CN108676763A - 一种高耐锑卡氏变形杆菌dshn0704及其分离筛选方法和应用 - Google Patents

一种高耐锑卡氏变形杆菌dshn0704及其分离筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704及其分离筛选方法和应用，属于微生物技术领域。本发明的菌株分类命名为：卡氏变形杆菌(Proteus cibarius)DSHN0704，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号是：CCTCC NO：M2018184，保藏日期：2018年4月8日；本发明的卡氏变形杆菌DSHN0704的16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示，所述菌株是从湖南省冷水江市锡矿山剃污染土壤中分离筛选获得。本发明的卡氏变形杆菌菌株DSHN0704菌株对水体中锑(Sb)离子具有较高的吸附容量，吸附速度快，易保存，对环境友好，具有良好的开发应用潜力。

Description

一种高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704及其分离筛选方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种卡氏变形杆菌，更具体地说，本发明涉及一种高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704及其分离筛选方法和应用。
背景技术
锑(Sb)具有慢性毒性、致癌性、且呈全球迁移性特点，是全球性污染物和优先控制污染物。锑(Sb)及其化合物可通过食物链和水等途径进入人体，不仅影响某些酶的作用，还可导致肝和心血管***方面的疾病，因此，世界卫生组织、欧盟和中国均对饮用水中锑含量做了严格限制(<5μg/L)。国内外针对含锑废水的处理技术做了一些研究，如混凝沉淀、膜处理技术、离子交换等处理技术。这些技术可去除水中锑，但仍有效率低、成本高、操作复杂、易产生二次污染等不足，难以既满足水质标准又兼顾经济性。
近年来，国内外学者提出了安全经济、环境友好、选择性强最有潜在价值的微生物吸附除锑技术。有关高耐锑微生物的筛选、鉴定是微生物吸附除锑技术的基石，但这方面的研究相对来说较少。
基于上述理由，提出本申请。
发明内容
本发明针对背景技术中所指出的问题及现有技术存在的不足，本发明的第一目的在于提供一种高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704，本发明的第二个目的在于提供上述所述高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的分离筛选方法，本发明的第三个目的在于提供上述高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的应用，可用于含锑土壤或废水的处理。
为了实现本发明上述第一个目的，本发明采用的技术方案为：一种高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704，其分类命名为：卡氏变形杆菌(Proteus cibarius)DSHN0704，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：CCTCC NO：M2018184，保藏日期：2018年4月8日；高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的16S rRNA序列如SEQID No.1所示。
本发明所述的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704，是从湖南省冷水江市锡矿山剃污染土壤中分离筛选获得，具体是经平板划线筛选获得。
本发明上述所述的高耐锑卡氏变形杆菌(Proteus cibarius)DSHN0704还具有如下性质：
1、微生物学特征
本发明的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704为为革兰氏阴性菌，该菌单菌落呈乳白色，菌落大小1～3mm，***，表面光滑，菌苔粘稠，菌体为短棒杆状，***生殖，显微镜观察，菌落为形态如图1所示。
为了实现本发明的另一目的，本发明提供上述所述的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的分离筛选方法，所述方法主要包括以下步骤：
取湖南省冷水江市锡矿山剃污染土壤，加入灭菌瓶中，用无菌水浸泡，在温度为25℃摇床上震荡10～30min，静置20～60s；采用系列稀释法分离细菌，挑选单菌落后，固体培养基上划线纯化，在25℃恒温培养箱中进行细菌纯培养，获得纯化菌株，菌株经形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为卡氏变形杆菌(Proteus cibarius)，即本发明的卡氏变形杆菌DSHN0704菌株。
为了实现本发明的第三个目的，本发明提供上述所述高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的应用，可用于含锑离子土壤或废水的治理。
所述的卡氏变形杆菌DSHN0704作为锑离子吸附剂的应用。
一种锑离子吸附剂，所述吸附剂包含所述的卡氏变形杆菌DSHN0704。
与现有技术相比，本发明涉及的一种高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704及其分离筛选方法和应用具有如下的有益效果：
(1)本发明提供了对水体或土壤中锑离子具有极强耐受性的菌株的分离筛选、优化培养，初步构建了耐锑菌株的***发育树和耐锑菌株库；
(2)本发明的卡氏变形杆菌菌株DSHN0704为革兰氏阴性菌，对高浓度锑具有良好的耐受性能，不论在液体或者是固体培养基中，都具有较好的耐锑性能，因此该生防细菌在锑含量高的溶液和土壤中依然能够生存，可有效实现Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)在土壤或水体中迁移转化过程的控制，降低土壤或水体中锑毒性及生态危害，最终实现重金属Sb污染的有效治理。
(3)本发明的卡氏变形杆菌菌株DSHN0704菌株对水体中锑(Sb)离子具有较高的吸附容量，吸附速度快，且本发明的菌种培养条件简单，易保存，易于工业化生产，对环境友好，具有良好的开发应用潜力，对微生物吸附除锑技术的发展具有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例1的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的显微镜照片；
图2是本发明实施例1的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的平板菌落形态照片；
图3是本发明实施例1的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的透射电镜照片；
图4是本发明实施例1的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的***发育树。
具体实施方式
下面对本发明的实施案例作详细说明。本实施案例在本发明技术方案的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式做出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
实施例1高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的分离筛选
本发明的卡氏变形杆菌，其属名为Proteus，种名为cibarius，株名为DSHN0704，菌株是从湖南省冷水江市的废水处理池滚石区旁水沟淤泥中分离筛选获得，具体通过平板划线筛选获得，所述筛选方法属于本领域常规菌株分离筛选实验方法。具体方法及过程描述如下：称取10g新鲜淤泥，加入250ml的已灭菌锥形瓶中；取90ml无菌水浸泡，在温度为25℃摇床上震荡20min，静置30s；采用系列稀释法分离细菌，挑选单菌落后，固体培养基上划线纯化，在25℃恒温培养箱进行细菌纯培养，获得纯化菌株。该菌株的显微镜照片参见图1。菌株平板菌落形态照片见图2，另外，将该菌种进行生理生化特征和16S rDNA序列分析，并参照文献(Claesson MJ,O’Sullivan O,Wang Q,et al.Comparative Analysis ofPyrosequencing and a Phylogenetic Microarray for Exploring MicrobialCommunity Structures in the Human Distal Intestine.Ahmed N,ed.PLoS ONE.2009；4(8):e6669；Parks DH,Tyson GW,Hugenholtz P,Beiko RG.STAMP:statistical analysisof taxonomic and functional profiles.Bioinformatics.2014；30(21):3123-3124.)，鉴定为卡氏变形杆菌(Proteus cibarius)，即本发明的卡氏变形杆菌DSHN0704菌株。
图1所示照片为卡氏变形杆菌DSHN0704在激光共聚焦显微镜下，放大40×10倍的显微照片；图2所示照片为卡氏变形杆菌DSHN0704菌落形态照片；图3所示照片为卡氏变形杆菌DSHN0704的透射电镜照片。
该菌种的分离纯化培养条件、检测存活性条件是：牛肉膏蛋白胨培养基，10g蛋白胨粉，5g氯化钠，5g牛肉膏，20g琼脂粉，1000ml水，pH7.0，25℃下培养。
该菌种的检测存活性条件是：牛肉膏蛋白胨培养基，10g蛋白胨粉，5g氯化钠，5g牛肉膏，20g琼脂粉(固体培养基不含)，1000ml水，pH7.0，Sb(Ⅴ)，在25℃下培养。
实施例2卡氏变形杆菌DSHN0704的分子鉴定
本实施例通过16S rRNA序列对本发明的卡氏变形杆菌DSHN0704进行测试分析。
16S rRNA相关鉴定方法：
利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上游引物5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(如SEQID No.2所示)和下游引物5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’(如SEQ ID No.3所示)，对卡氏变形杆菌DSHN0704的16S rRNA基因片段进行PCR扩增，克隆并测序。
测序后获得1427bp的片段，在GenBank的登录号为MH613348，经过测序得到该菌属于卡氏变形杆菌，扩增片段的测序结果见SEQ ID No.1所示。
本发明上述所述卡氏变形杆菌DSHN0704的16S rRNA基因测序BLAST结果如下表1所示。
表1卡氏变形杆菌DSHN0704的16S rRNA测序BLAST结果表
本实施例上述分离筛选出的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704菌株的基于16S rRNA基因序列比对结果以V.furnisii ATCC 35016T(X74704.1)为外枝构建的Neighbor-Joining***发育树如图4所示。
上述基因测试表明，卡氏变形杆菌DSHN0704(Proteus cibarius DSHN0704)与Proteus cibarius JS9FJ796245具有最大的相似度，两者相似度达到99.2992％。
实施例3高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的耐锑性能测试(固体培养基、液体培养基)。
固体培养基：采用平板划线在不同锑浓度的牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线，在25℃恒温培养箱中恒温培养，测定耐锑性能。进行耐锑性能测定的每株菌株设置3个重复组。最终获得一株耐锑性能较高的菌株。高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704在含锑浓度为1～1000mg/L的固体培养基上均能正常生长，锑浓度为1200mg/L生长极其缓慢，几乎不生长。
液体培养基：将通过了较高锑浓度固体培养基测定的菌株，在较高浓度的牛肉膏液体培养基中进行液体耐锑性能检测。具有较高耐锑性能的卡氏变形杆菌DSHN0704于含锑的牛肉膏蛋白胨液体培养基中25℃下培养72小时，取0.1mL该菌液于涂布于不含锑的牛肉膏蛋白胨固体培养上培养，检测其存活性能。在含锑浓度为400mg/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，卡氏变形杆菌DSHN0704仍旧能较好生长。
与其他研究报道相比较，卡氏变形杆菌DSHN0704对重金属锑的抗性高于其他报道的微生物。菌株长期生存在重金属污染区，对重金属锑的强抗性可能与它的复杂的生存环境有关。
实施例4高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的生理生化特性测试
卡氏变形杆菌DSHN0704的酶活、碳源同化实验具体检测方法：
首先，准备试条：准备一个培养盒，倒入约5ml蒸馏水於盘的蜂窝小凹中，造成湿室；在盘沿编号菌株号，取出试验条放到盘中，置于培养盒内。然后，接种物准备：打开一安瓿NaCl0.85％(2ml)，用接种针挑取1～4分纯单个菌落至悬浮基物中，仔细研匀均一，所需浓度为0.5麦氏单位标准浊度。接着，进行接种：用同一根吸管分别接种盐水菌悬液从NO3到PNPG试验管；打开一安瓿APIAUX培养基加入200μl(6～8滴)，剩下的生理盐水菌悬液至安瓿，仔细混匀，避免产生气泡；注满由GLU至PAC培养基，管表面平整或稍凸，GLU、ADH和URE则用矿物油覆盖，直至凸出的新月形成；盖上培养盒，于29℃±2℃培养24h(±2h)。
NO3试验：加一滴NIT1和一滴NIT2试剂到NO3管内，5分钟后红色表示阳性反应；因氮气的产生，可能引置阴性反应：加2～3mgZn试剂到NO3管中，5分钟后，保持无色表明阳性反应，如果颜色改变为粉红色，表明硝酸盐仍存在，被Zn还原成至亚硝酸盐，反应结果为阴性。用于鉴定细菌的反应是硝酸盐还原。当上述两个任何一个为阳性，硝酸盐还原反应为阳性。
TRP试验：加一滴James试验，立即发生反应，全管粉红色表明阳性结果。
同化试验：观察细菌生长，不透明杯部表明阳性反应。
根据上述检测方法，本发明的卡氏变形杆菌DSHN0704的酶活、碳源同化的检测结果分别如表2所示。
表2卡氏变形杆菌DSHN0704的酶活、碳源同化检测结果表
+：阳性反应；-：阴性反应；弱阳性反应
卡氏变形杆菌DSHN0704的利用碳源产酸实验具体检测方法：
首先，试条准备：每条试条分别由5个小试条组成，每个小试条上有10个小管；准备孵育盒；在盒子底部记录菌株编号；加10ml蒸馏水于孵育盒底盘中，使其填满所有的孔，以保持湿润的气体环境。取出2个小试条(0～19，20～39)，分成四个小试条(0～9，10～19，20～29，30～39)，并全部放于孵育盒底盘中，取出另一个小试条(40～49)放于孵育盒底盘中上述4个试条的后面。然后，打开一安瓿NaCl0.85％(2ml)，用接种针挑取单个菌落至10ml液体培养基，仔细研匀均一。接着，用无菌加样器按下面要求将菌悬液加到试条上的50个管中：将孵育盒底盘向前轻轻倾斜，将加样器头靠在杯的边缘加入菌悬液，仅加满管的部分，管的上部不要加菌悬液，这样可以保持管内厌氧环境。接种完成后，液面应平整。将试条放在35摄氏度进行孵育。试条孵育过程中，试条上的小管内在厌氧环境下产酸，pH改变而使培养基中指示剂变色，由此观测到发酵作用。
检测：氧化作用-细菌通过需氧产酸，使试条孔中pH指示剂变色。
同化作用-当细菌利用底物中的不同物质为唯一碳源时，试条上的孔中即可显示明显的细菌生长。
根据上述检测方法，本发明的卡氏变形杆菌DSHN0704的利用碳源产酸的检测结果分别如表3所示。
表3卡氏变形杆菌DSHN0704的利用碳源产酸表
+：阳性反应；-：阴性反应；
实施例5：卡氏变形杆菌DSHN0704吸附性能测试
用摇瓶实验对卡氏变形杆菌DSHN0704的锑吸附能力进行了初步研究。9个250mL的三角烧瓶中装100mL牛肉膏蛋白胨培养基，编号为NO.1～9，分为3组：(1)1～3号为A组；(2)4～6号为B组；(3)7～9号为C组。A组不接种，B、C组接入3％的菌液，9个瓶子均放到30℃、180rpm的摇床中培养。24h后，把C组的3个瓶子进行高温灭菌(121℃，20min)。然后在9个瓶子中均加入Sb(Ⅲ)，使Sb(Ⅲ)的终浓度为20mg/L，再把9个瓶子放入摇床中培养。24h后，将培养液8000rpm离心10min，用原子吸收光谱法测定上清液中的锑浓度，取每组的平均数值作为实验数据，并计算它们的锑吸附率。
从表4可知，在锑的吸附实验中，活菌组B组和灭活组C组中锑等的浓度低于空白组A组。从节省时间和能源的角度考虑，生物吸附的适宜时间为24h。与Sb(Ⅲ)作用24h后，活菌和灭活菌溶液中的锑离子浓度分别下降5.64mg/L和7.97mg/L，对溶液中的Sb(Ⅲ)去除率分别达到28.20％和39.857％。结果表明卡氏变形杆菌DSHN0704的活菌和灭活菌都对水环境中的锑有一定去除作用，灭活菌的除锑效果比活菌好。表明微生物的重金属去除与菌株本身的特点有关，该菌株有较强的重金属抗性，其生长受重金属的毒性影响较小，它在水处理过程中有生物吸附、生物积累和排外作用，而死菌体具有较多的吸附位点，不具备排外作用，灭活菌的除锑效果比活菌好。
表4卡氏变形杆菌DSHN0704对Sb(Ⅲ)的吸附性能
序列表
<110> 湖南科技大学
<120> 一种高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704及其分离筛选方法和应用
<130> 无
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagtctacac atgcagtcga gcggtaacag gagaaagctt gctttcttgc tgacgagcgg 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagtttgatc ctggctcag 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggttacc ttgttacgac tt 22

Claims (5)

1.一种高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704，其特征在于：其分类命名为：卡氏变形杆菌(Proteus cibarius)DSHN0704，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：CCTCC NO：M2018184，保藏日期：2018年4月8日；高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的分离筛选方法，其特征在于：所述方法主要包括以下步骤：
取湖南省冷水江市锡矿山锑污染土壤，加入灭菌瓶中，用无菌水浸泡，在温度为25℃摇床上震荡10～30min，静置20～60s；采用系列稀释法分离细菌，挑选单菌落后，固体培养基上划线纯化，在25℃恒温培养箱中进行细菌纯培养，获得纯化菌株，菌株经形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为卡氏变形杆菌(Proteus cibarius)，即本发明的卡氏变形杆菌DSHN0704菌株。
3.权利要求1所述的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704的应用，其特征在于：可用于含锑离子土壤或废水的治理。
4.权利要求1所述的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704作为锑离子吸附剂的应用。
5.一种锑离子吸附剂，其特征在于：所述吸附剂包含所述的高耐锑卡氏变形杆菌DSHN0704。
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