CN107164557A - 一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜a型双重实时荧光定量pcr方法的引物及应用 - Google Patents

一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜a型双重实时荧光定量pcr方法的引物及应用 Download PDF

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Abstract

一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法的引物及应用，它涉及生物技术领域。本发明的引物为：Kmt‑F：5'‑GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT‑3'；Kmt‑R：5'‑GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT‑3'；Kmt‑P：5'FAM‑TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG‑BHQ13'；CapA‑F：5'‑GGGCTGGCTATGTTGGTTTAT‑3'；CapA‑R：5'‑CTTTATCTGTGATGGGCGATT‑3'；CapA‑P：5'HEX‑TAGCTCAACACCACAATGTGATCT3'。同时检测kmt1和hyaD‑hyaC基因。

Description

一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定 量PCR方法的引物及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型的双重Real-time PCR方法的引物及应用。
背景技术
多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)可引起人和动物的多种疾病，包括禽霍乱、牛出血性败血症、猪萎缩性鼻炎、兔出血性败血症和人的皮下感染等，对动物造成较高的致病率和死亡率。多杀性巴氏杆菌根据荚膜型的不同分为：A、B、D、E和F型。常规检测多杀性巴氏杆菌抗原的方法是采用细菌分离鉴定，或者增菌后通过普通PCR检测。其中，细菌分离鉴定法在实际操作中非常繁复，且易受杂菌干扰影响，这种方法耗时费力；而普通PCR方法相较于传统的分离鉴定检测法，虽然较为灵敏快捷，但是对目标菌在菌液中的含量以及杂菌数量等方面要求较为严格，且有可能出现假阴性与假阳性等结果。细菌荚膜的分型主要采用血清学方法和荚膜PCR分型：血清学方法需要荚膜型标准血清，很难购买到，费时费力。
发明内容
本发明的目的在于：过设计两对高特异性引物，采用Taqman实时荧光定量PCR方法同时对多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型菌进行鉴定，从而替代普通PCR的方法，使检测更准确和高效。本发明设计两对高特异性荧光定量PCR检测引物，便于对多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型菌的检测，从而提高检测效率。
本发明的一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法的引物及应用，所述的引物包括上、下游引物和Taqman探针引物，具体如下：
上游引物Kmt-F：5'-GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT-3'；
下游引物Kmt-R：5'-GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT-3'；
探针引物Kmt-P：5'FAM-TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG-BHQ1 3'；
上游引物CapA-F：5'-GGGCTGGCTATGTTGGTTTAT-3'；
下游引物CapA-R：5'-CTTTATCTGTGATGGGCGATT-3'；
探针引物CapA-P：5'HEX-TAGCTCAACACCACAATGTGATCT3'。
本发明包含以下有益效果：
本发明通过Kmt引物检测多杀性巴氏杆菌，利用CapA引物检测该菌的荚膜A型。
本发明采用的高特异引物，使用荧光定量PCR法，在细菌含量在3×10-12g/μL时仍可准确的检测出来多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型，且不受杂菌干扰影响；采用的实时荧光定量PCR法检测多杀性巴氏杆菌抗原，具有方便、准确、高灵敏度的特点。
附图说明
图1为FAM探针标记(kmt1基因)和HEX探针标记(CapA基因)双重实时荧光定量PCR检测的标准曲线；其中A为kmt1基因曲线，B为CapA基因曲线；
图2为双重实时荧光定量PCR敏感性检测图；其中，N为阴性对照；
图3为常规双重PCR电泳图；其中，N为阴性对照；
图4为实时荧光定量PCR特异性检测图；其中，A为P.multocida C48-1荚膜A型(CapA)HEX；B为P.multocida C48-1FAM；C为P.multocida C44-1FAM；D为P.multoci da901FAM；E为其它菌株。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法的引物及应用，所述的引物包括上、下游引物和Taqman探针引物，具体如下：
上游引物Kmt-F：5'-GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT-3'；
下游引物Kmt-R：5'-GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT-3'；
探针引物Kmt-P：5'FAM-TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG-BHQ1 3'；
上游引物CapA-F：5'-GGGCTGGCTATGTTGGTTTAT-3'；
下游引物CapA-R：5'-CTTTATCTGTGATGGGCGATT-3'；
探针引物CapA-P：5'HEX-TAGCTCAACACCACAATGTGATCT3'。
具体实施方式二：
PCR反应体系为20μL；
PCR反应条件：95℃5min；95℃15sec，53℃20sec，72℃30sec，35循环；在循环的延伸时进行荧光信号检测。
本实施方式与具体实施方式有一不同的是：所述的引物应用到检测多杀性巴氏杆菌及及其荚膜A型中。其它与具体实施方式一相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1
多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR引物的设计
参照GenBank收录的多杀性巴氏杆菌Pm70株的kmt1序列(GenBank号：AE004339)，借助生物信息软件对参考菌株进行序列比对，分析并获得多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD-hyaC基因的保守区域。采用ABI PrimerExpress 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成TaqMan探针及引物。设计出2对引物对及探针。
同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型的双重Real-time PCR方法的引物及检测方法，所述的引物包括上、下游引物和探针引物，具体如下：
上游引物Kmt-F：5'GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT 3'，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物Kmt-R：5'GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT3'，如SEQ ID NO.2所示；
探针引物Kmt-P：5'FAM-TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG-BHQ1 3'，SEQ ID NO.3所示。
上游引物CapA-F：5'-GGGCTGGCTATGTTGGTTTAT-3'，如SEQ ID NO.4所示；
下游引物CapA-R：5'-CTTTATCTGTGATGGGCGATT-3'，如SEQ ID NO.5所示；
探针引物CapA-P：5'HEX-TAGCTCAACACCACAATGTGATCT3'，如SEQ ID NO.6所示；
二、样品的制备
1抗原检测
1.1采样采集病死禽的肝脏、脾脏；猪和牛的鼻拭子，取出鼻拭子放入事先分装的含有30％甘油的BHI培养基中；
1.2菌液制备采集病死禽的肝脏、脾脏；猪和牛的鼻拭子进行细菌增菌培养；37℃摇床，在200rpm条件下，过夜培养16h；另取保存菌种Pm，经过复苏、菌落计数后梯度稀释为不同浓度作为阳性对照。
1.3多杀性巴氏杆菌基因组DNA的提取
无菌条件下取多杀性巴氏杆菌48h血琼脂培养物悬浮于1.5mL装有200μL无菌PBS中，浓度调至1个麦氏浊度。按照基因组DNA提取试剂盒使用说明，提取DNA。用紫外分光光度仪测定所得多杀性巴氏杆菌基因组DNA浓度，立即进行检测或置于-20℃保存。
实施例2
多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR标准曲线的绘制
多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD-hyaC基因的PCR扩增，将其扩增目的片段连接至pMD-18T载体构建质粒标准品。
kmt1反应体系50μL包括：
25μL 2×Taq预混液(购自宝生物工程大连有限公司)、1μL正向引物KMT1-SP6：5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’(10pmol)、1μL的反向引物KMT1-T7：5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’(10pmol)、1μL DNA、22μL超纯水；
hyaD-hyaC反应体系50uL：25μL 2×Taq预混液，1μL正向引物CapA-F：5’-GGGCTGGCTATGTTGGTTTAT-3’(10pmol)、1μL的反向引物CapA-R：5’-CTTTATCTGTGATGGGCGATT-3’(10pmol)、1μL DNA、22μL超纯水。
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30sec，53℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。
取PCR扩增产物5μL琼脂糖凝胶电泳检测，将获得457bp和120bp的目的条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收并纯化。将纯化多杀性巴氏杆菌kmt1和CapA基因片段与pMD18-T载体进行连接，将连接产物热转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养。将选定的含有阳性克隆的单菌落进行培养，提取质粒DNA，进行鉴定并测序。
测序结果表明获得了正确的序列，将正确的含目的基因的重组质粒，命名为pMD-kmt和pMD-CapA。紫外分光光度法测定OD260nm值用以测定质粒DNA浓度，计算拷贝数，结果拷贝数为1×109拷贝/μL，-20℃保存。
2、标准品检测
将pMD-kmt和pMD-CapA质粒DNA作为模板进行多杀性巴氏杆菌探针法实时荧光定量PCR检测，分别建立标准曲线。
具体操作如下：将质粒DNA进行10倍系列稀释成1×109拷贝/μL、1×108拷贝/μL、1×107拷贝/μL、1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL共8个稀释度。每个稀释度重复平行试验2次。3、标准曲线的绘制。
根据所得CT值(循环阈值)作为纵坐标与其对应的标准品的对数值作为横坐标，绘制的多杀性巴氏杆菌的实时荧光定量PCR检测的标准曲线见图1，其中，A的斜率为y＝-3.3607x+43.051；R2＝0.9909；B的斜率为y＝-3.2439x+41.612；R2＝0.9873。标准曲线显示：建立的多杀性巴氏杆菌探针法实时荧光定量PCR检测方法有7个数量级的线性检测范围，进一步说明该检测方法具有非常高的灵敏度。
实施例3
双重实时荧光定量PCR检测方法的敏感性
将多杀性巴氏杆菌C48-1株基因组DNA作为模板模板10倍系列稀释成3×10-7g/μL、3×10-8g/μL、3×10-9g/μL、3×10-10g/μL、3×10-11g/μL、3×10-12g/μL、3×10-13g/μL、3×10-14g/μL共8个稀释度，以无菌水为阴性对照，进行探针法实时荧光定量PCR检测，评价本发明反应***的敏感性。
双重实时荧光定量PCR检测敏感性扩增曲线结果显示：在模板浓度为3×10-12g/μL时可检测到鉴定细菌种属和荚膜A型的荧光信号，如图2所示。本发明建立多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR具有良好的敏感性。
按照双重实时荧光定量PCR中模板的稀释浓度，用普通PCR进行扩增，进行对比验证。普通PCR结果见附图3，3×10-10g/μL浓度的基因组DNA可扩增目的条带，如图3所示。本发明建立的双重实时荧光定量PCR方法比普通的双重PCR方法敏感100倍。
实施例4
双重实时荧光定量PCR检测方法的特异性
设定水空白对照，以金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、鸭疫里默氏杆菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、约翰不动杆菌、鼻气管鸟杆菌、支气管败血波氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌荚膜A、B、D型等17株菌株的DNA作为模板进行实时荧光定量PCR检测，评价反应***的特异性。反应体系及反应条件与实施例2相同。
结果如图4所示。结果显示：双重实时荧光定量PCR只检测到多杀性巴氏杆菌和荚膜A型的细菌，而对B型和D型菌均无法鉴定其血清型；对其他菌株均无法扩增。结果说明：本发明建立的多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR具有良好的特异性。
实施例5
双重实时荧光定量PCR检测方法对样品的检测
用建立的多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法对30份C48-1株细菌人工接种动物感染的肝脏、脾脏等样品进行了检测，均可检测到细菌种属和荚膜A型特异的荧光信号。对46临床样品进行细菌直接检测和增菌培养后检测的结果表明：双重实时荧光定量PCR对两者的检出率分别为18/46和30/46，而普通双重PCR对两者的检出率分别为10/46和13/46；比普通PCR检测更灵敏、准确。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120>一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法的引物及应用
<160>6
<210>1
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> Kmt-F。
<400> 1
GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT 21
<210>2
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Kmt-R。
<400> 2
GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT 21
<210>3
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Kmt-P。
<400> 3
TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG 21
<210>4
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CapA-F。
<400> 4
GGGCTGGCTATGTTGGTTTAT 21
<210>5
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CapA-R。
<400> 5
CTTTATCTGTGATGGGCGATT 21
<210>6
<211>24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CapA-R。
<400> 6
TAGCTCAACACCACAATGTGATCT 24

Claims (3)

1.一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法的引物及应用，其特征在于，所述的引物包括上、下游引物和Taqman探针引物，具体如下：
针对多杀性巴氏杆菌的引物及探针序列如下：
上游引物Kmt-F：5'-GCTYGTTGTGAGTGGGCTTGT-3'；
下游引物Kmt-R：5'-GCCGTTGTCAAGGAAGCAGAT-3'；
探针引物Kmt-P：5'FAM-TTTGTTGGGCRGAGTTTGGTG-BHQ1 3'；
针对荚膜A型的引物及探针序列如下：
上游引物CapA-F：5'-GGGCTGGCTATGTTGGTTTAT-3'；
下游引物CapA-R：5'-CTTTATCTGTGATGGGCGATT-3'；
探针引物CapA-P：5'HEX-TAGCTCAACACCACAATGTGATCT3'。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法的引物及应用，其特征在于：PCR反应体系为20μl；
PCR反应条件：95℃5min；95℃15sec，53℃20sec，72℃30sec，35循环：最后72℃10min。
3.一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法的引物及应用，其特征在于，将如权利要求1所述的引物应用到检测多杀性巴氏杆菌及及其荚膜A型中。
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