CN107513583A - 检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量pcr引物及试剂盒 - Google Patents

检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量pcr引物及试剂盒 Download PDF

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CN107513583A CN201710786492.5A CN201710786492A CN107513583A CN 107513583 A CN107513583 A CN 107513583A CN 201710786492 A CN201710786492 A CN 201710786492A CN 107513583 A CN107513583 A CN 107513583A
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物及试剂盒。所述的检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO.1～2所示，该引物可以特异性扩增非典型猪的瘟病毒NS3基因片段。本发明还提供了一种检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒和检测非典型猪的瘟病毒的方法，该试剂盒具有快速高效、操作便捷、高特异性、高灵敏度、鉴定简单、成本低等有益效果。发明通过上述引物、试剂盒和方法对非典型猪的瘟病毒进行定量检测和确定，可以快速精准的测定目的基因的拷贝数，对APPV的检测鉴定提供了一种技术基础。

Description

检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物及试剂盒。
背景技术
众所周知，黄病毒科瘟病毒是感染偶蹄动物的重要病原体之一。其中瘟病毒除了包括具有代表性的猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus，BVDV)之外，近年来，还分别于2007发现了Bungowannah病毒，于2012年发现了菊头蝠瘟病毒(Rhinolophus affinis bats pestivirus，RaPestV-1)，于2014年发现了挪威鼠瘟病毒，更是于2015年发现了一种新型的非典型猪的瘟病毒(Anatypical porcine pestivirus，APPV)。
APPV是2015年由Hause在美国农场中的猪体内首先发现，该研究称对猪的血清样品进行检测分析发现一种新型病毒，它与RaPV有68％的相似率，剩下25％～28％与其他的瘟病毒相似。因此，该病毒被命名为一种新型的非典型猪的瘟病毒(An atypical porcinepestivirus)，简称“APPV”。该研究结果也表明这种新型的非典型猪的瘟病毒在美国猪的体内广泛分布。随后，为了探索APPV在欧洲猪群中的流行情况，德国也采集了部分当地养猪场内猪的样品进行分析研究，发现APPV在德国猪群中也呈现出普遍流行的状况。
之后，有研究者通过APPV疫苗去接种未感染怀孕母猪，发现这些初产母猪的头胎仔猪大部分患有仔猪先天性震颤，除此之外，还有其他相关研究也表明APPV与仔猪的先天性震颤有关。而仔猪先天性震颤是发生在新生仔猪身上的一种普遍现象，于1922年被首次发现，发病时通常表现出局部或全身的肌肉震颤特征，轻微症状表现为在耳朵和后腿呈现局部颤动。严重症状表现为全身震颤、站立或行走困难，最终由于哺乳护理困难死于饥饿或直接淘汰。
在中国，仔猪先天性震颤导致仔猪的百分百淘汰率对养猪业造成了巨大的经济损失。有一些报道认为仔猪先天性震颤的病因是母猪妊娠后期的营养不足导致的胎儿发育不全，或是由猪瘟病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒等病毒病所引起的，但究竟是那种病因导致的仔猪先天性震颤，目前尚未有确切的结论。但近年来的研究表明，在APPV和仔猪先天性震颤之间存在着明显的影响关系，APPV可能是导致仔猪先天性震颤的重要原因之一。
至今，在中国尚未有关于APPV研究的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物。
本发明的另一目的在于提供一种检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述绝对荧光定量PCR引物。
本发明的再一目的在于提供上述检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物和检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物，包含引物APPV_NS3-F、引物APPV_NS3-R，其核苷酸序列如下所示：
引物APPV_NS3-F：5’-CAGAGRAAAGGKCGAGTGGGT-3’；
引物APPV_NS3-R：5’-ACCATAYTCTTGGGCCTGSAGG-3’；
一种检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒，包括上述检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物；
所述的检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒优选包括如下组分：2×One Step SYBRGreen Mix、One Step SYBR Green Enzyme Mix、上述检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物和无RNA酶水；
所述的试剂盒还包括阳性标准品和阴性对照；
所述的检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物和检测非典型猪的病毒的试剂盒在检测非典型猪的瘟病毒中的应用；
所述的应用不包括疾病治疗与诊断目的；
一种检测非典型猪的瘟病毒的方法，包含如下步骤：
(1)提取猪组织或血清样本中APPV病毒的RNA；
(2)将步骤(1)提取的APPV病毒的RNA反转录为cDNA；
(3)根据APPV的保守序列设计普通PCR引物对，以步骤(2)中反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的片段；其中，普通PCR引物对为：APPV_NS3-F和APPV_NS3-R；
(4)步骤(3)扩增得到的目的片段经胶回收纯化后连接PMD-18-T载体，得到重组质粒；
(5)以步骤(4)得到的重组质粒为模板，引物APPV_NS3-T7-F和APPV_NS3-R作为扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(6)以步骤(5)扩增得到的PCR扩增产物为模板，利用体外转录试剂盒将其转录为RNA；
(7)将步骤(6)转录得到的RNA倍比稀释后作为标准品，测算出起始RNA拷贝数；
(8)以待测样品的RNA及各梯度稀释的标准品分别作为反应模板进行荧光定量PCR反应，根据标准品荧光定量PCR标准曲线计算待测样品的起始拷贝数，即为APPV的含量；
步骤(2)中所述的反转录优选为采用随机引物和反转录MLV酶将RNA反转录为cDNA；
步骤(2)中所述的反转录进一步优选为：
配制RNA引物混合液反应体系：步骤(1)提取的APPV病毒的RNA(作为模板)5.75μL，随机引物1μL，共计6.75μL；70℃水浴10min，冰浴2min；再配制反转录体系：RNA引物混合液6.75μL，5×反转录buffer 2μL，10μM dNTP0.5μL，RNase抑制剂0.25μL，MLV酶0.5μL，共计10μL；30℃水浴10min，42℃水浴1h，得到cDNA；反转录后的cDNA可保存于-20℃；
步骤(3)中所述的PCR扩增的体系优选为：Premix Taq酶12.5μL，无RNA酶水6.5μL，引物APPV_NS3-F和APPV_NS3-R各0.5μL，cDNA模板5μL；
步骤(3)中所述的PCR扩增的反应程序优选为：98℃10s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min；
步骤(5)中所述的APPV_NS3-T7-F的核苷酸序列为：
引物APPV_NS3-T7-F：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCAGAGGAAAGGCCGAGTGGG；
步骤(5)中所述的PCR扩增的体系优选为：Premix Taq酶12.5μL，无RNA酶水6.5μL，引物APPV_NS3-T7-F和APPV_NS3-R各0.5μL，质粒模板5μL；
步骤(5)中所述的PCR扩增的反应程序优选为：98℃10s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min；
步骤(8)中所述的荧光定量PCR的反应体系为：2×One Step SYBR Green Mix缓冲液10μL，One Step SYBR Green Enzyme Mix 1μL，荧光定量PCR引物各0.4μL，无RNA酶水6.2μL，RNA模板2μL；
步骤(8)中所述的荧光定量PCR的反应程序为：50℃3min；95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环；
步骤(8)中所述的待测样品和标准品在同一扩增体系和反应中进行荧光定量PCR扩增，保证了标准品和样品的同扩增体系和同反应；
步骤(8)中所述的荧光定量PCR的引物为APPV_NS3-F和APPV_NS3-R；
所述的方法不包括疾病治疗与诊断目的；
本发明的原理：
绝对荧光定量PCR的基本原理是利用已知浓度的标准品绘制标准曲线，然后推算出未知样品的量。首先将标准品RNA倍比稀释至不同浓度，然后作为模板进行荧光定量PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以定量PCR反应测得的Ct值为纵坐标，绘制出标准曲线。Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系。根据样品的Ct值和标准曲线方程计算出样品中所含的模板量。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物和检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒，该引物可以特异性扩增非典型猪的瘟病毒NS3基因片段，对APPV的检测鉴定提供了技术支持。
(2)本发明提供了一种检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒，该试剂盒具有快速高效、操作便捷、高特异性、高灵敏度、鉴定简单、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果。
(3)本发明通过绝对荧光定量PCR的方法，对非典型猪的瘟病毒即APPV进行定量检测和确定，可以快速精准的测定目的基因的拷贝数，对APPV的检测鉴定提供了一种技术基础。
附图说明
图1是普通PCR目的条带电泳图；其中，M：Maker，1：目的片段(117bp)，2：阴性对照。
图2是绝对荧光定量PCR标准曲线图。
图3是绝对荧光定量PCR引物对特异性实验扩增结果图。
图4是绝对荧光定量PCR引物对敏感性实验扩增结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
以下方法步骤详细说明APPV的RNA抽提、质粒制备、质粒浓度测定、质粒扩增曲线建立以及待测样品中的APPV含量的测定。本发明采用绝对荧光定量PCR方法检测APPV拷贝数。
(1)样品来源：本发明采集了中国南部两家养殖场中一只患有先天性震颤病猪的血清样本和器官样本(包括肾、脾、十二指肠等)；根据APPV毒株(GenBank号：KY624591.1)，经鉴定，血清样本和器官样本均为APPV阳性。
(2)RT-PCR引物的设计
采用Primer express软件在从NCBI-Genebank获取Postel于2016公开发表的APPV基因序列(KY624591.1)，在NS3基因区，利用Oligo7.0设计普通反转录PCR的引物对，引物对由英潍捷基公司合成。所述绝对荧光定量PCR引物对包括绝对荧光定量PCR上游引物和绝对荧光定量PCR下游引物，分别为：
APPV_NS3-F：5’-CAGAGRAAAGGKCGAGTGGGT-3’；
APPV_NS3-R：5’-ACCATAYTCTTGGGCCTGSAGG-3’；
设计另一在APPV_NS3-F的5’端加入T7启动子的上游引物：
APPV_NS3-T7-F：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCAGAGGAAAGGCCGAGTGGG；
(3)收集好血清样品，并对组织样品进行研磨处理。根据Viral RNA/DNAextraction Kit Ver.5.0说明书，采用OMEGA病毒RNA提取试剂盒进行RNA抽提(血清样本和肾脏组织样本)，将560μL QVL Buffer、5.6μL Carrier RNA、10μLβ-硫基乙醇加入1.5mL离心管；加入140μL血清样品，充分混匀30s，室温孵育5min；再添加560μL无水乙醇，充分混合30s；将离心柱放入收集管中，将650μL上述液体转移至离心柱，操作要仔细而迅速，10000g离心30s后，弃(收集管)液体，并重复此步骤；换新的2mL收集管，加入500μL RWA，10000g离心30s后，弃液体；加入500μL RWB，10000g离心30s后，弃液体；空管10000g离心3min后，弃液体；换新的1.5mL Ep管，加入30μL DEPC水，静置3min，10000g离心1min，所得液体即为抽提的RNA，于-80℃保存；
(4)以步骤(3)抽提的血清样品RNA为模板，采用随机引物6N(Takara Bio Inc)和反转录MLV酶将RNA反转录为cDNA，过程为：在1.5mL的离心管中，加入RNA模板5.75μL，随机引物1μL，共计6.75μL，将混合液置于70℃水浴10min，立刻冰浴2min；再向离心管中加入5×反转录buffer 2μL，dNTP(10μM)0.5μL，RNase抑制剂0.25μL，MLV酶0.5μL，共计10μL，将混合液置于30℃水浴10min，42℃水浴1h，所得产物即为cDNA，于-20℃保存；
(5)以步骤(4)中反转录得到的cDNA为模板，在包括APPV_NS3-F/APPV_NS3-R引物对的PCR反应体系中进行普通PCR扩增；其中，普通PCR反应体系(25μL)：Premix Taq酶12.5μL，无RNA酶水6.5μL，普通PCR上下游引物(APPV_NS3-F/APPV_NS3-R)各0.5μL，cDNA模板5μL。
普通PCR反应程序：98℃10s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min；4℃保存；
(6)普通PCR反应结束后，将扩增产物于质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，紫外成像***拍照(见图1)目的条带117bp，切割目的条带。
(7)采用Gel ExtraCtion Kit试剂盒(OMEGA BIO-TEK)对切割下的目的条带进行胶回收；
(8)将回收纯化后的目的条带连接PMD-18-T载体，于恒温金属浴仪器中16℃恒温18小时；常规转染至300μL的感受态细胞大肠杆菌DH5α中，将转染完成后的感受态大肠杆菌DH5α涂板在含有氨苄的LB固体培养基上，37℃恒温过夜培养，次日挑取单克隆菌落，加入含有氨苄的LB液体培养基中，37℃、200r/min摇床培养12小时。菌液PCR检测菌液转染阴阳性，将转染成功的菌液离心浓缩后按照质粒提取试剂盒(OMEGA BIO-TEK)说明提取质粒；质粒经测序和比对，核对正确后使用；
(9)以步骤(8)中所提质粒为模板，在包括APPV_NS3-T7-F/APPV_NS3-R的普通PCR体系中进行PCR扩增；普通PCR反应体系(25μL)：Premix Taq酶12.5μL，无RNA酶水6.5μL，普通PCR上下游引物(APPV_NS3-F/APPV_NS3-R)各0.5μL，质粒模板5μL；
普通PCR反应程序：98℃10s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min；4℃保存；
(10)以步骤(9)中PCR扩增产物为模板，利用体外转录试剂盒将其转录为RNA；利用体外转录试剂盒(Takara Bio Inc)，配制体外转录体系(20μL)：转录缓冲液2μL，ATP溶液2μL，GTP溶液2μL，CTP溶液2μL，UTP溶液2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，T7RNA聚合酶2μL，无RNA酶水6.5μL，线性模板DNA1μL。将上述体系均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部，42℃反应2小时。取反应液的一部分进行凝胶电泳确认体外转录后的RNA产物，并保存转录好的RNA于-80℃。
(11)采用核酸蛋白测定仪(BIO-RAD)测定步骤(10)所转录的RNA浓度，依据公式计算：RNA拷贝数(拷贝数/μL)＝6.02×1023(拷贝数/μL)×RNA浓度(g/μL)/RNA分子量(g/mol)。计算得出所制备的RNA浓度为8.323×1013拷贝/μL。
采用Primer express软件设计绝对荧光定量PCR引物对，绝对荧光定量PCR引物对由英潍捷基公司合成。绝对荧光定量PCR上游引物为APPV_NS3-F：5’-CAGAGRAAAGGKCGAGTGGG-3’，绝对荧光定量PCR下游引物为APPV_NS3-R：5’-ACCATAYTCTTGGGCCTGSAG-3’。取DEPC水对测定出拷贝数的RNA做10倍倍比稀释，取10-1到10-8 8个梯度做模板进行绝对荧光定量PCR反应。
绝对荧光定量PCR反应体系：
绝对荧光定量PCR反应程序：50℃3 min；95℃5 min；95℃10 s，60℃30s，40个循环；
(12)按照(9)中的绝对荧光定量PCR反应体系和程序，取0-1到10-7 8个梯度已知浓度质粒做模板，另以肾脏组织样品的RNA做模板同时进行荧光定量PCR反应，根据Log(模板拷贝数)与循环数Ct值的对应关系(表1)生成标准曲线，见图2。将待测样品所得Ct值代入标准品曲线方程便可得出待测样品起始拷贝数，计算出样品中APPV的含量。绝对荧光定量PCR扩增产物长度为117bp。
表1 Log(模板拷贝数)与循环数Ct值对应关系
Log(模板拷贝数) 10.22 9.22 8.22 7.22 6.22 5.22 4.22
Ct值 8.87 11.43 15.22 18.77 22.14 25.76 28.73
实验结果分析：以Log(模板拷贝数)为横坐标，循环数Ct值为纵坐标，所得曲线方程为：y＝-3.3989X+43.245，R2＝0.9986(表明线性关系良好)。所得待测样品Ct值为15.28，将样品Ct值代入标准曲线方程，15.28＝-3.3989X+43.245，即X＝(15.28-43.245)/-3.3989＝8.23。通过对数计算得出待测样品的拷贝数，即待测样品中(2μL)APPV拷贝数为108.23＝1.70×108，该待测样品的浓度为8.5×107拷贝/μL。
实施例2绝对荧光定量PCR引物对特异性实验
以实施例1中的肾脏组织样品的RNA作为阳性对照，同时提取猪瘟病毒(猪瘟病毒(CSFV)疫苗株GXW-07，已在申请号为“201310629121.8”，申请名称为“检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用”中公开)、猪乙型脑炎病毒(猪乙型脑炎病毒GZ0409-31株，已在申请号为“201310627844.4”，申请名称为“检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒及应用”中公开)、猪细小病毒(猪细小病毒灭活疫苗WH-1株，购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)、猪流行性腹泻病毒(猪流行性腹泻病毒CV777株，已在申请号为“201310153789.X”，申请名称为“检测猪流行性腹泻病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用”中公开)的RNA进行特异性检测，使用实施例1中的绝对荧光定量PCR引物对、绝对荧光定量PCR反应体系和程序进行绝对荧光定量PCR，结果除阳性对照(肾脏组织样品的RNA)外循环数都大于34，即均没有特异性扩增，说明本发明绝对荧光定量PCR引物对具有良好的特异性(图3)。
实施例4绝对荧光定量PCR敏感性实验
取实施例1步骤(10)反转录制得的RNA 10倍递增稀释并作为绝对荧光定量PCR模板，取10-5～10-9稀释倍数的RNA做模板，每个稀释度各取2μL作为模板，按实施例1的绝对荧光定量PCR方法进行检测，观察扩增曲线，以出现阳性预期曲线所用模板量的最高稀释度计算其敏感性。图4中的扩增曲线从左到右依次为10-5、10-6、10-7、10-8、和10-9稀释倍数模板的扩增曲线，最后一支扩增曲线为10-9稀释倍数模板，即最小检出量为11.43拷贝/μL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物及试剂盒
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物APPV_NS3-F
<400> 1
cagagraaag gkcgagtggg t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物APPV_NS3-R
<400> 2
accataytct tgggcctgsa gg 22
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物APPV_NS3-T7-F
<400> 3
gatcactaat acgactcact atagggcaga ggaaaggccg agtggg 46

Claims (10)

1.一种检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物，其特征在于包含引物APPV_NS3-F、引物APPV_NS3-R，其核苷酸序列如下所示：
引物APPV_NS3-F：5’-CAGAGRAAAGGKCGAGTGGGT-3’；
引物APPV_NS3-R：5’-ACCATAYTCTTGGGCCTGSAGG-3’。
2.一种检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物。
3.根据权利要求2所述的检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒，其特征在于包括如下组分：2×One Step SYBR Green Mix、One Step SYBR Green Enzyme Mix、上述检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物和无RNA酶水。
4.权利要求1所述的检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量PCR引物和权利要求2或3所述的检测非典型猪的瘟病毒的试剂盒在检测非典型猪的瘟病毒中的应用。
5.一种检测非典型猪的瘟病毒的方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)提取猪组织或血清样本中APPV病毒的RNA；
(2)将步骤(1)提取的APPV病毒的RNA反转录为cDNA；
(3)根据APPV的保守序列设计普通PCR引物对，以步骤(2)中反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的片段；其中，普通PCR引物对为：APPV_NS3-F和APPV_NS3-R；
(4)步骤(3)扩增得到的目的片段经胶回收后连接PMD-18-T载体，得到重组质粒；
(5)以步骤(4)得到的重组质粒为模板，引物APPV_NS3-T7-F和APPV_NS3-R作为扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(6)以步骤(5)扩增得到的PCR扩增产物为模板，利用体外转录试剂盒将其转录为RNA；
(7)将步骤(6)转录得到的RNA倍比稀释后作为标准品，测算出起始RNA拷贝数；
(8)以待测样品的RNA及各梯度稀释的标准品分别作为反应模板进行荧光定量PCR反应，根据标准品荧光定量PCR标准曲线计算待测样品的起始拷贝数，即为APPV的含量。
6.根据权利要求5所述的检测非典型猪的瘟病毒的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的反转录为采用随机引物和反转录MLV酶将RNA反转录为cDNA。
7.根据权利要求6所述的检测非典型猪的瘟病毒的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的反转录为：
配制RNA引物混合液反应体系：步骤(1)提取的APPV病毒的RNA(作为模板)5.75μL，随机引物1μL，共计6.75μL；70℃水浴10min，冰浴2min；再配制反转录体系：RNA引物混合液6.75μL，5×反转录buffer 2μL，10μM dNTP0.5μL，RNase抑制剂0.25μL，MLV酶0.5μL，共计10μL；30℃水浴10min，42℃水浴1h，得到cDNA；反转录后的cDNA可保存于-20℃。
8.根据权利要求5所述的检测非典型猪的瘟病毒的方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的APPV_NS3-T7-F的核苷酸序列为：
引物APPV_NS3-T7-F：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCAGAGGAAAGGCCGAGTGGG；
步骤(8)中所述的荧光定量PCR的引物为权利要求1中所述的引物APPV_NS3-F和引物APPV_NS3-R。
9.根据权利要求5所述的检测非典型猪的瘟病毒的方法，其特征在于：
步骤(8)中所述的荧光定量PCR的反应体系为：2×One Step SYBR Green Mix缓冲液10μL，One Step SYBR Green Enzyme Mix 1μL，荧光定量PCR引物各0.4μL，无RNA酶水6.2μL，RNA模板2μL。
10.根据权利要求5所述的检测非典型猪的瘟病毒的方法，其特征在于：
步骤(8)中所述的荧光定量PCR的反应程序为：50℃3min；95℃5min；95℃10sec，60℃30sec，40个循环。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106929606A (zh) * 2017-04-14 2017-07-07 华南农业大学 一种检测鉴定非典型猪瘟病毒（appv）的pcr引物及检测方法与检测试剂盒
CN108611442A (zh) * 2018-06-07 2018-10-02 西南民族大学 一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量rt-pcr引物和探针及方法与应用
CN114015815A (zh) * 2021-12-17 2022-02-08 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106801109A (zh) * 2017-03-24 2017-06-06 广东温氏食品集团股份有限公司 一种猪非典型瘟病毒rt‑pcr检测特异性引物、试剂盒及检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106801109A (zh) * 2017-03-24 2017-06-06 广东温氏食品集团股份有限公司 一种猪非典型瘟病毒rt‑pcr检测特异性引物、试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIN YUAN等: "Atypical Porcine Pestivirus as a Novel Type of Pestivirus in Pigs in China", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 *
于浩等: "《生物信息实验指导》", 30 September 2009, 吉林大学出版社 *
张爱联: "《生物化学与分子生物学实验教程》", 31 January 2009, 中国农业大学出版社 *
李自刚等: "《生物检测技术》", 31 August 2016, 中国轻工业出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106929606A (zh) * 2017-04-14 2017-07-07 华南农业大学 一种检测鉴定非典型猪瘟病毒（appv）的pcr引物及检测方法与检测试剂盒
CN108611442A (zh) * 2018-06-07 2018-10-02 西南民族大学 一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量rt-pcr引物和探针及方法与应用
CN108611442B (zh) * 2018-06-07 2021-09-24 西南民族大学 一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量rt-pcr引物和探针及方法与应用
CN114015815A (zh) * 2021-12-17 2022-02-08 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法
CN114015815B (zh) * 2021-12-17 2024-04-30 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法

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