CN108658874B - 硫代嘧啶杂环类抗肿瘤化合物及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及硫代嘧啶杂环类抗肿瘤化合物及其制备方法与用途，该抗肿瘤化合物具体为式(I)所示的结构。本发明还涉及所述式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，或含其的药物组合物通过抑制野生型EGFR、突变型EGFR‑T790M表皮因子受体蛋白酪氨酸激酶进而***疾病，特别是用于治疗小细胞肺癌、非小细胞肺癌、EGFR‑T790M突变型非小细胞肺癌的用途；

Description

硫代嘧啶杂环类抗肿瘤化合物及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及抗肿瘤化合物及其制备方法与用途，具体而言，该抗肿瘤化合物为硫代嘧啶杂环类化合物，属于医药技术领域。

背景技术

恶性肿瘤的靶向治疗大大延长了肿瘤患者生存期，显著提高了病人的生活质量。“分子靶向”治疗的核心是瞄准精准的分子“靶点”，随后予以应用能够与这些靶点特异性结合的小分子药物。蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTKs)是细胞生命活动重要的信号使者，可催化将ATP末端的γ-磷酸基团转移至底物上，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，从而传递信号，在细胞增殖、存活、凋亡、代谢、转录以及分化中具有重要作用。PTKs是目前抗肿瘤靶向药物研发中最为理想的“靶点”，超过50％的原癌基因和癌基因产物都是酪氨酸激酶。表皮生长因子受体酪氨酸激酶(epidermal growth factorreceptor tyrosine kinase，EGFR)是最早发现的蛋白酪氨酸激酶之一，EGFR的胞内区有ATP结合位点，EGFR抑制剂可以竞争性与ATP结合位点相结合，从而抑制EGFR的磷酸化过程，阻断下游信号的传导，进而抑制肿瘤细胞的生长、分化和转移(Yun,et al.Cancer Cell2007,11,217-227)。EGFR作为抗肿瘤靶点的生化过程已被阐明，其晶体结构和活性部位也已比较清楚，以此为靶点的药物吉非替尼、埃罗替尼、阿法替尼等已经应用于临床。然而这些药物不可避免地存在着抗耐药性差的问题。研究表明：EGFR激酶蛋白790位点的苏氨酸到甲硫氨酸的突变(EGFR-T790M)是此类药物产生耐药性的主要诱因。临床案例数据显示，大约有60％的患者获得性耐药都源于T790M位点的突变所致。因此开发抗耐药性更强、毒性更小、活性更强的新型EGFR抑制剂具有非常重要现实价值。

奥斯替尼是口服不可逆的，T790M突变选择性EGFR抑制剂，在LoVo细胞中对外显子19位缺失的EGFR^L858R/T790M和EGFR^WT的IC₅₀分别为11.44和493.8nM，于2015年12月被美国FDA批准上市(WO2013014448)用于治疗EGFR-T790M耐药型肺癌患者。罗司替尼是另一种不可逆的，突变选择性EGFR-T790M抑制剂，在无细胞试验中作用于EGFR-T790M和EGFR^WT的IC₅₀分别为21.5nM和303.3nM，目前处于临床III期研究(WO 2012061299)。其它如HM61713，EGF816，PF-06747775，艾维替尼，ASP8273也是进入临床研究的EGFR-T790M抑制剂(Ma et al.,J.Med.Chem.,2016,59,6580–6594)，涉及的专利如：US20120157426、US8563568B2、CN102740847、CN102083800。上述药物的发现在一定程度上满足了EGFR-T790M耐药患者的用药需求，但上述药物均属嘧啶衍生物，药效及药理机制类似，且存在一定的毒副作用，应用范围有限。

鉴于治疗癌症，特别是耐药型癌症的迫切需要，本领域有必要开发新型分子骨架、作用机制、且效果更佳良好的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的之一在于提供新型抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，该抗肿瘤化合物具体为硫代嘧啶杂环类化合物，该类化合物具有良好的抗肿瘤活性。

本发明的另一目的在于提供前述抗肿瘤化合物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供含所述硫代嘧啶杂环类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

本发明的再一目的在于提供所述硫代嘧啶杂环类化合物或其药学上可接受的盐，或所述组合物的用途。

一方面，本发明提供一种通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，所述通式(I)所示的化合物具有如下结构：

其中，

X选自O、NH；

M选自S(O)_n,n＝0,1；

R选自

优选地，所述通式(I)所示的化合物具有(I-1)～(I-6)所示的结构：

优选地，所述通式(I)所示的化合物为I-1，I-2，I-4，I-5。

如上所示结构化合物为硫代嘧啶杂环类化合物，抗肿瘤活性筛选显示本发明中的化合物都具有预料不到的抗肺癌细胞(A431磷细胞、HCC827腺癌细胞和A549腺癌细胞)和EGFR T790M耐药型肺癌细胞(H1975细胞)的增殖能力；部分化合物还显示出比参照药物吉非替尼和罗司替尼预料不到的更加优良的抗EGFR-T790M激酶活性。作为一类结构新颖的分子，本发明中的化合物具有开发成新型高效EGFR-T790M突变型激酶抑制剂的潜力，对治疗相关的肿瘤疾病尤其是小细胞肺癌、非小细胞肺癌、EGFR-T790M耐药型非小细胞肺癌中有较大的应用价值。

前述(I-1)～(I-6)所示的结构分别具有如下名称：

(I-1)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)丙硫基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-2)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)丙硫基)苯胺]-4-嘧啶]氧基]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-3)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)丙基亚硫酰)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-4)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)乙酰硫基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-5)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)乙酰硫基)苯胺]-4-嘧啶]氧基]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-6)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)乙酰基亚硫酰)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-丙烯酰胺。

另一方面，本发明提供前述抗肿瘤化合物的制备方法，该抗肿瘤化合物按如下路线制备：

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其含有有效剂量的本发明所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，及药用载体。

本发明所述化合物由于它们在药物中的用途，式(I)所示化合物的盐优选药物可接受的盐。本发明的化合物为碱，其中所需盐形式可以通过本领域已知的合适方法制备，包括用无机酸处理游离碱，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或用有机酸处理游离碱，所述有机酸例如乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羟基乙酸、水杨酸、吡喃糖苷酸，例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸，α-羟基酸，例如柠檬酸或酒石酸，氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸，芳香酸，例如苯甲酸或肉桂酸，磺酸，例如p-甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。药学上可接受的盐的实施例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟基乙酸盐、酒石酸盐、苦杏仁酸盐和磺酸盐、例如二甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐和萘-2-磺酸盐。

本发明的药物组合物通常含有一种本发明化合物。然而，在一些实施方案中，本发明的药物组合物含有超过一种本发明的化合物。另外，本发明的药物组合物还可任选包括一种或多种其它药学活性化合物。

本发明还提供所述硫代嘧啶杂环类化合物或其药学上可接受的盐，所述药物组合物通过抑制EGFR-T790M激酶，进而抑制肿瘤增殖的用途。具体地，该用途主要为制备用于治疗小细胞肺癌、非小细胞肺癌、EGFR-T790M耐药型非小细胞肺癌的药物中的用途。

本发明提供所示的化合物或其药学上可接受的盐，或本发明所述的药物组合物在制备EGFR-T790M激酶抑制剂中的应用。

本发明提供所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，或本发明所述的药物组合物在制备***的药物中的用途。优选地，所述肿瘤选自小细胞肺癌、非小细胞肺癌、EGFR-T790M耐药型非小细胞肺癌的一种或多种，进一步优选EGFR-T790M耐药型非小细胞肺癌。更优选地，所述用途主要通过抑制EGFR-T790M激酶实现的。

附图说明

图1表示化合物I-1不同处理组对H1975细胞的抑制作用随时间变化情况。

图2表示化合物I-1对EGFR-T790M突变的H1975细胞中细胞凋亡的影响结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步描述解释本发明，但这些实施例并非意味着限制本发明的范围。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1 目标分子的制备

薄层层析硅胶板使用烟台黄海GF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胺板采用的规格是0.15mm-0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm-0.5mm。

本发明使用的原料主要购自可购买自国药集团化学试剂有限公司，北京偶合科技有限公司、阿拉丁化学试剂有限公司、达瑞化学品等公司。

实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。

实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃-30℃。

本发明采用的技术方案如下：

化合物(I-1)、(I-2)、(I-3)的合成路线.试剂及条件:(a)丙烯酰氯，NaHCO₃，CH₃CN，室温，0.5小时，60-80％；(b)X＝OH时，K₂CO₃，DMF，60℃；X＝NH₂时，DIPEA，1,4-二恶烷，室温，2小时，91％；(c)1-氯-3-溴丙烷，K₂CO₃，CH₃CN，70℃，12小时，95％；(d)吗啉，K₂CO₃，KI，DMF，80℃，12小时，81％；(e)Fe-NH₄Cl，MeOH-H₂O，2小时，60℃，72％；(f)TFA，2-BuOH，100℃，12小时，22-37％；(g)m-CPBA，CH₂Cl₂，室温，31％。

化合物(I-4)、(I-5)、(I-6)的合成路线.试剂及条件:(a)2-巯基乙酸乙酯，K₂CO₃，KI，DMF，100℃，12小时，95％；(b)KOH，H₂O，50℃，24小时，76％；(c)SOCl₂，80℃，2小时；(d)吗啉，NaHCO₃，CH₃CN，室温，0.5小时，95％；(e)Fe-NH₄Cl，MeOH-H₂O，2小时，60℃，72％；(f)嘧啶3a-b，TFA，2-BuOH，100℃，12h，16-19％；(g)m-CPBA,CH₂Cl₂，室温，25％。

根据以上方法合成了目标分子，所合成目标分子的理化数据如下：

(I-1)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)丙硫基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-丙烯酰胺.产率:36.52％，黄色固体.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ1.60-1.63(m,2H),2.28-2.32(m,6H),2.82(t,J＝8.0Hz,2H),3.53(t,J＝8.0Hz,4H),5.76(dd,J＝4.0Hz,8.0Hz,1H),6.26(dd,J＝4.0Hz,16.0Hz,1H),6.44(dd,J＝8.0Hz,16.0Hz,1H),7.11(d,J＝8.0Hz,2H),7.18-7.35(m,2H),7.52-7.57(m,3H),7.89(s,1H),8.15(s,1H),9.00(s,1H),9.41(s,1H),10.22(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ26.37,32.42,53.98(2C),57.39,66.86(2C),104.60,116.17,116.24,120.03(2C),120.14,127.35,127.64,129.32,131.03(2C),132.53,139.46,139.76,139.83,155.48,156.96,158.18,163.84；HRMS(ESI)，C₂₆H₂₉ClN₆O₄S,m/z，[M+H]⁺，理论计算：525.1834,实测:525.1843.

(I-2)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)丙硫基)苯胺]-4-嘧啶]氧基]苯基]-2-丙烯酰胺.产率:22.14％；黄色固体；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ1.64-1.69(m,2H),2.32-2.36(m,6H),2.87(t,J＝8.0Hz,2H),3.58(t,J＝8.0Hz,4H),5.83(dd,J＝4.0Hz,8.0Hz,1H),6.32(dd,J＝4.0Hz,16.0Hz,1H),6.49(dd,J＝12.0Hz,16.0Hz,1H),7.06-7.10(m,3H),7.40(d,J＝8.0Hz,2H),7.52(d,J＝8.0Hz,2H),7.76(s,1H),8.54(s,1H),9.89(s,1H),10.46(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ26.01,31.83,53.67(2C),57.04,66.56(2C),105.09,113.30,117.02,117.39,119.75(2C),127.79,128.01,130.31(2C),130.39,131.97,138.56,140.78,152.66,157.75,158.51,163.73,164.26；HRMS(ESI),C₂₆H₂₈ClN₅O₃S,m/z,[M+H]⁺,理论计算:526.1674,实测:526.1678.

(I-3)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)丙基亚硫酰)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-丙烯酰胺.产率:31.0％；褐色固体；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ1.56-1.68(m,2H),2.26-2.32(m,6H),2.74-2.86(m,2H),3.52(t,J＝8.0Hz,4H),5.76(dd,J＝4.0Hz,8.0Hz,1H),6.27(dd,J＝4.0Hz,16.0Hz,1H),6.48(dd,J＝12.0Hz,16.0Hz,1H),7.30-7.40(m,5H),7.53-7.58(m,1H),7.83(d,J＝8.0Hz,2H),8.22(s,1H),9.10(s,1H),9.73(s,1H),10.28(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ19.14,19.47,53.68(2C),57.13,66.78(2C),105.28,114.31,116.17,116.35,119.33(2C),125.25(2C),126.64,127.63,129.53,132.56,135.60,139.91,143.62,155.47,157.03,158.01,163.86；HRMS(ESI),C₂₆H₂₉ClN₆O₃S,m/z,[M+H]⁺,理论计算:541.1783,实测:541.1788.

(I-4)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)乙酰硫基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-丙烯酰胺.产率:16.04％；白色固体；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ3.41-3.54(m,8H),3.80(s,2H),5.76-5.79(m,1H),6.28(dd,J＝4.0Hz,16.0Hz,1H),6.48(dd,J＝8.0Hz,16.0Hz,1H),7.20(d,J＝8.0Hz,2H),7.36(d,J＝8.0Hz,2H),7.45-57(m,3H),7.91(s,1H),8.18(s,1H),9.03(s,1H),9.46(s,1H),10.24(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ37.70,42.74,47.14,67.04(2C),105.06,116.42,116.59,120.18(2C),120.48,126.44,127.95,129.62,132.30(2C),132.84,139.75,140.12,140.71,155.75,157.25,158.43,164.15,167.63；HRMS(ESI),C₂₅H₂₅ClN₆O₃S,m/z,[M+H]⁺,理论计算:525.1470,实测:525.1484.

(I-5)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)乙酰硫基)苯胺]-4-嘧啶]氧基]苯基]-2-丙烯酰胺.产率:19.01％；白色固体；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.39(t,J＝4.0Hz,4H),3.50(t,J＝4.0Hz,4H),3.77(s,2H),5.77(dd,J＝4.0Hz,8.0Hz,1H),6.26(dd,J＝4.0Hz,16.0Hz,1H),6.45(dd,J＝8.0Hz,16.0Hz,1H),7.00-7.03(m,1H),7.11(d,J＝8.0Hz,2H),7.35(d,J＝8.0Hz,2H),7.46(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.0Hz,1H),7.70(s,1H),8.48(s,1H),9.85(s,1H),10.39(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ36.89,42.14,46.51,66.43(2C),105.30,113.26,117.09,117.43,119.60(2C),126.84,127.81,130.40,131.36(2C),131.98,139.24,140.78,152.67,157.74,158.50,163.77,164.28,166.95；HRMS(ESI),C₂₅H₂₄ClN₅O₄S,m/z,[M+H]⁺,理论计算：526.1310,实测:526.1323.

(I-6)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-***啉)乙酰基亚硫酰)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-丙烯酰胺.产率:25.0％；褐色固体；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ3.37-3.52(m,8H),3.93(d,J＝12.0Hz,1H),4.11(d,J＝12.0Hz,1H),5.77(dd,J＝4.0Hz,8.0Hz,1H),6.27(dd,J＝4.0Hz,16.0Hz,1H),6.47(dd,J＝8.0Hz,16.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,2H),7.49(d,J＝8.0Hz,2H),7.82-7.94(m,4H),8.22(s,1H),9.11(s,1H),9.72(s,1H),10.25(s,1H)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ42.39,46.71,61.09,66.61,66.78,105.36,116.23,116.43,119.23(2C),120.43,125.78(2C),127.71,129.36,132.53,135.41,139.40,139.91,143.96,155.48,157.09,158.01,163.89,163.91；HRMS(ESI),C₂₅H₂₅ClN₆O₄S,m/z,[M+H]⁺,理论计算:541.1419,实测:541.1441.

目标分子成盐的方法

无机酸盐的制备方法：取目标分子(1mmol)溶于10mL无水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加无机酸(1mmol)的5mL无水甲醇溶液，滴加完毕，于此温度下搅拌30分钟，然后常温蒸除甲醇，即得目标分子的无机酸盐。通过该方法制备了化合物I-1的盐酸盐(I-1-1)、氢溴酸盐(I-1-2)、硫酸盐(I-1-3)及磷酸盐(I-1-4)；

有机酸盐的制备方法：取目标分子(1mmol)溶于10mL无水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加有机酸(1mmol)的5mL干燥***，滴加完毕，于此温度下搅拌30分钟，然后常温蒸除溶剂，即得目标分子的有机酸盐。通过该方法制备了化合物I-1的马来酸盐(I-1-5)、琥珀酸盐(I-1-6)及富马酸盐(I-1-7)。

实施例2 目标分子生物活性评价

1、体外对受体酪氨酸激酶抑制活性测试方法

制备激酶检测缓冲液

①在室温融解激酶检测缓冲液，观察是否有沉淀。

②如果出现沉淀，就在37℃孵育激酶检测缓冲液15分钟并经常摇动，溶解沉淀。或者，小心吸走上清，去除沉淀。

制备激酶检测试剂

①使用前在室温平衡激酶检测缓冲液和激酶检测底物。

②将激酶检测缓冲液全部倒进装有激酶检测底物的棕色瓶中，使冻干粉底物溶解，这样就制成了激酶检测试剂。

③轻轻震荡、涡旋或颠倒混匀，成为均质溶液，底物应在1分钟内溶解。

④激酶检测试剂配好后应立即使用，或分装存于-20℃，配好的试剂经过几次冻融后循环信号活性都没有损失。

制作ATP转化成ADP的标准曲线

①用1×激酶反应缓冲液稀释试剂盒提供的超纯ATP和ADP，制成900μL 50μM ATP和500μL 50μM ADP。

②将上一步配好的50μM ATP和50μM ADP溶液按表1所示在384孔板A1-A12中混合，模拟每个转化百分比的ATP和ADP的浓度，混合好。

表1.制备50μM系列ATP+ADP标准品

③每孔加入5μL的ADP-Glo^TM试剂来终止激酶反应。在室温孵育40分钟。

④每孔加入10μL激酶检测试剂将ADP转化成ATP，并引进萤光素酶和萤光素来检测ATP。

⑤在室温孵育30-60分钟，用多功能酶标仪测量萤光并记录萤光值。

⑥绘制ATP转化成ADP的标准曲线。

确定激酶抑制物的IC50值

①按照promega试剂盒说明书配制1×激酶反应缓冲液，2.5×50ng/μL激酶和2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

②在无酶对照孔中加入3μL 1×激酶反应缓冲液，2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。在阴性对照孔中加入1μL 1×激酶反应缓冲液，2μL 2.5×50ng/μL激酶，2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。在测试孔中加入1μL 5×待测药物，2μL 2.5×50ng/μL激酶，2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

③混合好平板，孵育60分钟。

④每孔加入5μL的ADP-Glo^TM试剂来终止激酶反应。在室温孵育40分钟。

⑤每孔加入10μL激酶检测试剂将ADP转化成ATP，并引进萤光素酶和萤光素来检测ATP。在室温孵育30-60分钟，用多功能酶标仪测量萤光并记录萤光值。

⑥结果分析，结果如表2所示。

2、细胞生长实验(MTT检测法)

细胞接种：收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度,以每孔7x10³个细胞，每孔体积100μL接种到96孔板，每组设4个复孔(边缘孔用无菌PBS填充)；

细胞培养：细胞贴壁后，0％FBS RPMI-1640饥饿8h,对照组用10％FBS RPMI-1640培养,37℃，5％CO₂培养箱中继续培养(按实验要求分别培养不同时间)；

呈色：三组细胞分别于培养72h后加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，4h后终止培养，每孔加入100μL三联液，于摇床上低速振荡10min，使结晶充分溶解；

比色：在酶联免疫检测仪上测定各孔光度值(OD值)，选择570nm波长，以无细胞的即RPMl-1640培养液空白孔调零，测各孔的吸光度值。实验重复三次

记录结果：细胞生长抑制率＝(对照组吸光度值一实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100％，细胞增殖率＝(实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100；

绘制细胞生长曲线：以时间为横坐标，抑制率/增殖率为纵坐标绘制细胞生长曲线。

在GraphPad软件中的GraphPad Prism作图软件中针对抑制剂浓度做图，以便由log[抑制剂]相对于反应，可变斜率模型估算出IC₅₀。

测试结果如表2，表3，表4所示，表2表示化合物抑制EGFR和EGFR-T790M激酶活性，表3表示化合物抗肿瘤细胞和人体正常细胞的增殖活性，图1表示化合物I-1不同处理组对H1975细胞的抑制作用随时间变化情况。

表2

应用ADP-Glo^TM激酶测定***评价了此类分子对野生型EGFR和突变型EGFR-T790M/L858R激酶的抑制活性，以代表性EGFR抑制剂药物吉非替尼和罗司替尼作为阳性对照。表2中给出的测试结果清楚地表明此类化合物具有突出的EGFR-T790M/L858R激酶抑制活性，其中化合物I-1和I-5的抑制活性最强，其IC₅₀值分别为27.5和9.1nM。与含氧化合物I-7(IC₅₀＝100.5nM)的活性相比，含硫化合物I-1(IC₅₀＝27.5nM)提高了近10倍；与参照药相比，活性更具优势。尤为关注的是，此类化合物对野生型EGFR无效(IC₅₀>980nM)，表明它们对突变的EGFR-T790M具有高选择性抑制活性。尤其是抑制剂I-1(SI>36.4)和I-5(SI>110.2)具有比罗司替尼卜(SI＝25)高得多的选择性，也预示它们更低的毒副作用。

表3

^a四种典型的NSCLC细胞系：A431^EGFR-WT细胞，H1975^EGFR-T790M突变细胞株，A549^{EGFR -WT和k-ras突变}和HCC827^{EGFR del E746_A750突变}细胞株和两种正常细胞系(人支气管上皮细胞(HBE))和肝细胞(LO-2)

另外，使用MTT测定法评价所有化合物对NSCLC肺癌细胞系的抗增殖活性。如表3所示，化合物I-1～I-5在0.074至1.050μM浓度范围内，具有显著高于吉非替尼的抗H1975细胞增殖的活性；其对携带野生型EGFR的A431细胞效力与罗斯替尼以及吉非替尼相当。本发明化合物I-1～I-5的选择指数均高于吉非替尼，化合物I-1，I-2，I-5的选择指数高于罗斯替尼，特别是化合物I-1，其在浓度为0.074μM时对H1975细胞具有很强的效力。化合物I-1也具有抑制A431细胞增殖的中等活性(IC₅₀＝3.893μM)，表明其对突变H1975细胞的高选择性(SI＝52.6)。此外，所有这些化合物都对携带HCC827细胞高度敏感EGFR del E746-A750突变也非常有效，IC₅₀值低于0.308μM。化合物I-4最有最强的抑制HCC827细胞活性，IC₅₀值为有0.050μM。更令人关注的是大多数这化合物对正常细胞系HBE和LO-2无毒性，尤其是抑制剂I-1、I-4(IC₅₀值均大于40μM)显示出相当低的细胞毒性。

图1显示最强抑制剂I-1随着时间(24，48和72小时)和药物浓度(0.2,0.5和1.0μM)的增加而显著阻断H1975细胞的增殖的效果。当使用1.0μM浓度的I-1，给药72小时后，细胞存活率(26.8％)比罗司替尼非(44.8％)低约2倍，表明抗吉非替尼耐药性增强。这些生物学评估表明，化合物I-1可能潜在地用作针对NSCLC的EGFR-T790M耐药的抑制剂。本发明还研究了最有效的抑制剂I-1对EGFR-T790M突变的H1975细胞中细胞凋亡的影响。所得结果如图2所示，化合物I-1以剂量和时间依赖性方式诱导H1975细胞凋亡。用化合物I-1(0.2，0.5和1.0μM)处理72小时的H1975细胞的凋亡率明显从45.6％增加到96.8％。

以上生物活性结果表明，本发明中的分子抗肿瘤效果活性效果显著，毒副作用低，主要表现在以下几个方面:1)化合物I-1和I-5显示出非常突出的抗EGFR-T790M/L858R活性，其IC₅₀值分别为27.5和9.1nM，效果比参照药吉非替尼预想不到的强；2)化合物I-1和I-5对EGFR-T790M的选择性抑制指数SI也明显优于两个参照药，预示此类分子具有预想不到的更低的毒副作用；3)化合物I-1对耐药型肺癌细胞H1975的抑制活性小于100nM，显著优于吉非替尼，达到罗司替尼水平；4)I-4、I-6化合物对肺癌细胞HCC827的抑制效果小于100nM，抗NSCLC细胞增殖效果非常突出；4)大部分化合物对NSCLC鳞癌细胞A431和腺癌细胞A549也都有非常强的抑制活性，比已经上市的EGFR抑制剂药物具有更明显的进步和优势；5)大部分化合物对人上呼吸道正常细胞HBE和人肝正常细胞LO-2没有明显干扰和抑制作用，表明此类分子具有预想不到的更低的细胞毒性。

作为一类结构新颖的分子，本发明中研究化合物具有开发成新型高效EGFR-T790M激酶抑制剂的潜力，对治疗相关的肿瘤疾病尤其是小细胞肺癌、非小细胞肺癌、EGFR-T790M耐药型非小细胞肺癌有较大的应用价值。

Claims (5)

1.式(I-1)或式(I-5)所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐，其中，该化合物具有如下所示的结构：

2.一种药物组合物，其含有有效剂量的权利要求1所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐及药用载体。

3.权利要求1所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐或权利要求2所述的药物组合物在制备EGFR-T790M突变型表皮因子受体蛋白酪氨酸激酶抑制剂中的应用。

4.权利要求1所述的抗肿瘤化合物或其药学上可接受的盐或权利要求2所述的药物组合物在制备治疗EGFR-T790M突变型非小细胞肺癌的药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述用途主要通过抑制EGFR T790M突变型表皮因子受体蛋白酪氨酸激酶实现的。

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