CN104762398A - 一种脊髓性肌萎缩症致病基因检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种遗传病基因检测方法，特别是一种脊髓性肌萎缩致病基因的检测方法，包括：步骤1，用于将SMN1、SMN2基因富集化的处理；步骤2，用于测序所需的纳米孔测序文库制备；步骤3，使用测序仪进行测序；步骤4，对得到的序列文件进行临床报告评估。本发明使用方便、成本低廉，可以有效、准确得对脊髓性肌萎缩症致病基因的拷贝数，小段***、缺失，点突变，非编码区突变甚至基因易位进行检测，对脊髓性肌萎缩症的临床诊断和科研带来帮助和突破。

Description

一种脊髓性肌萎缩症致病基因检测方法

技术领域

本发明涉及一种遗传病基因检测方法，特别是一种脊髓性肌萎缩症致病基因的检测方法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atophy, SMA)是一种以进行性的弛缓性瘫痪和肌肉萎缩为特征的遗传性下运动神经元疾病。

作为一种体染色体隐性遗传疾病，主要病因是因脊髓的前角运动神经元渐进性退化，造成肌肉逐渐软弱无力、萎缩，从而造成运动能力障碍。较严重的病例吞咽和呼吸的技能也会受到影响，甚至导致死亡。本症是发病率第二高的体染色体隐性遗传疾病，发病率为1：6000 至1：10000，仅次于最常见的海洋性贫血。目前此症尚无具体之治疗方式，主要治疗方法是针对症状维护性的物理治疗及呼吸***照护。

依据发病时间和临床表现，可将此症分成下列几种类型：脊髓性肌肉萎缩症一型(SMA typeⅠ,重度)，脊髓性肌肉萎缩症二型(SMA typeⅡ,中度)，脊髓性肌肉萎缩症三型(SMA type Ⅲ,轻度)，脊髓性肌肉萎缩症四型(SMA type IV，成年人轻度), X连锁隐性遗传脊髓性肌肉萎缩症和脊髓性肌肉萎缩症下肢肌肉型（SMA-LED, 轻度）。脊髓性肌肉萎缩症一型的临床症状最为严重，患者在出生六个月内即会出现症状，四肢及躯干呈现肌无力症状（Hypotonia）,颈部控制、吞咽及呼吸困难，一般在两岁前就会因呼吸衰竭而死亡。其他类型存活率相对较高，呼吸道感染是导致死亡的主要原因。

目前已知的与脊髓性肌肉萎缩症相关的基因有SMN1、 SMN2、 UBA1、 DYNC1H1，以及VAPB。 位于第五号染色体（5q12.2-q13.3）的运动神经元存活基因1(SMN1)的变异是导致此症的最重要的原因。SMN1和运动神经元存活基因2（SMN2）基因是线性排列在5号染色体上的一对具有高度同源性的基因，在SMN2基因的7号外显子上的C-to-T 变异导致了RNA剪切位点变异（Splicing Site mutation），结果SMN2 的基因产物较之SMN1缺少了7号外显子。所以在机体内部，SMN2的主要功能是作为对SMN1的有限的补偿。当SMN1出现变异或者缺失，SMN2的拷贝数对病症的严重程度影响很大，例如SMN2的拷贝数多于2的患者往往属于轻型。

作为是最常见的致死性神经肌肉疾病之一，脊髓性肌萎缩症的分子检测目前主要局限于对相关基因SMN1和SMN2的拷贝数（Copy Number Variation：CNV）进行分析，由于SMN1、SMN2基因基因序列的高度相似性，针对这两个基因的测序分析极其困难。

脫氧核醣核酸(DNA)测序技术是医学，分子生物学领域最重要的技术手段之一，对生命科学、医学诊断等领域的技术发展起着巨大的推动作用。目前为止，短短三四十年的时间，DN测序技术经历了几代技术的变革。 第一代技术使用的是1977年Sanger等人发明的链终止法（桑格测序），以此为基础的毛细管电泳测序方法在分子诊断领域仍然发挥着重要的作用。第二代技术通常又叫做“下一代或者二代测序技术（Next Generation Sequencing），主要特点是基于荧光标记基础上的“边合成边测序”。

但由于传统桑格测序和二代测序技术的测序读长（Read length）比较短（300-1000 碱基左右），对SMN1、SMN2基因可能存在的点突变和小段***、缺失无法有效的检测。这严重地阻碍了对脊髓性肌萎缩症患者的诊断和治疗。

原理更为新颖，通量更高，读长更长，成本更低的第三/四代技术已经在迅速的发展当中。比如，牛津纳米孔公司的纳米孔测序技术，就是突出的代表。牛津纳米孔公司的技术发展迅速，PromethION和 MinION测序平台的商业化产品很快就会正式推出。纳米孔技术正体现了高通量、高读长、低成本、小型化的发展方向。纳米孔测序技术于上述测序方法的主要区别在于， DNA序列可以通过物理方法直接读取， 而不再依赖于PCR扩增或者荧光标记等生物化学方法。其基本原理是： 当经过预处理的核酸单链（PCR产物，质粒，甚至完整的染色体等）穿过纳米尺度的通道时，A， T， G， C 4 种不同的碱基化学性质的差异会导致纳米孔的电化学参数的变化量相应变化， 对这些变化进行检测可以转换得到核酸序列。

理论上讲，纳米孔测序的测序长度没有限制，它可以将整根染色体的 DNA完整得测序。在一项采用牛津纳米孔公司的MinION测序平台对伤寒沙门氏杆菌的耐药株的重复序列区域进行检测的研究中，平均测序读长已达到5,000碱基，最长达到了66,000 碱基 ，这远远超出了桑格测序和二代测序所能达到的水准。测序的精度也有很大提高，平均精确度达到了84.2%. 纳米孔技术的超常测序读长，在分子信息学技术工具的辅助之下，可以实现对大的DNA区段，同源性基因，或者假基因（Pseudogene）的基因编码，单倍体（Haplotypre）信息和拷贝数的同时读取。这对脊髓性肌萎缩症的分子诊断具有非常突出的现实意义，会对临床工作带来突破性的进展。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足而提供一种SMN基因测序方法，该测序方法成本更为低廉，可以有效，准确地对SMN基因的拷贝数，小段***、缺失，点突变，非编码区突变甚至基因易位（Translocation）进行检测。

本发明的技术方案是：（1）SMN1、SMN2基因的富集：采取限制内切酶酶切法，即在包含SMN1和SMN2的基因区段的特异酶切位点切断DNA之后，通过液相序列捕获技术,即设计合成针对SMN1和SMN2基因同源区段的单链寡核苷酸探针，与酶切得到的DNA片段在缓冲液中反应并杂交，采用带有链霉亲和素涂层的磁珠就可以把含有SMN1和SMN2基因的核酸片段捕捉和富集。另一个可行的基因富集方法为长片段扩增技术（Long range PCR），即在包含FMR1的基因区段的两侧设计特异性的PCR引物，通过特殊的DNA聚合酶和特殊反应程序将包含目标基因的区段直接扩增出来。DNA无需进行片段化的预处理。

（2）纳米孔测序：将连接酶和接头引物加入末端修饰后的DNA，进行纯化处理，对DNA测序文库进行定量处理，在测序仪中进行测序，利用测序控制软件控制整个测序过程，使用序列读取软件读取结果数据。

（3）序列分析和临床报告： 采用专门针对纳米孔序列数据开发的序列分析软件，对序列文件进行质控处理，针对参考序列的序列排比，变异注释和变异识别。SMN1和SMN2的基因拷贝数和位置也可以由此序列数据中得出。由以上途径检测得到的变异和缺失，应参照若干公共临床数据库中已知数据，并结合病人的病例和家族史进行综合评估。

本发明的工作原理是：首先对SMN1、SMN2基因进行富集，以形成SMN1和SMN2基因的测序文库。当经过预处理的测序文库（核酸单链， 可以是PCR产物，质粒，甚至完整的染色体等）穿过纳米尺度的通道时，A、T、G、C ，4种不同的碱基化学性质的差异会导致纳米孔的电化学参数的变化量相应变化，对这些变化进行检测可以转换得到核酸序列，从而实现测序。

本发明的发明效果是：本发明与现有技术相比其显著优点：纳米孔测序技术可以对单根染色体进行无间断连续测序，目前报道的最高测序长度已达到60,000 碱基以上。同时，这一测序技术的测序长度和精度在不断提高和完善当中。另外，纳米孔技术不需要对DNA进行标记，省去了昂贵的荧光试剂和CCD成像环节，通量更大，成本更为低廉。纳米孔测序技术可以有效，准确得对SMN1和SMN2基因的拷贝数，小段***/缺失，点突变，非编码区突变甚至基因易位进行检测，这项发明将对脊髓性肌萎缩的临床诊断和科研带来突破。

具体实施方式1。

下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

本发明主要包括，步骤1SMN1、SMN2基因富集(Enrichment)；步骤2，用于测序所需的纳米孔测序文库制备；步骤3，使用测序仪进行测序；步骤4，对得到的序列文件进行临床报告评估。

步骤1：SMN1、SMN2基因富集化。

作为一种优选，采用热处理法对DNA进行片段化预处理：

1-2 微克 DNA样品（体积50 微升）在PCR扩增仪仪中进行加热处理（90℃ 30分钟，4℃ ∞）。短暂离心。DNA片段的大小可以采用琼脂糖凝胶电泳的方法测定。再采用Next End-Repair module 试剂盒对片段化的DNA进行末端修复。末端修复后的平端DNA使用等体积的AMPure XP beads纯化，去除未反应完全的试剂和底物。使用Next dA-tailing module 试剂盒进行末端修饰，最终反应体积为30 微升。

目标基因富集采用液相序列捕获技术（In solution capture）,即设计合成针对SMN1和SMN2基因同源区段的单链寡核苷酸探针（带有生物素标记），与步骤1得到的DNA片段在缓冲液中反应并杂交，采用带有链霉亲和素涂层的磁珠（streptavidin magnetic beads）就可以把含有SMN基因的核酸片段捕捉和富集。这种生物素标记的FISH探针可以由EXIQON公司设计并合成。液相序列捕获过程可以采用EXIQON公司提供的试剂盒和相应流程。

步骤2：纳米孔测序文库制备。

作为一种优选以2014年9月公布的SQK-MAP-003测序试剂和R7.3 流动池（Flow cell）为例，将50 微升 Blunt/TA ligase master mix 连接酶和10 微升 Adapter Mix and HP adapter接头引物加入上述 30 微升 末端修饰后的 DNA, 室温处理10分钟。产物用0.4 × 体积的AMPure XP beads纯化，去除未反应完全的试剂和底物，最终反应体积为25 微升。

步骤3：使用测序仪测序。

作为一种优选，使用牛津纳米孔公司的纳米孔测序仪MinION进行测序。将流动池安装在MinION 测序仪中，在加样孔中加入150 微升 EP 缓冲液对流动池进行初始化，每次10 分钟，共两次。在加样前对测序文库采用Qubit fluorometer进行定量，最终体积应为146 微升， 成分为350 纳克 (R7.3) DNA测序文库，4 微升 Fuel mix 和EP缓冲液。采用流动池的测序流程耗时48小时，使用MinKNOW软件对测序过程进行控制，使用Metrichor agent软件对基因序列进行读取。

步骤4：序列分析和临床报告。

采用专门针对纳米孔序列数据开发的序列分析软件，对序列文件进行质控处理，针对人类基因组参考序列进行对比。由以上途径检测得到的基因序列可作为脊髓性肌萎缩症临床诊断判断的最有效依据。SMN1和SMN2基因及其特定外显子的拷贝数可以由此序列数据中得出，同时，该基因的内含子，增强子等区域的序列和拷贝数变异也可同时检测。

由以上途径检测得到的变异和缺失，应参照若干公共临床数据库中已知数据，并结合病人的病例和家族史进行综合评估。这将对脊髓性肌肉萎缩症的临床诊断带来巨大的帮助。

具体实施方式2。

步骤1、SMN1/SMN2基因的富集: 采用长片段扩增技术（Long range PCR），在包含SMN1和SMN2的基因区段的两侧设计特异性的PCR引物，通过特殊的DNA聚合酶和特殊反应程序将包含目标基因的区段直接扩增出来。

长片段扩增采用Long Range Hot Start PCR system试剂盒。具体实验条件和反应体系如下： 5× KAPA Long Range Buffer (without Mg²⁺) 1×, MgCl₂ (25 mM) 1.75 mM, dNTPs (10 mM each dNTP) 0.3 mM, Fwd primer (10 μM) 0.5 μM, Rev primer (10 μM) 0.5 μM, 50ng DNA, KAPA Long Range Hot Start DNA Polymerase (2.5 单位/微升) 1.25 单位/50 微升, 总体积 50微升，采用的引物序列：PCR反应条件：98°C  5 min; 25 cycles of 97°C  35 s, 62°C  35 s, and 72°C  4 min; a final of extension at 72°C 10 min。

步骤2、纳米孔测序文库制备：将50 微升Blunt/TA ligase master mix 连接酶和10 微升 Adapter Mix and HP adapter接头引物加入上述末端修饰后的DNA, 室温处理10分钟。产物用0.4 × 体积的AMPure XP beads纯化，去除未反应完全的试剂和底物，最终反应体积为25 微升。

步骤3、使用MinION测序仪测序： 将牛津纳米孔公司提供的Flow cell 安装在MinION 测序仪中，在加样孔中加入150 微升 EP 缓冲液对Flow cell进行初始化，每次10 分钟，共两次。在加样前对测序文库采用Qubit fluorometer进行定量，最终体积为146 微升， 成分为350 纳克 (R7.3) DNA测序文库，4 微升 Fuel mix 和EP缓冲液。采用R7.3 Flow cell进行48小时测序， 测序控制软件采用MinKNOW version 0.46.1.9 。 序列读取采用软件 Metrichor agent (version 0.16.37960)，流程采用1.2.2 rev 1.5 (R7.3)。

步骤4、序列分析和临床报告。采用专门针对纳米孔序列数据开发的序列分析软件，对序列文件进行质控处理，针对人类基因组参考序列进行对比。由以上途径检测得到的基因序列可作为脊髓性肌萎缩症临床诊断判断的最有效依据。SMN1和SMN2基因及其特定外显子的拷贝数可以由此序列数据中得出，同时，该基因的内含子，增强子等区域的序列和拷贝数变异也可同时检测。

由以上途径检测得到的变异和缺失，应参照若干公共临床数据库中已知数据，并结合病人的病例和家族史进行综合评估。这将对脊髓性肌肉萎缩症的临床诊断带来巨大的帮助。

附录:实验试剂及厂家。

Next End-Repair module 试剂盒——英国NEB公司。

AMPure XP beads——英国贝克曼库尔特公司，Beckman Coulter,。

Next dA-tailing module 试剂盒——英国NEB公司。

FISH探针——丹麦EXIQON公司。

液相序列捕获过程——EXIQON公司提供的试剂盒和相应流程。

Blunt/TA ligase master mix 连接酶——英国NEB公司。

Adapter Mix and HP adapter接头引物——英国牛津纳米孔公司（Oxford nanopore）。

AMPure XP beads——英国贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter)。

Qubit fluorometer——美国生命科技公司（Life Technologies）。

Long Range Hot Start PCR system试剂盒——美国Kapa Biosystems公司。

Claims (7)

1.一种脊髓性肌萎缩致病基因检测方法，其特征在于包括：

步骤1，用于将SMN1、SMN2基因富集化的处理， 包含采用热处理法对DNA进行片段化；步骤2，用于测序所需的纳米孔测序文库制备；步骤3，使用测序仪进行测序；步骤4，对得到的序列文件进行临床报告评估。

2.根据权利要求1所述的一种脊髓性肌萎缩致病基因检测方法，其特征在于步骤1，采用液相序列捕获技术或长片段扩增技术进行基因富集。

3.根据权利要求1所述的一种脊髓性肌萎缩致病基因检测方法，其特征在于步骤1，采用热处理法对DNA进行片段化。

4.根据权利要求1所述的一种脊髓性肌萎缩致病基因检测方法，其特征在于步骤2，纳米孔测序文库的制备过程应按使用的测序试剂及流动池的要求进行。

5.根据权利要求1所述的一种脊髓性肌萎缩致病基因检测方法，其特征在于步骤3，使用SQK-MAP-003测序试剂和R7.3流动池配合进行测序。

6.根据权利要求1所述的一种脊髓性肌萎缩致病基因检测方法，其特征在于步骤3，所述测序仪为MinION测序仪。

7.根据权利要求1所述的一种脊髓性肌萎缩致病基因检测方法，其特征在于步骤4，所述临床报告评估是对序列文件进行质控处理，针对参考序列的序列排比，变异注释和变异识别。