传因素研究中。
目前，PD治疗主要为对因治疗，尚无治愈手段。进行早期诊断，将使患者有机会获得及时、有效、合理的干预。因此进行PD致病基因突变位点检测，将对潜在PD患者的超早期诊断、PD发病机制研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种帕金森病致病基因突变筛查检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种帕金森病致病基因突变筛查检测方法，包括以下步骤：
(1)将合成的MIPs探针，加dd H2O配成浓度为100μM的探针溶液，在-20℃温度下储存备用；
(2)使用移液器吸取(1)中每条探针溶液1μl，置于1.5ml的新EP管中，充分混匀，在管壁使用Marker笔标记为mixed-MIPs；
(3)配置MIPs探针磷酸化激活体系，将mixed-MIPs进行激活；
反应体系如下：25μl的mixed-MIPs、3μl的T4Polynucleotide Kinase、1μl的T4PNK、1μl的dd H2O、30μl的Total，
反应条件如下：37℃，45min→65℃，20min→4℃；
(4)mixed-MIPs探针稀释：使用移液器吸取(3)中已磷酸化激活的mixed-MIPs探针混合液1μl加至新1.5ml EP管中，加99μl dd H2O，混合均匀，稀释成100倍的pooled-MIPs，4℃保存备用；
(5)配制MIPs靶向捕获反应体系：10μl的DNA(10ng/μl)、2.5μl的10x AmpligaseDNA ligase reaction Buffer、0.01μl的、Ampligase DNA ligase、0.03μl的dNTP(0.25mM)、0.32μl的Hemo Klentaq、0.1μl的pooled-MIPs、25μl的dd H2O，
MIPs靶向捕获反应条件：95℃，10min→60℃，22h→10℃；
(6)配制MIPs酶切反应体系：0.5μl的Exonuclease I、0.5μl的Exonuclease III、0.2μl的10×Ampligase Buffer、0.8μl的dd H2O、25μl的MIPs靶向捕获产物，
酶切反应条件：37℃，60min→95℃，3min→4℃；
(7)PCR扩增反应
步骤(6)中产物为MIPs探针-靶向捕获区域的单链环状DNA分子，作为本步骤的模板进行PCR扩增，通过PCR反应将目标捕获序列进行扩增，并通过携带标签序列(index)反向引物，对不同样本进行标记，以便对不同样本的测序数据进行区分、识别；
PCR扩增反应体系：12.5μl的Q5High Fidelity 2×Master Mix、0.125μl的Forward primer(100μM)、1.25μl的Reverse primer(10μM)、5μl的酶切反应体系、25μl的ddH2O，
PCR扩增反应条件：98℃，30s→98℃，10s
↙↖21循环
60℃，30s→72℃，30s→72℃，2min→4℃；
(8)聚丙烯酰胺凝胶电泳与磁珠纯化
利用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，取步骤(7)的PCR扩增产物，进行产物鉴定，保证产生的文库无差错；
(9)混合文库进行高通量测序
运用Illumina HiSeq 3000高通量测序平台，对(8)中构建的文库，进行Paired-end150bp测序，并对测序数据进行生物信息学分析；
(10)Sanger测序验证
针对选定的变异位点进行PCR扩增引物设计，并进行PCR反应扩增，对扩增产物进行Sanger测序，验证高通量测序筛选的碱基改变的准确性，排除高通量测序造成的假阳性可能。
作为本发明进一步的方案：还包括生物样本，所述生物样本为体液，所述体液包括但不限于：血液、血清、羊水、淋巴液。
作为本发明进一步的方案：所述体液为血液。
作为本发明进一步的方案：在所述聚合酶链扩增反应使用的引物对为：SEQ IDNO:6。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过本发明的帕金森病致病基因突变筛查检测方法，可以完成对帕金森病18个PD致病基因突变筛查，对潜在PD患者的超早期诊断、PD发病机制研究具有重要意义。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将结合实施例来详细说明本发明。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种帕金森病致病基因突变筛查检测方法，包括以下步骤：
(1)将合成的MIPs探针，加dd H2O配成浓度为100μM的探针溶液，在-20℃温度下储存备用；
(2)使用移液器吸取(1)中每条探针溶液1μl，置于1.5ml的新EP管中，充分混匀，在管壁使用Marker笔标记为mixed-MIPs；
(3)配置MIPs探针磷酸化激活体系，将mixed-MIPs进行激活；
反应体系如下：25μl的mixed-MIPs、3μl的T4Polynucleotide Kinase、1μl的T4PNK、1μl的dd H2O、30μl的Total，
反应条件如下：37℃，45min→65℃，20min→4℃；
(4)mixed-MIPs探针稀释：使用移液器吸取(3)中已磷酸化激活的mixed-MIPs探针混合液1μl加至新1.5ml EP管中，加99μl dd H2O，混合均匀，稀释成100倍的pooled-MIPs，4℃保存备用；
(5)配制MIPs靶向捕获反应体系：10μl的DNA(10ng/μl)、2.5μl的10x AmpligaseDNA ligase reaction Buffer、0.01μl的、Ampligase DNA ligase、0.03μl的dNTP(0.25mM)、0.32μl的Hemo Klentaq、0.1μl的pooled-MIPs、25μl的dd H2O，
MIPs靶向捕获反应条件：95℃，10min→60℃，22h→10℃；
(6)配制MIPs酶切反应体系：0.5μl的Exonuclease I、0.5μl的Exonuclease III、0.2μl的10×Ampligase Buffer、0.8μl的dd H2O、25μl的MIPs靶向捕获产物，
酶切反应条件：37℃，60min→95℃，3min→4℃；
(7)PCR扩增反应
步骤(6)中产物为MIPs探针-靶向捕获区域的单链环状DNA分子，作为本步骤的模板进行PCR扩增，通过PCR反应将目标捕获序列进行扩增，并通过携带标签序列(index)反向引物，对不同样本进行标记，以便对不同样本的测序数据进行区分、识别；
PCR扩增反应体系：12.5μl的Q5High Fidelity 2×Master Mix、0.125μl的Forward primer(100μM)、1.25μl的Reverse primer(10μM)、5μl的酶切反应体系、25μl的ddH2O，
PCR扩增反应条件：98℃，30s→98℃，10s
↙↖21循环
60℃，30s→72℃，30s→72℃，2min→4℃；
(8)聚丙烯酰胺凝胶电泳与磁珠纯化
利用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，取步骤(7)的PCR扩增产物，进行产物鉴定，保证产生的文库无差错；
(9)混合文库进行高通量测序
运用Illumina HiSeq 3000高通量测序平台，对(8)中构建的文库，进行Paired-end 150bp测序，并对测序数据进行生物信息学分析；
(10)Sanger测序验证
针对选定的变异位点进行PCR扩增引物设计，并进行PCR反应扩增，对扩增产物进行Sanger测序，验证高通量测序筛选的碱基改变的准确性，排除高通量测序造成的假阳性可能。
还包括生物样本，所述生物样本为体液，所述体液包括但不限于：血液、血清、羊水、淋巴液。
所述体液为血液。
在所述聚合酶链扩增反应使用的引物对为：SEQ ID NO:6。
发明人通过分子倒置探针结合高通量测序技术，对1852例PD患者18个PD致病基因(SNCA、UCH-L1、LRRK2、HTRA2、GIGYF2、VPS35、EIF4G1、DNAJC13、CHCHD2、PARK2、DJ-1、PINK1、ATP13A2、PLA2G6、FBXO7、DNAJC6、SYNJ1、RAB39B)外显子区域变异进行筛查，并在1565例正常对照进行验证。该结果可提供18个PD致病基因突变位点、
本发明提供了18个PD致病基因MIPs捕获序列(SEQ ID NO:1)。
通过本发明的帕金森病致病基因突变筛查检测方法，可以完成对帕金森病18个PD致病基因突变筛查，对潜在PD患者的超早期诊断、PD发病机制研究具有重要意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种帕金森病致病基因突变筛查检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将合成的MIPs探针，加dd H2O配成浓度为100μM的探针溶液，在-20℃温度下储存备用；
(2)使用移液器吸取(1)中每条探针溶液1μl，置于1.5ml的新EP管中，充分混匀，在管壁使用Marker笔标记为mixed-MIPs；
(3)配置MIPs探针磷酸化激活体系，将mixed-MIPs进行激活；
反应体系如下：25μl的mixed-MIPs、3μl的T4Polynucleotide Kinase、1μl的T4PNK、1μl的dd H2O、30μl的Total，
反应条件如下：37℃，45min→65℃，20min→4℃；
(4)mixed-MIPs探针稀释：使用移液器吸取(3)中已磷酸化激活的mixed-MIPs探针混合液1μl加至新1.5ml EP管中，加99μl dd H2O，混合均匀，稀释成100倍的pooled-MIPs，4℃保存备用；
(5)配制MIPs靶向捕获反应体系：10μl的DNA(10ng/μl)、2.5μl的10x Ampligase DNAligase reaction Buffer、0.01μl的、Ampligase DNA ligase、0.03μl的dNTP(0.25mM)、0.32μl的Hemo Klentaq、0.1μl的pooled-MIPs、25μl的dd H2O，
MIPs靶向捕获反应条件：95℃，10min→60℃，22h→10℃；
(6)配制MIPs酶切反应体系：0.5μl的Exonuclease I、0.5μl的Exonuclease III、0.2μl的10×Ampligase Buffer、0.8μl的dd H2O、25μl的MIPs靶向捕获产物，
酶切反应条件：37℃，60min→95℃，3min→4℃；
(7)PCR扩增反应
步骤(6)中产物为MIPs探针-靶向捕获区域的单链环状DNA分子，作为本步骤的模板进行PCR扩增，通过PCR反应将目标捕获序列进行扩增，并通过携带标签序列(index)反向引物，对不同样本进行标记，以便对不同样本的测序数据进行区分、识别；
PCR扩增反应体系：12.5μl的Q5High Fidelity 2×Master Mix、0.125μl的Forwardprimer(100μM)、1.25μl的Reverse primer(10μM)、5μl的酶切反应体系、25μl的dd H2O，
PCR扩增反应条件：98℃，30s→98℃，10s
↙↖21循环
60℃，30s→72℃，30s→72℃，2min→4℃；
(8)聚丙烯酰胺凝胶电泳与磁珠纯化
利用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，取步骤(7)的PCR扩增产物，进行产物鉴定，保证产生的文库无差错；
(9)混合文库进行高通量测序
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(10)Sanger测序验证
针对选定的变异位点进行PCR扩增引物设计，并进行PCR反应扩增，对扩增产物进行Sanger测序，验证高通量测序筛选的碱基改变的准确性，排除高通量测序造成的假阳性可能。
2.根据权利要求1所述的一种帕金森病致病基因突变筛查检测方法，其特征在于，还包括生物样本，所述生物样本为体液，所述体液包括但不限于：血液、血清、羊水、淋巴液。
3.根据权利要求2所述的一种帕金森病致病基因突变筛查检测方法，其特征在于，所述体液为血液。
4.根据权利要求1所述的一种帕金森病致病基因突变筛查检测方法，其特征在于，在所述聚合酶链扩增反应使用的引物对为：SEQ ID NO:6。
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2018
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