CN108611442B - 一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量rt-pcr引物和探针及方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT‑PCR引物和探针及方法与应用，该引物和探针的序列如SEQ ID NO:1～3所示。本发明可快速、特异、灵敏地检测猪非典型瘟病毒，最低检测浓度为5copies/μL。本发明使用的操作方法简单、反应结果易于判断，灵敏性和检出率高，并且能够避免假阳性现象，适用于疾病监测、现场应急及临床样品的检测，适合大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体地说，涉及一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针及方法与应用。
背景技术
猪非典型瘟病毒(Atypical porcine pestivirus，APPV)是近几年来新发现的一种新型瘟病毒，与猪瘟(Classical swine fever virus，CSFV)、牛病毒性腹泻(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)、边境瘟病毒(Border disease virus，BDV)等同属瘟病毒属(Pestivirus)黄病毒科(Flaviviridae)。其发病特征是在出生后数小时内可观察到骨骼肌的双侧痉挛收缩，并造成无法吮乳的现象，严重时可损伤仔猪的脑和脊髓，并导致仔猪死亡。在临床上症状轻重不一，有的仔猪是全身一致的、有节奏的震颤，无法站立，在躺卧后震颤减轻或停止。有的仔猪全身震颤程度不一，仅头部、颈部震颤强烈，不能准确吃奶但仍可正常运动。2015年，美国Hause 研究小组检测并证实了该病毒的存在，同时指出APPV可能导致仔猪先天性震颤。随后，该病毒在德国、荷兰、西班牙、奥地利等地相继被报道。在2017年，该病毒被我国华南农业大学宁永章课题组首次发现。
目前对于猪非典型瘟病毒尚无预防用生物制品，能准确、快捷、有效的检测猪非典型瘟病毒(APPV)对于提高对该病毒的防控是至关重要的。目前，根据研究数据表明，该病毒的基因序列变异快，不同毒株之间基因序列差异大，国外建立的检测方法在国内并不适用，而国内已有的普通PCR和荧光检测试剂盒又易出现假阳性问题，因此其检测结果的准确性是有待考究的。
由此可见，我国对于该病毒的检测技术还需要进一步的完善。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR 引物和探针及方法与应用，本发明在多株APPV基因序列比对基础上，基于5’端基因设计了特异性引物和探针，对猪非典型瘟病毒进行快速、准确地鉴别，具有简单、快速、灵敏度高和特异强的特点。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针，包括上游引物APPV F、下游引物APPV R以及探针APPV Probe，其中，上游引物APPV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，下游引物APPV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针APPV Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还公开了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR的方法，包括以下步骤：提取待检测样品的RNA，以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用上述的引物和探针对cDNA进行荧光定量RT-PCR 扩增；通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和 CT值，在扩增曲线正常的情况下，若CT值＞0时，则可记为阳性，若CT 值＝0时，则记为阴性。
可选地，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL、1号5×Prime Script Buffer 4μL、2号Prime ScriptRT Enzyme Mix 1μL、4号Random 6mers 2μL 和5号RNase Free dH2O 9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。
可选地，所述反转录反应所需试剂为宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScriptTMRT试剂。
可选地，荧光定量PCR反应检测体系为：Premix Ex Taq(Probe qPCR) 10μL，上游引物APPV F、下游引物APPV R各0.5μL，探针APPV Probe 0.8 μL，cDNA模板100ng，用ddH2O补齐到20μL。
可选地，所述的荧光定量RT-PCR反应条件为:95℃预变性2min；PCR: 95℃反应15sec，54℃反应20sec进行40个循环。
本发明还公开了一种上述的检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR 引物和探针在猪非典型瘟病毒的快速诊断中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)引物针对的基因靶标不同：本发明设计的引物是基于APPV 5’端，在瘟病毒中5’端序列相对保守，适合用做引物和探针的设计靶点。而公开的检测方法的引物是基于APPVNS3和APPV E2基因设计的引物。
2)引物设计的可检测范围不同：本发明设计的引物是根据国内外公布的所有APPV病毒序列，能够同时对国内外现有的毒株进行检测，而设计范围在高度保守的5’端序列。
3)本发明不仅操作步骤少，只需要常规的提取核酸，进行反转录后就能进行探针荧光定量PCR检测；能节约大量时间，整个扩增只需要1h即可完成，检测的灵敏度到5copies/μL。
4)本发明的阳性结果鉴定便捷，只需要判断其CT值是否大于“0”即可；比检测APPV的核酸电泳或荧光定量PCR的方法更加快捷、准确，且能很好的避免SYBR Green荧光定量PCR实验中假阳性的现象，为猪非典型瘟病毒的快速诊断和流行病学调查奠定了基础。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明阳性模板经52℃-58℃7个退火温度PCR扩增后曲线图；其中，N代表阴性对照，1-7代表同一个实验样本；
图2是本发明引物特异性实验结果图；其中，1：APPV病毒样品；2：猪瘟病毒样品；3：猪蓝耳病毒样品；4：伪狂犬病毒样品；5：牛病毒性腹泻样品；6：大肠杆菌样品；7：沙门氏菌样品。
图3是本发明引物灵敏度实验的检测结果图，其中A:5×108拷贝/μL； B:5×107拷贝/μL；C:5×106拷贝/μL；D:5×105拷贝/μL；E:5×104拷贝/μL； F:5×103拷贝/μL；G:5×102拷贝/μL；H:5×10拷贝/μL；I:5拷贝/μL。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1引物设计
根据NCBI登陆的APPV基因的国内外已经发表的毒株序列 (KU041637，KU041638，KU041639，KU194229，KX929062，KX929063， KX929069，LT594521)，应用Beacon Designer7.7软件设计针对APPV的 5’端基因的特异性引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
上游引物APPV F：YGAGTAGTACACCCAAAG(其中Y代表T或C)， SEQ ID NO:1；
下游引物APPV R：CACCACCGATTTCTCTTT，SEQ ID NO:2；
探针序列APPV Probe：CYGAGCCTCAGTAGACCCT(其中Y代表T 或C)SEQ ID NO:3。
实施例2检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR方法的建立：
该方法包括以下步骤：
(1)待检测样品RNA提取：
待检血液样品经过8000g离心5min，取上层血清各用；组织器官样品需要以1:5的质量体积比与灭菌双蒸水混合，研磨后8000g 离心5min，取上清液，备用。
(2)提取的RNA加入到购自宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA模板：
反转录步骤为：将RNA模板4μL、1号5×PrimeScript Buffer 4μL、 2号PrimeScriptRT Enzyme Mix 1μL、4号Random 6mers 2μL和5 号RNase Free dH2O 9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。其反应条件：37℃15min，85℃15s，16℃10min。此反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。
(3)探针荧光定量RT-PCR扩增反应：扩增反应20μL反应体系含有： Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，上游引物APPV F、下游引物APPV R 各0.5μL，探针APPV Probe 0.8μL，cDNA模板100ng，用ddH2O补齐到 20μL。然后:95℃预变性2min；PCR:95℃反应15sec，54℃反应20sec进行40个循环，扩增产物大小为91bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4 所示。
(4)结果判断：通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S 型扩增曲线和CT值，在扩增曲线正常的情况下，若CT值＞0时，则可记为阳性，若CT值＝0时，则可记为阴性。
实施例3退火温度、引物浓度和探针浓度的优化、灵敏度、稳定性和特异性的测定
(1)退火温度的优化：APPV F/R引物反应条件中的退火温度设置48℃-54℃，对荧光定量PCR仪的扩增峰图进行观察，选取CT 值最小的为最佳退火温度，如图1所示，本发明的最佳退火温度为 54℃。
(2)引物浓度的优化：PCR按20μL反应体系，上下游引物各 0.2μL～1μL，探针0.5μL。选取CT值最小的引物浓度为最佳引物浓度，如图2所示，最佳引物浓度为0.5μL。
(3)探针浓度的优化：PCR按20μL反应体系，上下游引物各 0.8μL，探针0.2μL～1μL。选取CT值最小的探针浓度为最佳引物浓度，如图3所示，最佳探针浓度为0.8μL。
(4)灵敏度评价：
克隆转化和重组阳性质粒：RT-PCR扩增出目的基因，进行电泳观测分析。电泳筛选出来的APPV阳性样本用购自OMGA公司PCR 纯化试剂盒进行PCR产物纯化，将纯化的PCR产物与TMD-19T载体连接，放入金属浴3h后取出。得到的连接产物加入感受态细胞 (大肠杆菌DH5α株)后液体加入1mL LB液体中，放入37℃摇菌箱2～3h，然后5000r/min 4min离心，弃800μL上清液，剩下200 μL吹打混匀。吸取100μL菌液滴于含有氨苄青霉素的LB的培养基，并用涂布棒把菌液均匀的分布在培养基上，放37℃细菌培养箱12 h～16h。挑取单菌落溶于10μL灭菌水中混匀，取2μL菌液为PCR 模板做PCR扩增，将PCR产物做电泳检测后挑取亮条带的菌液加到 2mL LB+AMP液体中摇菌12h。用质粒提取试剂盒对已摇好的菌液进行质粒的提取，得到的质粒即阳性模板，放-20℃保存。
将上述制备得到的阳性模板用无菌水做10倍连续稀释： 10-1-10-11，取C:1.0×10-4、D:1.0×10-5、E:1.0×10-6、F:1.0×10-7、 G:1.0×10-8、H:1.0×10-9、I:1.0×10-10稀释的质粒，按以上最优的探针荧光RT-PCR反应体系和反应条件进行扩增，对荧光PCR结果数据进行分析，发现检测其最低浓度见如图3所示，所建立的探针荧光定量RT-PCR反应最低检测量分别为：APPV毒株5拷贝/μL，表明灵敏性良好。
(5)重复性评价：将已稀释好的质粒，都统一按照(3)的操作方式进行3个平行试验，结果表明方法具有高度稳定性和可重复性(表1)
表1探针荧光定量RT-PCR的重复性
特异性的评价：用上述优化好的体系对待样品进行检测，按照实施例 2同等的方法对样本进行RNA提取，所检测的样品分别为猪非典型瘟病毒、猪瘟病毒样品；猪蓝耳病毒样品；伪狂犬病毒样品；牛病毒性腹泻样品；大肠杆菌；沙门氏菌，以上病毒样本均由西南民族大学提供。
实施例4
本发明猪非典型瘟病毒探针荧光定量RT-PCR检测方法在临床中的应用评价：使用本发明探针荧光定量RT-PCR检测方法与常规的PCR电泳检测方法分别检测48份临床疑似样本。检测结果见表2，结果显示，已申请专利(申请号：CN 106801109A)的常规PCR方法，阳性检出率20.8％ (10/48)；已申请专利(申请号：CN 107267666A)的SYBR Green荧光定量RT-PCR方法，阳性检出率25％(12/48)；本发明对样本检测阳性率为29.2％(14/48)，阳性样本经克隆测序验证都为APPV。经统计学计算三种方法阳性率存在明显的差异。说明本发明方法对于临床标本检测能力优于已申请专利中的PCR检测方法(表2)。
表2本方法与常规PCR鉴定方法对临床标本检测的比较
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 西南民族大学
<120> 一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针及方法
<130> 2018
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ygagtagtac acccaaag 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
caccaccgat ttctcttt 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cygagcctca gtagaccct 19
<210> 4
<211> 88
<212> DNA
<213> 猪非典型瘟病毒(Atypical porcine pestivirus，APPV)
<400> 4
tgagtagtac acccaaagac caccactagg tgtagggtct actgaggctc gggtggacgt 60
gggcgtgccc aaagagaaat cggtggtg 88
Claims (5)
1.一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针，其特征在于，包括上游引物APPV F、下游引物APPV R以及探针APPV Probe，其中，上游引物APPV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物APPV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针APPV Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种非诊断目的地检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待检测样品的RNA，以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用权利要求 1中所述的引物和探针对cDNA进行荧光定量RT-PCR扩增；通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和CT值，在扩增曲线正常的情况下，若CT值＞0时，则可记为阳性，若CT值= 0时，则记为阴性。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反转录的步骤为：将RNA模板4 µL、1号5×Prime Script Buffer 4 µL、2号Prime ScriptRT Enzyme Mix 1 μL、4号Random 6mers 2 µL和5号RNase Free dH2O 9 μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光定量RT-PCR的反应检测体系为：Premix Ex Taq10 μL，上游引物APPV F、下游引物APPV R各0.5 μL，探针APPV Probe 0.8 μL，cDNA模板100 ng，用ddH2O补齐到20 μL。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的荧光定量RT-PCR反应条件为： 95℃预变性2 min；PCR: 95℃反应15 sec，54℃反应20 sec进行40个循环。
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